Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

We beschrijven een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van stresskorrelvorming in zoogdiercellen nadat de cellen zijn uitgedaagd met bacteriën en een aantal verschillende stressen. Dit protocol kan toegepast worden om de cellulaire stress granule respons te onderzoeken in een breed scala van gastro-bacteriële interacties.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescente beeldvorming van cellulaire componenten is een effectief instrument om interactie tussen gastheer-pathogeen te onderzoeken. Pathogenen kunnen veel verschillende eigenschappen van geïnfecteerde cellen beïnvloeden, waaronder organische ultrastructuur, cytoskeletale netwerkorganisatie, evenals cellulaire processen zoals Stress Granule (SG) -vorming. De karakterisering van hoe pathogenen gastheerprocessen ondermijnen is een belangrijk en integraal onderdeel van het pathogenese veld. Hoewel variabele fenotypes gemakkelijk zichtbaar zijn, is de nauwkeurige analyse van de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de cellulaire structuren die door pathogeenuitdaging geïnduceerd zijn essentieel voor het definiëren van statistisch significante verschillen tussen experimentele en controle monsters. SG-vorming is een evolutionair geconserveerde stressrespons die leidt tot antivirale reacties en is al lang onderzocht met behulp van virale infecties 1 . SG-vorming heeft ook invloed op signaleringskascades en kan nog andere onbekende conseq hebbenUences 2 . De karakterisering van deze stressrespons op andere pathogenen dan virussen, zoals bacteriële pathogenen, is momenteel een opkomende onderzoeksgebied 3 . Momenteel is de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van SG-vorming nog niet routinematig gebruikt, zelfs in de virale systemen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het induceren en karakteriseren van SG-vorming in niet-geïnfecteerde cellen en in cellen die zijn geïnfecteerd met een cytosolisch bacterieel pathogeen, dat de vorming van SG's beïnvloedt in reactie op verschillende exogene stressen. Analyse van SG-vorming en samenstelling wordt bereikt door gebruik te maken van een aantal verschillende SG markers en de spotdetector plug-in van ICY, een open source beeld analyse tool.

Introduction

Het visualiseren van gastropathogene interacties op cellulaire niveau is een krachtige methode om inzicht te krijgen in pathogene strategieën en voor het identificeren van belangrijke cellulaire pathways. Inderdaad kunnen pathogenen worden gebruikt als instrumenten om belangrijke cellulaire doelen of structuren te bepalen, omdat pathogenen zich hebben ontwikkeld om centrale cellulaire processen te onderdrukken als een strategie voor hun eigen overleving of voortplanting. Visualisatie van cellulaire componenten kan worden bereikt door recombinant fluorescent gelabelde gastheer eiwitten uit te drukken. Terwijl dit een real-time analyse mogelijk maakt, is de opwekking van cellijnen met specifiek gelabelde gastheerproteïnen zeer moeizaam en kan resulteren in ongewenste bijwerkingen. Handiger is de detectie van cellulaire factoren met behulp van specifieke antilichamen, omdat meerdere gastheerfactoren gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en men niet beperkt is tot een bepaald celtype. Een nadeel is dat alleen een statische weergave kan worden vastgelegd, aangezien immunofluorescentie analyse een gastheercelfixaat vereistion. Echter, een belangrijk voordeel van immunofluorescentie beeldvorming is dat het gemakkelijk leent op zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse. Dit kan op zijn beurt gebruikt worden om statistisch significante verschillen te verkrijgen om nieuwe inzichten te geven in gastropathogene interacties.

Fluorescerende beeldanalyseprogramma's zijn krachtige analytische instrumenten voor het uitvoeren van 3D en 4D analyse. Echter, de hoge kosten van software en het onderhoud ervan maken methodes op basis van gratis open source software meer aantrekkelijk. Zorgvuldige beeldanalyse met behulp van bioanalysesoftware is waardevol, aangezien het visuele analyse ondersteunt en bij het toewijzen van statistische betekenis het vertrouwen in de correctheid van een bepaald fenotype vergroot. Voorheen zijn SG's geanalyseerd met behulp van de gratis ImageJ software, die de handmatige identificatie van individuele SG's 4 vereist. Hier leveren we een protocol voor de inductie en analyse van cellulaire SG-vorming in het kader van bacTerreine infecties met behulp van de gratis open source bio-image analyse software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). De bio-image analyse software heeft een ingebouwde spot detector programma dat zeer geschikt is voor SG analyse. Hiermee kunt u het geautomatiseerde detectieproces verfijnen in bepaalde regio's van belangstelling (ROI's). Dit overwint de behoefte aan handmatige analyse van individuele SG's en verwijdert de steekproef.

Veel milieuprestaties veroorzaken de vorming van SG's, die fase-dichte cytosolische, niet-membranale structuren zijn van 0,2 - 5 μm in diameter 5 , 6 . Deze cellulaire respons wordt evolutionair geconserveerd in gisten, planten en zoogdieren en komt voor wanneer de mondiale eiwitvertaling wordt geremd. Het omvat aggregatie van vertaalde translatie-initiatiecomplexen in SG's, die beschouwd worden als houdplaatsen voor translationally-inactieve mRNA's, waardoor selectieve translatie van een subset van cellulaire mRNA's mogelijk is.Bij het verwijderen van de stress ontbinden SG's en de globale percentages van eiwitsynthese hervatten. SG's zijn samengesteld uit translatieverlengingsinitiatiefactoren, eiwitten die betrokken zijn bij RNA-metabolisme, RNA-bindende eiwitten, alsmede steigerproteïnen en factoren die betrokken zijn bij gastensignaalvorming 2 , hoewel de exacte samenstelling kan variëren afhankelijk van de toegepaste stress. Omgevingsfactoren die SG-vorming induceren omvatten onder meer aminozuurhongering, UV-bestraling, warmtechok, osmotische shock, endoplasmatische reticulumspanning, hypoxie en virale infectie 2 , 7 , 8 . Er is veel vooruitgang geboekt om te begrijpen hoe virussen induceren en ook SG-vorming onderdrukken, terwijl nog weinig bekend is over hoe andere pathogenen, zoals bacteriële, schimmel- of protozoa pathogenen, deze cellulaire stressrespons 1 , 7 beïnvloeden.

ShigeLla flexneri is een gram-negatief facultatief cytosolisch pathogeen van mensen en het veroorzakende middel van ernstige diarree of shigellose. Shigellose is een belangrijke publieke gezondheidsbelasting en leidt jaarlijks naar 28.000 sterfgevallen bij kinderen jonger dan 9 jaar. S. flexneri infecteert het colonepithelium en verspreidt cel-naar-cel door de gastheer's cytoskeletale componenten 11 , 12 te kapen. Infectie van het epitheel ondersteunt de replicatie van S. flexneri in het cytosol, maar geïnfecteerde macrofagen sterven door een ontstekingscel-doodsproces genaamd pyroptose. Infectie leidt tot een massale werving van neutrofielen en ernstige ontsteking die gepaard gaan met hitte, oxidatieve stress en weefselvernietiging. Aldus, terwijl geïnfecteerde cellen onderworpen zijn aan interne spanningen geïnduceerd door infectie, zoals Golgi-ontwrichting, genotoxische stress en cytoskeletale omrangS, geïnfecteerde cellen worden ook onderhevig aan milieuprestaties door het ontstekingsproces.

Karakterisering van het effect van S. flexneri- infectie op het vermogen van cellen om te reageren op milieupressen met behulp van een aantal SG markers heeft aangetoond dat infectie leidt tot kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in SG-samenstelling 3 . Er is echter weinig bekend over andere bacteriële pathogenen. Hier beschrijven we een methode voor de infectie van gastheercellen met het cytosolische pathogeen S. flexneri , de stress van cellen met verschillende milieuprestaties, de etikettering van SG componenten en de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van SG-vorming en samenstelling in het kader van besmette En niet-geïnfecteerde cellen. Deze methode is op grote schaal van toepassing op andere bacteriële pathogenen. Daarnaast kan de beeldanalyse van de SG-vorming gebruikt worden voor infecties door virussen of andere pathogenen. Het kan gebruikt worden om SG te analyserenVorming bij infectie of het effect van infectie op SG-vorming in reactie op exogene stressen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van bacteriën en gastheercellen

  1. Breng 12 of 14 mm glazen dekselplaten in respectievelijk 24- of 12-putjesplaten, respectievelijk, met steriele tweezers, en tel een put per experimentele conditie. Steriliseer deze door UV-behandeling in een weefselkweekkap gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Bevat controlebronnen voor bacteriële uitdaging en voor SG-inductie door exogene spanning.
  2. Voor een 24-putjesplaat met 12 mm dekglazen, zaad 1 x 10 5 zoogdiercellen ( bijv. HeLa-cellen) op de dekglazen; Druk de deksels naar beneden met een steriele pipettip. Laat cellen negenhaken bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator in kweekmedium geschikt voor elk celtype.
    OPMERKING: Plaatcellen, zodat de samenloop van cellen tussen de 40 en 60% de volgende dag bedraagt.
    1. Voor HeLa cellen, incuberen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 10% decomplemented foetale kalf serum (FCS).Ontkamp FCS door 30 minuten te verwarmen in een waterbad van 56 ° C, waarna het serum eenmaal na 15 minuten wervelt.
  3. Om bacteriën uit te strekken, gebruik een steriele pipettip om een ​​kleine hoeveelheid van een bacteriële glycerolvoorraad (20% glycerol) in een -80 ° C vriezer te verwijderen en op een gelabelde plaat te plaatsen. Gebruik een steriele lus om de bacteriën over ongeveer 10% van de plaat te verspreiden. Gebruik een nieuwe steriele lus en sleep het door de smeer om 3 parallelle lijnen, een halve plaat lang te maken. Streep door deze lijnen over de rest van de plaat. Incubeer plaat O / N bij 37 ° C.
    1. Selecteer een enkele bacteriële kolonie ( bijv. S. flexneri ) van de versstreepte plaat. Vermijd het werken met bacteriële kolonies ouder dan 1 week.
    2. Voor S. flexneri- stam M90T, een rode kolonie in een 15 ml buis in een proefschotel Soy Agar-0,1% Congo-rode agar in een 8 ml sojabout in Tryptic Soy. Draai de deksel aan en incubeer bij 222 rpm O / N bij 306; C.
      VOORZICHTIG: Gebruik geen grote witte kolonies aangezien ze het virulensplasmide hebben verloren en niet-infectief zijn.

2. Bacteriële uitdaging van gastheercellen

  1. Bereid bacteriën voor om het infectiepotentieel te maximaliseren.
    1. Voor S. flexneri , subcultuurbacteriën door 150 μL O / N kweek toe te voegen aan 8 mL Tryptic Soy Agar en incuberen 222 rpm bij 37 ° C te schudden naar late exponentiële fase (~ 2 uur) om virulentie genuitdrukking te induceren en infectie te verhogen.
      1. Wanneer de cultuur op een optische dichtheid ligt tussen 0,6 en 0,9 (gemeten op 600 nm), overstappen 1 ml kweek in een 1,5 ml buis. Pelletbacteriën gedurende 2 minuten bij 8.000 xg en resuspenderen in infectiemedium (DMEM met NEAA, ontbreekt FCS) bij OD 600 = 1. Als de OD 600 0,85 is, resuspendeert het in 850 μL.
        OPMERKING: Voor S. flexneri, bij OD 600 = 1, zullen er 8 x 10 8 bacteriën per ml zijn wanneerGekweekt in 8 ml medium. Een veelvoud van infectie (MOI) van 20 is passend. Voor andere pathogenen moet het aantal bacteriën per ml bij een OD 600 en de juiste MOI empirisch worden bepaald.
    2. Om bacterie-gastheerinteracties te verbeteren, belmbacteriën met Poly-L-Lysine (PLL).
      OPMERKING: PLL behandeling van S. flexneri had geen invloed op SG dynamics. Andere pathogenen moeten worden beoordeeld op hun geschiktheid voor PLL behandeling.
      1. Om bacteriën te bedekken met PLL, centrifugeer 1 ml bacteriële cultuur gedurende 2 minuten bij 8.000 xg en resusteer dan de pellet in 10 μg / ml PLL in fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) bij een OD 600 = 1.
      2. Voeg de bacteriele oplossing toe aan een kleine schotel, zoals een putje in een 12-putjesplaat, en incubeer bij 10 minuten bij RT (~ 20 ° C) met een zachte agitatie op een plaatschudder.
      3. Pelletbacteriën gedurende 2 minuten bij 8.000 xg, verwijder de overmaat PLL. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS anD herhaal deze wasstap twee keer. Na de laatste was, resuspenderen in infectiemedium bij OD 600 = 1.
        OPMERKING: Hier is het infectiemiddel voor S. flexneri gastheercelmedium met 20 mM HEPES zonder FCS.
  2. Bereid cellen voor bacteriële uitdaging.
    1. Verwijder medium uit zoogdier HeLa-cellen met behulp van een zuigpomp. Voeg 500 μL RT HeLa celmedium toe om de cellen te wassen, wervelen, medium verwijderen met behulp van een zuigpomp, en vervang met 500 μL RT geschikt infectiemiddel ( bijv . Gastheermedium met 20 mM HEPES zonder FCS).
    2. OPMERKING: Voor alle wasstappen, werk snel en verwerk slechts 4 deklips tegelijk om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
  3. Uitdaging voorbereid HeLa cellen met bacteriën om 20 tot 50% van de cellen te infecteren.
    OPMERKING: De juiste tijd en MOI moeten worden vastgesteld voor elke bacterie. Over het algemeen is een goede start 30 minuten bij 37° C met een MOI van 10.
    1. Voor S. flexneri, challenge HeLa cellen cellen met behulp van een van de twee methoden (stap 2.3.1.1 of 2.3.1.2).
      1. Spin-niet-PLL-behandelde bacteriën (20 μl OD 600 = 1 / putje van 24-putjesplaat in 500 μl medium) op 10 minuten bij cellen bij 13000 x g op cellen.
      2. Voeg PLL-gecoate bacteriën (15 μl OD 600 = 1 / putje van 24-putjesplaat in 500 μl medium) gedurende 15 minuten bij RT toe om bacteriën in de cellen te laten zakken.
    2. Laat de infectie plaatsvinden door cellen met gevestigde bacteriën in een 37 ° C weefselkweek incubator te plaatsen gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Voor korte tijdspunten synchroniseert S. flexneri infectie door platen in een waterbad van 37 ° C gedurende 15 minuten in plaats van in de weefselkweek incubator te plaatsen.
  4. Stop infectie door cellen te wassen.
    1. Om cellen te wassen en overtollige bacteriën te verwijderen, verwijder het medium met een zuigpomp, voeg 1 ml toeVers voorverwarmd (37 ° C) HeLa kweekmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Wissel het medium, verwijder en vervang met vers medium. Herhaal twee keer en laat vers medium op de cellen.
      1. Voor S. flexneri , of andere intracellulaire bacteriën, na infectie van HeLa cellen en de was, vervang medium met standaard weefselkweekmedium dat 50 μg / ml gentamicine bevat om extracellulaire bacteriën te doden en verdere celinval te voorkomen.
        OPMERKING: Voeg geen antibiotica toe in het medium voor extracellulaire bacteriën.
  5. Incubeer bacteriën met cellen voor de gewenste hoeveelheid tijd in een weefselkweek incubator.
    OPMERKING: voor S. flexneri kan infectie zo lang als 6 uur zijn, afhankelijk van het celtype. Voor de HeLa-cellen laat de infectie 1,5 tot 2 uur duren voordat exogene spanningen worden toegevoegd om SG-vorming in te leiden. Voor Caco-2 infecties, waarin Shigella cel-naar-cel verspreidt, infecteren gedurende 30 minuten tot 6 uur voordat exogene stress wordt toegevoegd. CeEr kunnen momenteel op dit punt worden gefixeerd zonder exogene spanningen toe te voegen om de vorming van SG's te beoordelen als gevolg van de bacteriële infectie (in dat geval ga verder naar sectie 4).

3. Stimuleren van stressvorming door toevoeging van exogene stressoren

  1. Verwijder het medium van geïnfecteerde en niet geïnfecteerde HeLa-cellen met behulp van een zuigpomp, vervang het medium met 500 μL van het juiste medium met of zonder de stressor en incubeer.
    OPMERKING: Stress-inducerende omstandigheden omvatten het volgende (zie hieronder). Voor aanvullende behandelingen zie Kedersha et al . 13 .
    1. Voor warmtechokbehandeling, gebruik regelmatig medium dat 20 mM HEPES bevat en plaats de plaat gedurende 30 minuten in 44 ° C waterbad.
    2. Voor behandeling met clotrimazol (induceert mitochondriale stress), gebruik regelmatig medium zonder FCS met 20 μM clotrimazol en incubeer in een weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar eenmalig gebruik van 20 mM clotrimazol voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO) bij -20 ° C gedurende maximaal 4 maanden. Gebruik DMSO voertuig voor controlecellen.
    3. Voor arseenit (induceert oxidatieve stress) behandeling, gebruik regelmatig medium met 0,5 μM arseniet en incubeer in weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar eenmalig gebruik van 0,5 mM arsenietvoorraad bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
      VOORZICHTIG: Clotrimazol en arseeniet zijn schadelijk en gevaarlijk voor het milieu en moeten op passende wijze worden verwijderd.
    4. Voor Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -pateamine behandeling (remt eukaryotische vertaling initiatie), gebruik regelmatig medium met 50 - 200 nM DMDA-pateamine en incubeer in weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar DMDA-pateamine bij -80 ° C. Bewaar reagentia als kleine porties om ontdooien te bevriezen.

4. Vaststelling en Immunofluorescentie Analyse van Stress Granule Formation

OPMERKING: verwerk de controle enExperimentele coverlips tegelijkertijd om verschillen te vermijden die de volgende stappen kunnen beïnvloeden in beeldanalyse. De controle monsters omvatten geen infectie met en zonder SG inducerende behandeling, en geïnfecteerde monsters met en zonder SG inducerende behandeling.

  1. Verwijder medium helemaal met behulp van een zuigpomp en maak monsters vast door 0,5 ml RT 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe te voegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    VOORZICHTIG: PFA is schadelijk voor de verwerker en het milieu. Neem de juiste maat om de handler te beschermen en te verwijderen met chemisch afval.
    OPMERKING: Alternatief, fixeer gedurende 15 minuten en vervang vervolgens met -20 ° C voorgekookte methanol gedurende 10 minuten om meer cytoplasmatische lokalisatie van SG markers 13 te behouden.
  2. Verwijder de PFA met een pipet en gooi de vloeistof in een geschikte afvalbak. Was de deklaag met 1 ml Tris-bufferde Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3, 15 mM NaCl). Incubeer de deklaag voor 2 minuten met zacht schuddenOp een platechaker tijdens het wassen.
  3. Verwijder TBS volledig met behulp van een zuigpomp en voeg 10 min. 500 μL 0,3% Triton-X100 toe in TBS gedurende 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.
  4. Verwijder de permeabiliserende oplossing met een zuigpomp. Vervang met 1 ml TBS, draai de plaat zachtjes, verwijder TBS door zuigkracht en voeg 1 mL blokkerende oplossing (5% FCS in TBS) 1 uur bij RT toe.
  5. Bereid de primaire antilichaamoplossing (1: 300 verdunning) in 5% FCS in TBS. Bereken 50 μL per 12 mm deklaag en maak voldoende voor alle deklagen in één partij.
    OPMERKING: De gemeenschappelijke primaire antilichamen die worden gebruikt doel G3BP1, eIF3b en TIA1.
  6. Plaats 50 μL van het primaire antilichamenmengsel op een plastic paraffinefilm (parafilm) die stevig op de bank of de kamer is gelegd.
    OPMERKING: een lijst met kanonieke SG markers is in de Tabel van Materialen verschaft , maar de samenstelling van SG's kan afhangen van de toegepaste stress. Andere SG markers staan ​​vermeld in Kedersha et al. 13 S. flexneri infectie zijn vermeld in Tabel 1 .
  7. Pak de deklap met een pincet op, doe de rand van de deklaag op het weefsel vast, laat de pincet losdraaien om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats het gezicht zachtjes op de druppel. Incubeer deklips gedurende 1,5 uur bij RT of 's nachts bij 4 ° C in een vochtige kamer.
    OPMERKING: Voor het voorbereiden van een vochtige kamer plaatst u voorgevormde weefsels langs de randen van een stevig gesloten kamer, gevoerd met plastic parafilm.
  8. Breng elke deksel met pincet over in een putje van een nieuwe 24-putjesplaat, gevuld met 1 ml TBS; Incubeer met zacht schudden op een plaatschudder gedurende 5 minuten. Zuig de TBS uit in elke put met behulp van een zuigpomp, vervang met 1 mL TBS en plaats 5 minuten op de plate shaker. Herhaal wassen nog een keer.
    OPMERKING: Hergebruik de parafilm door de overtollige vloeistof met een weefsel te verwijderen en het oppervlak met water te wassen. Zorg ervoor dat de paraffine film volledig droog is voor de usinGeef het voor de volgende kleuringstap.
  9. Bereid de secundaire antilichaamoplossing in TBS (verdunning 1: 500-1: 2000) op. Om de kern en bacteriën te vlek, voeg 2 μg / ml DAPI toe aan de mix. Om actin te vlek, voeg fluorescerende phalloidin toe. Pipet 50 μL secundair antilichaam mengen op de plastic paraffine film.
    OPMERKING: Het gebruik van hooggezuiverde, cross-absorberende ezel secundaire antilichamen wordt aanbevolen voor co-lokalisatie studies van verschillende SG markers wanneer G3BP1 (geit antilichaam) wordt gebruikt. Kies fluorescente gelabelde secundaire antilichamen met niet-overlappende spectra. EIF3b vlekt het cytoplasma van cellen duidelijk en is daarom een ​​goede marker om cellen af ​​te geven. De actin-vlek helpt verder om cellen op cel-naar-cel contactpunten en gebieden van bacteriële toegang af te leiden.
  10. Pak de deklap met een pincet op, doe de rand van de deklap op het weefsel, laat de pincet vrij, om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats de deksel voorzichtig naar beneden op de druppel en incubeer de dekglazenIn het donker gedurende 1 uur bij RT.
  11. Gebruik tweezers om de deklaag terug te plaatsen in de 24-putjesplaten, gevuld met vers 1 ml PBS. Zorg ervoor dat de deklaag volledig door de PBS is bedekt. Was de cellen 3x met een zachte shake gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Houd de plaat tijdens de was onder een deksel om van licht te beschermen, aangezien de fluoroforen van het secundaire antilichaam lichtgevoelig zijn.
  12. Dompel de deklaag in gedeïoniseerd water kort om het zout te verwijderen, droog uit de rand drogen op een weefsel en bevestig de deklaag op 5 μL fluorescentiemonteringsmedium op een glazen glijbaan. Verzegel de deklip voor afbeeldingen met nagellak. Houd glijbanen bij 4 ° C voor de korte termijn (week) of bij -20 ° C voor langdurige (maand) opslag.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen bij verzegeling, omdat dit de beeldkwaliteit zal schaden.

5. Fluorescentie Imaging

OPMERKING: Raadpleeg de gebruikershandleiding van de microscoop om de opstelling te optimaliseren.

  1. Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop met behulp van een 40 of 63X olie onderdompelingslens. Selecteer de gewenste fluorescentiekanalen voor het maken van beelden. Wanneer u meerdere fluorescerende kanalen gebruikt, selecteert u de sequentiële acquisitie modus.
    OPMERKING: Begin met de experimentele monsters waar SG's zijn geïnduceerd, het sterkst om overexposure op volgende monsters te vermijden. Zorg ervoor dat u niet overbelichte SG's heeft over de gehele diepte van de cel.
    1. Stel een bitgrootte van 12 of hoger in de microscoopinstellingen om de nauwkeurigheid van de beeldanalyse te waarborgen.
    2. Stel de beeldstapels in om de hele diepte van de cel te dekken. Controleer in de verschillende kanalen en voor verschillende SG markeringen om ervoor te zorgen dat het gehele assortiment is opgenomen. Stel het begin van de stapel aan de basis van de cellen en de bovenkant van de stapels op de hoogte bovenaan de cellen waar niet meer SG-markers worden waargenomen.
    3. Verkrijg de stapel. Houd de stapelhoogte hetzelfde voor alle beelden.
      OPMERKING: nietVerander acquisitie instellingen tussen controle en experimentele monsters die zullen worden gebruikt voor de volgende vergelijking.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Hier wordt SG-analyse op ingevouwen stapels met behulp van freeware ICY beschreven. Beeldanalyse van 3D-reconstructies kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere gespecialiseerde software. SG detectie kan worden uitgevoerd via een volledig geautomatiseerde workflow die is ingesteld voor dit protocol (beschikbaar op http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Om dit protocol te gebruiken, moeten de kernen worden gekleurd met een DNA-vlek voor de software om het middelpunt van elke cel te vinden, en de celranden moeten worden gemarkeerd door een cytoplasmatische marker (zoals eIF3b) of actinvlek voor de software De celgrenzen identificeren. De automatische workflow kan gebruikt worden om manueel afgeleide resultaten te valideren of direct voor analyse wanneer celgrenzen gedetecteerd zijn met een hoog vertrouwen, wat moStly hangt af van de dichtheid van cellen en de marker die gebruikt wordt om de celgrenzen te detecteren.

  1. Gebruik ImageJ of Fiji, installeer de beeldstapels (Image> Stacks> Z projection) en sla deze op als .tiff-bestanden.
    OPMERKING: maak een nieuwe map voor elke afbeelding, aangezien de beeldanalysesoftware haar resultaten koppelt aan de site van het originele beeld.
  2. Plaats een controle en experimentele .tiff afbeelding op het beeldanalyse platform (File> Open). Ga naar het Sequence venster. Blader naar beneden in de "Lookup Table" naar de kanaalparameters.
  3. Deactiveren van alle kanalen door op het selectievakje van alle kanaal tabbladen te klikken. Klik op kanaal 0 en selecteer de gewenste kleur door op de kleurbalk hierboven te klikken. Verhoog de intensiteit van het kanaal als nodig om alle structuren te zien door te klikken en de lijn in het intensiteitsveld te verplaatsen. Herhaal dit voor alle kanalen.
    OPMERKING: Schakel de kanalen uit die niet voor een bepaalde taak nodig zijn om de vooroordeel in de analyse te minimaliseren.
  4. RolUp en binnen het tabblad Canvas, zoom in op ongeveer 10 cellen per veld door het zoombalk aan te passen.
  5. Gebruik de polygonfunctionele gereedschappen (in de bovenste balk) om de celgrenzen van cellen in de afbeelding te definiëren. Gebruik de actinvlek of een cytosolische marker voor celgrensafbakening ( bijv. EIF3b).
    1. Klik op de polygoonfunctie in de "File & ROI" -gereedschappen. Start afbakening door op de cel te klikken en breid de lijn uit door ankers te maken door herhaaldelijk op de celgrens te klikken. Om een ​​ROI te voltooien, klik je nogmaals op de polygoonfunctie in de "File & ROI" tools.
      OPMERKING: Identificeer de subpopulaties van de afgebroken cellen die geïnfecteerd zijn. Het monster bestaat uit een mix van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. Om bacteriën te identificeren, gebruik dan ook de DAPI-vlek of fluorescerende bacteriën (zoals GFP-expressieve bacteriën). Verhoog de intensiteit om ervoor te zorgen dat alle bacteriën worden gezien.
    2. Om een ​​ROI te noemen, ga naar het ROI-venster rechts en cliCk op de cel van belang in de afbeelding. Dit zal de overeenkomstige ROI op het ROI tabblad markeren. Dubbelklik op de ROI-naam en wijzig de naam ( bijvoorbeeld geïnfecteerde cel # 1).
      OPMERKING: als één afbeelding wordt gebruikt om zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde cellen te analyseren, is het gemakkelijker om de afbeelding op te slaan in twee afzonderlijke mappen en de afzonderlijke en niet-geïnfecteerde cellen afzonderlijk te definiëren, waardoor twee verschillende spreadsheets worden gegenereerd later.
  6. Open de spotdetector toepassing binnen het tabblad 'Detectie en Tracking' (bovenste balk). Op het tabblad Invoer wordt het huidige beeld geselecteerd. Verander niets. Selecteer in het tabblad Voorverwerking het kanaal dat moet worden geanalyseerd.
    OPMERKING: Alleen één kanaal kan op elk gewenst moment worden geanalyseerd. Een batchanalyse kan hier geselecteerd worden als men de volledig geautomatiseerde analysesekvens gebruikt waarvan de parameters zijn gecontroleerd om bevredigende resultaten te geven.
    1. In het tabblad Detector selecteerde u 'DeSelecteer de juiste schaal en gevoeligheid. Doe dit door het testen van verschillende instellingen en cross-checking spot detectie in zowel de controle als de experimentele monsters.
      OPMERKING: Voor een beeld met een resolutie van 2.048 x 2.048 en een pixelgrootte van 0,12 μm 2 is een niveau 2 drempel met een gevoeligheid van 25 tot 100 meestal geschikt, maar elke SG-markering moet empirisch getest worden. Plaats spotdetectie zodanig dat in het niet behandelde controle monster niet spots worden gedetecteerd, terwijl in de experimentele steekproef met SG's alle kleine en grote SG's worden geteld.
    2. Selecteer in het tabblad ROI de voorgestelde ROI From Sequence. Selecteer in het tabblad Filtrering geen filteren. Kies in het tabblad Uitvoer de juiste uitvoer.
      OPMERKING: Het kiezen van een specifiek bestand inschakelen is handig om verschillende detectiecondities of verschillende kanalen op te slaan. Als u selecteert om het binaire beeld en het originele beeld te exporteren met ROI's en detectie, is het helPful voor kwaliteitscontrole analyse.
    3. Selecteer 'Verwijder vorige spots die als ROI's zijn weergegeven'. Kies de map om het bestand op te slaan door op de knop "No File selected" te klikken. Selecteer in het tabblad Weergave de gewenste opties. Klik op "Start detectie".
      OPMERKING: er wordt een map met de naam en de gekozen locatie gemaakt die de uitgevoerde beeldopties bevat. Deze afbeeldingen worden overschreven voor elke nieuwe geteste conditie. Om de afbeeldingen te behouden, doe de naam van de map opnieuw, zodat er een nieuwe map wordt gemaakt of de beelden van de save-map naar een nieuwe map overbrengen. Voor de kwaliteitscontrole van de afbeeldingen is het handig om display detectie markering, aantal detectie van ROI en ROI nummer en naam te selecteren.
  7. Consolideer en bewaar de gegevens voor de verschillende parameters met behulp van de gegenereerde spreadsheet voor elke geteste afbeelding of conditie.
    OPMERKING: De parameters om te analyseren omvatten het aantal SG's per ROI, de SG oppervlakten en de SG maxImum, gemiddelde en minimum intensiteiten.
  8. De gegevens overbrengen en analyseren met behulp van een analyseprogramma dat in staat is om de statistische betekenis te analyseren, te plannen en te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om het protocol beschreven in dit manuscript uit te leggen en te demonstreren, gekenmerkt we het beeld van clotrimazole geïnduceerde SG's in HeLa cellen die geïnfecteerd zijn of niet met het cytosolische pathogeen S. flexneri . Een overzicht van de procedure wordt weergegeven in Figuur 1 , en bevat virulente en avirulente S. flexneri gestreept op Congo Rode Platen, bacteriebereiding, infectie, toevoeging van milieustress, monsterfixatie en -kleuring, monsterbeelden en kwantificering, evenals beeldanalyse . Een aantal verschillende spanningen kunnen worden gebruikt om SG-vorming induceren en een aantal SG-markers zijn beschikbaar voor ondervraging. EIF3b is een kanonieke SG marker die ook het cytoplasmatische compartiment van de cel duidelijk vlekt en kan worden gebruikt om celranden te identificeren. G3BP1 is een veelgebruikte SG-markering die in SG's aggregateert zonder achtergrondkleuren ( Figuur 2 A, B D ). Cellen worden het best weergegeven met een confocale microscoop, en de stapels die de hele celdiepte bedekken, worden geladen op de beeldanalyse freeware ICY ( Figuur 2 A-C ). Om de geïnfecteerde cellen beter te identificeren en cellen in de geïnfecteerde of niet geïnfecteerde groep te zetten voor latere analyse, is het handig om de intensiteit van de nucleïnezuurvlek te verhogen ( Figuur 2 D ). Binnen de beeldanalysesoftware wordt de spotdetector gebruikt om SG's te identificeren binnen elk van de aangewezen ROI's ( Figuur 2 E ) en wordt een binaire afbeelding gegenereerd die alle geïdentificeerde SG's toont ( Figuur 2 F ).

SG analyse moet worden afgestemd op elke geanalyseerde SG markering en de juiste instelling voor analyse moet zorgvuldig gekozen worden. Focus op de SG maRker G3BP1, het veranderen van de vereiste grootte van de plaats die wordt gedetecteerd of de gevoeligheid van de detectieparameters verandert, zal leiden tot verschillende resultaten, zoals getoond in figuur 3 A-C . De schaal selectie (1 - 3, hoewel weegschalen kunnen worden toegevoegd) is gebaseerd op pixelgrootte en dus bij hogere weegschalen, kleinere SG's worden niet geteld en de aantallen SG's zullen afnemen ( Figuur 3C). Gevoeligheid wordt gemeten van 1 tot 100, waarbij 100 de meest gevoelige zijn. Door de gevoeligheid te verhogen neemt het aantal gedetecteerde SG's toe ( Figuur 3 C ). Zo moeten de juiste instellingen worden gevonden om valse positieven en valse negatieven te minimaliseren. Dit wordt het best gedaan door de visuals die voor elke instelling worden verkregen, zorgvuldig te analyseren. Voor G3BP1 leverde een schaal van 2 met een gevoeligheid van 100 (2 - 100, gemarkeerd in rood) het beste resultaat. Een schaal van 2 met een lagere gevoeligheid (50 of 25) is kleinSG's uncounted (zie oranje pijlen). Op dezelfde manier is een schaal van 3 links kleine SG onverkorte terwijl een schaal van 1 oversampled is. Belangrijk, extra schalen kunnen worden toegevoegd om alleen te richten op grote SG's, als dit gerechtvaardigd is. Voor eIF3b leverde een schaal van 2 met een gevoeligheid van 55 (2 - 55) het beste resultaat voor eIF3b (rood gemarkeerd), hoewel rode pijlen respectievelijk onder of oversampling markeren in een schaal van 2 - 50 en 2 - 55 respectievelijk.

Zodra de parameters voor SG analyse correct zijn ingesteld, kunnen de gegevens op vele manieren worden geanalyseerd ( Figuur 4 ). De spotdetector geeft het aantal SG's waargenomen binnen elke ROI, zodat de niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen kunnen worden vergeleken ( Figuur 4 A ). Op dezelfde manier wordt de grootte, in dit geval aantal pixels, gegeven waaruit het oppervlak kan worden berekend ( Figuur 4 B ). Frequentieverdeling plOts zijn ook handig om verschuivingen in de grootte van de SG's in verschillende celpopulaties te markeren. Hier wordt een volledige afwezigheid van grote SG's in S. flexneri- geïnfecteerde cellen, evenals een duidelijke verschuiving in de verdeling duidelijker ( Figuur 4 C ). Daarnaast geeft de intensiteit (hier de minimale en maximale intensiteit) informatie over de kwaliteit van de geanalyseerde SG's. Voor S. flexneri- geïnfecteerde cellen zijn SG's significant minder intens. Deze analyses geven statistisch relevante informatie over zowel de kwalitatieve als kwantitatieve aard van SG's die worden gevormd als reactie op exogene stress wanneer cellen geïnfecteerd zijn met of zonder S. flexneri .

Figuur 1
Figuur 1 : Overzicht van de experimentele procedure om cellen te infecteren met S. Flexneri enHet effect van de infectie-SG-vorming analyseren Een Congo-rode kolonie, en een non-virulent Congo-rode-negatieve kolonie, worden gepoogd en gegroeid O / N in tryptische sojabothouillon. De nachtcultuur wordt subcultured tot de late exponentiële fase voordat bacteriën met PLL zijn bekleed om adhesie te bevorderen. Hostcellen die op glazen dekglazen worden gegroeid in platen met 12 putjes worden 30 minuten geïnfecteerd met bacteriën. Controlecellen zijn niet geïnfecteerd. Cellen worden gewassen en behandeld met spanningsinducerende middelen om SG-vorming te induceren, hetzij door het medium te vervangen door spanningsbevattend medium of het onderwerpen van de cellen aan spanningsomstandigheden, zoals warmte. Cellen worden vervolgens gefixeerd, geventileerd met immunofluorescente SG-specifieke markers en afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Z-projecties worden gemaakt met behulp van ImageJ en geanalyseerd met behulp van de spotdetector van de beeldanalysesoftware. De gegevens worden dan geanalyseerd. Klik hier om een ​​grotere afbeelding te bekijkenVersie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2 : Spotdetectoranalyse van HeLa-cellen geïnfecteerd met S. Flexneri gedurende 1,5 uur voor de toevoeging van Clotrimazole gedurende 1 uur. A. Immunofluorescente afbeelding van een z-projectie met cellen die gekleurd zijn met de SG-markers eIF3b en G3BP1, DAPI en actine. B. Hetzelfde beeld als in (A) maar zonder de actinvlek om het gebruik van eIF3b te markeren om celgrenzen te definiëren. C. Schermafbeelding van de beeldanalysesoftware met de spotdetector module. D. Gating van de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen zoals gezien met behulp van verschillende kanalen. Om alle bacteriën te zien, wordt de intensiteit verhoogd. Cellen met meer dan 1 bacterie aanwezig in de cel zijn gemarkeerd met een rode ster. E. Output van de spot detecAnalyse van individuele ROI's, met vermelding van de ROI-naam, het aantal plekken en hun locatie. F. Afbeelding van spots gedetecteerd in de ROIs. Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 : Vergelijkingen van verschillende schaal- en gevoeligheidsinstellingen van spotdetector voor het detecteren van SG's via verschillende SG markers. A. Inzoomen naar HeLa-cellen die zijn geïnfecteerd of niet met S. flexneri en gekleurd met DAPI en de SG-marker G3BP1, en geanalyseerd op verschillende weegschalen (pixelgrootte afgesneden, 1 - 3) en gevoeligheid (1 - 100). Grafische weergave van SG-nummers in ongeïnfecteerde en geïnfecteerde cellen die op verschillende schalen worden geanalyseerd ( > B) en gevoeligheid ( C ). Visuals ( D ) en grafische weergave ( E ) van SG-nummerdetectie van de SG-markering eIF3b voor hetzelfde beeld bij het wijzigen van de gevoeligheidsgrens zonder de afmeting van de grootte van de stip te wijzigen. Rood schrijven en rode symbolen geven de beste parameters aan. Rode pijlen wijzen op valse positieven en oranje pijlen tot een gebrek aan SG detectie. Waarden omvatten gemiddelde met standaardafwijking. De beste resultaten worden in rood gemarkeerd. Geselecteerde statistische analyse is voor de duidelijkheid opgenomen met behulp van de Wilcoxon rank sum test p-waarden aan de linkerkant en de variant F-toets rechts. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = niet significant. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figuur 4 : Analyse van spotdetector Gegenereerde SG data verkregen uit Clotrimazole-behandelde HeLa-cellen geïnfecteerd met S. Flexneri . A. Aantal G3BP1 SG's per cel in geïnfecteerde en ongeïnfecteerde HeLa cellen. B. Oppervlakte van G3BP1-SG's in geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen, en hun percentage verdeling frequentie ( C ). D. Minimum en maximum intensiteitswaarden (willekeurig) van G3BP1-SGs. Waarden omvatten gemeen met standaardfout. Geselecteerde statistische analyse is voor de duidelijkheid opgenomen met behulp van de Wilcoxon rank sum test p-waarden aan de linkerkant en de variant F-toets rechts. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = niet significant. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie, lokalisatie en analyse van SG's in niet geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met het cytosolische pathogeen S. flexneri in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene stress. Met behulp van gratis beeldvormingssoftware kunnen de protocollen de precieze kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de SG-vorming identificeren en statistisch adresseren van verschillen in gegeven fenotypen.

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol voor de infectie, SG-inductie en beeldvormende onderdelen. Voor de infectie is het belangrijk dat de bacteriële interactie met gastheercellen, zoals invasie zoals hierin beschreven protocol, zoveel mogelijk gesynchroniseerd wordt. Dit is vooral belangrijk bij het vroegtijdig onderzoeken naar de effecten van bacteriële uitdaging tijdens het infectieproces. We hebben eerder aangetoond dat sommige fenotypes, zoals eIF3b lokalisatie na S. flexneri- infectie vroegtijdig verstoord raken tijdens wildtypeS. flexneri- uitdaging terwijl andere fenotypes, zoals aggregatie van G3BP1-bevattende SG's, meer aangetast worden op latere tijdspunten 3 . Dus, om het temporale effect van de bacteriële uitdaging precies te omschrijven, is de synchronisatie van de infectie aan te bevelen. Met name om de SG-vorming te analyseren, zouden cellen in de exponentiële groeifase moeten zijn en dus is de celdichtheid bij de toevoeging van stress ook een belangrijke parameter. Het beperkt ook SG analyse naar niet-confluente celinfectie modellen. Een ander kritisch aspect is de co-verwerking van controle- en experimentele monsters tijdens zowel de verwerking van de monsters voor beeldvorming als tijdens beeldverwerving. Voor immunofluorescente verwerking moeten alle monsters met dezelfde werkwijzen van hetzelfde antilichaam worden gelakt gedurende dezelfde tijd en onder dezelfde omstandigheden ( bijv. RT Vs. 4 ° C), terwijl u ook zorgt voor het behandelen van elke deklaag in de wasfasen en Montage oF de dekglazen. Dit zorgt voor vergelijkbare immunofluorescerende vlekken die zowel kwalitatief als kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Verschillen in het montagemedium kunnen significante effecten hebben op het bleken van de monsters tijdens de beeldverzameling en moet daarom constant gehouden worden. Op dezelfde wijze moet beeldverzameling voor alle monsters die in de analyse worden vergeleken, worden uitgevoerd binnen één zitting en met dezelfde instellingen om de verschillen te voorkomen die voortvloeien uit lasersterkte of monsteropstelling.

Bij het gebruik van exogene spanningen is het belangrijk om het reagens goed op te slaan en vaak nieuwe werkvoorraden te maken. Uitgebreide perioden (> 4 maanden voor clotrimazol bijvoorbeeld) leiden tot verminderde sterkte van het geneesmiddel en beïnvloeden SG-vorming. Reagentia moeten onmiddellijk worden toegevoegd aan kweekmedium voor toevoeging aan de cellen; Indien een vermindering van de SG-vorming in controlecellen wordt waargenomen of de aggregatie van SG's afwijkend blijkt, moeten reagentia worden getest op hun acTiviteit en nieuwe voorraden moeten worden gemaakt.

Een beperking is dat SG-identificatie met behulp van spotdetector minder betrouwbaar wordt als er te veel achtergrondfluorescentie aanwezig is. Hoewel dit geen probleem is voor veel SG markers, zijn sommige, zoals eIF3b, die een duidelijke cytosolische marker onder zowel SG-inducerende als niet-inductieve omstandigheden zijn, moeilijker te analyseren, zoals aangetoond in Figuur 3 . Daarnaast moeten weegschaal en gevoeligheid empirisch bepaald worden voor elke SG-markering. Een andere beperking is dat de analyse via de beeldanalysesoftware het beste is bij 2D-beelden, en werkt daarom goed op optische plakjes of inklapbare stapels, wat echter tot een verlies van 3D-informatie leidt. De analyse op z-projecties heeft derhalve de neiging om de grootte van SG's te overschatten en het aantal SG's te onderschatten. 3D analyse van SG's kan met Imaris worden uitgevoerd om een ​​nog nauwkeuriger ruimtelijke karakterisering te geven, indien nodig geacht voor een bepaald fenotype. SG karakterisering kan snel en op een gestandaardiseerde manier worden uitgevoerd met behulp van de geautomatiseerde spotdetector van de beeldanalysesoftware. In tegenstelling hiermee, handmatige methoden voor het identificeren en afscheiden van SG's zoals eerder uitgevoerd 4 , laat de analyse open voor meer vooroordeel en is aanzienlijk tijdrovend. SG-analyse met behulp van spotdetector kan ook worden aangepast om kleine SG-aggregaten te omvatten of uit te sluiten door verschillende gevoeligheids- en afmetingsdrempels te selecteren, waardoor flexibiliteit in het evalueren van verschillende aspecten van SG-vorming mogelijk is. SG analyse kan ook op een volledig geautomatiseerde manier worden uitgevoerd met behulp van een gevestigde geautomatiseerde workflow 3 . Binnen deze workflow wordt het middelpunt van de cel geïdentificeerd via een DAPI-vlek en het programma laat dan een smeebare bol groeien naar buiten om de celgrenzen te definiëren, gebaseerd op ofwel een cytoplasmatische vlek (zoals eIF3b) of actine. Tegelijkertijd, met behulp van een semi-geautomatiseerde analyse doorHandmatig afleiden van individuele cellen voor analyse, kan voordelig zijn als cellen in clusters groeien en celgrenzen zijn moeilijk voor het geautomatiseerde programma om duidelijk te definiëren. In deze omstandigheden kan het definiëren van celgrenzen handmatig onjuiste positieve of negatieve waarden elimineren.

Het protocol kan aangepast worden aan andere SG-inducerende omstandigheden en andere pathogenen, waaronder virussen, bacteriën, gist en protozoanen. Van bijzonder belang kunnen andere cytosolische pathogenen zijn zoals Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei en Listeria spp. Voor elk besmettelijk middel, en mogelijk ook verschillende cellijnen, moet het infectieprotocol aangepast worden en de steekproeftijden van exogene stressen worden empirisch bepaald. Daarnaast kan SG karakterisering met behulp van beeldanalysesoftware ook in de toekomst uitgebreid worden naar live-celbeelden. Real-time SG analyse zou nodig zijnDe expressie van één of meer fluorescently gemerkte SG markers in de gastheercellen ijveren, maar daardoor zouden vragen over de temporele en speciale dynamiek van SG-vorming kunnen worden aangepakt onder verschillende experimentele omstandigheden. Fluorescente-gemarkeerde bacteriën zouden dan nodig zijn om de real-time SG analyse in geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen aan te vullen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

PS is een ontvanger van de Bill en Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV werd ondersteund door een Zwitserse National Science Foundation Early Postdoc Mobiliteitsgemeenschap en een postdoctorale gemeenschap Roux-Cantarini. PJS wordt ondersteund door een HHMI-subsidie ​​en ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat  Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat  Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat  Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat  Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS) Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Life Technologies 11140 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application - data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application - data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436, (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18, (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315, (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33, (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12, (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298, (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8, (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14, (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7, (5), 333-340 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics