Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De retinale en choroidale bloedstroomdynamiek kan inzicht verschaffen in de pathofysiologie en vervolg van diverse oogziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie, leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. Het kan ook helpen om de therapeutische reacties in het oog te volgen. De juiste etikettering van de bloedcellen, in combinatie met live-celbeelden van de gelabelde cellen, maakt het mogelijk om de stromingsdynamiek in de retinale en choroidale circulatie te onderzoeken. Hier beschrijven we de gestandaardiseerde protocollen van respectievelijk 1,5% indocyaninegroen (ICG) en 1% natriumfluoresceïne-etikettering van muizen erythrocyten en leukocyten. Scanning laser-oftalmocopie (SLO) werd toegepast om de gelabelde cellen te visualiseren in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wildtype). Beide methoden demonstreerden onderscheiden fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis. Deze etiketteringsmethoden kunnen bredere toepassingen hebben in verschillende oogziektenmodellen.

Introduction

Het bestuderen van de stromingsdynamiek van de bloedcellen in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van potentieel visiebedreigende oogziekten en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. De conventionele angiografietechnieken, die de binding van fluorescerende kleurstoffen aan plasma-eiwitten omvatten, verschaffen echter geen informatie over de dynamiek van de erythrocyten of leukocyten 1 . De erytrocytische retinale stromingsdynamiek is belangrijk voor het bestuderen van metabolisch efficiënte circulatie in het retina, en de leukocytestroomdynamiek, om de celmigratie, herkenning, adhesie en vernietiging in verschillende ontstekingsomstandigheden te begrijpen 2 . Er zijn verschillende fluorescerende moleculen gebruikt bij de identificatie en karakterisering van verschillende celtypen 3 . De hemodynamica van de bloedcellen kan worden gemeten door ze te kleuren met de juiste fluorenCent kleurstoffen en het toepassen van de juiste beeldvormingstechnieken 4 .

De aanwezigheid van ontstekingsreacties bij intraoculaire ziekten zoals leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en diabetische retinopathie (DR) behelst de accumulatie van lymfocyten in het zieke gebied 5 , 6 . Het bijhouden van de immuuncellen in de weefsels kan helpen bij het begrijpen van de complexe gebeurtenissen die betrokken zijn bij het mechanisme van ziektepatogenese. Radioactieve isotopen zoals 51 Cr en 125 I werden in vroege studies gebruikt als cellracers. Deze kleurstoffen zijn giftig en beïnvloeden de levensvatbaarheid van de cellen. Hoewel de radioactieve markers 3 H en 14 C minder giftig zijn voor de cellen, is het moeilijk om hun signalen in het systeem 7 , 8 te detecteren door hun lagere emissie-energieën. Er werden een aantal fluorochroom-kleurstoffen ingevoerd om de mogelijke problemen die verband houden met w te overwinnenMet radioactieve markers en tracklymfocytemigratie in vitro met behulp van fluorescerende microscopie en flowcytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, die worden gebruikt om lymfocyten in vivo te volgen. Hoechst 33342 bindt aan AT-rijke gebieden in het DNA, is membraan doorlaatbaar, houdt fluorescentiesignalen gedurende 2 - 4 dagen en is bestand tegen slokkend 9 , 10 . De nadelen van Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn de remming van lymfocyt proliferatie 11 en de korte halveringstijd respectievelijk 9 .

Calcein-AM, fluoresceendiacetaat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (en-6) Carboxyfluoresceendiacetaat (CFDA) en 5- (en-6) -carboxyfluoresceendiacetaatacetoxymethylester (CFDA-AM)Zijn de cytoplasmatische fluorescerende kleurstoffen gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FDA, CFDA en CFDA-AM hebben echter lagere retentie in de cellen 9 . BCECF-AM vermindert de proliferatieve respons en beïnvloedt de chemotaxis en superoxideproductie 9 , 12 . Calcein-AM is een fluorescerende kleurstof en bruikbaar voor korte termijn in vivo lymfocytemigratie studies. Het emitert sterke fluorescerende signalen, verstoort de meeste cellulaire functies niet en houdt fluorescente signalen gedurende maximaal 3 dagen 12 , 13 . Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylester (CFDA-SE) zijn covalente koppeling fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FITC vertoont geen effect op de cellevendigheid en heeft een sterkere affiniteit met B-lymfocyten dan T-lymfocyten 14 , 15 9 , 16 in vivo worden gevolgd. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 en PKH26 zijn membraan- Het inbrengen van fluorescerende lipofiele carbocyanine kleurstoffen die gebruikt worden om leukocyten en erythrocyten te labelen. C18 Dil en DiO tonen hogere signalen wanneer ze in het celmembraan worden opgenomen en zijn relatief niet giftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- en PKH26-gemerkte cellen tonen een goede retentie van de fluorescerende signalen met minder toxiciteit 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Echter, PKH2 regelt de CD62L expressie en vermindert de ly Mphocyt levensvatbaarheid 23 .

De meeste bovengenoemde studies zijn uitgevoerd voor het bijhouden van de lymfocytemigratie en proliferatie in de lymfatica en het bestuderen van de geëtiketteerde erythrocyten in de niet-oculaire circulatie. Er zijn zeer weinig studies die de etiketteringstechnieken toepassen om de bloedcellen in de oculaire circulatie te bestuderen. Toepassing van scan-laser-oftalmoprofie (SLO) heeft een groot voordeel bij het bestuderen van de gelabelde cellen in de retinale en choroidale circulatie in vivo door fundus angiography 24 . Er zijn verschillende fluorescerende kleurstoffen, zoals ICG, acridine oranje, FITC, natriumfluoresceïne en CFDA die gebruikt worden om de leukocyten in de retinale circulatie door SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . De fototoxiciteit en carcinogeniciteit van acridine oranje 26 , 27 , de interferentie van FITC met de cellulaire activiteit en de eis van een intravascular contrastmiddel voor de oplossing van de retinale en choroidale bloedvaten beperkt hun toepassing in in vivo dierproeven 29 . Natriumfluoresceïne en ICG zijn niet-toxisch, goedgekeurd door de Food and Drug Administration, en veilig voor het testen op mensen 32 , 35 . De meeste dynamische studies zijn gerelateerd aan de etikettering van de leukocyten of erythrocyten en zijn visualisatie in de retinale en choroidale bloedvaten 36 , 37 , 38 , 39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth, Singapore en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkunde en visie Onderzoek.

1. Etikettering van erytrocyten en leukocyten met fluorescerende kleurstoffen

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid ICG (1,5 mg / ml) door 3 mg ICG op te lossen in 1800 μL gesteriliseerd gedistilleerd water. Voeg 200 μl 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
    2. Bereid 40% 1x PBS door 4 ml 1x PBS toe te voegen aan 6 ml gesteriliseerd gedestilleerd water. Bereid 1% boviene serumalbumine (BSA) in PBS door 100 mg BSA toe te voegen aan 10 ml 1x PBS. Meng goed tot de BSA is opgelost.
  2. Isolatie van erytrocyten en leukocyten onder toepassing van dichtheidsgradiëntcentrifugatie
    1. Verdoof de muizen (wild tyPe C57BL / 6) met behulp van een combinatie van ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) (volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen). Bevestig de verdoving door het terugtrekken van de pedaal ( bijv . De knijp).
    2. Steek de 29-gaalsnaald langzaam in (bij een 1 ml spuit) in een kogelhoek gericht naar het hart. Om te bevestigen dat de naald in het hart zit, trek de plunjer een beetje uit en controleer of bloed in de spuit is opgenomen. Blader 0,8 - 1 ml bloed direct uit het hart.
    3. Zet het bloed onmiddellijk over in een ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) (1,8 mg / ml bloed) met bloedinzamelbuis en meng zachtjes om bloedstolling te voorkomen.
    4. Euthanize de muizen door middel van intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg).
    5. Laag het gehele bloed op een polysucrose- en natriumdiatrizoaatoplossing (1: 1 verhouding: dichtheid 1,077 g / ml) in een 2 ml microcentrifugebuis en centriFuge (450 xg, 30 min) om de scheiding van de leukocyten en erytrocyten uit het plasma mogelijk te maken.
    6. Verwijder en wis de supernatant (plasma) met behulp van een pipet. Zet de buffy coat (leukocyten) en erythrocyten (rode bloedcellaag) zorgvuldig over in nieuwe en afzonderlijke buizen met behulp van pipetten.
  3. ICG (1,5%) etikettering van erythrocyten
    1. Was de erytrocyten met 1x PBS om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resuspendeer de erytrocyten in 1x PBS (1: 1) om 50% hematocrit te maken. Aliquot 0,5 ml 50% hematocrit (~ 250 μL verpakte erythrocyten) in microcentrifugebuizen. Centrifugeer de erytrocyten (750 xg, 5 min) en gooi de supernatant weg.
    2. Voeg 200 μl 40% 1x PBS toe aan de gepelleteerde erythrocyten, meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 100 μL ICG (1,5 mg / ml) toe aan de erytrocyt suspensie, meng zachtjes door de buis om te keren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 300 μl 1x PBS toe en incubeer bij37 ° C in een shaker incubator gedurende 60 minuten.
    3. Centrifugeer de drager erythrocyten (750 xg, 3 min) en resuspendeer in 1 ml 1x PBS.
    4. Was de cellen ~ 3 - 5 keer met 1x PBS totdat de supernatant helder is (stap 1.3.3). Na de laatste was decomponeer de supernatant en voeg 1% BSA PBS (1: 1) toe aan de geëtiketteerde voorgeswelte erythrocyten om een ​​50% hematocrit (1,25 x 10 8 cellen / ml) ICG geëtiketteerde erythrocyten te verkrijgen.
  4. Natrium fluoresceïne (1%) etikettering van leukocyten
    1. Nadat u de buffy coat van het bloed heeft afgescheiden met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie (vanaf stap 1.2.6), wassen de cellen eenmaal met 10 mL 1x PBS door centrifugeren bij 450 xg gedurende 10 minuten om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resulteer de pellet in 900 μl 1x PBS.
    2. Voeg 100 μl 10% natrium fluoresceïne toe aan 900 μl van de leukocytsuspensie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Was de gelabelde cellen driemaal met 10 ml 1X PBS door centrifugiNg (450 x g, 10 min). Resuspendeer de cellen in 100 μl 1x PBS.

2. Live Imaging van Fluorescently Labelled Cells

  1. Live-imaging van ICG genaamd erythrocyten
    1. Om cellen voor injectie via staartvene of retro-orbitale route voor te bereiden, verdunnen de 50% hematocrit van ICG geëtiketteerde erythrocyten 10 keer en 50 keer met 1x PBS om respectievelijk 5% en 1% hematocritcellen te maken.
    2. Plaats de muis onder het infraroodlicht (250W intensiteit) gedurende 5 minuten om de staartvene te vergroten. Verdoof de muis met ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) via intraperitoneale injectie (hier volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen).
    3. Dilate elke pupil van de ogen met een daling van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrine hydrochloride.
    4. Plaats de contactlens op één oog voor beeldvorming. Gebruik oftalmische gel als een medium voor beeldvorming en om droog te voorkomenS van de hoornvlies. Fixeer de camera van de confocal laser scanning ofthalmoscopie (SLO) met een 25-diopterlens om de breking van het muisoog te compenseren.
    5. Plaats de muis op het SLO beeldplatform. Zorg ervoor dat de hoornvlies van de muis recht naar de optische hoofd van de SLO-machine staat.
    6. Schakel de beeldmodule in. Gebruik de bijbehorende beeldmodemsoftware, klik op de knop "Nieuwe patiënt" en voeg de identificatiegegevens van dieren toe, zoals het muisoormerknummer, de geboortedatum, het percentage fluorescerende kleurstof en het gemarkeerde celtype.
      1. Plaats de optische zenuw van het dier in het midden van het beeldscherm door de beeldmodule te manoeuvreren. Gebruik de bijbehorende beeldmateriaal software, klik op de knop 'Acquire' om de infrarood (IR) fundus beelden te maken met de 30 ° of 15 ° hoekweergave instelling. Zorg ervoor dat het midden van het netvlies, de leerling en het optische pad van de laser op elkaar afgestemd zijn om een ​​beste kwaliteitbeeld te verkrijgen.
    7. Neem de ICG fundus video.
      1. Zet het ICG-filter (790 nm) aan, zet de camera in de hoge snelheidsmodus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en stel de ICG-intensiteit op 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Op het bedieningspaneel klikt u op de knop 'Acquire' om de video (basislijnregeling) gedurende 8 minuten bij 8,8 / 15 frames / s te maken.
    8. Laad 100 μL ICG geëtiketteerde erythrocyten in een insulinspuit bevestigd aan een 30 gauge naald.
      1. Voor de injectie via de staartaderweg, steek de naaldschuin in de staartader. Bevestig de intraveneuze toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren.
      2. Voor de injectie via de retro-orbitale route, steek de naald naast het oog in de retro-orbitale ruimtee. Bevestig de retro-orbitale toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren.
    9. Plaats na de injectie de muis en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.6.1) en video met behulp van het ICG filter (zie stap 2.1.7.1). De gelabelde cellen in de retinale circulatie kunnen onmiddellijk na de injectie van de cellen worden weergegeven.
    10. Nadat u de videoramen hebt verworven, verwijdert u .tiff-afbeeldingen van de video-sequenties door het .tiff-formaat te kiezen bij het exporteren van de video met behulp van de SLO-weergavemodussoftware. Sla de bestanden op in een gewenste map.
    11. Verwijder de contactlens, plaats het over het andere oog en voltooi de afbeeldingen zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Plaats na het imago het verdovende dier onder het infraroodlicht (250W) om de lichaamstemperatuur te behouden tot het terugkeert van verdoving. Wanneer het dier volledig is hersteld, plaats de muis terug in de houderkooi.
  2. Live-imaging van 1% natrium fluoresceïne gelabelde leukocyten
    1. Bereid de muis op en stel het instrument op zoals beschreven in paragraaf 2.1.
    2. Plaats de muis en gebruik de IR fundus beelden zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Verkrijg het fluoresceine-angiogram van de muis met behulp van het fluoresceïnefilter (488 nm) met de hoge-snelheidscamera-modus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en fluoresceinintensiteit bij 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Opnemen van de video (basisregeling) op 8,8 / 15 frames / s (zie stap 2.1.7.1).
        OPMERKING: hier zijn meerdere tracks van video's (1 min video's) bij verschillende tijdsintervallen aangeschaft.
    3. Spuit 100 μL gemerkte leukocyten in de muis door de staartvene of retro-orbitale injectie zoals beschreven in paragraaf 2.1.8.
    4. Plaats de muis direct na de injectie en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.5 en 2.1.6) en de fluoRescein angiogram van de muis (zie paragraaf 2.2.2).
    5. Let op de gelabelde cellen in de retina of choroidale bloedvaten door het brandpuntspunt van de aftastlaser aan te passen door de focusknop op de beeldmodule te draaien.
    6. Verkrijg de videolijsten en afbeeldingen met behulp van de SLO-kijkmodulesoftware (zie stap 2.1.10) en sla het op in een gewenste map.
    7. Volg de procedure, volg stap 2.1.12 voor de verzorging van dieren.
  3. Beeldanalyse door MtrackJ software
    1. Open de beeldsequentie in ImageJ door op "File" te klikken. Selecteer 'Import' en kies 'Beeldvolgorde', selecteer de gewenste afbeeldingsmap en klik op 'Openen'. Op het scherm verschijnt een pop-up venster genaamd "Sequence Options". Klik op "Ok"; De beeldsequentie wordt geopend.
    2. Stel het frame interval van de beeldvideo in door op "Afbeelding" te klikken en selecteer "Eigenschappen" voor snelheidsmetingen. Hier is het 8,8 frames / s.
    3. Open de MTrackJ plugin door "Plugins" te selecteren. Selecteer "Tracking" en selecteer dan "MtrackJ". Er moet een menu verschijnen.
    4. Als u de tracking-instellingen wilt aanpassen, selecteert u 'Tracking' (onder menu) en selecteert u het vak 'Verplaats naar de volgende tijdlijstindex na het toevoegen van punt'.
    5. Volg de eerste cel.
      1. Zoek een cel en volg dezelfde cel in de volgende frames. Klik op het menu op 'Toevoegen' om een ​​nieuw nummer toe te voegen.
      2. Schuif de cursor over de afbeelding (+ teken) en klik op de betreffende cel.
        OPMERKING: MTrackJ zal automatisch naar het volgende tijdstip springen en een kleine cirkel toevoegen, waarbij de positie van het eerste punt in het traject wordt gemarkeerd.
      3. Blijf doorgaan met klikken op de huidige positie van de cel terwijl u door de frames van de beeldvolgorde beweegt.
        OPMERKING: soms worden de cirkels die de vorige punten in het traject markeren, de mogelijkheid om de huidige locatie te bekijken, beïnvloed. Als dit gebeurt,Ga verder naar stap 2.3.5.3.1.
        1. Wijzig de weergaveoptie voor het traject door op "Weergeven" in het menu te klikken en selecteer de optie "alleen trackpunten weergeven op de huidige tijd". Om alle trajecten te zien, deselecteer deze optie.
      4. Blijf doorgaan tot het traject van de eerste cel wordt gezien. Sla dan het spoor op door op "Opslaan" te klikken.
    6. Volg de tweede cel.
      1. Klik in het menu op 'Toevoegen' om een ​​nieuw nummer te starten. Herhaal stappen 2.3.5.1 - 2.3.5.4 voor het bijhouden van de nieuwe cel. Klik op "Save" om het tweede spoor op te slaan.
      2. Ga door met deze stappen voor alle waarneembare cellen waargenomen. Nadat u de cellen hebt gevolgd, klikt u op "Meet" en "OK" in het menu tab om de resultaten te krijgen.
        OPMERKING: een resultaatvenster wordt automatisch geopend, die kan worden opgeslagen en geopend in een spreadsheet voor verdere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erythrocyten gemarkeerd met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wild type). Beide 1% en 5% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten waren onderscheiden in de retinale circulatie. De afzonderlijke gemerkte cellen werden echter duidelijker met 1% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten ( Figuur 1 ). In 5% hematocrit, door het grote aantal gelabelde cellen in de retinale vaten, was het niet mogelijk om de individuele cel te markeren. Erythrostase werd onder beide omstandigheden in het peripapillair gebied waargenomen, maar het was meer prominent in de 5% hematocrit van gelabelde erythrocyten ( Figuur 2 ).

Leukocyten werden met succes gemerkt met 1% natrium fluoresceïne volgens het bovenstaande protocol en werden weergegeven als groene gemerkte cellen onder gebruikmaking van de fluorescerende microscopie ( Class = "xfig"> Afbeelding 3). Kleine klompen cellen (4 - 5 cellen samen) werden ook waargenomen in gemerkte monsters. Wanneer de cellen werden geïnjecteerd in de muizencirculatie, werden gemarkeerde leukocyten in de retinale circulatie gesimuleerd ( Figuur 4 ). Na de etikettering werden beide erythrocyten en leukocyten onmiddellijk in de muizen geïnjecteerd en bij 30 en 60 minuten tijdsintervallen gevisualiseerd. Fluorescent gelabelde cellen werden onmiddellijk na de injectie waargenomen, maar de fluorescentie-intensiteiten gingen geleidelijk af bij 30 en 60 minuten tijdsintervallen. We hebben ook het leukocytenvlekprotocol (1% natriumfluoresceïne) op de erytrocyten gebruikt en geen etikettering van de erytrocyten waargenomen. Met behulp van de Mtrack J plugin op de Image J public domain software, werden de cellen gevolgd in de retinale circulatie ( Figuur 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
Figuur 1 : 1% Hematocrit van 1,5% ICG Gemerkte Erythrocyten in de Retinale Cirkulatie. De ICG merkt op individuele erytrocyten die lichte signalen tonen in de retinale vaten. Erythrostase werd in het peripapillair gebied waargenomen. Schaal = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : 5% Hematocrit van 1,5% ICG Gemerkte Erythrocyten in Retinale Circulatie. Veel ICG genaamd erythrocyten die lichte signalen in de retinale vaten tonen; Een grote hoeveelheid erytrostase werd waargenomen in het peripapillair gebied. Schaal = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 : Fluorescentie Microscopie Afbeelding van 1% Natrium Fluoresceine Gemerkte Leukocyten. Natriumfluoresceine gemarkeerde leukocyten die groene fluorescerende signalen met kleine klompen weergeven (20X vergroting; schaal = 50 μm). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 : 1% Natrium Fluoresceine Gemerkte Leukocyten In Retinale Circulatie. Natriumfluoresceine gemarkeerde leukocyten (pijl) die een helder signaal in de retinale vaten tonen. Schaal = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5 : Tracking van gelabelde individuele cellen in retinale circulatie met behulp van beeldanalysesoftware. Verschillende tracks (gekleurde cirkels en lijnen zoals weergegeven op de afbeelding) werden gemeten om de gemiddelde snelheid van de gemerkte cellen in de retinale circulatie te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het bestuderen van de hemodynamica in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van veel oogziekten. De bloedstroomdynamiek in de retinale circulatie kan worden bestudeerd door Fourier-domeine optische coherentie-tomografie (FD-OCT), laserspotflowgrafie (LSFG) en retinale oximetrie. Hoewel deze methoden verschillende benaderingen gebruiken om de totale bloedstroom in de retinale circulatie 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 te bestuderen, delen ze de beperking van het onvermogen om de stromingsdynamiek van individuele celsoorten te bestuderen. De voedingsstoffen en zuurstoftoevoer naar de retinale en choroidale weefsels, evenals de migratie van immuuncellen bij oculaire ontstekingsziekten en hun rol bij de ziektepatogenese, kunnen worden bestudeerd door de stromingsdynamiek van er te onderzoekenYthrocyten en leukocyten in respectievelijk retinale en choroidale circulatie. Etiketteringstechnieken gekoppeld aan beeldvormingsmethoden helpen bij het bijhouden van de gelabelde cellen in de omloop en om de stromingsdynamiek van de gelabelde cellen te bestuderen. Verschillende fluorescerende kleurstoffen werden succesvol toegepast om de leukocyten en erytrocyten te labelen voor het onderzoeken van hun stromingsdynamiek in de circulatie 3 , 17 , 18 , 19 .

Hierbij rapporteren wij de toepassing van goedgekeurde niet-giftige fluorescerende kleurstoffen, indocyaninegroen en natriumfluoresceïne, voor de etikettering en visualisatie van de erythrocyten en leukocyten in de retinale circulatie. Hoewel natriumfluoresceïne de meest gebruikte kleurstof is voor het bijhouden van de leukocyten 31 , 32 , 33 34 , is het voordeel van gelijktijdig etikettering van erythrocyten en leukocyten met ICG en natrium fluoresceïne respectievelijk efficiënt visualiseren van gelabelde cellen gelijktijdig in het oog van het dier door de filters in de SLO te veranderen. SLO is een niet-invasieve methode van retinale beeldvorming die uitgebreid wordt gebruikt in de studie van pathologische veranderingen in verschillende retinale ziekten bij mensen en dieren. Het kan ook helpen bij het vergelijken van retinale veranderingen als reactie op een bepaalde behandeling 46 .

Om kwaliteitbeelden in de SLO te behalen, moeten de leerlingen volledig worden verwijdd en moet de contactlens worden gebruikt met oftalmische gel om een ​​vochtige hoornvlies te handhaven en cataractvorming te voorkomen. De positie van de ogen en het optische pad van de camera moeten recht zijn om kwaliteit fundus en angiogrambeelden te behalen. Het dier moet diep verdoofd zijn om de beweging tijdens het imago te minimaliseren. Hoewel zowel 1% als 5% hematocrit van 1,5% ICGGeëtiketteerde erythrocyten toonde de visualisatie van fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie, 1% hematocrit was beter geschikt voor het bewaken van de individuele cellen. Fluorescent gelabelde cellen kunnen niet worden weergegeven als het aantal geïnjecteerde leukocyten te laag is. Daarom, om betere resultaten te verkrijgen bij het bewaken van de gemerkte cellen in de retinale circulatie, wordt aanbevolen om leukocyten uit ten minste 4 muizen te verzamelen, met 1% natriumfluoresceïne te labelen en in één muis te injecteren. Hoewel er alternatieve kleurstoffen zijn voor natriumfluoresceïne (Calcein, FITC, DIO, FDA en CFDA met absorptie- / emissie maxima vergelijkbaar met of in de buurt van natriumfluoresceïne), moet de kleurstofretentie en toxiciteit voor oculaire weefsels 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

De beperking van de gerapporteerde techniek is deVervagen van het fluorescerende signaal in circulatie na 60 minuten. Daarom moet de stromingsdynamiek van de gelabelde cellen binnen 60 minuten worden geanalyseerd. Hier, om leukocyten te labelen, werd bloed uit één muis verwijderd, cellen werden geïsoleerd, gemerkt, geïnjecteerd in een andere muis en gesimboliseerd door SLO. In SLO werd echter alleen 0 - 1 cel per frame waargenomen in retinale bloedvaten. Dit kan het gevolg zijn van onvoldoende leukocytencelnummer en daarom raden we aan om bloed van tenminste 3 - 4 muizen te verzamelen om een ​​hoger celnummer per frame te visualiseren. De camera snelheid van 8,8 frames / s werd gebruikt in de studie, maar dit kan worden verhoogd om meer opeenvolgende beelden en video's van de gelabelde cellen te bereiken.

Eerder studies hebben veranderingen in de bloedvloeistofsnelheid gemeld bij de retinale circulatie van diabetische patiënten met verschillende stadia van DR. Clermont et al. Meldde een 33% daling van de retinale bloedstroom bij patiënten met een vroeg stadium van DR 47 en Nguyen etal. Meldde een toename van de retinale bloedstroom bij diabetische patiënten met proliferatieve DR 48 . Een verminderde bloedsnelheid werd ook gerapporteerd te zijn geassocieerd met progressieve glaucoom 49 . In de hiervoor genoemde studies onderzochten de auteurs de volledige bloedstromingssnelheid bij de retinale circulatie. Het bestuderen van de stromingssnelheden van elk celtype kan informatie verschaffen over de cellulaire interacties in verschillende ziekten en in verschillende fasen van de ziekte en kunnen helpen bij prognose. Hier rapporteren we een methode om de erythrocyten en leukocyten met respectievelijk ICG en natriumfluoresceïne te melden en hun visualisatie in de retinale circulatie; Deze methode kan toegepast worden op elk ziekte model voor in vivo studies.

Toekomstig onderzoek kan gebruik maken van onze etiketteringstechnieken met behulp van SLO om de variatie in stromingsdynamiek van de geëtiketteerde erythrocyten en leukocyten onder verschillende behandelingsvoorwaarden te bestuderenIn verschillende stadia van de ziekte. Bovendien kunnen onze methoden de rol van erytrocyten en leukocyten bij ziektefenotypen helpen begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen. Geen financieel of belangenconflict.

Acknowledgements

Het onderzoeksproject werd gefinancierd uit New Investigator grant van de National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Het team wil graag de onderzoeksopleiding ontvangen die aan Dr Agrawal bij het Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) is verstrekt aan de National Medical Research Council (NMRC) overzeese onderzoeksopleiding van november 2012 tot oktober 2014 onder mentorschap van prof. David Shima. Dr. Agrawal verwierf het concept en de vaardigheden om de cellen te labelen en live imaging te produceren in het lab van Dr. Shima. Het team zal bijgevolg het toezicht en de begeleiding tijdens de training van prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh en Dr. Daiju Iwata erkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics