तंत्रिका तंत्र पुनर्निर्माण, मॉडुलन, और मॉडलिंग के लिए एनाटॉमिक रूप से प्रेरित थ्री-आयामी माइक्रो-टिशू इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क

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Neuroscience

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Summary

यह पांडुलिपि सूक्ष्म ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क के निर्माण का विवरण देता है: तीन-आयामी माइक्रोन-आकार के निर्माण में ट्यूबल्युलर हाइड्रोगेल में लगाए गए समेकित न्यूरोनल जनसंख्या (एस) फैले लंबे समय से गठबंधन अक्षीय ट्रेक्ट्स शामिल थे। ये रहने वाले स्कॉफॉल्ड न्यूरल सर्किट्री के पुनर्निर्माण या विनियमन के लिए कार्यात्मक रिले के रूप में या ग्रे-व्हाइट मामले की न्यूरोनेटोमी की नकल करने वाले बायोफैलिकिक टेस्ट-बेड के रूप में काम कर सकते हैं।

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Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

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Abstract

निरोधात्मक वातावरण और न्यूरोजेनेसिस के लिए सीमित क्षमता के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर चोट या बीमारी प्रेरित अध: पतन के बाद कामकाजी वसूली बहुत कम होती है। हम क्षतिग्रस्त सीएनएस के भीतर एक साथ न्यूरॉनल और एसेनलल पाथवे हानि को संबोधित करने के लिए एक रणनीति विकसित कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में सूक्ष्म-ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन), न्यूरॉन्स और गठबंधन वाले अक्षीय ट्रेक्ट्स वाले माइक्रो मैट्रिक्स (ईसीएम) ल्यूमन फैले हुए हाइड्रोजेल सिलेंडर के सैकड़ों माइक्रोसन व्यास में सेंटीमीटर का विस्तार हो सकता है। लंबाई में। न्यूरॉनल समुच्चय तीन आयामी encasement के चरम सीमाओं के लिए सीमांकित हैं और axonal अनुमानों द्वारा फैला रहे हैं। माइक्रो-टीएनएन विशिष्ट रूप से सीएनएस पुनर्निर्माण के लिए एक रणनीति के रूप में तैयार हैं, मस्तिष्क संयोजी cytoarchitecture के पहलुओं का अनुकरण करते हैं और संभावित रूप से नेटवर्क प्रतिस्थापन के लिए साधन प्रदान करते हैं। नीरोनाल समुच्चय लापता या क्षतिग्रस्त सर्किटरी को पुनर्स्थापित और / या विनियोजित करने के लिए नए कार्यात्मक रिले बनाने के लिए मेजबान टिशू के साथ संकुचित हो सकता है ये संरचनाएं उत्थान की स्थिति के आधार पर स्यारगिस्टिक संरचनात्मक और घुलनशील संकेत प्रदान करते हुए, सेल प्रवासन और अक्षीय पथ-पथ के लिए विकासात्मक तंत्र का शोषण करने में सक्षम प्रो-रिजनेटिव "लिविंग स्कैफॉल्ड" के रूप में भी कार्य कर सकती हैं। माइक्रो-टीएनएन तरल हाइड्रोगेल को एक बेलनाकार मोल्ड में डालने के द्वारा तैयार किए गए हैं जिसमें एक लंबे समय तक केन्द्रित सुई होती है। एक बार हाइड्रोगेल सुस्त हो गया है, सुई को हटा दिया जाता है, एक खोखले माइक्रो-कॉलम छोड़कर। न्यूरोनल आसंजन और अक्षीय परिणाम के लिए उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए एक ईसीएम समाधान लुमेन में जोड़ा जाता है। अलग-अलग न्यूरॉन्स को सूक्ष्म-स्तंभ के एक या दोनों छोरों के भीतर सटीक बोने के लिए यंत्रवत् एकत्रित किया जाता है। इस पद्धति में मज़बूती से लंबे समय से प्रक्षेपित अक्षांश के साथ आत्मनिहित लघु निर्माण का उत्पादन होता है जो मस्तिष्क तंत्रिका विज्ञान की सुविधाओं को दोहरा सकते हैं। सिनैप्टिक आईएमआईअसंगत और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक सूक्ष्म- TENNs व्यापक synaptic वितरण और आंतरिक विद्युत गतिविधि का अधिकार है कि सुझाव है। नतीजतन, माइक्रो-टीएनएन मस्तिष्क रास्ते के लक्षित न्यूरोसार्जिकल पुनर्निर्माण के लिए एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करती है और इन विट्रो में न्यूरोबॉजिकल घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बायोफ़ैलिकिक मॉडल के रूप में भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), जैसे कि दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई), स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग, और पार्किंसंस रोग के विकारों और रोगों का एक सामान्य लक्षण, अक्षीय मार्गों और न्यूरोनल सेल का वियोग है हानि 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 । उदाहरण के लिए, जब एक इस्कीमिक स्ट्रोक अनुपचारित होता है, तो यह अनुमान लगाया जाता है कि एक्सॉन 7 मिनट की एक्सॉन 5 मिनट प्रति मिनट की दर से खो गया है। टीबीआई के मामले में, जो लगभग 1.7 मिलियन लोगों का अकेले अमेरिका में अनुभव होता है, अस्थिजनित अवस्था आघात के बाद कई वर्षों तक हो सकती है, क्योंकि प्रारंभिक चोट दीर्घकालिक न्यूरोडेजनरेटिव स्टेट 4 की उत्पत्ति करता है। इन हानिकारक प्रभावों को बढ़ाना, सीएनएस एक गंभीर रूप से सीमित कैपा हैपुनर्जनन के लिए शहर 1 , 7 , 8 , 9 चोट के बाद, एक निरोधात्मक वातावरण विकसित होता है जो कि दूर के लक्ष्यों को निर्देशित निर्देशों की कमी के कारण होता है, माइलेन-जुड़े अवरोधकों की उपस्थिति जो न्यूरेटिक परिणाम को बाधित करती है, और 8 , 10 , 11 , 12 के प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स द्वारा ग्लेल निशान के गठन के लिए। ग्लेल निशान पुनर्जनन के लिए एक जैव-रासायनिक और शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है, जैसे अणुओं जैसे चोंड्रोइटीन सल्फेट प्रोटोजेलीकैंस, एंजॉन आउटग्रोथ 8 , 11 को बाधित करता है। इसके अलावा, भले ही तंत्रिका स्टेम सेल वयस्क सीएनएस में पाए गए हैं, नए न्यूरॉन्स का उत्पादन सीमित है, क्योंकि न्यूरोजेनेसिस के लगातार प्रमाण घ्राण बल्ब, हिप्पोकैम्पलउप-क्षेत्रीय क्षेत्र, परिधीय क्षेत्र और रीढ़ की हड्डी 13 , 14 की केंद्रीय नहर। ये बाधाएं चोट या बीमारी के बाद खोए गए न्यूरॉन्स और श्वेत पदार्थों की वास्तुकला की कार्यात्मक वसूली को रोकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप इन स्थितियों के अक्सर जीवन-बदलते और लंबे समय तक प्रभाव पड़ते हैं।

प्रौढ़ सीएनएस में पुनर्योजी क्षमता की कमी के बावजूद, यह दिखाया गया है कि यदि पर्याप्त पर्यावरण संकेतों को न्यूरॉन्स 15 , 16 , 17 , 18 के होस्ट करने के लिए पर्याप्त पर्यावरणीय संकेत दिए गए हैं तो अक्षतंतु उत्थान संभव है। शोधकर्ताओं ने प्लास्टिसिटी और अक्षतंतु उत्थान को प्रोत्साहित करने के लिए विकास कारकों ( उदाहरण के लिए, तंत्रिका वृद्धि कारक, epidermal वृद्धि कारक, glial-dependent वृद्धि कारक, और न्यूरोट्रोफ़िक फैक्टर -3) और अन्य मार्गदर्शन अणुओं को वितरित करने और हेरफेर करने का प्रयास किया है 14 ,/ Sup> 18 , 1 9 हालांकि इन अध्ययनों ने पुष्टि की है कि वयस्क अक्षतंतु विकास कारकों पर प्रतिक्रिया देने में सक्षम हैं, इन रणनीतियों को रक्त-मस्तिष्क की बाधा के कम पारगम्यता और पुनर्जीवित 14 , 18 , 1 9 को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक विशिष्ट स्थानिक और लौकिक ग्रेडियंट्स द्वारा सीमित हैं। अन्य तरीकों ने सीएनएस न्यूरॉन्स में उत्थान-संबंधित प्रतिलेखन कारकों के hyperactivation पर भरोसा किया है। उदाहरण के लिए, Stat3 प्रतिलेखन कारक के अत्यधिक विषमता ने ऑप्टिक तंत्रिका 20 में अक्षीय पुनर्जनन को प्रेरित किया। फिर भी, दोनों बायोमोलेक्यूल डिलीवरी और प्रतिलेखन कारकों के अत्यधिक विषमता खो चुके न्यूरोनल आबादी को बदलने में विफल होते हैं। सेल-आधारित रणनीति मुख्य रूप से तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) को सीएनएस में ट्रांसप्लांट करने पर केंद्रित है, सीएनएस न्यूरॉन्स को बदलने की क्षमता का लाभ लेते हैं, ट्रॉफी कारक जारी करते हैं,और चोट 17 के बाद होने वाली न्यूरोजेनेसिस के प्रयासों का समर्थन करते हैं। इस के बावजूद, अभी भी इस दृष्टिकोण को निरोधक चुनौतियों का सामना करना पड़ रहा है, जिसमें प्रत्यारोपित तंत्रिका कोशिकाओं को जीवित रहने की क्षमता, मेजबान के साथ एकीकृत करने, और घायल क्षेत्र 6 , 14 , 17 , 21 के लिए सीमित रहने के लिए बाधा आ गई है। इसके अलावा, केवल सेल डिलीवरी क्षतिग्रस्त या खोए हुए अक्षीय मार्गों के cytoarchitecture को पुनर्स्थापित करने में असमर्थ है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो सेल और ड्रग / रासायनिक वितरण रणनीति का सामना करने वाली समस्याओं को संबोधित करता है, इन तरीकों को बायोमैटिरियल्स 14 , 22 , 23 के उपयोग से जोड़ रहा है। हाइड्रोजेल जैसे बायोमैटिरियल्स बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के जैवरासायनिक और भौतिक गुणों को मापने में सक्षम हैं, सेल डिलीवरी में सहायता कर रहे हैं औरघायल क्षेत्र के भीतर अवधारण, और नियंत्रित रिहाई के साथ विकास कारकों और अन्य जैव-अणुओं को वितरित करना 22 इन जैव-सामग्री-आधारित रणनीतियों की आकर्षक विशेषताओं के परिणामस्वरूप 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 2 9 , 30 के घावों वाले क्षेत्र को स्कॉफॉल्ड्स के प्रत्यारोपण के बाद विवो अक्षत में पुनर्जीवन के प्रमाण दिए गए हैं। हालांकि, गिलहरी बायोमेटिकल रणनीतियों खोई हुई न्यूरोनल आबादी का स्थान नहीं लेते हैं; जब न्यूरोनल, ग्लियाल या न्यूरॉनल अग्रदूत कोशिकाओं के लिए डिलीवरी वाहनों के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, तो बायोमैटिरियल्स लंबी दूरी के अक्षीय नेटवर्क के पुनर्गठन के लिए असमर्थ हैं। सीएनएस की चोट और बीमारी के साथ जुड़े अक्षीय मार्ग दोनों के अपक्षय और न्यूरोनल हानि दोनों से निपटने वाले एक दृष्टिकोण के विकास की चुनौती अब भी बनी हुई है <Sup वर्ग = "xref"> 31

हमारे अनुसंधान समूह ने पहले इंपैन्टable सूक्ष्म ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन) के विकास की सूचना दी, जो "जीवित पाड़" का एक प्रकार है, जिसमें न्यूरोनल सेल निकाय शामिल है जो एक एग्रोसेज हाइडोगेल-ईसीएम माइक्रो-कॉलम के एक या दोनों छोर तक सीमित है। , इस त्रि-आयामी (3 डी) encasement 1 , 10 , 31 , 32 के इंटीरियर के भीतर स्थित गठबंधन अक्षीय ट्रेक्टर्स के साथ। इस तकनीक और पिछले दृष्टिकोण के बीच मुख्य अंतर यह है कि सूक्ष्म- TENN के cytoarchitecture पूरी तरह से इन विट्रो में बनाया जाता है और बाद में 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup वर्ग = "xref"> 39 , 40 , 41 इन विट्रो फैब्रिकेशन में सेलुलर फिनोटाइप और ओरिएंटेशन, मैकेनिकल / भौतिक गुणों, जैव रासायनिक संकेतों और एक्सोजेन्सिक कारकों का व्यापक स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है, जो इम्प्लांटेशन 41 , 42 के बाद मेजबान के साथ इन स्कॉफोल्ड के एकीकरण को लाभ देता है। माइक्रो-टीएनएन स्वत: प्रेरणा से प्रेरित हैं क्योंकि वे मस्तिष्क की न्यूरोनाटॉमी का अनुकरण करते हैं, जो उन मस्तिष्क के अलग-अलग कार्यात्मक क्षेत्रों ( चित्रा 1 ए ) 1 से जुड़े अक्षरों के समान प्रदर्शित होते हैं। इसलिए, यह रणनीति घाटे वाले क्षेत्र में प्रत्यारोपण के बाद शारीरिक रूप से बदले हुए सफेद पदार्थों के नलिकाओं और न्यूरॉन्स को बदलने में सक्षम हो सकती है। यह तकनीक विकास तंत्र से भी प्रेरित है जिसमें "प्राकृतिक जीवित scaffolds" रेडियल glial कोशिकाओं और अग्रणी axons द्वारा गठित सेल के लिए पथ पथ गाइड के रूप में कार्य करता हैसेवेंटरिकुलर ज़ोन और एक्सीनल आउटग्रोथ से क्रमशः 43 इन तंत्रों को सूक्ष्म-टीएनएन के गठबंधन अक्षांश के क्षेत्र में दोहराया जाता है, जो कि तंत्रिका कोशिका प्रवासन और अक्षतंतु-मध्यस्थीय अक्षीय उत्खनन ( चित्रा -1 सी ) 43 द्वारा जीवित मार्गों को पेश कर सकता है। इसके अलावा, यह रणनीति माइक्रो-टेनन न्यूरॉन्स और नेटिव सर्किट्री के बीच अन्तर्ग्रथनी एकीकरण का लाभ लेती है, जिससे नए रिले बनते हैं जो कार्यात्मक वसूली ( चित्रा 1 बी ) 43 में योगदान दे सकते हैं। Synapse गठन की क्षमता भी इस दृष्टिकोण को सीएनएस को कम करने और नेटवर्क प्रतिक्रिया के अनुसार मेजबान टिशू को प्रतिक्रिया करने की क्षमता प्रदान कर सकती है। उदाहरण के लिए, जीवित scaffolds में optogenetically सक्रिय न्यूरॉन्स synaptic बातचीत ( चित्रा 1 डी ) के माध्यम से मेजबान न्यूरॉन्स को विनियमित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।

इसके अलावा, बायोमैटिकल-आधारित ट्यूबलर कन्स्ट्ररसूक्ष्म-टीएनएन के प्रयोग से सेल आसंजन, विकास, न्यूरैट विस्तार और सिग्नलिंग के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान किया जाता है, जबकि निर्माण के लघु आयामों में संभवतः कम से कम इनवेसिव आरोपण को अनुमति दी जाती है और मस्तिष्क में क्रमिक एकीकरण के लिए आंशिक रूप से सिक्वर्टेड माइक्रोएनेयरमेंट प्रदान करता है। दरअसल, हाल के प्रकाशनों ने चूहा मस्तिष्क में आरोपण के बाद तंत्रिका पथ की नकल करने के लिए सूक्ष्म-टीएनएन की क्षमता का प्रदर्शन किया है। स्टीरियोटेक्सिक माइक्रोइन्ग्नाइजेशन के बाद, हमने माइक्रो-टीएनएन न्यूरोनल अस्तित्व, एक्सऑनल ट्रैक्ट आर्किटेक्चर के रखरखाव, और मेजबान प्रांतस्था में न्यूरैट एक्सटेंशन का विवो 10 , 31 में कम से कम 1 महीने तक साक्ष्य दर्ज किया है। इसके अलावा, सिनापसिन के साथ लेबलिंग मूल ऊतक 10 , 31 के साथ अन्तर्ग्रथनी एकीकरण के हिस्टोलॉजिकल प्रमाण प्रदान करता है। कुल मिलाकर, सूक्ष्म-टीएनएन क्षतिग्रस्त होकर पुनर्निर्माण और विनियमित करने के लिए विशिष्ट रूप से अनुकूल हो सकता हैखोया न्यूरॉन्स की जगह सीएनएस, होस्ट सर्किरी के साथ समन्वयित रूप से एकीकरण, खोए अक्षीय साइटोर्काचिकित्सा बहाल करना, और, कुछ मामलों में, उपयुक्त पाथफाइंडिंग संकेतों के साथ रीजनेटिंग एक्सॉन प्रदान करना।

आकृति 1
चित्रा 1: माइक्रो-टिशू इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन) के विकास के सिद्धांत और प्रेरणा। ( ) माइक्रो-टीएनएन मस्तिष्क संयोजी (बैंगनी) के cytoarchitecture की नकल करते हैं, जिसमें कार्यात्मक रूप से अलग-अलग क्षेत्रों लंबे, गठबंधन अक्षीय ट्रेक्ट्स से एक यूनिडायरेक्शनल (लाल, हरे) या द्विदिश (नीला) तरीके से जुड़े होते हैं। उदाहरण के तौर पर, सूक्ष्म-टीएनएन को कॉर्टिकोथैलेमैम और निगोस्ट्रायटल पाथों में या इंटोरहिनल कॉर्टेक्स से प्ररित मार्ग में हिपोकैम्पस (स्टूज़िना एट अल , 2015 से अनुकूलित) 1 में खोए हुए कनेक्शन का पुनर्गठन किया जा सकता है। ( बी ) एक यूनिडायरेक्शनल आरेखएल और द्वि-दिशात्मक सूक्ष्म-टीएनएन (क्रमशः लाल और नीला, क्रमशः) मेजबान सर्किटरी (बैंगनी) के साथ एकीकरण के लिए एक घाव के दोनों छोरों के बीच एक कार्यात्मक रिले के रूप में काम करता है। ( सी ) एक यूनिडायरेक्शनल सूक्ष्म-टीएनएन (हरा) के अक्षतलों के योजनाबद्ध, एक लक्ष्य के लिए अक्षतंतु-सुविधा वाले उत्थान के लिए एक मार्गदर्शिका के रूप में कार्यरत है, जिसके साथ माइक्रो-टेनएन इंटरैक्ट होता है। ( डी ) उत्तेजक या निरोधात्मक न्यूरॉन्स (नीचे) के साथ अन्तर्ग्रथनी एकीकरण का लाभ उठाते हुए, न्यूरोमोडुलेटरों के रूप में ऑप्टोगैनेटिक रूप से सक्रिय माइक्रो-टेनेन्स के उपयोग के संकल्पनात्मक आरेख। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

वर्तमान पांडुलिपि में भ्रूणिक रूप से प्राप्त सेरेब्रल कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का उपयोग करके माइक्रो-टेनएन बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का विवरण दिया गया है। विशेषकर, सूक्ष्म-टीएनएन अन्य प्रकार के तंत्रिका कोशिकाओं के साथ गढ़े जा सकते हैं। पूर्व के लिएपर्याप्त, सफल सूक्ष्म-टीएनएन विकास की प्रारंभिक रिपोर्ट में डॉरसल जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स 32 एक कस्टम निर्मित, लेजर कट बेलनाकार चैनल सरणी या तरल एगरोज़ को जोड़कर हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम ( चित्रा 2 ए ) उत्पन्न किया जा सकता है, दोनों में गठबंधन वाले एक्यूपंक्चर सुई होते हैं। सुई लुमेन का निर्माण करता है और सूक्ष्म-स्तंभ के भीतर का व्यास (आईडी) को निर्धारित करता है, जबकि लेजर कट डिवाइस में केशिका ट्यूब आईडी और सिलेंडर का व्यास निर्माण के बाहरी व्यास (ओडी) को नियंत्रित करता है। उपकरण और केशिका ट्यूब और एक्यूपंक्चर सुई के लिए क्रमशः विभिन्न व्यास का चयन करके वांछित आवेदन के अनुसार ओडी और आईडी को चुना जा सकता है। माइक्रो-कॉलम की लंबाई भी भिन्न हो सकती है; आज तक, हमने सूक्ष्म-टीएनएन के निर्माण की लंबाई 10 मिमी में 10 मिमी तक की सूचना दी है और सक्रिय रूप से अब तक की लंबी अवधि का पीछा कर रहे हैं। Agarose जैल और एक्यूपंक्चर n के बादईडल्स हटा दिए जाते हैं, एक ईसीएम समाधान आमतौर पर टाइप 1 कोलेजन और लैमिनिन से बना होता है जो निर्माण के लुमेन ( चित्रा 2 सी ) में जोड़ा जाता है। ईसीएम कोर ने न्यूरोनल सेल आसंजन और अक्षीय परिणाम की सहायता के लिए एक मचान प्रदान किया है। प्रारंभिक, प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स 10 , 31 , 32 असंबद्ध सेल निलंबन का उपयोग कर माइक्रो कॉलम में चढ़ाया गया। हालांकि, इस दृष्टिकोण ने सभी मामलों में लक्ष्य cytoarchitecture का उत्पादन नहीं किया था, जिसे सूक्ष्म-स्तंभों के अंत तक प्रतिबंधित न्यूरोनल सेल निकाय के रूप में परिभाषित किया गया था, साथ ही केंद्रीय लुमेन में शुद्ध गठबंधन अक्षीय आचरण शामिल थे। तब से, मजबूर न्यूरोनल एकत्रीकरण पद्धति (अनग्रिन एट अल । से अनुकूलित प्रोटोकॉल पर आधारित) के उपयोग ने आदर्श संरचना ( चित्रा 2 बी ) 44 के साथ माइक्रो-टीएनएन के अधिक विश्वसनीय और सुसंगत निर्माण सक्षम किया है। वर्तमान का वर्णन करने के अलावाकार्यप्रणाली, इस लेख में माइक्रो-टीएनएन के प्रतिनिधि चरण-विपरीत और confocal छवियां दिखाई देंगी जो समय के साथ अक्षीय ट्रेक्ट्स के निर्माण का प्रदर्शन करती हैं, साथ ही साथ अंतिम लक्ष्य वाले साइटोराचाचरचर यह पांडुलिपि प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं और माइक्रो-टेनन प्रौद्योगिकी के शेष चुनौतियों और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर विस्तार करेगा।

चित्र 2
चित्रा 2: तीन चरण के सूक्ष्म-टेनन निर्माण प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख। ( ) एगारोस हाइड्रोगेल का विकास: (i) शुरू में, एक छोटी एक्यूपंक्चर सुई ( जैसे , व्यास में 180-350 सुक्ष्ममापी) को कस्टम-निर्मित, लेजर-कट ढालना या एक केशिका ट्यूब के बेलनाकार चैनलों में डाला जाता है ( उदा। , व्यास में 380-700 माइक्रोन)। अगले चरण में, डीपीबीएस में द्रव एगरोज़ को बेलनाकार चैनल या केशिका ट्यूबों में पेश किया जाता है। (Ii) agarose जैल के बाद, सुई हटा दी जाती है औरढालना खोखले agarose सूक्ष्म कॉलम उपज के लिए disassembled है (Iii) डीपीबीएस में इन निर्माणों को निष्फल और संग्रहीत किया जाता है। ( बी ) प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति और कुल विधि: (i) न्यूरोनल एकत्रीकरण पिरामिड सूक्ष्म-अच्छी तरह से सरणियों में किया जाता है, जो 3-डी-मुद्रित मोल्डों से डाली जाती है, जो कि 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुएं में फिट होते हैं। (Ii) माइक्रो-टीएनएन में भ्रूण के दिन -18-चूहों के भ्रूण के दिमाग से अलग-अलग प्राथमिक चूहे न्यूरॉन्स अलग-अलग होते हैं। ट्रिप्सिन-ईडीटीए और डीएनस 1 के साथ ऊतक विघटन के बाद, 1.0-2.0 x 10 6 सेल / एमएल के घनत्व के साथ एक सेल समाधान तैयार किया गया है। (Iii) इस समाधान के 12 μL पिरामिड सूक्ष्म अच्छी तरह से सरणी में प्रत्येक कुएं को स्थानांतरित कर दिया जाता है। इन सूक्ष्म कुएं युक्त प्लेट सेल समुच्चय का उत्पादन करने के लिए केन्द्रित किया गया है। (Iv) ये तब सूक्ष्म-स्तंभों में चढ़ाने से पहले रातोंरात लगाए जाते हैं। ( सी ) ईसीएम कोर निर्माण और सेल बीइंग: (i) सेल बीइंग से पहले, 1 एमजी / एमएल टाइप आई कोलेजन और 1 मिलीग्राम / एमएल युक्त ईसीएम समाधानलमिनिन को सूक्ष्म-टीएनएन के इंटीरियर में स्थानांतरित किया जाता है और उसे पोलीमर बनाने की अनुमति है (Ii) इस पर निर्भर करते हुए कि क्या यूनिडायरेक्शनल या द्विदिश माइक्रो-टीएनएन गढ़े जा रहे हैं, एक कुल को क्रमशः सूक्ष्म-स्तंभ के एक या दोनों चरम पर रखा गया है। (Iii) आसंजन को बढ़ावा देने के लिए ऊष्मायन की अवधि के बाद, माइक्रो-टीएनएन पूरक भ्रूण न्यूरोनल बेसल माध्यम के साथ भर में पेट्री डिश में सुसंस्कृत हैं। (Iv) संस्कृति में 3-5 दिनों के बाद, अंतिम सूक्ष्म-टीएनएन संरचना में सूक्ष्म-स्तंभ के चरम पर कोशिकाओं के समुच्चय को प्रदर्शित करना चाहिए, इसकी लंबाई लंबाई में फैले अक्षीय ट्रेक्ट्स के साथ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रक्रियाएं, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों और माइकल जे। क्रेसेन्ज़ के दिग्गजों मामलों के मेडिकल सेंटर द्वारा अनुमोदित की गईं और मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला के प्रयोग पर एनआईएच सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति में दिये गये दिशानिर्देशों का पालन करती हैं। पशु (2015)

1. एगारोज हाइड्रोजेल का विकास (सूक्ष्म-टीएनएन के एक्सेलुलर घटक)

  1. Agarose समाधान तैयारी
    1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर, सूक्ष्म-स्तंभों के लिए जलाशयों को तैयार करके 20 मिलीलीटर की डल्बेक्को के फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (डीपीबीएस) को दो 10 सेमी पेट्री डिश में से प्रत्येक में स्थानांतरित कर दें। एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ के साथ ठीक संदंश और microscalpels जीवाणुरहित
    2. Agarose के 3 ग्राम वजन और जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक बाँझ बीकर में स्थानांतरण। 3% वजन / मात्रा (डब्ल्यू / वी) के अंतिम एकाग्रता के लिए 100 एमएल डीपीबीएस जोड़ें। एक साफ चुंबकीय पट्टी शामिल करें और अलमारी के साथ बीकर को कवर करेंNum पन्नी
    3. गर्म प्लेट / उत्तेजक के साथ, बीकर को 100 डिग्री सेल्सियस से गर्म करें और 120-200 आरपीएम पर हलचल करें ताकि पूरी तरह से agarose (समाधान हलचल से साफ़ हो जाएगा) को भंग कर दें। जलोदर को रोकने के लिए बाद में हीटिंग और सरगर्मी को बनाए रखें और agarose जलाने से बचने के लिए आवश्यक हीटिंग तापमान को बदल दें।
      नोट: लेजर कट डिवाइस और केशिका ट्यूब दोनों के साथ निर्माण क्रमशः उपखंड 1.2 और 1.3 में प्रस्तुत किया गया है। उप-धारा में वर्णित चरणों को पूरा करने के बाद उप-अनुभाग 1.4 में आगे बढ़ें। सूक्ष्म-स्तंभ निर्माण दोनों तरीकों के लिए, तरल agarose जल्दी से जोड़ें, क्योंकि agarose तेजी से मजबूत रूप में यह ठंडा है। जब निम्न में से किसी भी एक चरण में आटोक्लेव के साथ स्टरलाइज़ किया जाए, कांच के बने पदार्थ पर लागू मानक शर्तें का उपयोग करें
  2. लेजर कट डिवाइस का उपयोग करके माइक्रो-कॉलम तैयारी
    नोट: लेजर कट डिवाइस एक वाणिज्यिक सीओ 2 लेजर कटर का उपयोग करके पारदर्शी एक्रिलिक से काटा जाता है। फैब्ररीलेजर काटने के माध्यम से संरचनाओं और उपकरणों का निर्माण, कई इंजीनियरिंग और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित है 45 , 46 , 47 । इस ढालना ( चित्रा 3 ) में पांच बेलनाकार चैनलों की एक सरणी होती है, प्रत्येक में 3 9 8 माइक्रोन का व्यास और 6.35 मिमी की लंबाई होती है। ये बेलनाकार सरणियां अपनी लंबाई के साथ दो टुकड़ों से बनती हैं: एक निचला आधा (लंबाई: 25.4 मिमी, चौड़ाई: 6.35 मिमी, ऊंचाई: 6.0 मिमी) और एक शीर्ष आधा (लंबाई: 31.5 मिमी, चौड़ाई: 6.35 मिमी, ऊंचाई: 12.7 मिमी ), जैसा कि आंकड़े 3 ए और 3 बी में दिखाए गए हैं, क्रमशः। चित्रा -3 सी (लंबाई: 31.5 मिमी, चौड़ाई: 6.35 मिमी, ऊंचाई: 12.7 मिमी) में देखे गए पूर्वकाल और पीछे के कैप द्वारा दोनों हिस्सों को एक साथ रखा जा सकता है, जो चार संरेखण छेदों को दर्शाता है जो कि ऊपर और नीचे प्रत्येक के दो छेदों के साथ मेल खाते हैं टुकड़े और जो सभी हिस्सों को एक साथ सुरक्षित कर देते हैं जब खराब हो जाते हैं। ये कैप्स भी इंकबेलनाकार चैनलों के लिए गाढ़ा पांच छेद, जिसमें सूक्ष्म कॉलम के लुमेन के रूप में एक्यूपंक्चर सुई डाली जा सकती है।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी और आटोक्लेविंग के साथ इसे कवर करके चित्र 3 में दिखाए गए डिवाइस को जीवाणुरहित करें। चित्रा 3 में दिखाए गए डिवाइस को नीचे के आधे टुकड़े के साथ पूर्वकाल और पीछे के कैप को संरेखित करके दो संरेखित छेद में दो # 4-40 स्क्रू और नट्स (थ्रेड व्यास: 3.05 मिमी) के साथ तीन भागों को सुरक्षित करने के लिए इकट्ठा करें।
    2. सुई छेद में पूरी तरह से एक्यूपंक्चर सुई (व्यास: 180 माइक्रोन, लंबाई: 30 मिमी) का परिचय या तो डिवाइस के पूर्वकाल या पश्च कैप ( चित्रा 3 डी ) पर। माइक्रोप्रिपेट के साथ, नीचे-आधा टुकड़े पर पर्याप्त तरल एगरोज़ (पांच चैनलों के लिए ~ 1 एमएल) को पूरी तरह से बेलनाकार चैनल के हिस्सों में भरें।
    3. तुरंत छमाही के ऊपर डिवाइस के ऊपर-आधा टुकड़े को स्थानांतरित करें और जब तक यह मजबूती से नहीं होता तब तक दबाव डालेंबेलनाकार चैनल को पूरा करने के लिए जगह (टोपी के बीच घर्षण और शीर्ष टुकड़ा बाद में रखेंगे) डिवाइस के चैनलों के अंदर अपने चमक को समायोजित करने के लिए agarose addition के बाद कमरे के तापमान पर ~ 5 मिनट की प्रतीक्षा करें।
    4. डिवाइस के कैप पर प्रत्येक छेद से सुई को मैन्युअल रूप से निकालें। शिकंजा निकालें और मैन्युअल रूप से दो कैप और नीचे आधा टुकड़े से ऊपर आधे को अलग करें, जहां बाद में हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम रखे जायेंगे।
    5. नीचे से आधे हिस्से पर चैनलों से सूक्ष्म-स्तंभों को धीरे से निकालकर ठीक से संदंश का उपयोग करें और उन्हें डीपीबीएस (चरण 1.1.1) वाला पहले से तैयार पेट्री डिश में रखें। सूक्ष्म-स्तंभ निर्माण के दूसरे दौर के लिए डिवाइस को फिर से बनाएं। उपखंड 1.4 की तरफ बढ़ोतरी
  3. केशिका ट्यूबों का उपयोग करके माइक्रो-कॉलम निर्माण
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर गिलास केशिका ट्यूब (व्यास: 398.78 माइक्रोन, लंबाई: 32 मिमी) का स्थानांतरण करें। मैन्युअल रूप से तोड़लंबे ट्यूबों में 2.0-2.5 सेमी टुकड़े और पूरी तरह से प्रत्येक टुकड़ा ( चित्रा 2 ए ) में एक एक्यूपंक्चर सुई (व्यास: 180 माइक्रोन, लंबाई: 30 मिमी) डालें।
    2. बीकर से खाली पेट्री डिश की सतह तक तरल एगरोज़ के 1 एमएल ट्रांसफर करें। केशिका ट्यूब और शुरू की गई सुई को पकड़कर, तरल एगरोज पूल के संपर्क में ट्यूब के एक छोर को कैशिलरी कार्रवाई से भर दें। केशिका वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए ट्यूब को उत्तेजित करें
      नोट: केशिका क्रिया परमिट के रूप में तरल agarose के साथ केशिका ट्यूबों को भरें; इसके बाद, इन सूक्ष्म कॉलमों को इच्छित संरचनाओं के आधार पर छोटे निर्माण में काटा जा सकता है। 1-एमएल agarose पूल आमतौर पर केवल एक ट्यूब के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि agarose ठंडा और जेल तेजी से, आगे कीशिका कार्रवाई को रोकने।
    3. जब तरल बढ़ जाती है, तो पूल से केशिका ट्यूब को हटा दें और इसे पेट्री डिश की सतह पर क्षैतिज रूप से रखें। 5 मिनट के लिए इंतजार करें ताकि ट्यूबों में agarose जेल चले जाएं/ Li>
    4. ट्यूब के दोनों तरफ अंगूठे और तर्जनी की स्थिति को व्यवस्थित करें और उसके खिलाफ दबाएं। अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग करते हुए सूक्ष्म-स्तंभ को ट्यूब से बाहर फिसलने से रोकने के लिए सुई को तुरंत खींचने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। धीरे-धीरे माइक्रो-कॉलम को डीपीबीएस (चरण 1.1.1) वाले डिश में ढकने के लिए केशिका ट्यूब में एक 30-गेज सुई डालें।
  4. माइक्रो-कॉलम ट्रिमिंग और नसबंदी
    1. ठीक संदंश के जरिये एक माइक्रो-कॉलम डीबीबीएस से एक खाली डिब्ब में नमक स्थानांतरित करें। सुखाने को रोकने के लिए सूक्ष्म-स्तंभ के ऊपर 10 μL डीबीपीएस को माइक्रोप्रोपेट के साथ जोड़ें। दृश्य मार्गदर्शन के लिए एक स्टीरियोस्कोप के बाद वाला डिश रखें।
      नोट: प्रोटोकॉल के दौरान, सूक्ष्म-स्तंभ सुखाने या निर्जलीकरण का मतलब क्रैम्प्लड संरचना के अधिग्रहण से है, जो इन संरचनाओं के सामान्य, हाइड्रेटेड उपस्थिति से अलग-अलग रूप से भिन्न है। निर्जलित माइक्रो-कॉलम पेटी डिश और सी की सतह से मजबूती से संलग्न हैंटिप्पणी को आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है, जबकि हाइड्रेटेड संरचनाएं संदंश के साथ छेड़छाड़ के बाद सतह पर फैली हुई हैं। पूरी तरह से सूखे सूक्ष्म-स्तंभ के चरण-विपरीत छवि को चित्र 8 ए में दिखाया गया है।
    2. सूक्ष्म-स्तंभ को एक माइक्रोस्कोपेल के साथ ट्रिम करें ताकि इसे वांछित लंबाई में छोटा कर दिया जाए (यहां, 2-5 मिमी)। कदम 1.1.1 में तैयार अन्य डीपीबीएस पेट्री डिश के लिए ठीक संदंश के साथ छंटनी सूक्ष्म-स्तंभ को ट्रांसपोर्ट करें।
    3. हर गढ़े हुए माइक्रो-कॉलम के लिए 1.4.1 और 1.4.2 के चरणों को दोहराएं।
    4. 1 घंटे के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत डीपीबीएस युक्त पेट्री डिश में माइक्रो-कॉलम को जीवाणुरहित करें। ईसीएम के अतिरिक्त और सेल चढ़ाना से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश स्टोर करें।

2. प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति और मजबूर सेल एकत्रीकरण विधि

  1. पिरामिडल सूक्ष्म अच्छी सरणी की तैयारी
    नोट: यह खंड एक 3 डी-मुद्रित मोल्ड को एक बेलनाकार आधार (व्यास: 2.2 सेमी, ऊंचाई: 7.0 मिमी) से युक्त है।चित्रा 3 ई में दिखाए गए अनुसार, 3 x 3 सरणी में व्यवस्थित किया गया, शीर्ष पर 9 वर्ग के पिरामिड (साइड की लंबाई: 4.0 मिमी, तिरछा कोण: 60 डिग्री)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी प्रिंटर का उपयोग करने वाली योजक विनिर्माण प्रक्रिया अच्छी तरह से प्रलेखित है। कंप्यूटर-एडेड डिजाइन सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल ढालना डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है। परिणामस्वरूप डिजाइन फ़ाइल को तब एक 3D प्रिंटर के लिए उपकरण-पथ में डिजिटल रुपांतरित किया जा सकता है। प्रत्येक प्रिंटर में अलग-अलग विशिष्टताएं होती हैं, और एक 3D प्रिंटर को सेट अप और संचालन के लिए निर्देश अलग-अलग होते हैं।
    1. एक 10 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन में केंद्रित एक 4 x 4 सरणी (साइड की लंबाई: 4 सेंटीमीटर, छेद अलग करना: 1 सेंटीमीटर) में छेद करने के लिए 3/32 "ड्रिल बिट का प्रयोग करें। एक रासायनिक धुएं के हुड के अंदर, उपयोग करें पेट्री डिश का निचला हिस्सा पॉलीडिमैथाइलसिलोनैन (पीडीएमएस) के 27 ग्राम और इलाज के एजेंट के 3 ग्राम (1:10 अनुपात के लिए) वजन करने के लिए होता है। एजेंट को समान रूप से वितरित करने के लिए माइक्रो-स्पैटुला के साथ हलचल।
    2. पीडीएमएस / इलाज करने वाले एजेंट को पंचर ढक्कन के साथ कवर करें। एक नली के एक छोर को रिक्त करने के लिए कनेक्ट करेंधूआं हुड का बंदरगाह और फ़नल के स्टेम में दूसरे छोर को डालें (मुंह व्यास: 10 सेमी, स्टेम लंबाई: 3 सेमी, स्टेम व्यास: 1.5 सेमी)।
    3. एक 1 एमएल विंदुक बल्ब के शीर्ष पर एक 3/32 "ड्रिल बिट खोलकर खोलें और खोलने में 1,000 μL माइक्रोप्रिपेट टिप सुरक्षित करें (ऊपर की ओर ऊपर की ओर)। बल्ब और टिप को नली में रखें और खींचें नली ऊपर की तरफ जब तक बल्ब नली को नहर के स्टेम में जकड़ता है।
    4. फंक्शयुक्त पकवान ढक्कन पर फ़नल रखें और एक उपलब्ध मजबूत समर्थन के साथ नली को सुरक्षित रखें। 5 मिनट के लिए वैक्यूम वाल्व खोलें और सतह पर हवा के बुलबुले लाओ।
    5. वाल्व को बंद करें, फ़नल को हटा दें, और धूआं हुड की सतह के खिलाफ पेट्री डिश को दबाएं- 3 बार किसी भी हवा के बुलबुले को फटा करने के लिए।
    6. एक 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में प्रत्येक कुओं में एक पिरामिड-अच्छी तरह से 3 डी-मुद्रित मोल्ड रखें, जिसमें पिरामिड का संकेत मिलता है। टीडीएमएस / इलाज करने वाले एजेंट को ढक्कन के शीर्ष पर डालें जब तक टी के प्रत्येक खैर न होवह प्लेट भर गया है अपने ढक्कन के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें और इसे 1 डिग्री सेल्सियस पर 60 डिग्री सेल्सियस तक सूखने के लिए ओवन में स्थानांतरित करें।
    7. एक सूक्ष्म-रंग के साथ थाली से प्रत्येक पीडीएमएस सूक्ष्म-अच्छी सरणी ( चित्रा 3 एफ ) को ध्यान से हटा दें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ PDMS सरणियों को कवर करें और आटोक्लेविंग द्वारा बाँझें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, एक 12-अच्छी तरह से प्लेट ( चित्रा 2 बी ) के प्रत्येक खैर में एक सूक्ष्म-अच्छी सरणी डालें।
  2. चूहे के भ्रूण से कॉर्टिकल न्यूरॉन अलगाव
    1. एक बायोसाफेटी कैबिनेट के अंदर चार से छः 10 सेमी पेट्री डिश (हर विच्छेदित ऊतक के लिए एक) में हर हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के ~ 20 एमएल जोड़ें। इन व्यंजनों को विच्छेदन हुड में स्थानांतरित करें और उन्हें बर्फ पर रखें गर्म बीड स्टीरलाइज़र के साथ विच्छेदन उपकरण, जैसे माइक्रोस्कोपल्स, कैंची और संदंश, को जीवाणुरहित करें।
    2. पूर्व गर्म भ्रूण न्यूरॉन बेसल मध्यम + 2% सीरम मुक्त पूरक + 0.4 मिमी एल-ग्लूटामाइन (इसे "संस्कृति माध्यम" के रूप में जाना जाता हैआर) और 0.25% ट्रिप्सिन + 1 एमएम एथिलीनएमीनियानेटेटिक एसिड (ईडीटीए) 37 डिग्री सेल्सियस पर थॉ डीऑक्सीरिबोन्युकेलीज (डीएनज़) मैं इसे कमरे के तापमान पर रखकर। एचबीएसएस में 0.15 मिलीग्राम / एमएल डीएनसी मैं समाधान के 1.5 एमएल तैयार करें और बर्फ पर समाधान बनाए रखें।
    3. कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा एक समयबद्ध-गर्भवती भ्रूण-दिन -18 चूहा को पुष्ट करें और शिरच्छेद से मृत्यु की पुष्टि करें। शव को बाँझ विच्छेदन हुड में स्थानांतरित करें और इसे उदर-पक्ष ऊपर रखें। पेट को अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ कुल्ला।
    4. गर्भाशय को खोलें और भ्रूणों को (आमतौर पर ~ 11) कैंची से एम्नियोटिक थैलों से हटा दें और उन्हें संदंश के साथ एक पेट्री डिश में ठंडा एचबीएसएस युक्त स्थानांतरित करें, जैसा कि वर्णित है 48 । स्टीरियोस्कोप के नीचे एक ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) ग्रेनाइट ब्लॉक रखें। विच्छेदन प्रक्रिया में एचबीएसएस के निम्न तापमान को संरक्षित करने के लिए इस ठंड ब्लॉक की सतह पर पेट्री डिश रखें।
    5. पिल्ले को एचबीएसएस के आसपास स्विफ्ट करके कुल्ला और फिर उन्हें अगले साफ डिश में भेज देंएचबीएसएस युक्त स्टिरिओस्कोप और विच्छेदन उपकरणों की सहायता से, अनुक्रमिक रूप से सिर, मस्तिष्क गोलार्द्धों, और भ्रूणों के कॉर्टिस को हटा दें और प्रत्येक विच्छेदन 48 के बाद एक नए एचबीएसएस से भरे पकवान में संदंश के साथ प्रत्येक ऊतक को स्थानांतरित करें।
    6. पाश्चर पिपेट के साथ केवल कॉर्टिस की तरक्की करें और ऊतक को बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। अन्य विच्छेदित ऊतकों को त्यागें सीरियल विंदुक के साथ ~ 5 एमएल एचबीएसएस के क्रमिक रूप से जोड़कर और निकालने से तीन बार कॉर्टिस को कुल्ला। उपयोग में नहीं होने पर ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    7. एक पाश्चर पिपेट के साथ cortices को 15 मिलीलीटर ट्यूब युक्त प्री-वार्मर ट्रिप्सिन-ईडीटीए (ट्रिप्सिन-ईडीटीए 5 मील प्रति 5 एमएल प्रति) में स्थानांतरण करें। मैन्युअल रूप से ट्यूब को एक बार आंदोलन और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें ऊतक को clumping से रोकने के लिए हर 3 मिनट ट्यूब उलटा।
    8. पाश्चर विंदुक के साथ ऊतक को हटाकर और 15 एमएल के अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करने के बाद ~ 10 मिनट के बाद ट्रिप्सिन के संपर्क को रोकेंट्यूब। एक विंदुक के साथ ट्यूब में 0.15 मिलीग्राम / एमएल डीएनस आई समाधान (1.5 एमएल) जोड़ें।
    9. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें ताकि टिशू क्लंप और भंवर (~ 30 एस) को मैन्युअल रूप से तोड़ दिया जाए, जब तक समाधान सजातीय नहीं दिखता और तरल में शेष शेष टिशू टुकड़े न हो। यदि समाधान का पूरी तरह से होमोजिनाइज करना संभव नहीं है, तो उन्हें पाश्चर पिपेट की नोक में खींचकर अघुलनशील टुकड़े निकालें।
    10. 3 मिनट के लिए 200 xg के चरण 2.2.9 में प्राप्त समरूप सेल समाधान को अपकेंद्रित्र। पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, ध्यान से पेलेटेड कोशिकाओं को परेशान न करें। कोशिकाओं को पुन: resppend करने के लिए एक सीरियल विंदुक और भंवर के साथ 2 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    11. एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके चरण 2.2.10 में तैयार समाधान में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें; अपेक्षित उपज 3.0-5.0 x 10 6 कोशिकाएं / कोशिका गोलार्ध हैं। 1.0-2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की घनत्व के साथ, संस्कृति माध्यम में 1 एमएल या अधिक सेल निलंबन तैयार करें।
  3. न्यूरोनल सेल समुच्चय का गठन
    1. माइक्रोप्रोपेट के साथ, पीडीएमएस सरणी के प्रत्येक माइक्रो-वेल में 1.0-2.0 x 10 6 / एमएल सेल निलंबन के 12 μL जोड़ें (जो चरण 2.1.7 में थाली में रखा गया था)।
      नोट: सेल एकाग्रता को सूक्ष्म-कॉलम आईडी और वांछित सेल के समग्र आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, क्योंकि उच्च सांद्रता अधिक समुच्चय उत्पन्न करती हैं।
    2. सूक्ष्म कुओं ( चित्रा 2 बी ) के निचले भाग में कोशिकाओं के एकत्रीकरण को मजबूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 200 ग्राम में प्लेट को अपकेंद्रित करें। सावधानीपूर्वक एकत्रित कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए सभी सीड वाले सूक्ष्म कुओं को कवर करने के लिए प्रत्येक पीडीएमएस सरणी के ऊपर ~ 2 एमएल की संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    3. यदि कोशिकाओं को वायरल वेक्टर से ट्रांसडुल्ड नहीं किया जाता है, तो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 12-24 घंटे के लिए प्लेट सेते हैं और फिर खंड 3 में आगे बढ़ें। यदि समुच्चय ट्रांसडुस्ड हो जाए तो ऊष्मायन को छोड़ दें और खंड 2.4 पर जाएं ।
  4. लेन-देनकैल्शियम सिग्नलिंग को देखने के लिए वायरल वेक्टर के साथ दुर्घटना
    नोट: इन चरणों को एक वायरल वेक्टर युक्त न्यूरॉन्स को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है जिसमें आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (जीईसीआई) होता है। इस आलेख में दिखाए गए परिणाम वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एडीनो-जुड़े वायरस (एएवी) (सीरोटाइप 1) जीसीएएमपी 6 एफ के साथ जीईसीआई के जरिए प्राप्त किए गए थे, जिसमें ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), कन्तोयडुलिन (सीएएम), और एम 13 पेप्टाइड युक्त तेजी से कैनेटीक्स थे, मानव Synapsin मैं प्रमोटर द्वारा संचालित वायरल वेक्टर समाधान को शेयर समाधान की एकाग्रता के आधार पर, पारगमन से पहले बाँझ डीपीबीएस में कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। वेक्टर सांद्रता की एक श्रृंखला के लिए सेल स्वास्थ्य / आकृति विज्ञान और जीसीएएमपी 6f सिग्नल स्ट्रेंथ समय पर ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह ऑप्टिमाइज़ेशन प्रक्रिया प्रत्येक जांचकर्ता द्वारा अपने स्वयं के संस्कृतियों के लिए उपयुक्त टिटोरर निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। ठेठ GCaMP6f अभिव्यक्ति का समय 7-8 दिन होता है जो ट्रांसडक्शन के बाद होता है जो सेंट में किया जाने वाले ऊष्मायन के दौरान होता हैईपी 2.4.2।
    1. माइक्रोप्रिपेट के साथ, वायरल वेक्टर समाधान की आवश्यक मात्रा (कुल सकल प्रति ~ 3.0 x 10 9 जीनोमिक प्रतियों की एकाग्रता के लिए) को जोड़कर संस्कृति के माध्यम से जोड़ने के लिए, समुच्चय को कवर करना। यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट ऊपर और नीचे कि वेक्टर समाधान समग्र संस्कृति माध्यम में समसामयिक रूप से वितरित किया जाता है।
    2. जीसीएएमपी 6f के वायरल पारगमन के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए वरीयता वाले पिरामिड माइक्रो कुओं के साथ प्लेट को सेते।

3. माइक्रो-टीएनएन के सेलुलर अवयव का विकास

  1. ईसीएम कोर निर्माण
    1. कुल ऊष्मायन के बाद, ईसीएम समाधान तैयार करने के लिए माइक्रो-सेंट्र्रिज्यूज ट्यूब में संस्कृति के मध्यम (प्रत्येक में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए) प्रकार कोलेजन और लैमिनिन जोड़ें। कमरे के तापमान पर कदम 3.1.2-3.1.4 करें, लेकिन समय से पहले जलन को रोकने के लिए उपयोग में नहीं होने पर बर्फ पर ईसीएम के साथ ट्यूब को बनाए रखें।
    2. आवश्यकता के अनुसार ईसीएम को 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) और / या 1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 1 μL को जोड़ने के लिए, प्रारंभिक पीएच को सत्यापित करने के लिए 1-2 μL को लिटमुस पेपर स्थानांतरित करके ईसीएम समाधान के पीएच को समायोजित करें। और पीएच 7.2-7.4 तक दोहराता है। हवा के बुलबुले के गठन से बचाव करते समय ईसीएम समाधान के होमोजिनायझेशन को ऊपर और नीचे पिइपेट करके सुनिश्चित करें।
    3. स्टेरिलिज्ड संदंश के साथ सूक्ष्म-स्तंभों को चरण 1.4.3 में व्यंजन से 35- या 60 मिमी पेट्री डिश खाली करने के लिए स्थानांतरित करें। निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक समय में 4-5 माइक्रो-कॉलम पर काम करें। एक माइक्रोप्रोपेट के लिए 1,000-μL टिप से जुड़ी एक 10-μL टिप संलग्न करें। दृश्य मार्गदर्शन के लिए त्रिविम का उपयोग करना, सूक्ष्म-स्तंभों के एक छोर पर टिप रखें और लुमेन से अवशिष्ट डीपीबीएस और हवा के बुलबुले निकालने के लिए।
    4. माइक्रोप्रोपेट में जल्दी से 4-5 μL ईसीएम आकर्षित करें। एक स्टी के तहत निरीक्षणरीरोस्कोप, सूक्ष्म कॉलम के किसी एक छोर पर माइक्रोप्रिपेट की टिप रखें और ल्यूमन को भरने के लिए पर्याप्त ईसीएम छोड़ें। लुमेन में हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति की पुष्टि करें, क्योंकि ये ईसीएम के माध्यम से अक्षतित परिणाम को रोक सकते हैं। यदि हवा के बुलबुले मौजूद हैं, तो ईसीएम को हटा दें, जैसा कि चरण 3.1.3 में समझाया गया है, और ईसीएम को फिर से जोड़ें।
    5. निर्जलीकरण को रोकने के लिए, प्रत्येक सूक्ष्म-स्तंभ के आसपास ~ 2 μL ईसीएम जोड़ें पेट्री डिश में 37 डिग्री सेल्सियस और 25 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में हाइड्रोजेल / ईसीएम माइक्रो-कॉलम सेते हैं। ऊष्मायन के तुरंत बाद सेल बीजिंग के लिए आगे बढ़ें
      नोट: चरण 3.1.5 में ऊष्मायन अवधि सूक्ष्म-स्तंभों के अंदर कोलेजन और लामीनिन के पोलीमराइजेशन के लिए समय की अनुमति देना है।
  2. माइक्रो-कॉलम में न्यूरॉनल सेल बीइंगिंग
    नोट: ट्रांसडुस्ड समुच्चय के संस्कृति माध्यम को बदलने के लिए, प्लेट को झुकाएं, अच्छी तरह से दीवार की पूल को हटाने के लिए एक माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करें, और उसके बाद धीरे-धीरे ~ 1 एमएलदीवार (पिरामिड माइक्रो कुओं में समुच्चय को परेशान करने से बचने के लिए) इस माध्यम को दोबारा दोबारा दोबारा बदल दें।
    1. चरण 3.1.5 में ऊष्मायन अवधि के बाद, माइक्रो-कॉलम वाले पेट्री डिश में लगभग 10-20 μL संस्कृति माध्यम को दो मुक्त क्षेत्रों में स्थानांतरित करें। समुच्चय को पेट्री डिश में अलग-अलग स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करें और उन्हें सेल हेल्थ को संरक्षित करने के लिए संलयन के छोटे पूल में से एक में ले जाएं।
    2. स्टिरिओस्कोप के नीचे देखे जाने पर, द्विदिश सूक्ष्म- TENN के लिए सूक्ष्म-स्तंभों के प्रत्येक छोर पर या संदंश का उपयोग कर एक यूनिडायरेक्शनल आर्किटेक्चर (वांछित) के लिए एक छोर पर एक सम्मिलित करें। स्टिरिओस्कोप का उपयोग करके माइक्रो-कॉलम के भीतर समुच्चय के स्थान की पुष्टि करें। निर्जलीकरण से बचने के लिए और समग्र स्वास्थ्य को संरक्षित करने के लिए सांस्कृतिक माध्यम के अन्य छोटे पूल में वरीयता प्राप्त सूक्ष्म-स्तंभों को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 से 45 मिनट के लिए सेते हैंईसीएम का पालन करने के लिए समुच्चय सत्यापित करें कि समुच्चय लघु-स्तंभों के छोर पर बने हुए हैं जो त्रिविम का उपयोग करते हैं; सेल के समुच्चय को पुन: उत्पन्न करना और आवश्यकतानुसार ऊष्मायन चरण को दोहराएं।
    4. सीरीओरियल विंदुक का उपयोग करते हुए कृत्रिम माध्यम (क्रमशः 35 या 60 मिमी पेट्री डिश के लिए 3 या 6 एमएल) के साथ सूक्ष्म-टीएनएन वाले पेट्री व्यंजनों को सावधानीपूर्वक बाढ़ते हैं। इनक्यूबेटर में व्यंजन 37 डिग्री सेल्सियस और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए 5% सीओ 2 में रखें।
    5. संस्कृति माध्यम के साथ हर 2 दिन आधे-माध्यम परिवर्तन करें सावधानी से पुराने माध्यमों का आधा हिस्सा विंदुक के साथ हटा दें और सूक्ष्म-टीएनएन को सूखने से बचने के लिए दृश्य मार्गदर्शन के लिए त्रिविम का उपयोग करें। धीमी गति से ताजा, प्री-वार्मिंग माध्यम को एक विंदुक के साथ जोड़कर बदलें।
    6. पीडीएमएस सूक्ष्म-अच्छी तरह से सरणियों का पुनः उपयोग करने के लिए, संस्कृति के माध्यम को हटा दें, विआयनीकृत पानी में 30 मिनट के लिए सरणियां उबाल लें, और कुल गठन और संस्कृति के दूसरे दौर के लिए आटोक्लेव में बाँझें।
      नोट: वांछित समय समय पर,माइक्रो-टीएनएन के cytoarchitecture चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है। यहां चरण-विपरीत छवियों को कैप्चर करने के लिए 5-8 एमएस और 10 एक्स (0.64 माइक्रोग्राम / पिक्सेल) और 20 एक्स (0.32 माइक्रोग्राम / पिक्सेल) के उद्देश्य का उपयोग किया गया था। कैल्शियम एकाग्रता से जुड़ा प्रतिदीप्ति वायरल ट्रांसडुस्ड सूक्ष्म-टीएनएन में परिवर्तन एक उच्च गति प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग 50 एमएस का एक्सपोज़र समय, 10 एक्स उद्देश्य (0.64 माइक्रोग्राम / पिक्सेल), और 480 ~ 480 के बैंडपास फिल्टर के साथ ठोस-राज्य प्रकाश के साथ किया गया था। एनसीएम और ~ 510 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए, क्रमशः जीसीएएमपी 6 एफ प्रतिदीप्ति संकेत को देखने के लिए।

4. विट्रो स्टडीज में इम्यूनोक्योटोकामेस्ट्री

नोट: यहां दिखाए गए छवियों के लिए, निम्न प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया: माउस एंटी-तुज-1 / बीटा-तृतीय ट्यूबिलिन (1: 500) और खरगोश एंटी-सिनेपसिन-1 (1: 500) एक्सॉन लेबलिंग के लिए और प्री -सिनेप्टिक बॉटन, क्रमशः। माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी थे-माउस 568 (1: 500) और गधा विरोधी खरगोश 488 (1: 500)। तैयार प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधानों की अपेक्षित मात्रा, साथ ही फॉर्मलाडीहाइड, घोड़े सीरम और डिटर्जेंट समाधानों की मात्रा, पूरी तरह से निर्माणों को कवर करने के लिए आवश्यक मात्रा पर निर्भर करती है। इन खंडों को प्रत्येक माइक्रो-कॉलम के आसपास के क्षेत्र को सीमित करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक अवरोधक पेन का उपयोग करके कम किया जा सकता है।

सावधानी: यह खंड फॉर्मलाडिहाइड और होचस्ट को रोजगार देता है फार्मलाडेहाइड कैसरजनिक होने के लिए जाना जाता एक जहरीले यौगिक है, और होचस्ट एक ज्ञात उत्परिवर्तक है। इसलिए, इन यौगिकों को उचित अपशिष्ट कंटेनर में निपटा जाना चाहिए। उपयुक्त निजी सुरक्षा उपकरण जैसे कि प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, और दस्ताने का उपयोग करते हुए उन्हें हमेशा एक रासायनिक धुएं के हुड में रखें।

  1. एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर 1x फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) में 4.0% मात्रा / मात्रा (v / v) फॉर्मलाडिहाइड समाधान तैयार करें।
  2. पेट्री डिश कंटीनी से संस्कृति माध्यम निकालेंमाइक्रोबिपेट के साथ माइक्रो-टेनएन एनजी माइक्रो-टेनन को पूरी तरह से कवर करने के लिए व्यंजनों के फार्मलाडेहाइड समाधान का पर्याप्त मात्रा जोड़ें। सूक्ष्म-स्तंभों में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए सूक्ष्म-टीएनएन को 18-24 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए फार्मलाडेहाइड समाधान में भिगोएँ।
  3. एक विंदुक के साथ पेट्री डिश से 4.0% फॉर्मलाडेहाइड समाधान निकालें और उपयुक्त खतरनाक सामग्री निपटान के दिशानिर्देशों के अनुसार त्यागें।
  4. पर्याप्त पीबीएस को पूरी तरह से फिक्स्ड माइक्रो-टीएनएन को कवर करने और फिर पीबीएस को एक विंदुक के साथ हटाकर दो त्वरित रिन्जस करें। 10 मिनट के लिए पीबीएस में संरचनाओं को भिगोने से तीसरी बार कुल्ला करना
    सावधानी: पीबीएस को रद्दी के लिए उपयोग किया जाता है, जो संभवतः फार्मलाडहाइड के निशान होते हैं।
  5. पीबीएस में 4% वी / वी हॉर्स सीरम में गैर-ईओण डिटर्जेंट का 0.3% वी / वी समाधान तैयार करें। पेट्रिक व्यंजनों से पीबीएस को निकालें, जिसमें सूक्ष्म सूक्ष्म-टीएनएन होते हैं और संरचनाओं को कवर करने के लिए 0.3% डिटर्जेंट समाधान का एक पर्याप्त मात्रा जोड़ें। 18-24 और # पर 60 मिनट के लिए भिगोएँ176; सी कोशिकाओं को प्रचलित करने के लिए।
  6. विंदुक के साथ डिटर्जेंट समाधान निकालें जोड़कर और बाद में पीबीएस को हटाने के द्वारा दो त्वरित रिंच करें। बाद में, पीबीएस में बांधों को प्रत्येक कुल्ला के दौरान 5 मिनट के लिए भिगोने से तीन से अधिक रिक्सेस करें।
  7. 4% घोड़े सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला। पेट्री व्यंजनों से पीबीएस निकालें जिसमें निश्चित और पारगम्य सूक्ष्म-टीएनएन होते हैं। माइक्रो-कॉलम में पूरी तरह से उन्हें कवर करने के लिए पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें वाष्पीकरण को रोकने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (12-16 घंटे) सेवन करने के लिए पैराफिल के साथ पेट्री डिशों को सील करें
  8. व्यंजनों से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और कुल्ला करें जैसा चरण 4.6 में बताया गया है। अंधेरे में, 4.0% घोड़ा सीरम में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। संरचनाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ व्यंजन को कवर करें और 18 से 24 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेवन करें।
  9. पीबीएस में हाईक्स्ट समाधान (1: 10,000) तैयार करें जिससे नाभिक दाग हो।
  10. नोट: immunolabeled माइक्रो-टीएनएन के लिए छवियों को 2,048 (~ 8 एस / फ्रेम), 10X उद्देश्य (0.64 माइक्रोग्राम / पिक्सेल), 487-एनएम उत्तेजना और ~ 525 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए लेजर इंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। हरे रंग की प्रतिदीप्ति, 561 एनएम उत्तेजना और ~ 595 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य लाल प्रतिदीप्ति के लिए, और ~ 3.22 माइक्रोग्राम / टुकड़ा ~ Z- ढेर के लिए औसत पर 60 स्लाइस के साथ।

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Representative Results

सूक्ष्म-टीएनएन का परीक्षण चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उनके cytoarchitecture और axonal outgrowth ( चित्रा 4 ) का मूल्यांकन किया गया। यूनिडायरेक्शनल में, 2 मिमी लंबे सूक्ष्म-टीएनएन, न्यूरॉनल समुच्चय माइक्रो-कॉलम के एक छोर तक सीमित थे और इनर कोर के माध्यम से ऐशंस का एक बंडल का अनुमान लगाया गया था। ऐक्सॉन ने 5 दिनों के भीतर इन विट्रो (डीआईवी) ( चित्रा 4 ए ) की पूरी लंबाई को फैलाया। द्विदिश 2 मिमी-लंबी सूक्ष्म-टीएनएन में एक बड़ी प्रारंभिक अक्षय वृद्धि दर थी, क्योंकि एक्सॉन ने पूरे माइक्रो-कॉलम को 3 डीआईवी ( चित्रा 4 बी ) से फैलाया था। 5 डीआईवी तक, द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन में घने अक्षतलों का चित्रण किया गया है जो सूक्ष्म-स्तंभ के चरम पर बनाए रखा समुच्चय को जोड़ता है। 5-एमआईएम माइक्रो-टीएनएन में यह साइटोर्काचिकित्सा भी देखा गया था, जिसमें 5 डीआईवी ( चित्रा 4 सी ) द्वारा माइक्रो-कॉलम फैले हुए एक्सॉन थे। जैसा कि सभी उदाहरणों में देखा गया है, लुमेन और ज्यामितीय restri में ईसीएमएग्रीज़ोज़ द्वारा पेश किए गए सीशन ने अक्षतलों के लिए आवश्यक दिशा-निर्देश प्रदान किए, जो मूल रूप से न्यूरोनेटोमी की सुविधाओं की नकल करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में इम्यूनोकैटोकामेस्ट्री तकनीकों को लागू किया गया था, और सूक्ष्म-टीएनएन आर्किटेक्चर के घटकों को सत्यापित करने के लिए कन्फोकल चित्रों को लिया गया था एचईचस्ट (नीला) के साथ दाग सेल नाभिक, अनियमित और द्विदिश सूक्ष्म-स्तंभों के चरम पर लगभग अनन्य रूप से स्थानीय रूप से स्थानीय रूप से स्थानांतरित किया गया था, जिसमें इंटीरियर में चित्रा 5 ( चित्रा 5 ) में अनिवार्य रूप से कोई हईचस्ट धुंधला नहीं था। यह अवलोकन चरण-विपरीत छवियों से अनुमानित किया गया था: न्यूरोनल आबादी समाप्त होने तक ही सीमित थी, और सूक्ष्म- TENN के लुमेन में फैले केवल ऐशंस (लाल) में। हालांकि, एगॉन्स ने समुच्चय को पार कर जाने के बाद, कक्ष प्रवासन को आंतरिक ल्यूमन में देखा गया था, जैसाकि इंटीरियर में नाभिक (नीला) की उपस्थिति द्वारा 28 डीआईवी में 2 मिमी-लंबी द्विआधारीसीमेंटल माइक्रो-टीएनएन ( चित्रा 6 )। इसके अलावा, स्टेपसिन आई इम्युनोलाबेलिंग (हरा) पूरे सेल बॉडी और एक्सीनल ट्रेक्टर्स ( चित्रा 6 ) में पाया गया था। Synapsin मैं एक पूर्व synaptic टर्मिनल प्रोटीन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के नियमन में निहित है और पूर्व synaptic टर्मिनलों की उपस्थिति का संकेत जब एक punctate वितरण में पाया; यह पहले पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग 49 द्वारा सक्रिय synapses के गठन के साथ सहसंबंधित किया गया है माइक्रो-टेनन के अक्षतंतु-युक्त केंद्रीय क्षेत्र में सिनापसिन धुंधला होने की संभावना संभव है कि पॉन्काटा के संयोजन के साथ-साथ पूर्व-अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों के लिए एक्सॉन को ट्रांसफ़ोन किया जा रहा है। फिर भी, सूक्ष्म-टीएनएन समुच्चय के भीतर synapsin puncta की उपस्थिति से पता चलता है कि इन constructs synapses के माध्यम से संवाद करने की क्षमता है, यद्यपि एक synapsin के साथ synapsin के colocalization कार्यात्मक synapses के आगे संरचनात्मक सबूत के लिए आवश्यक होगा।/ P>

माइक्रो-टीएनएन भी एकत्रित न्यूरॉन्स के साथ गढ़े थे, जो कि इन संरचनाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों की जांच करने के लिए जीएसीएपी 6 एफ कैल्शियम सूचक को युक्त एक एएवी के साथ ट्रांसडुल्ड किया गया था। इन संरचनाओं ने अपनी पूरी लंबाई में कैल्शियम सूचक को व्यक्त किया, जैसा कि न्यूरोनल समुच्चय और अक्षतंतु दोनों (आकृती 7 ए) में प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाया गया है। ध्यान दें कि सूक्ष्मदर्शी सेटिंग्स के कारण समुच्चय में तीव्रता को अधिकतम करने के लिए, अक्षतलों में प्रतिदीप्ति फैनर दिखाई दिया। इन ट्रांसडुस्ड सूक्ष्म-टीएनएन का समय उच्च स्पीड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (बाहरी विद्युत उत्तेजना के बिना) के साथ विश्लेषण किया गया था, और ब्याज (आरओआई) के कई सेल-आकार के क्षेत्रों को सिग्नलिंग क्षमता में चिह्नित करने के लिए एक प्रतिनिधि माइक्रो-टेनन में यादृच्छिक रूप से चुना गया था निर्माण करती है। कैल्शियम एकाग्रता फटने लगभग सभी आरओआई में मनाए गए थे, जैसा कि एशॉक के साथ दर्शाया गया थापूरे समय ( चित्रा 7 बी ) में अस्थिर प्रतिदीप्ति तीव्रता। विशेष रूप से, विभिन्न आरओआई कैल्शियम एकाग्रता वृद्धि ( चित्रा 7 बी ) के निकट-निरंतर आवधिकता को दिखाना चाहते थे। ये कैल्शियम एकाग्रता परिवर्तन अलग-अलग समुच्चय के भीतर सहज, अंतर्निहित कार्यवाही क्षमता, सेल सिग्नल का परिणाम होने के लिए अनुमान लगाए जाते हैं, और / या अलग समुच्चय से अक्षांशों में सिग्नल करते हैं। आगे के विश्लेषण के लिए सूक्ष्म-टीएनएन के भीतर न्यूरॉन्स और अक्षांश के इलाकों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को पूरी तरह से चिह्नित करना आवश्यक है। फिर भी, इन प्रारंभिक परिणामों से पता चलता है कि सूक्ष्म- TENNs मजबूत अंतर्जात / आधारभूत विद्युत गतिविधि प्रदर्शित करता है।

चित्र तीन
चित्रा 3: सेल एकत्रीकरण के लिए लेजर कटौती सूक्ष्म-स्तंभ निर्माण उपकरण और 3 डी-मुद्रित पिरामिड माइक्रो-मॉल के ब्ल्यूप्रिंट। ( ) - ( बी ) क्रमशः बेलनाकार चैनल सरणी के नीचे और ऊपरी हिस्से की खाका और छवि, जो हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाता था। ( सी ) एक साथ डिवाइस को पकड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली कैप की खाका और छवि। पूर्वकाल और पीछे के दोनों हिस्से समान आयाम साझा करते हैं। ( डी ) माइक्रो-कॉलम तैयार करने के लिए इकट्ठे डिवाइस की छवि। निचले दो संरेखण छेद (बाएं) में शिकंजा के साथ केवल दो टोपी और नीचे के आधे हिस्से को एक साथ रखा जाता है। टूटी हुई रेखाएं प्रत्येक टोपी पर पाँच छेदों के माध्यम से एक्यूपंक्चर सुइयों का स्थान दिखाती हैं। तरल एगरोज़ सिलेंडरों के निचले आधे हिस्से में जोड़ा जाता है और बाद में, तरल एगरोज़ को आकार में ढालने के लिए ऊपर आधा (दाएं) को डिवाइस पर रखा जाता है। ( ) 3 डी-मुद्रित molds का ब्ल्यूप्रिंट PDMS सूक्ष्म अच्छी तरह से arrays बनाने के लिए इस्तेमाल किया। ( एफ ) 3 डी-मुद्रित ढालना (बाएं) और पीडीएमएस सूक्ष्म-अच्छी सरणियों के चित्र (दाएं) सभी आयाम मिल्ली में हैं मीटर (मिमी) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: इन विट्रो में दिन के एक समारोह के रूप में यूनिडायरेक्शनल और द्विदिश निर्माण के चरण-विपरीत इमेजिंग द्वारा माइक्रो-टेनन्स में अक्षत वृद्धि के अवलोकन। ( ) यूनिडायरेक्शनल 2 मिमी लम्बी सूक्ष्म-टीएनएन अक्षय ट्रेक्ट्स दिखाते हैं जो सूक्ष्म-स्तंभ की पूरी लंबाई 5 डिविएक्स तक बढ़ाते हैं। ( बी ) यूनिडायरेक्शनल सूक्ष्म-टीएनएन की तुलना में, द्विदिश 2 मिमी सूक्ष्म-टीएनएन तेज अक्षय वृद्धि दर दिखाती है। ( सी ) 5 मिमी द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन के लिए, अक्षीय ट्रैक्ट्स 5 डीआईवी में सूक्ष्म-स्तंभ की लंबाई को आबाद करते हैं। यह वास्तुकला 10 डिवीजन तक कम से कम तक बनाए रखा जाता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन/ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: माइक्रो-टीएनएन cytoarchitecture immunolabeled unidirectional और द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन की confocal छवियों के साथ मनाया। कोशिकाएं सेल नाभिक (एचईचस्ट, नीला) और एक्सॉन (ट्यूज 1; लाल) के लिए दाग गईं थीं। ( ) 5 मिमी द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन (28 डीआईवी) की चरण-विपरीत छवि। 5 मिमी द्विदिश (28 डीआईवी) और एक यूनिडायरेक्शनल (25 डीआईवी) सूक्ष्म-टीएनएन, क्रमशः सेल नाभिक ( डी ), ( आई ) को दिखाए जाने वाले कन्फोकल पुनर्निर्माण ( डी ) - ( एफ ) और ( आई ) - (के) और एक्सॉन ( ), ( जे ), साथ ही ओवरले ( एफ ), (के)। स्केल सलाखों: 500 माइक्रोन इनसेट्स ( एफ ), और (के) चरण-विपरीत ( बी ) - ( सी ) और कन्फोकल ( जी ) -एच ( एच ), ( एल ) -एम ( एम ) न्यूरॉनल समुच्चय और अक्षांश के जूम-इन्स का संदर्भ देते हैं। । छवियां सूक्ष्म-टीएनएन के सिरे तक सीमित मात्रा दर्शाती हैं, जबकि लुमेन गठबंधन अक्षीय ट्रेक्टर्स द्वारा फैला हुआ है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: पूर्व-अन्तर्ग्रथनी टर्मिनल प्रोटीन synapsin की अभिव्यक्ति मैं एक प्रतिनिधि द्विदिश सूक्ष्म- TENN में। कन्स्ट्रक्शन सेल नाभिक (हईपस्ट; नीला), एक्सॉन (तुज 1; लाल), और प्री-सिनेप्टिक बूटोन (सिनापसिन आई, हरा) के लिए दाग गया था। ( ) चरण-विपरीत28 डीआईवी में एक 2 मिमी द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन की छवि। ( डी ) - ( जी ) सेल नाभिक ( डी ), एक्सॉन ( ), प्री-सिनेप्टिक बॉटन ( एफ ), और तीन चैनलों के ओवरले ( जी ) को दिखाते हुए कन्फोकल पुनर्निर्माण। बक्से क्रमशः न्यूरोनल समुच्चय के लिए चरण-विपरीत और ओवरले छवियों के ज़ूम-इन ( बी ) - ( सी ), ( एच ) - ( I ) दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सूचक की अभिव्यक्ति के माध्यम से मनाया गया एक द्विदिश सूक्ष्म-टीएनएन में सहज संचार गतिविधि। ( ) फ्लोरेसेसेनकई माइक्रोस्कोपी ने जीसीएएमपी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की पुष्टि की, जैसा कि पूरे समुच्चय और एक्सॉन में फ्लोरोसेंस द्वारा मनाया गया है। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) कैल्शियम एकाग्रता रूपांतरों से जुड़े प्रतिदीप्ति परिवर्तन समय के एक समारोह के रूप में ब्याज (आरओआई) के कई क्षेत्रों में बाहरी उत्तेजना के बिना मापा गया था। ( ) संख्याबद्ध रंगीन मंडल इन ROI को निर्दिष्ट करते हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

आंकड़ा 8
8 चित्रा: सूक्ष्म- TENN पद्धति में विफलता के सामान्य मोड के चरण-विपरीत छवियाँ ( ) निर्माण के प्रारंभिक चरण में डीपीबीएस के हटाने और / या बाष्पीकरण के परिणामस्वरूप एक पूरी तरह से निर्जलित / सूखे agarose सूक्ष्म-स्तंभ। स्केल बार = 5081 मी। ( बी ) हाइड्रोगेल सूक्ष्म-स्तंभ, केशिका ट्यूब के साथ एक्यूपंक्चर सुई के समकक्ष संरेखण की कमी के कारण निर्माण की बाहरी दीवार को लुमेन अस्तर के साथ। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( सी ) 1 डीआईवी में मौजूद दोनों समुच्चय के साथ बीएमड माइक्रो-टीएनएन। ( डी ) समुच्चय में से एक ही सूक्ष्म-स्तंभ से ( सी ) 3 डीआईवी में बंद हो गया। ( ) 4 DIV पर यूनिडायरेक्शनल माइक्रो-टीएनएन। ( एफ ) कुल और अक्षीय ट्रेक्ट्स ( ) में माइक्रो-कॉलम से निकल गए और 5 डीआईवी में संस्कृति माध्यम में तैरते रहे। ( सी ) के लिए स्केल बार - ( ) = 300 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

सीएनएस की चोट और बीमारी आमतौर पर लंबी दूरी के अक्षीय पथों के नुकसान या दोष का कारण बनती है जिनमें मस्तिष्क संयोजी शामिल होती है, जो कि संवेदनाहारी न्यूरोनल अध: पतन के बिना या बिना। यह न्यूरोजेनेसिस और पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए सीएनएस की सीमित क्षमता से बढ़ता है। विकास कारक, सेल और बायोमैटिकल डिलीवरी के रूप में व्यक्तिगत या संयोजी दृष्टिकोण के रूप में मरम्मत की रणनीति का पीछा करने के बावजूद, ये तकनीक न्यूरोनल कोशिकाओं के अध: पतन और एक्सोनल कनेक्शन 14 , 22 दोनों के नुकसान के लिए एक साथ खाते में विफल हो जाती हैं। प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में ये अंतराल एक नियंत्रित और निरंतर फैशन में तंत्रिका नेटवर्क को सुधारने, बदलने और जांच करने की क्षमता को सीमित करता है। तदनुसार, सूक्ष्म- TEEN प्रौद्योगिकी एक तंत्रिका मरम्मत की रणनीति की आवश्यकता को पूरा करने के लिए विकसित की गई थी, जो मौजूदा तरीकों के विपरीत, न्यूरॉनल प्रतिस्थापन और लंबे अक्षीय कनेक्शनों के पुनर्निर्माण की सुविधा प्रदान करती है। माइकआरओ-टीएनएन एक प्रीफॉर्टेड साइटोआर्किटेक्चर के साथ implantable रहने वाले मचान हैं जो मस्तिष्क संयोजी के सिस्टम-स्तरीय बिल्डिंग ब्लॉकों तक पहुंचते हैं जो विशेष रूप से लक्षित पुनर्निर्माण, प्रतिस्थापन और मेजबान तंत्रिका सर्किट के संशोधन के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं। इन मचानों में लंबे समय से एक्सीोनल ट्रैक्ट्स से जुड़ी न्यूरॉन्स की असतत आबादी (ओं) शामिल हैं जो कि लघुकृत बेलनाकार agarose hydrogels के ईसीएम युक्त लुमेन के भीतर हैं। ये संरचनाएं खोई रास्ते को बदलने के लिए अन्तर्ग्रथनी रिले के रूप में कार्य करने में सक्षम हो सकती हैं और देशी सर्किटरी गतिशील रूप से संशोधित कर सकती हैं। इसके अलावा, अलग-अलग अक्षतंतु के घटने के मामलों में (स्रोत न्यूरॉन्स को बरकरार रखा गया है), माइक्रो-टेनएन संभवतः अक्षतंतु-सुविधा वाले अक्षतंतु ग्रहण तंत्र के तंत्र के आधार पर अक्षीय पुनर्जनन के लिए मार्गदर्शक के तौर पर काम कर सकते हैं। इस पांडुलिपि ने नियंत्रित जियोमेट्री, फ़िनोटाइप और कार्यात्मक विशेषताओं के साथ मज़बूती से सूक्ष्म-टीएनएन बनाने के लिए निर्माण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी, इम्योनोसाइटोकेमीस्ट्रॉ, और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने दिखाया कि प्रोटोकॉल के साथ उत्पादित माइक्रो-टेनएनस आवश्यक साइटोआर्किटेक्चर को प्रदर्शित करता है और प्री-सिनाप्टीक टर्मिनल प्रोटीन सिनापसिन को व्यक्त करता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि बाहरी सिमुलेशन के अभाव में, ऐक्शनिएंटिल्स के कारण संभवतः सूक्ष्म-टीएनएन के पास आंतरिक सिग्नलिंग गतिविधि होती है आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम रिपोर्टर से जुड़े प्रतिदीप्ति में निकट-तुल्यकालिक उतार चढ़ाव की उपस्थिति से इसका पता लगाया गया था।

माइक्रो-टीएनएन के विकास को तीन चरणों में संक्षेप किया जा सकता है: (1) खोखले हाइड्रोजेल ट्यूब का निर्माण, (2) ट्यूब के लुमेन में ईसीएम समाधान के अलावा, और (3) पृथक न्यूरॉन्स के समुच्चय का बीजांकन ट्यूब के छोर सूक्ष्म-कॉलम कांच केशिका ट्यूबों के साथ या सूक्ष्म-गढ़ी यंत्र युक्त सिलेंडर चैनल वाले गढ़े जा सकते हैं। यह डिवाइस अन्वेषक के लिए उपलब्ध किसी भी उच्च-सटीक सूक्ष्म-निर्माण पद्धति के साथ बनाया जा सकता है। तरलएगरोस को डिवाइस के चैनलों में या केशिका ट्यूबों में डाला जाता है जिसमें हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम बनाने के लिए केंद्र की एक्यूपंक्चर सुई होती है। Agarose gelation के बाद, एक्यूपंक्चर सुई को खोखले लुमेन उत्पादन करने के लिए हटा दिया जाता है। निर्माण या विकास के दौरान होने वाले कई आम नुकसान चित्र 8 में प्रकाशित किए गए हैं। ध्यान दें कि चित्रा 4 में प्रदर्शित कुछ चित्र और चित्रा 8 बी में एक चरम मामले सिलेंडर की दीवार के करीब अनिश्चिततापूर्वक ल्यूमिनल भाग दिखाते हैं केशिका ट्यूब विधि का उपयोग करते समय एक भी दीवार मोटाई का निर्माण करने के लिए, एडोजोज के संपर्क में होने पर ट्यूब-सुई असेंबली को सीधे रखा जाना चाहिए और सुई को ट्यूब के बीच में रखा जाना चाहिए। एंजोस की सतह के सापेक्ष एक कोण पर ट्यूब-सुई विधानसभा को रखते हुए सुई के विकेंद्रीकरण को बढ़ावा देता है। फिर भी, इन सावधानियों को लागू करना मुश्किल है, और सुई एलेन को आराम से अधिक नहीं हैकेशिका ट्यूबों की दीवारों g इसके विपरीत, सूक्ष्म-निर्मित उपकरण की मुख्य संपत्ति यह है कि यह क्रमशः चैनल और सूक्ष्म-स्तंभ के मुकाबले सुई और लुमेन के पर्याप्त केंद्रीकरण को बढ़ावा देने, बेलनाकार चैनलों के साथ गठबंधन सुई छेद दिखाती है। इसके अतिरिक्त, एक ही समय में कई सूक्ष्म-स्तंभों के निर्माण को सुविधाजनक बनाने के द्वारा यंत्र बढ़ता है। डिवाइस द्वारा प्रदान किए गए लाभ के बावजूद, मुड़ एक्यूपंक्चर सुइयों का उपयोग करके ऑफ-सेंटर लुमेन अभी भी बनाया जा सकता है। सूक्ष्म-निर्माण तकनीकों में एक अंतर्निहित सहिष्णुता भी होती है जो उनकी प्रभावशीलता को सीमित करती है। आम तौर पर, माइक्रो-कॉलम डीहाइड्रेशन, जिसके लिए एक चरम मामले को चित्रा 8 ए में दिखाया गया है, यदि कोई भी प्रोटोकॉल में उपलब्ध कराई गई सिफारिशों का पालन नहीं किया गया है, तो बाधा नहीं होना चाहिए। ध्यान दें कि बाहरी घेराबंदी के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले agarose के भौतिक गुणों में वैकल्पिक न्यूरोनल उपप्रकार के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि सुधारित कॉर्टिकल न्यूरॉनउच्च (3-4%) बनाम कम (1-2%) एजरास सांद्रता पर मूत्रवाही और न्यूरेट आउटग्राव 10 देखा गया था।

सूक्ष्म-टेनन विकास, माइक्रो-कॉलम लुमेन में ईसीएम की शुरूआत के साथ जारी है, जो न्यूरोनल आसंजन, अस्तित्व और परिणाम के लिए पर्याप्त वातावरण प्रदान करता है। इसके अलावा, ईसीएम, एग्रोसेज हाइड्रोगेल द्वारा प्रदान की गई ज्यामितीय प्रतिबंध और कम चिपचिपापन के संयोजन में, अपेक्षित आर्किटेक्चर का उत्पादन करने के लिए अनुदैर्ध्य दिशा में अक्षीय वृद्धि पर प्रतिबंध लगाता है। ईसीएम समाधान की सामग्री इस्तेमाल किया न्यूरॉन के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अकेले कोलेजन केवल डीआरजी सूक्ष्म-टीएनएन में अस्तित्व और अक्षय परिणाम को बढ़ावा देता है, जबकि कोलेजन और लैमिनिन का एक संयोजन कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 10 के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, माइक्रो-कॉलम के अंदर ईसीएम पॉलीमिराइजेशन सेल चढ़ाना से पहले महत्वपूर्ण है, क्योंकि अनॉम्पोलिमेरिज्ड ईसीएम के साथ कोशिकाओं के सह-वितरण में कमी हुई न्यूरेट आउटगओवथ और फेसिउलेशन 31 ध्यान दें कि हालांकि सूक्ष्म-स्तंभ प्रारंभिक रूप से ईसीएम समाधान से भरा हुआ है, इसकी सामग्री को नरम जेल में बहुलित किया जाता है और ऊष्मायन अवधि के दौरान अनुबंध होता है, जिससे एक स्थान बना रहता है जो सेल समुच्चय को सम्मिलित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि ईसीएम ने स्टेरियोस्कोप के तहत निरीक्षण करके माइक्रो-कॉलम इंटीरियर में प्रवेश किया है; कुल अनुपस्थिति और / या लापता ईसीएम परिणामों की जेब, समुच्चय से अक्षतित परिणाम की कमी में। स्कैफोल्ड के चरम पर क्लोरिक न्यूरॉन समुच्चय के बीजिंग में सूक्ष्म-टेनन का निर्माण खत्म हो गया। इन न्यूरॉन्स को ज्ञात प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए चूहे गर्भ से विच्छेदित किया गया था 48 यह अनुमान लगाया जा सकता है कि अलग-अलग कोशिकाओं में न्यूरॉन्स होते हैं क्योंकि अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले गर्भावस्था के समय भ्रूण चूहे प्रांतस्था में 99% न्यूरॉन्स होते हैं, और प्रोटोकॉल में प्रयुक्त परिभाषित संस्कृति माध्यम चयापचय के लिए सीमित है glial प्रसार 49 नतीजतन, कम से कम glial प्रदूषण होना चाहिए, हालांकि विशिष्ट मार्करों के लिए धुंधला होना पुष्टि के लिए आवश्यक है। हालांकि इस पांडुलिपि में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के साथ सूक्ष्म-टेनन का निर्माण किया गया था, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों ( उदा।, निगल, थैलमिक, और हिप्पोकैम्पल) से न्यूरॉन्स या अलग-अलग फीनोटाइप ( उदाहरण के लिए, उत्तेजक, निरोधक और डोपामिनर्जिक) का उपयोग वांछित आवेदन के अनुसार किया जा सकता है आरोपण के क्षेत्र सूक्ष्म-टेनन निर्माण प्रोटोकॉल के पिछले पुनरावृत्तियों में 10 , 31 , 32 को अलग-थलग कोशिकाओं में बीज लगाया गया था। यद्यपि अलग-अलग विधि का उपयोग करके वांछित cytoarchitecture प्राप्त किया गया है, यह सभी मामलों में हासिल नहीं किया गया था। कई उदाहरणों में, अलग-अलग कोशिकाओं ने इंटीरियर में पानी भर दिया और परिणामस्वरूप लुमेन में कई सेल बॉडी क्लस्टर लगाए गए, जिसमें उन्हें एक विस्तृत 3 डी नेटवर्करेफरी>> 10 , 31. दूसरी तरफ, समग्र विधि, सेल निकायों की सीमा को अधिकतम करने के लिए सुनिश्चित करती है, और इसलिए सूक्ष्म-तकनीकी प्रौद्योगिकी ( चित्रा 5 ) की सफलता के लिए अभिन्न है। प्रतिनिधि सूक्ष्म-टीएनएन दिखाया गया है आंकड़े 4-6 में बड़े समुच्चय के साथ गढ़े गए थे जो पूरी तरह से सम्मिलित नहीं हुए थे, और कभी-कभी संस्कृतियों में सूक्ष्म-स्तंभों से गिरने वाले समुच्चय, जैसे कि चित्रा 8 डी और 8 ई में दिखाए गए उदाहरणों में इसका परिणाम हो सकता है। इसे रोकने के लिए, समुच्चय सूक्ष्म-कॉलम के भीतर पूरी तरह से सम्मिलित किया जा सकता है.यदि यह स्थिति पिछली रणनीति को लागू करने के बाद भी खुद को प्रस्तुत करती है, तो प्रारंभिक ऊष्मायन अवधि को बढ़ाया जा सकता है ताकि ईसीएम के समग्र आसंजन के लिए पर्याप्त समय मिल सके। संस्कृति के दौरान, सूक्ष्म-टीएनएन के कोमल हैंडलिंग हाइड्रोजेल एन्केशमेन्ट और साइटोआर्किटेक्चर की अखंडता को बनाए रखने की सिफारिश की; माइक्रो-टी के दौरान समस्याएंएनएन हेरफेर अन्यथा गठबंधन अक्षीय ट्रेक्ट्स ( चित्रा 5 ) में प्राप्त वक्रता का कारण है। इसके बावजूद, इस आलेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करने से अपेक्षित न्यूरोनल / एक्सॉनल आर्किटेक्चर, पूर्व-अन्तर्ग्रथनी बटन वितरण, और आंतरिक विद्युत गतिविधि के साथ सूक्ष्म-टीएनएन के लगातार निर्माण का परिणाम होना चाहिए।

माइक्रो-टीएनएन के पास होने वाले वादे के बावजूद, शेष चुनौतियां हैं जो इस तकनीक के अनुप्रयोगों को सीमित कर सकती हैं। वर्तमान सूक्ष्म-स्तंभ निर्माण तकनीक माइक्रो-कॉलम लुमेन के विकेंद्रीकरण द्वारा सीमित है, जो कोशिकाओं ( जैसे कठोरता), सूक्ष्म-कॉलम की दीवार के टूटने और अक्षतलों के उत्तरार्ध के जोखिम के लिए यांत्रिक संकेतों की असंगत प्रस्तुति का कारण हो सकता है बाहरी के लिए, और आरोपण के दौरान समस्याएं हालांकि माइक्रो-फैब्रेट किए गए डिवाइस के उपयोग से केशिका ट्यूबों की तुलना में परिणाम में सुधार हुआ है, उच्च परिशुद्धता माइक्रो फैब्रेटिओइन तकनीकों की आयामी प्रतिरूपिकता बढ़ाने के लिए n तकनीकें आवश्यक हैं इस पांडुलिपि के परिणाम में दिखाया गया है कि माइक्रो-टेनन कार्यप्रणाली न्यूरॉन्स और अक्षतलों के रहने वाले स्केफॉल्ड्स का मज़बूती से उत्पादन कर सकती है जो मूल तंत्रिका-विज्ञान के समान होती है, विशेष रूप से अक्षीय ट्रेक्ट्स जो अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से जुड़ते हैं। फिर भी, सूक्ष्म-टीएनएन की लंबाई एक बाधा है, जो कि मेजबान अक्षतंतु मार्ग की लंबाई के आधार पर बदलना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, टिशू इंजीनियर न्यूर ग्रर्ट्स (टीएनजी) एक अलग जीवित मचान की रणनीति है जो हमारे शोध समूह द्वारा उपयोग की जाती है ताकि बेहद लंबी तंत्रिका चोटों की मरम्मत हो सके। इन लंबे अंतराल को बदलने के लिए, टेनग्स में ऐक्सोन को 1 मे , 23 , 50 के कस्टम मैचनोनो-बायोरेक्टर्स में लगातार यांत्रिक तनाव लगाने से सेंटीमीटर तक लंबा किया जा सकता है। यह "खिंचाव वृद्धि" तकनीक भी एट्रोस्टायटिक प्रक्रिया लंबाई को पैंतरेबाज़ी करने के लिए लागू किया गया हैR रेडियल ग्लियाल पथ 51 की संरचना की नकल करें इसके विपरीत, वर्तमान माइक्रो-टेनन तकनीक अभी तक इस हद तक नियंत्रण नहीं करती है; अधिकतम प्राप्य लंबाई वर्तमान में पारंपरिक वृद्धि-शंकु-मध्यस्थता विस्तार के आधार पर इन विट्रो में अक्षीय ट्रेक्ट्स कितने समय तक बढ़ सकता है, यह सीमित है। इसके अलावा, भले ही सीएनएस विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल रीवाइरिंग के लिए एक आंतरिक क्षमता रखता है, और प्रत्यारोपित कोशिकाओं में नेटिक सर्किटरी के साथ समन्वयित रूप से एकीकरण की क्षमता है, इस तकनीक का एक और सीमा यह है कि सूक्ष्म- TENNs देशी मस्तिष्क की तरलता पर भरोसा करते हैं और मेजबान नेटवर्क की क्षमता को प्रत्यारोपित निर्माण 52 , 53 , 54 , 55 के साथ कार्यात्मक रूप से एकीकृत किया गया। अंत में, सभी प्रत्यारोपण-आधारित दृष्टिकोणों की एक सहज कमी, जैसे कि सूक्ष्म-टीएनएन, उनकी आक्रामकता है। चूंकि न्यूरॉन्स हैंआमतौर पर केशिकाओं को करीब निकटता में, किसी भी प्रकार की शल्य प्रक्रिया से रक्त में मस्तिष्क की बाधा, रक्त के कारकों का रिसाव मस्तिष्क पैरेन्काइमा में, और तीव्र (और भी एक पुरानी) सूजन प्रतिक्रिया 31 में बाधित हो सकता है। यह प्रतिक्रिया मेजबान और सूक्ष्म-टीएनएन न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचा सकती है, इस तकनीक के लाभकारी पहलुओं को नकार दे रही है। फिर भी, कम से कम एक महीने तक कॉर्टिकोथमैमिक पथ में चूहों में प्रत्यारोपित माइक्रो-टीएनएन और मेजबान सेरेब्रल कॉर्टेक्स 10 , 31 के साथ संरचनात्मक एकीकरण के सबूत दिखाए। इसके अलावा, हमारे अनुसंधान समूह के एक पिछले प्रकाशन ने माइन-टीएनएन के चूहे के दिमाग 31 में सुई-कम आरोपण को सक्षम करने वाली एक पद्धति प्रस्तुत की। उस दृष्टिकोण में, हाइड्रोजेल एन्केशियन रणनीति को कार्बोइमेथाइलेसेलुलोज की एक पतली (~ 20 माइक्रोन) कोटिंग में शामिल करने के लिए संवर्धित किया गया था, जो हल्के निर्जलीकरण पर, घुसना करने के लिए पर्याप्त कठोरता प्रस्तुत किया गया थाएक सुई या गाइड 31 की आवश्यकता के बिना मस्तिष्क। सूई-कम आरोपण विधि, माइक्रो-कॉलम के छोटे क्रॉस-सेक्शन के साथ, स्टेरिएटेक्सिक आरोपण प्रक्रिया के दौरान और बाद में मस्तिष्क को नुकसान कम करना चाहिए।

वीवो में सूक्ष्म-टीएनएन की प्रारंभिक सफलता के बावजूद, भविष्य के अध्ययनों को यह पुष्टि करने की आवश्यकता होगी कि इन संरचनाओं को मूल रूप से ऊतक के साथ एकीकृत किया गया है और जांच करने के लिए कि सीएनएस की चोट और neurodegenerative रोग 10 , 31 के मॉडल में कार्यात्मक वसूली प्राप्त की गई है। उदाहरण के लिए, सिलवाया माइक्रो-टीएनएन विशिष्ट सेल फ़िनोटाइप्स के साथ डिज़ाइन किया जा सकता है और नेटवर्क को फिर से संगठित करने और फ़ंक्शन को पुनर्स्थापित करने के लिए अनुप्रयुक्त डिज़ेनेटेड पथ में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। आरोपण के बाद तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करने के लिए, सूक्ष्म-टीएनएन हाइड्रोजेल खोल को भड़काऊ और समर्थक अस्तित्व एजेंटों के साथ भंग किया जा सकता है। वैकल्पिक निर्माणतकनीक ( जैसे, 3 डी प्रिंटिंग) को हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम को अधिक आसानी से और अधिक सटीक विशेषताओं के साथ विकसित करने के लिए विकसित किया जा सकता है, जिसमें लुमेन के निरंतर केंद्रीकरण और आयामों की प्रजनन क्षमता शामिल है। सीएनएस की चोट और बीमारी के अन्य लक्षणों से निपटने के लिए माइक्रो-टीएनएन के साथ नियोजित एक ही बायोमैटिकल योजना को संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमारे समूह ने पहले से विकसित एग्रोसेज हाइड्रोगेल के कोलेजन-लेपित लुमेन के साथ लंबे समय तक गठबंधन वाले एस्ट्रोसाइटेटिक बंडलों के निर्माण को विकसित किया है जो संरचनात्मक रूप से अक्षीय पुनर्जनन और न्यूरॉनल माइग्रेशन 56 की सुविधा के लिए रेडियल ग्लियाल पथ और ग्लील ट्यूब का अनुकरण करता है। इसके अतिरिक्त, स्टेम सेल, जैसे मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी), प्रेरित प्लिरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं (आईपीएससीएस), और एडॉउज युक्त स्टेम सेल (एएससी), प्रति-रोगी आधार पर ऑटोलॉगस सूक्ष्म-टीएनएन को और अधिक बनाने के लिए शामिल किया जा सकता है बारीकी से खो गया cytoarchitecture और सेल phenotype के समान ये फ़्यूफिर से संशोधनों में विवो में डिजनेरेट किए गए रास्ते को बदलने के लिए माइक्रो-टेनन की क्षमता में वृद्धि होगी और अन्य विशेषताओं के बीच में एस्ट्रोग्लिअल सपोर्ट और एक्सॉनल मायेलिनेशन को शामिल करके, अधिक परिष्कृत ऊतक आर्किटेक्चर के पुनर्निर्माण की अनुमति होगी। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर न्यूरॉन्स को या तो ट्राफिक कारकों की रिहाई के माध्यम से सूक्ष्म-टीएनएन की पुनर्योजी कार्रवाई बढ़ाने या सीएनएस के मॉड्यूलेशन को हल्के गठित आयन चैनल 43 के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना द्वारा सक्षम करने के लिए सीड किया जा सकता है। इन मचानों को उत्तेजक या निरोधात्मक न्यूरॉन्स के साथ गढ़े जा सकते हैं ताकि मिर्गी, अवसाद, नशीली दवाओं की लत या दर्द संबंधी विकार जैसे परिस्थितियों में मौजूदा अपारदर्शी मेजबान कनेक्शन को समन्वयित किया जा सके। उदाहरण के लिए, सूक्ष्म-टीएनएन मुख्य रूप से गैबार्जिक या ग्लूटामाएटरजीक संक्रमणों को क्रमशः, अन्तर्ग्रथनी एकीकरण और / या बल्क न्यूर द्वारा क्रमशः या अपरिवर्तित मार्गों को दबा या उत्तेजित करने के लिए बनाया जा सकता है।ओट्रांसमीटर रिलीज ज़रूरी है कि, इस तरह के आत्म-निहित मोड्युलेटरी निर्माणों को सैद्धांतिक रूप से होस्ट-नेटवर्क प्रतिक्रिया 1 के आधार पर उत्तरदायी होगा। इसी तरह, माइक्रो-टीएनएन को मस्तिष्क-कंप्यूटर इंटरफेस (बीसीआई) के रूप में लागू किया जा सकता है, मस्तिष्क और अकार्बनिक उत्तेजक या रिकॉर्डिंग उपकरणों के बीच मध्यवर्ती के रूप में कार्य करने वाले ऑप्टोगेनेटिक रूप से इंजीनियर माइक्रो-टीएनएन के साथ। यह एप्लिकेशन बीसीआई के माइक्रोइलेक्ट्रोइड के लिए वैकल्पिक हो सकता है, जिसमें विशिष्ट सेल लक्ष्यीकरण और यांत्रिक स्थिरता की कमी होती है और मस्तिष्क 57 , 58 में घुसपैठ होने पर भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, ग्लिअल निशान गठन, और न्यूरोनल प्रवास या नुकसान का कारण हो सकता है।

इन विट्रो परीक्षण-बेड के रूप में , सूक्ष्म-टीएनएन तंत्रिका जीव विज्ञान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान कर सकता है, जो तंत्रिका तंत्र के बायोफाइडिक मॉडल के रूप में सेवा कर रहा है। इसके अतिरिक्त, न्यूरल इंजेक्शन के रूप में उपयोग किए जाने पर उपचार की रणनीति के लिए 3 डी निर्माण परीक्षण-बेड के रूप में कार्य कर सकते हैंUry और रोग मॉडल 59 3 डी के निर्माण के रूप में, सूक्ष्म-टीएनएन, विवो परिवेश का अनुकरण करने में सक्षम हैं, जो सभी स्थानिक दिशानिर्देशों में जटिल सेल-सेल और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन द्वारा दिखाया गया है, जिसे प्लानर संस्कृतियों 42 , 60 , 61 , 62 , 63 में सही रूप से प्रदर्शित नहीं किया जा सकता है , 64 , 65 दरअसल, कई जांच ने स्थापित किया है कि कोशिकी के लिए आकार का आकार, प्रसार, प्रवासन, जीन अभिव्यक्ति, भेदभाव, और देशी सेटिंग 60 में प्रदर्शित संकेत के लिए महत्वपूर्ण है। इन scaffolds और मस्तिष्क के 3 डी वातावरण के बीच समानता नियंत्रण की डिग्री से पूरित कर रहे हैं कि ये निर्माण उनके भौतिक और जैव रासायनिक जनसंपर्क की पेशकशऑपरेटीज़ 42 यह न्यूरोनल जीवित रहने, परिपक्वता, अक्षीय विस्तार, सिनाइप्टोजेनेस, और यंत्रो-ट्रान्सस्केक्शन 32 , 42 , 63 पर, इन संकेतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, मैकेनिकल, हिपोटैक्सिक और केमोटेक्सिक संकेतों के विभिन्न सेटों के साथ सूक्ष्म-टीएनएन के इंजीनियरिंग की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस सूक्ष्म-ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक की डिजाइन लचीलापन मस्तिष्क के ऊतकों की अन्य विशेषताओं की नकल करने वाले परम्पराओं के निर्माण की अनुमति देता है, जैसे कॉलमार, नेनोरेक्टेक्स के कंपार्टाइज्ड संरचना, कनेक्टोम के अक्षीय इलाकों द्वारा फैले, आगे बढ़ने के लिए मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म के रूप में इस प्रणाली की शक्ति 65 जांच प्लेटफार्मों के रूप में, सूक्ष्म-टीएनएन इन विट्रो मॉडल की विशिष्ट रूप से नियंत्रित सेटिंग का लाभ लेती है, ऊतक एन में डिजाइन पैरामीटर की विशाल उपलब्धताजीनियरिंग दृष्टिकोण, और बढ़ती हुई शारीरिक- और पैथोफिज़ियोलॉजिकल-प्रासंगिकता, न्यूरोबोलॉजिकल ज्ञान को अग्रिम करने के लिए एक आदर्श परीक्षण-बिस्तर बनने के लिए 3 डी प्लेटफॉर्म का। इस तकनीक के भविष्य के दिशा में असंख्य माइक्रो-टेनन की बहुमुखी प्रतिभा का प्रतीक है। इस पांडुलिपि ने यह साबित किया है कि सूक्ष्म- TENN प्रोटोकॉल मस्तिष्क के ऊतक-इंजीनियर वाले जीवित स्केफॉल्ड्स का निर्माण कर सकता है जो कि मस्तिष्क की न्यूरोनाटॉमी की महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करने के लिए विकास, बीमारी, और मरम्मत प्रक्रियाओं सहित न्यूरोबियल घटनाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। क्षतिग्रस्त श्वेत पदार्थों के पुनर्वासों के पुनर्निर्माण के लिए, न्यूरोनल कोशिकाओं की जगह खोले जाने और सीएनएस की चोट और बीमारी के बाद डिसीग्रेट किए गए पथों को व्यवस्थित करने के लिए इन संरचनाएं मूल रूप से मूल ऊतक के साथ एकीकृत हो सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ यूएडी-एनएस094340 (कलन), टी 32-एनएस043126 (हैरिस) और एफ 31-एनएस090746 (कटियार)), माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन (चिकित्सीय पाइपलाइन प्रोग्राम # 99 9 8 (कलन)) द्वारा वित्तीय सहायता प्रदान की गई थी, द पेन मेडिसिन न्यूरोसाइंस सेंटर पायलट अवार्ड (कल्लेन), नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप डीजी-1321851 (स्ट्रूज़िना एंड एडवॉल)), डिपार्टमेंट ऑफ वेयरेंस अफेयर्स (आरआर एंड डी मैरिट रिव्यू # बी 1097-आई (कल्लेन)), अमेरिकन एसोसिएशन न्यूरोलॉजिकल सर्जनों और न्यूरोलॉजिकल सर्जन कांग्रेस (2015-2016 न्यूरोट्रामा और क्रिटिकल केयर (पेट्रोव) में Codman फैलोशिप), और अमेरिकी सेना मेडिकल रिसर्च और मैटेरियल कमांड (# W81XWH-13-207004 (कुलेन) और W81XWH-15-1- 0466 (कुलेन))

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

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References

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