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Summary

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。

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Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kühn, J. P., Frank, M., Steinhoff, G., David, R. Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (123), e55567, doi:10.3791/55567 (2017).

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Abstract

現在までに、心血管疾患(CVD)のために利用できる外科および薬理学的治療は限られており、多くの場合、姑息されています。同時に、遺伝子や細胞療法は、CVD処理のための非常に有望な代替的なアプローチです。しかし、遺伝子治療の広範な臨床応用を大幅に適当な遺伝子送達系の欠如によって制限されます。適切な遺伝子送達ベクターの開発は、細胞療法における現在の課題に対する解決策を提供することができます。特に、このような負傷者の臓器における限ら効率と低い細胞保持などの既存の欠点は、移植前に、適切な細胞工学( すなわち、遺伝)によって克服することができます。提示プロトコルは、ポリエチレンイミン超常磁性ナノ粒子(PEI / MNP)に基づく送達ベクターを使用して、内皮細胞の効率的かつ安全な過渡変形を記載しています。また、セルの特性評価のためのアルゴリズムおよび方法が定義されています。成功intracelluヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)へのマイクロRNA(MIR)のLAR送達は、細胞生存率、機能、または細胞間通信に影響を与えることなく達成されました。また、このアプローチは、導入された外因性のmiRに強い機能的な効果を引き起こすことが証明されました。重要なことに、このMNPベースのベクターの適用は、磁気ターゲットと非侵襲的MRIトレースの可能性を伴って、細胞磁化を確実にします。これは、MRIで非侵襲的に監視することができる磁気誘導、遺伝的に操作された細胞治療のための基礎を提供することができます。

Introduction

遺伝子や細胞治療は、CVD処理における現在の課題を解決する可能性を持っている強力なツールです。これらのアプローチの両方が、現在臨床試験で検証されているという事実にもかかわらず、彼らはまだ広い臨床応用1のための準備ができていません。特に、遺伝子や細胞治療の課題に取り組むための一般的なアプローチは、臨床応用に適した多機能の遺伝子送達ベクターを開発することです。安全かつ効率的な遺伝子送達システムの欠如は遺伝子治療の主要な関心事です。同時に、移植前に細胞産物の遺伝子工学は、 例えば、心臓の分野では、機能改善のわずか約5%がポスト幹細胞移植1を達成している(例えば、低効率として、細胞治療の深刻な課題を克服することができ時間Poに数分以内に10% - )と損傷部位での貧弱な保持/移植は( すなわち、細胞保持は5を下回りますST-アプリケーションにかかわらず、投与経路2、3、4)。

現在までに、ウイルスベクターは大きく、臨床試験におけるそれらの広い応用をもたらした効率の点で、非ウイルス系(〜67%)5上回ります。しかし、ウイルスビヒクルは、免疫原性などの重大なリスク(およびその後の炎症性の重篤な合併症を伴う応答、)、発癌性、および実施遺伝物質6の大きさに制限を運びます。これらの安全性の問題およびウイルスベクターの生産の高コストのため、非ウイルス系の使用は、特定のケース7,8で好ましいです。このような(CVD処理用など)血管新生を制御する成長因子の発現のような一過性の遺伝的補正を必要とする障害、又はdeliveに特に適していますワクチンのRY。

我々のグループでは、送達システムは、分枝25-kDaのポリエチレンイミン(PEI)及びビオチン-ストレプトアビジン相互作用9によって一緒に結合された超常磁性酸化鉄ナノ粒子(MNP)を組み合わせることにより設計しました。このベクターは、移植前に彼らの同時磁化を考慮して、細胞の遺伝子工学のための潜在的なツールです。後者は、高度な磁気ターゲティング技術が成功10を開発されているように、最近特に有望である磁気誘導/維持のための基礎を提供します。また、得られた磁気応答性細胞は、非侵襲的磁気共鳴画像法(MRI)または磁性粒子イメージング11,12によって監視される可能性を有しています。

PEI / MNPベクターの場合には、ポリアミンは、核酸縮合従って因子を分解からの保護を確実にします sの、細胞内でのベクターの内在、およびエンドソーム脱出5。 MNPは、磁気誘導の観点からだけでなく、公知のPEIの毒性7、13、14還元することによってだけでなく、PEIの特性を補完します。以前に、PEI / MNPベクトル特性は、線維芽細胞およびヒト間葉系幹細胞15、16用いて送達効率( すなわち、のpDNAおよびmiRNA)及び安全性の点で調整しました。

本稿において、miRNA修飾細胞の生成のためのPEI /のMNPのアプリケーションに関する詳細なプロトコールは、17に記載されています。この目的のために、HUVECを用い、in vitroでの血管新生のために確立されたモデルを表しています。彼らはトランスフェクトするために挑戦していると毒性影響18、19の影響を受けやすいですお尻= "外部参照"> 20。また、我々は彼らの標的化、細胞間コミュニケーション、およびMRI検出を含むin vitroでのこのような細胞を、評価するためのアルゴリズムを提供します。

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Protocol

細胞分離のためのヒト臍帯は、ヘルシンキ宣言に従って、研究のために、この材料の使用に彼らの書面による同意を与えた知らせ、健康な女性から産後を得ました。ロストック大学の倫理委員会が提示研究(REG。番号A 2011年06、長引く2013年9月23日)を承認しました。

トランスフェクション複合体の調製

  1. ポリエチレンのビオチン化(PEI)。
    1. 室温(RT)で24時間400rpmで0.18 mmの溶液を得るために光から保護 - 300で、磁気撹拌下、超純水に分枝PEIを溶解します。 4°Cで溶液を保管してください。
    2. 得られた溶液を21、22における第一級アミノ基の濃度を測定します。
      1. PRの100μLを混合することにより、アミン検出試薬23として2%ニンヒドリン試薬溶液を使用ediluted試料(1:超純水で200)とニンヒドリン試薬75μL。 80℃で30分間インキュベートします。それを冷却し、安定化のための50%エタノール100μLを追加します。吸収分光光度計で550 nmの吸光度を測定します。
      2. グリシンを使用して標準曲線を作成します。
        1. 1:1:5 1:10 1:20 1:40、1:80、1:0.1 Mアミノ-N-ストック溶液(0.75脱イオン水100mL中のグリシンのg)およびその希釈液1を調製100、1:200および1:400、1:600。ステップ1.1.2.1のようにこれらのソリューションを測定し、軸上の濃度と吸光度とのプロットを作成します。
        2. 得られたプロットとPEI溶液の測定された吸光度に基づいて、PEIにおけるαアミノ基の濃度を規定します。
          注:注意。ニンヒドリン試薬溶液は、排他的にフードの下で使用しなければならないし、窒素雰囲気下で保存しなければなりません。溶液の色は、酸化による変更されたときには使用できません。
    3. 使用直前に100 mgのビオチンリンカーを超純水に溶解し、0.01 mM溶液を得る。ビオチン化試薬の必要量(モル)を得るために、PEI(工程1.1.2で測定)中のα-アミノ基の濃度に20を掛けて、PEIに加えるビオチンの必要量を計算する。
      1. pH 8-9でPEI溶液にビオチン溶液を添加し、室温で磁気撹拌しながら16時間インキュベートする。
    4. サイズ排除クロマトグラフィー23によって未反応ビオチンを除去する。 25-kDA PEIの精製に適したゲル濾過媒体を含む市販のカラムを使用し、製造元の指示に従ってください。精製後にアリコートをとり、アミン検出試薬(ステップ1.1.2)を用いてアミン濃度を測定し、ビオチン抱合効率を決定する(ステップ1.2.2)。得られたビオチン化PEIを4℃で保存する。
  2. キャラクタービオチン化PEIの化。
    1. ステップ1.1.2で説明したように、ビオチン化後のPEIにおけるαアミノ基の濃度を決定します。
    2. 結合手順を確認するために、PEIのビオチン化の程度を決定します。定量化のために、ビオチン化レベル24、25の正確な比色決意を確保するため、HABA色素(4'-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸)のアプリケーションに基づいている市販のキットを使用します。製造元の指示に従ってください。
  3. MNPとその特性のろ過。
    1. 大きな毒性凝集物を排除するために0.45μmのシリンジ駆動式フィルター16を介して市販のストレプトアビジンでコーティングされたMNPをフィルタリングします。標準測光アッセイ26を用いて最終鉄濃度を測定します。
    2. 記録によってフィルタリングのMNPの品質を調べ磁化曲線及び標準プロトコル27、28に従ったTEMイメージングによる。
      1. 蒸留水でMNP懸濁液を希釈し、TEM分析のために300メッシュホルムバール炭素被覆銅グリッド上に得られた懸濁液の3μLを置きます。その後、加熱プレート上でスライドガラス上にこのグリッドを配置し、それを乾燥させてください。
      2. 120キロボルトの透過型電子顕微鏡で試料を分析して、X線検出器27を用いて元素含有量を確認します。
  4. 超解像顕微鏡のためのトランスフェクション複合体の3色のラベル。
    1. 製造業者の指示に従ってNHSエステルアトー488色素とPEIで測定一級アミノ基の0.5%にラベルを付けます。上記のように、サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰の未結合色素を除去する(ステップ1.1.4)。ニンヒドリンASSAを用いてアミノ基の得られる濃度を測定Y(ステップ1.1.2)。
    2. 市販のラベル(材料リストに示される)は、適切な標識キット15を用いCyanine5色素でのmiR(SCR-MIR)をスクランブル。分光光度法による蛍光団のmiR濃度を測定します。
    3. 新たに1にビオチン結合色素( 例えば、アト565-ビオチン)とMNPたびにラベルを付ける:1,000 / wの比wです。直接Delyangina 詳細あたり、トランスフェクション複合体の形成中のmiR / PEIにMNPを追加した後に染料を適用します 16。

2.細胞調製

  1. HUVEC分離。
    1. 直接コード静脈の内部からコラゲナーゼ消化を使用してコードを取得した後臍帯から細胞を単離します。以前に開発されたプロトコル29に従ってください。
      1. Tにロード - 〜60個の単位緩衝液中のコラゲナーゼタイプIV溶液/ mLで各コードをインキュベート彼臍帯静脈 - 37°Cで13分間。
    2. すべての実験のために、5人の患者の最小値からのHUVECをプール。
      注:栽培は4-5継代を超えないようにしてください。これは、トランスフェクション効率を低下させる原因となるよう、マイコプラズマで汚染された細胞を使用しないでください。マイコプラズマ汚染は、マイコプラズマの高感度検出のためのPCRキットを使用してプロトコルを開始する前にするために試験されるべきです。
      1. マイコプラズマの存在をテストします。
        1. 10分(13,000×gで)のための細胞培養上清の遠心1 mLです。 3分間17件のdH 2 OのμLおよび沸騰(93℃)でペレットを懸濁します。種々のマイコプラズマ種の高度に保存されたリボソームRNA(16S-rRNAの)をコードするDNA領域を増幅するためにサスペンションの2μLを使用します。
        2. 10pmolの各プライマーを用いてPCRを行う(フォワードプライマー:5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ';リバースプライマー:5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3')櫛で以下の条件で商用PCRキットでination:3分間94°C; 30秒、30秒、50℃、および30秒間72℃、94℃の45サイクル。 10分間72℃で最終伸長。
        3. アガロースゲル電気泳動を用いてPCR産物(292塩基対)を分析します。
    3. いずれかの5%CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で100 U / mLのペニシリンおよび100μg/ mLのストレプトマイシンを補充した内皮増殖培地中で得られた細胞を液体窒素または培養それらを長期間保存します。
  2. HUVECの特性評価。
    1. 基底膜マトリクス( 例えば、マトリゲル)で管を構築するためにそれらの機能的能力と、標準的なプロトコル30以下内皮マーカーCD31(血小板内皮細胞接着分子、PECAM-1)の発現の観点から、単離されたHUVECを特徴付ける31。

3.トランスフェクション

  1. ストックHUVEC培養物をトリプシン処理(ステップ4.1.2を参照。)、手動血球計数器を用いて細胞を数えます。 70~80%のコンフルエンスに到達するまで、トランスフェクション前に48時間、約13,000細胞/成長表面のcm 2での出発細胞密度で、適切なサイズのプラスチック製細胞培養ウェルプレート上のHUVECを播種。
  2. 新鮮なのmiR / PEI / MNPは毎回錯体準備します。
    注:最初に、該miR / PEI複合体が得られるはずである(ステップ3.2.1 - 3.2.3)。その後、のMNPは、トランスフェクション(ステップ3.3)に使用される最終のmiR / PEI / MNP製剤を得るために(ステップ3.2.4)のmiR / PEI溶液に添加されるべきです。
    1. 適切な市販のmiRの量を計算し、製造業者によって提供される株式の濃度を用いて(タグ付きまたは機能、スクランブル、ステップ4を参照)。細胞成長表面ののmiR / cm 2の2.5ピコモルを使用してください。 O 5%グルコース溶液中でのmiRを希釈miR /μLの0.125ピコモルの最終濃度btain。
    2. ステップ3.2.1からのmiR量及び25〜32の最適なNP比に基づいて、その測定された濃度(ステップ1.1.2)を使用して、PEIの必要量を計算します。 5%グルコース溶液の等量(算出必要な体積当たり)PEIを希釈します。 (ステップ3.2.1)からのmiR溶液に、得られた予備希釈PEIを添加し、30秒間得られた混合物をボルテックス。
    3. RTで30分間得られたmiR / PEI混合物をインキュベートします。
    4. 、室温で超音波処理水浴(材料リストを参照)で少なくとも20分間35 kHzでのMNPを超音波処理のmiR / PEIにMNP溶液の適切な量を加える(5 - 調製のmiR / PEIの鉄を25μg/ mLの/ MNP混合物16)、30秒間ボルテックスし、準備ができるまで、RTで30分間インキュベートします。
  3. 細胞上の培地に直接調製したmiR / PEI / MNP混合物を滴下して加えます。細胞CULの得られた混合物を使用してくださいmiR / PEI / MNPとトゥーレ培地は、トランスフェクション溶液としてグルコースで希釈しました。新鮮な培養培地を6時間トランスフェクション後で、この混合物を置き換えます。

ベクターの安全性4.分析

  1. 細胞生存率の検討。
    1. (3.1および3.2ステップ)HUVECを24ウェル培養プレートに播種トランスフェクション;テストプローブとしてのCy3-MIRを使用して、フローサイトメトリーのための制御ゲートプローブとしてのmiR(SCR-MIR)をスクランブル。 24時間5%CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃でインキュベートします。
    2. PBSで希釈した1×トリプシン-EDTAを用いてトリプシン処理により上清およびトランスフェクトされた細胞を収集し、37℃で4分間、細胞に添加しました。 10分間、300×gで遠心分離し、分析のために使用します。
    3. リビング/死細胞を区別するために、市販の染色を適用することにより、フローサイトメトリーを用いて、トランスフェクション後に細胞生存率およびmiR取り込み効率24時間を調べます。標準プロトコル15を使用
  2. 機能アッセイにおける細胞のためのmiR / PEI / MNP複合体の安全性を調べます。
    1. トランスフェクションされた細胞の増殖活性を評価します。
      1. トランスフェクトHUVECを機能的アンチセンスのmiR( 例えば、HUVEC31抗miR92a)と(3.1および3.2ステップ)12ウェル培養プレートに播種し、24時間CO 2 5%を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃でインキュベートします。
      2. レーザーベースの共焦点顕微鏡でのEdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)および走査で染色することによって増殖細胞の数を定義するために市販のキットを使用します。次顕微鏡設定を使用:油浸と40Xの目的。 (647 nmの染料用)633 nmの励起レーザ。 5つのランダムフィールドは、各サンプルに記録されます。総核数(HoechによってのEdU染色された核の数を割ることによって増殖細胞の割合を計算しますST-染色)。
    2. 以前に17、31記載されているように、チューブ状構造を形成するためにトランスフェクトされた細胞の能力を評価します。
      1. SCR-MIRと(3.1および3.2ステップ)HUVECを24ウェル培養プレートに播種トランスフェクトし、5%のCO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で48時間インキュベートします。 (ステップ4.1.1のように)トランスフェクトされた細胞を集めます。
      2. 基底膜マトリックスの140μLで被覆した24ウェルプレート中の修飾されたHUVECの種3.5×10 4。 5%CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で18時間インキュベートします。
      3. レコードの各ウェル用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡で10のランダムフィールドの画像(微分干渉コントラスト)とは、「血管新生アナライザ」プラグインでImageJソフトウェアを用いて分析します。分岐の合計長さ、分岐の数、及びjunctiの数などのパラメータを含みます評価でアドオン。未処理の対照に、この比較。
  3. 調べギャップジャンクション(GJ)でトランスフェクション複合体の可能性のある毒性影響が3Dに(FRAP)33を光退色後の3D蛍光回復を試験することにより細胞間コミュニケーション(GJIC)を媒介しました。
    1. 生細胞イメージング(油浸)に適した薄い底でゼラチン被覆スライドガラス上の細胞を播種します。ステップ3.2において上述したように非標識、非機能性のmiR(SCR-MIR)を用いて細胞をトランスフェクトし、24時間インキュベートします。
    2. 顕微鏡検査の前に直接カルセインでそれらをロードすることにより、イメージングのための細胞を準備します。特に、5μMのカルセインを含有する新鮮な培地で培地を交換し、20分間インキュベートし、PBSで洗浄し、新鮮な培地を加えます。 37℃に顕微鏡のインキュベータを予め加温し、5%までのCO 2濃度を調整します。
      注:すべての試薬は、細胞contracを避けるために暖かいはず測定前ション。
    3. 細胞の可視化およびFRAP実験のために561 nmの励起レーザーを使用します。まず、手動で関心領域(ROI)として測定するためのセルを選択。試験細胞は、少なくとも3つの隣接セルを有するべきです。漂白されることはありません明るい、安定した蛍光を有する基準セルを定義します。 zスタックの限界を定義します。 15層 - 10を含むように底への細胞の上からの蛍光を記録します。
    4. 100%レーザー出力を使用して試験セルを漂白し、次の15分の間(これは隣接セルからGJ特異的色素転写に)後続の蛍光回復を記録します。 Z-スタック60秒毎に生データを記録します。実験あたり10試験細胞 - 合計で、5未満ではないとFRAP測定を行います。非トランスフェクト細胞への結果の比較。

トランスフェクション効率の5.テスト

  1. miR取り込みの検討。
    1. STEに記載されるようにプローブを調製P 4.1およびフローサイトメトリーでのmiRの取り込みを定義するためにそれらを同時に使用しています。
  2. 確認し、共焦点と超解像構造化照明顕微鏡(SIM)によりトランスフェクション複合体の細胞内局在を記載しています。
    1. (ステップ3.1)の前に記載されているように、24ウェル培養プレートのウェルに入れたゼラチン被覆ガラスカバースリップ上のHUVECを播種。 3色標識のmiR / PEI / MNP(ステップ1.4)を用いて細胞をトランスフェクトし、CO 2 5%を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で24時間インキュベートします。
    2. ちょうどPBSで、次いでリン酸緩衝食塩水(PBS)中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)を有する第1のカバースリップを洗浄し。標準的なプロトコル16以下DAPIで15分間染色し、核を37℃で4%パラホルムアルデヒド(PFA)中でインキュベートすることによって細胞を固定。過剰の染料を除去するためにシェーカー(それぞれ15分)で3回洗浄します。
      注:PFAは発がん性であると慎重に処理しなければなりません。
    3. PRを配置後述のように顕微鏡でeparedカバースリップは、少なくとも1時間のためにそれらを乾燥させ、そして顕微鏡検査のためにそれらを使用し、適切な封入剤を使用してスライドします。
    4. 63X油浸対物レンズを用いて画像と次のSIM設定取得:励起用の405-、488-、561-、および633 nmのレーザーラインを、 4の平均で5角、5つの段階で32ビットの深さzスタックモード、。 633と405のレーザーライン、561と488、G4とG3とG5とG2グリッド。
  3. 未処理の対のmiR / PEI / MNP-たHUVECにおけるRT-QPCRによって提供されたmiRの機能性を評価します。
    1. HUVECを機能的アンチセンスのmiR有する12ウェル培養プレートのステップ(3.1および3.2)( 例えば、HUVEC31のための抗miR92a)に播種トランスフェクトし、5%のCO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で48時間インキュベートします。
    2. (材料参照)市販のキットを用いてRT-QPCRを有する抗miR92a配信および処理を評価します。トンに従ってください彼メーカーの指示、他の場所で17、31説明したように。並行して、標的遺伝子の発現を調べる( 例えば、ITGA5 31)。
      注:それはのmiRの実際の結果ではなく、単にその細胞内蓄積の測定を確実にするので、内因性のmiRに対するアンタゴの配信は、模倣よりも好ましいです。

評価と磁気細胞分離をターゲット6セル

  1. in vitroでの静的な条件で細胞標的
    1. (2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15〜25 / mlのMNP)24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクト、24時間インキュベート洗浄し、(ステップ4)上述したように集めます。
    2. ウェルの新鮮な培地1mLで1から得られた細胞ペレットを混合し、12ウェルプレートのウェルに配置します。テープを使用して、プレートの底部に局所的に(側)の小磁石を固定します。
    3. 24時間細胞懸濁液をインキュベートし、磁石なし磁石上及び領域内の領域における細胞の付着および成長を観察します。定性的な評価のために、従来の倒立顕微鏡を使用します。
  2. 試験管内でシミュレートされた動的な条件で細胞標的。
    1. ステップ3.1および3.2(2.5ピコモル/ cm 2でのCy3-MIR、NP 25、及び15から25 / mlのMNP)あたり24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクション24時間インキュベートし、洗浄、及び1Xを用いてトリプシン処理によって収集PBSで希釈したトリプシン-EDTAを37℃で4分間、細胞に添加しました。 10分間、300×gで遠心分離。
    2. ウェルの新鮮な培地1mLで1から得られた細胞ペレットを混合し、12ウェルプレートのウェルに配置します。テープを用いて(ウェルの側に)局所的に小さな磁石を固定します。シェーカー上で培養プレートを配置し、動的条件34をシミュレートするために、150rpmで12時間、細胞懸濁液をインキュベートします。
    3. 細胞を洗浄し、修正それらは、4%PFAを使用しました。 DAPI 16で核を染色します。分析のための画像を作成するために、生データを得るために - (12スライス5)、及び最大値投影画像処理514 nmの励起レーザー、zスタックモードを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて細胞付着を記録します。
  3. 磁気応答性および非応答性細胞の定量分析。
    1. 24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクト(2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15〜25 / mlのMNP)、(ステップ6.2.1)の前に説明したように洗浄し、24時間インキュベートし、収集。プレ暖かいPBSとセルソーティング緩衝液(濾過により滅菌し、マテリアルのリストを参照)37℃です。細胞選別緩衝液500μlで各ウェルから得られた細胞ペレットを再懸濁。
    2. 磁石上に新鮮な細胞ソーティング緩衝液で3回カラムを洗浄し、供給された磁石によって固定磁性選別列にこの細胞懸濁液を適用し、そしてフロースルーMAGNETIなどを収集的に応答しない画分(Mag含有)。
    3. 磁石からカラムを取り外し、直ちにプランジャーを用いて、カラムを通して新鮮な細胞ソーティングバッファを押して磁気応答性細胞画分(MAG +)を収集します。
    4. 10分間、300×gで遠心分離Mag含有及びMAGの両方+。 PBSで細胞ペレットを再懸濁、細胞を計数し、トリパンブルー排除アッセイ35を用いて細胞生存率を評価します。長期分析のために( すなわち、再シードと24、48、及び培養17における72時間後に評価する)、または直接、フローサイトメトリーのためのいずれか(ステップ4.1。)得られた細胞ペレットを使用します。
  4. トランスフェクションされた細胞の鉄負荷を定義します。
    注:準備中に、鉄の酸化物材料および機器を用いた細胞プローブのいずれかの接触は避けなければなりません。
    1. (ステップ4.1.1のように)トランスフェクトされたHUVECおよび非トランスフェクションコントロールを集めます。 PBS 36(b)に2%BSAで二回採取した細胞を洗浄 yが注意深くこの洗浄用緩衝液1mlで細胞を混合し、次いで10分間、300×gで遠心分離します。再懸濁、PBS 250μLで得られた細胞ペレットを4%PFAの100μLを添加し、細胞を固定するために20分間インキュベートします。上述したように、PBSで3回洗浄します。
    2. PBS 110μLで得られた固定細胞ペレットを再懸濁し、100μLのPCRチューブに移します。
      1. 細胞計数のために、10μLのアリコートを取り、磁性粒子分光法(MPS)の残りのサンプルを使用します。
    3. 市販のMPSデバイス上で測定を行います。測定中に、以下の設定を適用する:0 = 25 kHzのF = 25 MTおよび周波数磁場B ドライブ 。サンプルの鉄定量のために、2.1μgの既知の鉄量にMNP参照試料の対応3、refにMPS-スペクトルの3第三高調波を正規化外部参照"> 37。コントロールとして、未処理の細胞を使用してください。

7.定義MRI検出限界

  1. 細胞の調製。
    1. (ファントムを調製するための)細胞の必要量に応じて複製または三連で-種子6ウェルプレートおよびトランスフェクションでのHUVEC(25 / mlのMNP 2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15)。 24時間細胞をインキュベートし、洗浄し、収集し、(ステップ4)の前に説明したように、4%PFAで固定し。
    2. 適切な細胞数( 例えば、10 3、10 4、10 5、 )を用いてアリコートを調製し、得られた細胞を計数し、50μLにその音量を調節。
  2. アガロースファントムの準備
    1. 38との間に埋め込まれたトランスフェクトされた細胞の異なる量の50-mLチューブ中の2%アガロースの複数の層を準備します。準備、超音波処理および遠心分離器中に高温アガロース38へアーティファクトの原因となる気泡を破壊します。
      注:重要なことに、非磁性のmiR / PEI複合体で処理した5.5×10を含むファントム5個の HUVECを対照として役立つように同じ方法で調製されるべきです。
  3. コイルの中心にファントムを配置した後、7.1 T動物MRIシステムを用いたin vitroファントムで得られたスキャン、磁場のz軸に平行です。
    1. グラジエントエコーシーケンスの取得のために、以下のシーケンスパラメータを適用する:TR = 66ミリ。 TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 10 / TE 6 = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01ミリ。フリップ角= 3°; 256×256に補間マトリックス= 128×128、。ビュー= 42 [mm]のフィールド。 100%。平均= 1、エコートレイン長= 1。スライス厚= 1.5ミリメートル。そして16のスライス。
    2. すべての4つのエコー時間の信号の減衰を評価し、他の場所39記載したように、適切なソフトウェアを使用して、R2 *マップ(R2 * = 1 / T2 *)を計算します。

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Representative Results

提案されたプロトコルの主な目的は、磁気応答性のmiR-改変細胞を生成し、それらの正確な特性( 図1)を行うことです。その結果、磁気選択および誘導およびMRIで検出可能に反応効率的にトランスフェクトされた細胞は、得られるべきです。

まず、単離されたHUVECの同一性は、内皮マーカーCD31(PECAM)( 図2A)を有する典型的な染色によって、適切な基底膜マトリックス( 図2B)に管を形成する能力によって確認しました。得られた細胞は、miRは非常に効率的にPEI / MNPによって導入され始めました。顕微鏡検査は、すべてのセルがタグ付けされたmiR(Cy3の)24時間トランスフェクション後( 図3A)の信号に対して陽性であったことを実証しました。重要なことには、全く細胞死は、未処理細胞( 図3B)と比較して、記録されなかったとnormal外観は( 図3A)に維持しました。共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察されたように、Cy3でのmiRの信号は、主に細胞の内部に位置していました。また、トランスフェクションベクターおよびmiRのすべての部分の細胞内局在の詳細な調査は、高解像度3色標識複合体を用いて行きました。 SIM、のmiR、PEI、およびMNP信号は全て核周辺領域( 図3C)において細胞質で検出されました。

さらに、トランスフェクションベクターの安全性の詳細な検討は、miR / PEI / MNP-HUVECを( 図4A、得られたネットワークは陽性対照として用い、未処理細胞のものに匹敵する適切な基底膜マトリックス上で、その管を形成することができることが証明されています)。 3D-FRAP実験は、明らかにされるようにさらに、トランスフェクトされた細胞は、GJICを維持しました。特に、細胞は蛍光GJ-permeaがロードされBLE染料及びそれらの一方が漂白され、その蛍光が原因隣接セルと通信し、得られた染料転写( 図4B)に復帰します。

重要なことに、起因する超常磁性化合物40( 図5A)の存在のために、PEI / MNPのアプリケーションだけでなく、細胞トランスフェクションだけでなく、同時に磁化可能にします。細胞内の鉄の結果として得られる量を最適範囲内のすべての適用MNP濃度についてMPS( 図5B)を用いて測定した(2.5ピコモル/ cm 2でのmiR; NP 25は、5~25 / mlのMNPで補完):0.37±0.079 0.7±へ鉄/セル17 PG 0.150。磁気分離カラムの使用が実証されるように、これらすべてのMNP濃度のために、トランスフェクトされた細胞の総容積で磁気応答性細胞の量は〜70%( 図5C)です。また、HをトランスフェクトUVECsマウス組織感受性を模倣し、in vitroでのアガロースファントムの内部MRI( 図5D)と表示されています。さらに、 インビトロでシミュレート動的条件下でトランスフェクトされたHUVECの磁性標的は、効率的な( 図6)であることが証明されました。この実験では、培養液のにも一定の積極的な動きは、磁石のアプリケーションに近い領域での有力な細胞増殖を防ぐことはできませんでした。

図1
図1.磁化のmiR-修正のHUVECとその分析の生産の概略図。 PEI / MNP(ポリエチレンイミン/超常磁性ナノ粒子に基づくベクター)は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にマイクロRNA(MIR)を送達するために適用されます。細胞生存率を含む安全性(機能性:得られた細胞生成物は、以下のパラメータによって特徴付けられますITY、および細胞間通信のための容量)トランスフェクション効率( すなわち、のmiR取り込み効率およびその後の機能)。静的およびシミュレートされた動的条件下、in vitroで標的磁性。磁気共鳴画像(MRI)検出。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
孤立HUVECの特徴付け図。内皮CD31マーカーで染色し、単離され、培養HUVECのA.代表的な画像。核はDAPI(青)で対比されます。スケールバーは20μmです。単離されたHUVEC上で実行管形成アッセイのB.代表的な結果。画像は、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて記録した(差動インターフェレンスコントラスト)基底膜マトリックス上の細胞播種後18時間。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
PEI / MNPを利用したHUVECに 図3 のmiR配達。 A.タグ付けされた(赤のCy3)のmiRの24時間後、トランスフェクション(Cy3でタグ付けされたmiR、NP 25とMNPを25μg/ mLと2.5ピコモル/ cm 2)で、正常細胞の外観の維持の取り込みが示されています。画像は、514 nmの励起レーザー(Cy3の、赤色)および微分干渉コントラストを用いて共焦点レーザー顕微鏡により撮影しました。スケールバーは50μmです。 B.細胞生存率を24時間トランスフェクション後、フローサイトメトリーによって評価しました。プロットは、HUVECについて得られた結果を表します。以下の複合組成物で処理された(S)のCy3-MIRの2.5ピコモル/ cm 2で、 NP比25のMNPの5〜25μgの/ mLで補完します。バーは、生存細胞の平均数と全細胞集団(;:SEMエラーバーN = 6)の間の比を示しています。 3色のC.構造化照明顕微鏡(SIM)イメージングは、HUVECをによって取り込まれたmiR / PEI / MNP複合体を標識しました。細胞を上記のように、トランスフェクトインキュベートし、24時間後に処置を固定しました。核はDAPIで対比染色しました。生SIMデータは、zスタックに記録され、処理されました。代表画像は、最大値投影の結果です。次の励起レーザを適用した:405nmで(DAPI、青)、488nmの(Atto488-PEI、オレンジ)、565 NM(Atto565-MNP、シアン)、及び633nmの(赤色のCy5-MIRを、)。スケールバーは5μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4のmiR / PEI / MNPでのHUVEC変更の安全性。 48時間後処理; A.チューブ形成アッセイは、トランスフェクトされた細胞(NP 25とMNPを25μg/ mLのSCR-MIRの2.5ピコモル/ cm 2)を用いて行きました。画像は、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて取得した( すなわち、微分干渉コントラスト)18時間基底膜マトリックス上の細胞播種後。 miR / PEIでトランスフェクトされたHUVECを毒性コントロールおよびポジティブコントロールとして未処理細胞として使用しました。スケールバーは100μmです。管の長さ、分岐の数、及び接合部(N = 3、エラーバー:SEM)のプロットは、いくつかのパラメータを使用してトランスフェクトしたHUVECと未処理細胞との間の比率を反映しています。 B.のmiR / PEI / MNP変性HUVECのギャップ結合媒介性の間の通信を評価した24時間後transfecション。この目的のために、細胞をGJ透過性色素カルセイン(オレンジ)を負荷しました。 (FRAP)を光退色後蛍光回復は、Zスタック内の試験セルを走査することによって3次元で調べました。代表的な漂白前にカルセインを負荷した細胞の画像を、直接漂白後、及び(回復した蛍光を有する)を15分後に漂白が示されています。スケールバーは20μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
PEI / MNPとその応用でのトランスフェクションに起因図5.セルの磁化。それらのクラスタ化された形態を示すTEMで撮影された濾過のMNPのA.代表画像、、。小型 - (超常磁性を生じる)の単一酸化鉄粒子(5〜15 nm)は、それによってあります確認しました。スケールバーは100nmです。 B.トランスフェクトされた細胞の細胞内負荷が磁性粒子分光法(MPS)24時間後にトランスフェクションすることにより評価しました。代表的なパネルは、検査試料のMPSスペクトルを示します。具体的には、純粋なMNP懸濁液(50μL)を参照(青い四角)を務めました。グレーの三角形は、任意のサンプルなしで測定して得られた検出された背景スペクトルを示しているが、:、:丸は、二つのトランスフェクトされた細胞サンプル(MNP5μg/ mlの緑色の円MNPを25μg/ mLの赤丸)のMPSスペクトルです。振幅(A)の対数スケールに注意してください。磁気的に、トリプシン処理後24時間処理することによって回収し、磁気的に改変された細胞の量は、トランスフェクトされたHUVEC(NP 25は、MNPの5-25μgの/ mLで補完2.5ピコモル/ cm 2でのmiR)を適用することにより定量化したC.細胞分離カラム。得られた磁気陽性画分( すなわち、カラムに残っています)計数し、そしてトランスフェクトされた細胞の全体量のうち、その割合は、各MNP濃度(赤三角)についてのプロットに反映されます。細胞生存率は、続いてトリパンブルー排除アッセイ(灰色菱形)によって調べました。データは平均±SEMとして提示されている(N = 3)。トランスフェクトされたHUVECのD.アン例示的なMRI画像(30万細胞; 2.5ピコモル/ cm 2でのmiR; NP 25&25μgのMNPの/ mL)をアガロースファントムに埋め込ま7.1 T動物MRIシステムで記録しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
模擬動的条件におけるmiR / PEI / MNP-HUVECの インビトロ 磁気ターゲティング 6。 HUVECを24時間後にトランスフェクションを収集しましたイオン(2.5ピコモル/ cmでのCy3-MIRの2; NP 25&MNPを25μg/ mL)および再播種局所側壁に取り付けられた小さな磁石を、ウェル中の新鮮な培地中に。次に、この培養プレートを150rpmで回転振とう器に固定しました。 (; 514 nmでのCy3、オレンジ405nmで、DAPI、青色励起レーザ)細胞の付着および成長は、PFAで細胞を固定し、DAPIでそれらの核を染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡観察を行うことにより、12時間後に評価しました。代表的な画像は、磁石のアプリケーションでエリア内の細胞の成長を示しています。磁石のアプリケーションなし。ウェル培養の中心に、ここで液体の流れは、細胞を濃縮しました。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

それらのさらなる磁気的に制御指導のための超常磁性ナノ粒子を搭載した遺伝子操作された細胞の生産は現在のプロトコルに提示されています。この戦略の成功した適用は、移植のために標的化可能細胞生成物を提供することによって、そのような損傷した領域2、3、4における低い保持および乏しい生着などの細胞療法のいくつかの問題の解決を可能にします。また、適切に選択された遺伝物質の同時導入は、細胞の性質を促進することができ、したがって、機能的利益41を増大させる可能性があります。

現在のプロトコルは、モデルとしてのHUVEC上で開発されてきました。これらの細胞をトランスフェクトすることが困難と毒性影響18、19、20の影響を受けやすいことが知られています。 DEMPEI / MNPトランスフェクション後に95%を超えるフルオロフォア標識のmiR取り込みのonstratedレベルは、典型的には、PEIベースのベクターおよび一般的に使用されるカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬( 例えば、リポフェクタミン)42で得られます。 NP 40 - 加えて、25の最適なNP比が20の以前に公表された値に対応します。それにもかかわらず、テストした蛍光団タグ付きのmiRの非常に効率的な取り込みは必ずしも配達43の後に適切なのmiR処理や機能を保証するものではありません。この点は、NAのその緊密な静電凝縮して、PEIの場合に特に適切です。したがって、送達されたmiRの得られた機能的能力も試験しなければなりません。ここで、機能性のmiRは内因HUVEC中で発現、MIR-92A 31は 、選択された、及びそれに対する抗該miRはPEIおよびPEI / MNPを使用して送達しました。その結果、対象のmiR-92aのほぼ完全ノックダウンは、抗のmiR Fの効率的な放出を証明しましたトランスフェクション複合体をROM。

重要なことに、先行研究において、PEI / MNPベクターの成功裏の適用は接着性の両方、他の細胞型にプラスミドDNA(pDNAを)およびmiRの送達のために実証された( 例えば、COS7、ヒト間葉系幹細胞15、16)および懸濁液( 例えば、骨髄由来CD133 +造血幹細胞44)。すべてのこれらの実験は、トランスフェクション効率および毒性は、細胞の種類に依存し45であることが知られて事実を確認しています。したがって、最適なベクター組成物の選択( 即ち、該miR量、NP比、及びMNP鉄の量)は、基準点として以前に確立された最適条件を使用して、すべての特定の細胞型のために行われるべきです。

また、達成の遺伝子改変の過渡文字が考慮されるべきです。一方で、私Tは、成長因子の短期送達として、特定の機能に非常に適しています。一方、発現の持続時間は、長期発現を必要とする様々な目的のために十分に長くは続かないかもしれません。条件をさらに最適化された後にもかかわらず、PEI / MNPベクトルの実証済みの安全性は、その可能な反復投与をサポートしています。

PEIおよびその誘導体は、一般的に、他の非ウイルスビヒクルおよび7の変形例に柔軟性に比べてその高い効率のために使用されます。しかし、in vitroおよびin vivoで PEIの成功にもかかわらず、臨床試験への応用は非常に限られている( すなわち、いくつかのフェーズ1と2の試行または癌患者)7、PEIの毒性7、13による14。私たちのグループ16と同様に、このプロトコルの以前の作品としては、MNPのを証明しています大幅PEIの毒性を減少することができます。特に、該miR / PEIトランスフェクションは、それによってこれらの細胞のためのin vitro機能テスト主に失敗し、そのマトリックスに管を形成するHUVECの能力を損傷しました。対照的に、該miR / PEI / MNP-HUVECの管形成性能は、未処理細胞に匹敵しました。特に、PEIの毒性のこの減少は、生体適合性及び日常ヒト被験者40における造影試薬として使用される酸化鉄のような構成要素の低レベルを導入することによって達成されました。

別に機能的特性を維持するから、この機能は、細胞治療移植後46を適切に統合するために必要であるように改変された細胞は、細胞間通信を確立することが可能であることが重要です。加えて、改変された細胞は、損傷した組織47への治療のmiRの送達のための担体として利用することができます。この場合には、そのCapaciの隣接セルを有する分子を交換するTYは、車両としての成功を定義します。 PEI / MNPトランスフェクションは、修飾のHUVECでGJICを可能にするので、 インビボでの統合の可能性を有しており、損傷領域へのmiR送達を提供します。

注目すべきは、その後の標的化のためのセルの磁化の以前に発表された作品は、セル〜4のロードおよび鉄/セル48、49、50、51の30 PGを報告しています。これらの数は大幅にin vitroでの静的および動的シミュレート条件にNA / PEI / MNP-HUVECの標的化のために十分であった値〜0.16から0.7 PG /細胞を超え。このような低鉄量は、安全性の面で有利である:( すなわち、活性酸素種(ROS)の産生)を直接INTEの量と関連することが知られている酸化鉄ナノ粒子に関連した毒性の一般的に知られているメカニズムナノ粒子40を rnalized。加えて、いくつかの研究では、酸化鉄ナノ粒子の高い細胞内レベルは、用量依存性細胞骨格の崩壊および損傷52、53をもたらすことができることを実証しました。重要なのは、ほとんどが遺伝的細胞操作を含まない目的を標的とするために、セルの磁化の症例を報告しました。対照的に、該miR / PEI / MNPベクターを同時に細胞を改変し、磁気特性を追加する機会を提供します。

しかし、低MNP負荷は、血流と乱流環境で標的に磁気のためには十分ではないかもしれません。 インビボ状況挑戦に近づくために、動的条件は、インビトロでシミュレートした懸濁液中の磁化のmiR / PEI / MNP-HUVECを有する培養プレートを回転振盪器34上に置きました。この実験は、明らか発生するすべての相互作用をカバーすることはできません生体内。しかし、それはPEI / MNP-修飾された細胞の標的に可能性のより良い理解につながりました。培地もアクティブ振盪は、磁石54に向かって細胞移動を妨害しなかった場合、結果として、高効率な細胞標的を実証しました。この目的のために、のmiR-修正HUVECを鉄/セルの少なくとも〜0.16 PGを負荷しました。また、磁気応答性細胞をソートすることができます。現在の研究に適用される磁石ベースの細胞分離手順は、miR / PEI / MNP細胞の生存能力を損ないませんでした。重要なことは、( すなわち、12のための磁場を印加関わる実験ターゲット- 24時間)静磁場の適用は、標的細胞に有害な影響を及ぼしませんでした。したがって、磁化遺伝的に改変された細胞の実証された生産は、磁気力により確保細胞保持の効率をアドレッシングインビボ研究さらにための基礎を提供します。特に、目E 51、54、55に使用される細胞保持局所投与の代わりに細胞誘導後の静脈内注射後の磁化の細胞の標的化を用いたin vivo試験で最も成功しました。したがって、注射の部位での磁石ベースの保持は、miR / PEI / MNP修飾細胞のインビボでの用途さらにために望ましい現れます。

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Disclosures

我々は、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

Acknowledgments

私たちは、フィルタ処理された超常磁性ナノ粒子のTEM像を取得する際、そのX線分析を行う上での技術サポートのためにG.フルダ(電子顕微鏡センター、ロストック大学、ドイツ)を感謝したいと思います。 RTCロストックで行わ作品は、連邦教育研究省ドイツ(FKZ 0312138A、FKZ 316159およびVIP + 03VP00241)とEU構造基金と国家メクレンブルク=フォアポンメルン州(ESF / IV-WM-B34-によってサポートされていました0030/10及びESF / IV-BM-B35-0010 / 12)とDFG(DA 1296から1)、ダンプ・財団、ドイツ心臓財団(F / 01/12)。フランク・ウィークホースト EU FP7の研究プログラム "ナノMAG" FP7-NMP-2013-LARGE-7でサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEI 25 kDa Sigma Aldrich 408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101 Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2% Sigma Aldrich 7285
Glycine Sigma Aldrich 410225
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005
Microplate reader Model 680 Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Z5481
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 µm
Libra 120 transmission electron microscope Zeiss Acceleration Voltage 120 kV
Sapphire X-ray detector EDAX-Amatek
Cell culture plastic TPP
NHS-Esther Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-31
NHS-Esther Atto 488  ATTO-TEC GmbH AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit Mirus Bio MIR 9650
Biotin Atto 565 ATTO-TEC GmbH AD 565-71
Collagense Type IV Gibco Thermo Scientific 17104019
Endothelial growth medium, EGM-2 Lonza CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific 15140122 100 U/mL, 100 µg/mL
Matrigel BD Biosciences 356234
anti-PECAM-1 antibody Santa Cruz sc-1506
MS MACS columns Miltenyi Biotec  130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Scientific L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control Thermo Scientific AM17120 "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control  Thermo Scientific AM17110 "scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor  Thermo Scientific AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 4% solution in PBS
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit Machery-Nagel 740955
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Scientific AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay Thermo Scientific 000431 Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix Nippon Genetics LS27
ITGA5 TaqMan assay Thermo Scientific Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay Thermo Scientific 001093
18S rRNA Endogenous Control Thermo Scientific 4333760F
Gelatin Sigma Aldrich G7041
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
PBS Pan Biotech P04-53500
BSA Sigma Aldrich
MACS buffer Miltenyi Biotec  130-091-221
Agarose Sigma Aldrich A9539
7.1 Tesla animal MRI system Bruker Corporation A7906
ImageJ software National Institutes of Health upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device Bruker Biospin
Matlab software Mathworks
Ring Neodym Magnet  magnets4you GmbH RM-10x04x05-G ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Scientific C10340
FluorSave Reagent Merck 345789
Ultrasonic bath Bandelin electronic Type: RK 100 SH

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References

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