तंत्रिका तंत्र पुनर्निर्माण, मॉडुलन, और मॉडलिंग के लिए एनाटॉमिक रूप से प्रेरित थ्री-आयामी माइक्रो-टिशू इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क
Summary
यह पांडुलिपि सूक्ष्म ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क के निर्माण का विवरण देता है: तीन-आयामी माइक्रोन-आकार के निर्माण में ट्यूबल्युलर हाइड्रोगेल में लगाए गए समेकित न्यूरोनल जनसंख्या (एस) फैले लंबे समय से गठबंधन अक्षीय ट्रेक्ट्स शामिल थे। ये रहने वाले स्कॉफॉल्ड न्यूरल सर्किट्री के पुनर्निर्माण या विनियमन के लिए कार्यात्मक रिले के रूप में या ग्रे-व्हाइट मामले की न्यूरोनेटोमी की नकल करने वाले बायोफैलिकिक टेस्ट-बेड के रूप में काम कर सकते हैं।
Abstract
निरोधात्मक वातावरण और न्यूरोजेनेसिस के लिए सीमित क्षमता के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर चोट या बीमारी प्रेरित अध: पतन के बाद कामकाजी वसूली बहुत कम होती है। हम क्षतिग्रस्त सीएनएस के भीतर एक साथ न्यूरॉनल और एसेनलल पाथवे हानि को संबोधित करने के लिए एक रणनीति विकसित कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में सूक्ष्म-ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन), न्यूरॉन्स और गठबंधन वाले अक्षीय ट्रेक्ट्स वाले माइक्रो मैट्रिक्स (ईसीएम) ल्यूमन फैले हुए हाइड्रोजेल सिलेंडर के सैकड़ों माइक्रोसन व्यास में सेंटीमीटर का विस्तार हो सकता है। लंबाई में। न्यूरॉनल समुच्चय तीन आयामी encasement के चरम सीमाओं के लिए सीमांकित हैं और axonal अनुमानों द्वारा फैला रहे हैं। माइक्रो-टीएनएन विशिष्ट रूप से सीएनएस पुनर्निर्माण के लिए एक रणनीति के रूप में तैयार हैं, मस्तिष्क संयोजी cytoarchitecture के पहलुओं का अनुकरण करते हैं और संभावित रूप से नेटवर्क प्रतिस्थापन के लिए साधन प्रदान करते हैं। नीरोनाल समुच्चय लापता या क्षतिग्रस्त सर्किटरी को पुनर्स्थापित और / या विनियोजित करने के लिए नए कार्यात्मक रिले बनाने के लिए मेजबान टिशू के साथ संकुचित हो सकता है ये संरचनाएं उत्थान की स्थिति के आधार पर स्यारगिस्टिक संरचनात्मक और घुलनशील संकेत प्रदान करते हुए, सेल प्रवासन और अक्षीय पथ-पथ के लिए विकासात्मक तंत्र का शोषण करने में सक्षम प्रो-रिजनेटिव "लिविंग स्कैफॉल्ड" के रूप में भी कार्य कर सकती हैं। माइक्रो-टीएनएन तरल हाइड्रोगेल को एक बेलनाकार मोल्ड में डालने के द्वारा तैयार किए गए हैं जिसमें एक लंबे समय तक केन्द्रित सुई होती है। एक बार हाइड्रोगेल सुस्त हो गया है, सुई को हटा दिया जाता है, एक खोखले माइक्रो-कॉलम छोड़कर। न्यूरोनल आसंजन और अक्षीय परिणाम के लिए उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए एक ईसीएम समाधान लुमेन में जोड़ा जाता है। अलग-अलग न्यूरॉन्स को सूक्ष्म-स्तंभ के एक या दोनों छोरों के भीतर सटीक बोने के लिए यंत्रवत् एकत्रित किया जाता है। इस पद्धति में मज़बूती से लंबे समय से प्रक्षेपित अक्षांश के साथ आत्मनिहित लघु निर्माण का उत्पादन होता है जो मस्तिष्क तंत्रिका विज्ञान की सुविधाओं को दोहरा सकते हैं। सिनैप्टिक आईएमआईअसंगत और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक सूक्ष्म- TENNs व्यापक synaptic वितरण और आंतरिक विद्युत गतिविधि का अधिकार है कि सुझाव है। नतीजतन, माइक्रो-टीएनएन मस्तिष्क रास्ते के लक्षित न्यूरोसार्जिकल पुनर्निर्माण के लिए एक आशाजनक रणनीति का प्रतिनिधित्व करती है और इन विट्रो में न्यूरोबॉजिकल घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बायोफ़ैलिकिक मॉडल के रूप में भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), जैसे कि दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई), स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग, और पार्किंसंस रोग के विकारों और रोगों का एक सामान्य लक्षण, अक्षीय मार्गों और न्यूरोनल सेल का वियोग है हानि 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 । उदाहरण के लिए, जब एक इस्कीमिक स्ट्रोक अनुपचारित होता है, तो यह अनुमान लगाया जाता है कि एक्सॉन 7 मिनट की एक्सॉन 5 मिनट प्रति मिनट की दर से खो गया है। टीबीआई के मामले में, जो लगभग 1.7 मिलियन लोगों का अकेले अमेरिका में अनुभव होता है, अस्थिजनित अवस्था आघात के बाद कई वर्षों तक हो सकती है, क्योंकि प्रारंभिक चोट दीर्घकालिक न्यूरोडेजनरेटिव स्टेट 4 की उत्पत्ति करता है। इन हानिकारक प्रभावों को बढ़ाना, सीएनएस एक गंभीर रूप से सीमित कैपा हैपुनर्जनन के लिए शहर 1 , 7 , 8 , 9 चोट के बाद, एक निरोधात्मक वातावरण विकसित होता है जो कि दूर के लक्ष्यों को निर्देशित निर्देशों की कमी के कारण होता है, माइलेन-जुड़े अवरोधकों की उपस्थिति जो न्यूरेटिक परिणाम को बाधित करती है, और 8 , 10 , 11 , 12 के प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स द्वारा ग्लेल निशान के गठन के लिए। ग्लेल निशान पुनर्जनन के लिए एक जैव-रासायनिक और शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है, जैसे अणुओं जैसे चोंड्रोइटीन सल्फेट प्रोटोजेलीकैंस, एंजॉन आउटग्रोथ 8 , 11 को बाधित करता है। इसके अलावा, भले ही तंत्रिका स्टेम सेल वयस्क सीएनएस में पाए गए हैं, नए न्यूरॉन्स का उत्पादन सीमित है, क्योंकि न्यूरोजेनेसिस के लगातार प्रमाण घ्राण बल्ब, हिप्पोकैम्पलउप-क्षेत्रीय क्षेत्र, परिधीय क्षेत्र और रीढ़ की हड्डी 13 , 14 की केंद्रीय नहर। ये बाधाएं चोट या बीमारी के बाद खोए गए न्यूरॉन्स और श्वेत पदार्थों की वास्तुकला की कार्यात्मक वसूली को रोकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप इन स्थितियों के अक्सर जीवन-बदलते और लंबे समय तक प्रभाव पड़ते हैं।
प्रौढ़ सीएनएस में पुनर्योजी क्षमता की कमी के बावजूद, यह दिखाया गया है कि यदि पर्याप्त पर्यावरण संकेतों को न्यूरॉन्स 15 , 16 , 17 , 18 के होस्ट करने के लिए पर्याप्त पर्यावरणीय संकेत दिए गए हैं तो अक्षतंतु उत्थान संभव है। शोधकर्ताओं ने प्लास्टिसिटी और अक्षतंतु उत्थान को प्रोत्साहित करने के लिए विकास कारकों ( उदाहरण के लिए, तंत्रिका वृद्धि कारक, epidermal वृद्धि कारक, glial-dependent वृद्धि कारक, और न्यूरोट्रोफ़िक फैक्टर -3) और अन्य मार्गदर्शन अणुओं को वितरित करने और हेरफेर करने का प्रयास किया है 14 ,/ Sup> 18 , 1 9 हालांकि इन अध्ययनों ने पुष्टि की है कि वयस्क अक्षतंतु विकास कारकों पर प्रतिक्रिया देने में सक्षम हैं, इन रणनीतियों को रक्त-मस्तिष्क की बाधा के कम पारगम्यता और पुनर्जीवित 14 , 18 , 1 9 को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक विशिष्ट स्थानिक और लौकिक ग्रेडियंट्स द्वारा सीमित हैं। अन्य तरीकों ने सीएनएस न्यूरॉन्स में उत्थान-संबंधित प्रतिलेखन कारकों के hyperactivation पर भरोसा किया है। उदाहरण के लिए, Stat3 प्रतिलेखन कारक के अत्यधिक विषमता ने ऑप्टिक तंत्रिका 20 में अक्षीय पुनर्जनन को प्रेरित किया। फिर भी, दोनों बायोमोलेक्यूल डिलीवरी और प्रतिलेखन कारकों के अत्यधिक विषमता खो चुके न्यूरोनल आबादी को बदलने में विफल होते हैं। सेल-आधारित रणनीति मुख्य रूप से तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) को सीएनएस में ट्रांसप्लांट करने पर केंद्रित है, सीएनएस न्यूरॉन्स को बदलने की क्षमता का लाभ लेते हैं, ट्रॉफी कारक जारी करते हैं,और चोट 17 के बाद होने वाली न्यूरोजेनेसिस के प्रयासों का समर्थन करते हैं। इस के बावजूद, अभी भी इस दृष्टिकोण को निरोधक चुनौतियों का सामना करना पड़ रहा है, जिसमें प्रत्यारोपित तंत्रिका कोशिकाओं को जीवित रहने की क्षमता, मेजबान के साथ एकीकृत करने, और घायल क्षेत्र 6 , 14 , 17 , 21 के लिए सीमित रहने के लिए बाधा आ गई है। इसके अलावा, केवल सेल डिलीवरी क्षतिग्रस्त या खोए हुए अक्षीय मार्गों के cytoarchitecture को पुनर्स्थापित करने में असमर्थ है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो सेल और ड्रग / रासायनिक वितरण रणनीति का सामना करने वाली समस्याओं को संबोधित करता है, इन तरीकों को बायोमैटिरियल्स 14 , 22 , 23 के उपयोग से जोड़ रहा है। हाइड्रोजेल जैसे बायोमैटिरियल्स बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के जैवरासायनिक और भौतिक गुणों को मापने में सक्षम हैं, सेल डिलीवरी में सहायता कर रहे हैं औरघायल क्षेत्र के भीतर अवधारण, और नियंत्रित रिहाई के साथ विकास कारकों और अन्य जैव-अणुओं को वितरित करना 22 इन जैव-सामग्री-आधारित रणनीतियों की आकर्षक विशेषताओं के परिणामस्वरूप 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 2 9 , 30 के घावों वाले क्षेत्र को स्कॉफॉल्ड्स के प्रत्यारोपण के बाद विवो अक्षत में पुनर्जीवन के प्रमाण दिए गए हैं। हालांकि, गिलहरी बायोमेटिकल रणनीतियों खोई हुई न्यूरोनल आबादी का स्थान नहीं लेते हैं; जब न्यूरोनल, ग्लियाल या न्यूरॉनल अग्रदूत कोशिकाओं के लिए डिलीवरी वाहनों के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, तो बायोमैटिरियल्स लंबी दूरी के अक्षीय नेटवर्क के पुनर्गठन के लिए असमर्थ हैं। सीएनएस की चोट और बीमारी के साथ जुड़े अक्षीय मार्ग दोनों के अपक्षय और न्यूरोनल हानि दोनों से निपटने वाले एक दृष्टिकोण के विकास की चुनौती अब भी बनी हुई है <Sup वर्ग = "xref"> 31
हमारे अनुसंधान समूह ने पहले इंपैन्टable सूक्ष्म ऊतक इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन) के विकास की सूचना दी, जो "जीवित पाड़" का एक प्रकार है, जिसमें न्यूरोनल सेल निकाय शामिल है जो एक एग्रोसेज हाइडोगेल-ईसीएम माइक्रो-कॉलम के एक या दोनों छोर तक सीमित है। , इस त्रि-आयामी (3 डी) encasement 1 , 10 , 31 , 32 के इंटीरियर के भीतर स्थित गठबंधन अक्षीय ट्रेक्टर्स के साथ। इस तकनीक और पिछले दृष्टिकोण के बीच मुख्य अंतर यह है कि सूक्ष्म- TENN के cytoarchitecture पूरी तरह से इन विट्रो में बनाया जाता है और बाद में 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup वर्ग = "xref"> 39 , 40 , 41 इन विट्रो फैब्रिकेशन में सेलुलर फिनोटाइप और ओरिएंटेशन, मैकेनिकल / भौतिक गुणों, जैव रासायनिक संकेतों और एक्सोजेन्सिक कारकों का व्यापक स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है, जो इम्प्लांटेशन 41 , 42 के बाद मेजबान के साथ इन स्कॉफोल्ड के एकीकरण को लाभ देता है। माइक्रो-टीएनएन स्वत: प्रेरणा से प्रेरित हैं क्योंकि वे मस्तिष्क की न्यूरोनाटॉमी का अनुकरण करते हैं, जो उन मस्तिष्क के अलग-अलग कार्यात्मक क्षेत्रों ( चित्रा 1 ए ) 1 से जुड़े अक्षरों के समान प्रदर्शित होते हैं। इसलिए, यह रणनीति घाटे वाले क्षेत्र में प्रत्यारोपण के बाद शारीरिक रूप से बदले हुए सफेद पदार्थों के नलिकाओं और न्यूरॉन्स को बदलने में सक्षम हो सकती है। यह तकनीक विकास तंत्र से भी प्रेरित है जिसमें "प्राकृतिक जीवित scaffolds" रेडियल glial कोशिकाओं और अग्रणी axons द्वारा गठित सेल के लिए पथ पथ गाइड के रूप में कार्य करता हैसेवेंटरिकुलर ज़ोन और एक्सीनल आउटग्रोथ से क्रमशः 43 इन तंत्रों को सूक्ष्म-टीएनएन के गठबंधन अक्षांश के क्षेत्र में दोहराया जाता है, जो कि तंत्रिका कोशिका प्रवासन और अक्षतंतु-मध्यस्थीय अक्षीय उत्खनन ( चित्रा -1 सी ) 43 द्वारा जीवित मार्गों को पेश कर सकता है। इसके अलावा, यह रणनीति माइक्रो-टेनन न्यूरॉन्स और नेटिव सर्किट्री के बीच अन्तर्ग्रथनी एकीकरण का लाभ लेती है, जिससे नए रिले बनते हैं जो कार्यात्मक वसूली ( चित्रा 1 बी ) 43 में योगदान दे सकते हैं। Synapse गठन की क्षमता भी इस दृष्टिकोण को सीएनएस को कम करने और नेटवर्क प्रतिक्रिया के अनुसार मेजबान टिशू को प्रतिक्रिया करने की क्षमता प्रदान कर सकती है। उदाहरण के लिए, जीवित scaffolds में optogenetically सक्रिय न्यूरॉन्स synaptic बातचीत ( चित्रा 1 डी ) के माध्यम से मेजबान न्यूरॉन्स को विनियमित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।
इसके अलावा, बायोमैटिकल-आधारित ट्यूबलर कन्स्ट्ररसूक्ष्म-टीएनएन के प्रयोग से सेल आसंजन, विकास, न्यूरैट विस्तार और सिग्नलिंग के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान किया जाता है, जबकि निर्माण के लघु आयामों में संभवतः कम से कम इनवेसिव आरोपण को अनुमति दी जाती है और मस्तिष्क में क्रमिक एकीकरण के लिए आंशिक रूप से सिक्वर्टेड माइक्रोएनेयरमेंट प्रदान करता है। दरअसल, हाल के प्रकाशनों ने चूहा मस्तिष्क में आरोपण के बाद तंत्रिका पथ की नकल करने के लिए सूक्ष्म-टीएनएन की क्षमता का प्रदर्शन किया है। स्टीरियोटेक्सिक माइक्रोइन्ग्नाइजेशन के बाद, हमने माइक्रो-टीएनएन न्यूरोनल अस्तित्व, एक्सऑनल ट्रैक्ट आर्किटेक्चर के रखरखाव, और मेजबान प्रांतस्था में न्यूरैट एक्सटेंशन का विवो 10 , 31 में कम से कम 1 महीने तक साक्ष्य दर्ज किया है। इसके अलावा, सिनापसिन के साथ लेबलिंग मूल ऊतक 10 , 31 के साथ अन्तर्ग्रथनी एकीकरण के हिस्टोलॉजिकल प्रमाण प्रदान करता है। कुल मिलाकर, सूक्ष्म-टीएनएन क्षतिग्रस्त होकर पुनर्निर्माण और विनियमित करने के लिए विशिष्ट रूप से अनुकूल हो सकता हैखोया न्यूरॉन्स की जगह सीएनएस, होस्ट सर्किरी के साथ समन्वयित रूप से एकीकरण, खोए अक्षीय साइटोर्काचिकित्सा बहाल करना, और, कुछ मामलों में, उपयुक्त पाथफाइंडिंग संकेतों के साथ रीजनेटिंग एक्सॉन प्रदान करना।
चित्रा 1: माइक्रो-टिशू इंजीनियर न्यूरल नेटवर्क (सूक्ष्म-टीएनएन) के विकास के सिद्धांत और प्रेरणा। ( ए ) माइक्रो-टीएनएन मस्तिष्क संयोजी (बैंगनी) के cytoarchitecture की नकल करते हैं, जिसमें कार्यात्मक रूप से अलग-अलग क्षेत्रों लंबे, गठबंधन अक्षीय ट्रेक्ट्स से एक यूनिडायरेक्शनल (लाल, हरे) या द्विदिश (नीला) तरीके से जुड़े होते हैं। उदाहरण के तौर पर, सूक्ष्म-टीएनएन को कॉर्टिकोथैलेमैम और निगोस्ट्रायटल पाथों में या इंटोरहिनल कॉर्टेक्स से प्ररित मार्ग में हिपोकैम्पस (स्टूज़िना एट अल , 2015 से अनुकूलित) 1 में खोए हुए कनेक्शन का पुनर्गठन किया जा सकता है। ( बी ) एक यूनिडायरेक्शनल आरेखएल और द्वि-दिशात्मक सूक्ष्म-टीएनएन (क्रमशः लाल और नीला, क्रमशः) मेजबान सर्किटरी (बैंगनी) के साथ एकीकरण के लिए एक घाव के दोनों छोरों के बीच एक कार्यात्मक रिले के रूप में काम करता है। ( सी ) एक यूनिडायरेक्शनल सूक्ष्म-टीएनएन (हरा) के अक्षतलों के योजनाबद्ध, एक लक्ष्य के लिए अक्षतंतु-सुविधा वाले उत्थान के लिए एक मार्गदर्शिका के रूप में कार्यरत है, जिसके साथ माइक्रो-टेनएन इंटरैक्ट होता है। ( डी ) उत्तेजक या निरोधात्मक न्यूरॉन्स (नीचे) के साथ अन्तर्ग्रथनी एकीकरण का लाभ उठाते हुए, न्यूरोमोडुलेटरों के रूप में ऑप्टोगैनेटिक रूप से सक्रिय माइक्रो-टेनेन्स के उपयोग के संकल्पनात्मक आरेख। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
वर्तमान पांडुलिपि में भ्रूणिक रूप से प्राप्त सेरेब्रल कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का उपयोग करके माइक्रो-टेनएन बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का विवरण दिया गया है। विशेषकर, सूक्ष्म-टीएनएन अन्य प्रकार के तंत्रिका कोशिकाओं के साथ गढ़े जा सकते हैं। पूर्व के लिएपर्याप्त, सफल सूक्ष्म-टीएनएन विकास की प्रारंभिक रिपोर्ट में डॉरसल जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) न्यूरॉन्स 32 एक कस्टम निर्मित, लेजर कट बेलनाकार चैनल सरणी या तरल एगरोज़ को जोड़कर हाइड्रोगेल माइक्रो-कॉलम ( चित्रा 2 ए ) उत्पन्न किया जा सकता है, दोनों में गठबंधन वाले एक्यूपंक्चर सुई होते हैं। सुई लुमेन का निर्माण करता है और सूक्ष्म-स्तंभ के भीतर का व्यास (आईडी) को निर्धारित करता है, जबकि लेजर कट डिवाइस में केशिका ट्यूब आईडी और सिलेंडर का व्यास निर्माण के बाहरी व्यास (ओडी) को नियंत्रित करता है। उपकरण और केशिका ट्यूब और एक्यूपंक्चर सुई के लिए क्रमशः विभिन्न व्यास का चयन करके वांछित आवेदन के अनुसार ओडी और आईडी को चुना जा सकता है। माइक्रो-कॉलम की लंबाई भी भिन्न हो सकती है; आज तक, हमने सूक्ष्म-टीएनएन के निर्माण की लंबाई 10 मिमी में 10 मिमी तक की सूचना दी है और सक्रिय रूप से अब तक की लंबी अवधि का पीछा कर रहे हैं। Agarose जैल और एक्यूपंक्चर n के बादईडल्स हटा दिए जाते हैं, एक ईसीएम समाधान आमतौर पर टाइप 1 कोलेजन और लैमिनिन से बना होता है जो निर्माण के लुमेन ( चित्रा 2 सी ) में जोड़ा जाता है। ईसीएम कोर ने न्यूरोनल सेल आसंजन और अक्षीय परिणाम की सहायता के लिए एक मचान प्रदान किया है। प्रारंभिक, प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स 10 , 31 , 32 असंबद्ध सेल निलंबन का उपयोग कर माइक्रो कॉलम में चढ़ाया गया। हालांकि, इस दृष्टिकोण ने सभी मामलों में लक्ष्य cytoarchitecture का उत्पादन नहीं किया था, जिसे सूक्ष्म-स्तंभों के अंत तक प्रतिबंधित न्यूरोनल सेल निकाय के रूप में परिभाषित किया गया था, साथ ही केंद्रीय लुमेन में शुद्ध गठबंधन अक्षीय आचरण शामिल थे। तब से, मजबूर न्यूरोनल एकत्रीकरण पद्धति (अनग्रिन एट अल । से अनुकूलित प्रोटोकॉल पर आधारित) के उपयोग ने आदर्श संरचना ( चित्रा 2 बी ) 44 के साथ माइक्रो-टीएनएन के अधिक विश्वसनीय और सुसंगत निर्माण सक्षम किया है। वर्तमान का वर्णन करने के अलावाकार्यप्रणाली, इस लेख में माइक्रो-टीएनएन के प्रतिनिधि चरण-विपरीत और confocal छवियां दिखाई देंगी जो समय के साथ अक्षीय ट्रेक्ट्स के निर्माण का प्रदर्शन करती हैं, साथ ही साथ अंतिम लक्ष्य वाले साइटोराचाचरचर यह पांडुलिपि प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं और माइक्रो-टेनन प्रौद्योगिकी के शेष चुनौतियों और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर विस्तार करेगा।
चित्रा 2: तीन चरण के सूक्ष्म-टेनन निर्माण प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख। ( ए ) एगारोस हाइड्रोगेल का विकास: (i) शुरू में, एक छोटी एक्यूपंक्चर सुई ( जैसे , व्यास में 180-350 सुक्ष्ममापी) को कस्टम-निर्मित, लेजर-कट ढालना या एक केशिका ट्यूब के बेलनाकार चैनलों में डाला जाता है ( उदा। , व्यास में 380-700 माइक्रोन)। अगले चरण में, डीपीबीएस में द्रव एगरोज़ को बेलनाकार चैनल या केशिका ट्यूबों में पेश किया जाता है। (Ii) agarose जैल के बाद, सुई हटा दी जाती है औरढालना खोखले agarose सूक्ष्म कॉलम उपज के लिए disassembled है (Iii) डीपीबीएस में इन निर्माणों को निष्फल और संग्रहीत किया जाता है। ( बी ) प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति और कुल विधि: (i) न्यूरोनल एकत्रीकरण पिरामिड सूक्ष्म-अच्छी तरह से सरणियों में किया जाता है, जो 3-डी-मुद्रित मोल्डों से डाली जाती है, जो कि 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुएं में फिट होते हैं। (Ii) माइक्रो-टीएनएन में भ्रूण के दिन -18-चूहों के भ्रूण के दिमाग से अलग-अलग प्राथमिक चूहे न्यूरॉन्स अलग-अलग होते हैं। ट्रिप्सिन-ईडीटीए और डीएनस 1 के साथ ऊतक विघटन के बाद, 1.0-2.0 x 10 6 सेल / एमएल के घनत्व के साथ एक सेल समाधान तैयार किया गया है। (Iii) इस समाधान के 12 μL पिरामिड सूक्ष्म अच्छी तरह से सरणी में प्रत्येक कुएं को स्थानांतरित कर दिया जाता है। इन सूक्ष्म कुएं युक्त प्लेट सेल समुच्चय का उत्पादन करने के लिए केन्द्रित किया गया है। (Iv) ये तब सूक्ष्म-स्तंभों में चढ़ाने से पहले रातोंरात लगाए जाते हैं। ( सी ) ईसीएम कोर निर्माण और सेल बीइंग: (i) सेल बीइंग से पहले, 1 एमजी / एमएल टाइप आई कोलेजन और 1 मिलीग्राम / एमएल युक्त ईसीएम समाधानलमिनिन को सूक्ष्म-टीएनएन के इंटीरियर में स्थानांतरित किया जाता है और उसे पोलीमर बनाने की अनुमति है (Ii) इस पर निर्भर करते हुए कि क्या यूनिडायरेक्शनल या द्विदिश माइक्रो-टीएनएन गढ़े जा रहे हैं, एक कुल को क्रमशः सूक्ष्म-स्तंभ के एक या दोनों चरम पर रखा गया है। (Iii) आसंजन को बढ़ावा देने के लिए ऊष्मायन की अवधि के बाद, माइक्रो-टीएनएन पूरक भ्रूण न्यूरोनल बेसल माध्यम के साथ भर में पेट्री डिश में सुसंस्कृत हैं। (Iv) संस्कृति में 3-5 दिनों के बाद, अंतिम सूक्ष्म-टीएनएन संरचना में सूक्ष्म-स्तंभ के चरम पर कोशिकाओं के समुच्चय को प्रदर्शित करना चाहिए, इसकी लंबाई लंबाई में फैले अक्षीय ट्रेक्ट्स के साथ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएनएस की चोट और बीमारी आमतौर पर लंबी दूरी के अक्षीय पथों के नुकसान या दोष का कारण बनती है जिनमें मस्तिष्क संयोजी शामिल होती है, जो कि संवेदनाहारी न्यूरोनल अध: पतन के बिना या बिना। यह न्यूरोजेनेसिस और प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ यूएडी-एनएस094340 (कलन), टी 32-एनएस043126 (हैरिस) और एफ 31-एनएस090746 (कटियार)), माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन (चिकित्सीय पाइपलाइन प्रोग्राम # 99 9 8 (कलन)) द्वारा वित्तीय सहायता प्रदान की गई थी, द पेन मेडिसिन न्यूरोसाइंस सेंटर पायलट अवार्ड (कल्लेन), नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप डीजी-1321851 (स्ट्रूज़िना एंड एडवॉल)), डिपार्टमेंट ऑफ वेयरेंस अफेयर्स (आरआर एंड डी मैरिट रिव्यू # बी 1097-आई (कल्लेन)), अमेरिकन एसोसिएशन न्यूरोलॉजिकल सर्जनों और न्यूरोलॉजिकल सर्जन कांग्रेस (2015-2016 न्यूरोट्रामा और क्रिटिकल केयर (पेट्रोव) में Codman फैलोशिप), और अमेरिकी सेना मेडिकल रिसर्च और मैटेरियल कमांड (# W81XWH-13-207004 (कुलेन) और W81XWH-15-1- 0466 (कुलेन))
Materials
| Laser cutter | Universal Laser Systems | PLS4.75 | Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold. |
| Laser-cut micro-column fabrication device | Custom-made | ————– | Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript. |
| Screws | ————– | ————– | #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm |
| Nuts | ————– | ————– | #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm |
| Acupuncture needle (180 µm diameter) | Lhasa Medical | sj.16X40 | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen. |
| Petri dish | Fisher | 08772B | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14200075 | |
| Polystyrene disposable serological pipet | Fisher | 13-678-11D | |
| Agarose | Sigma | A9539-50G | |
| Capillary tube (398 µm diameter) | Fisher | 21170D | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell. |
| Hot plate | Fisher | SP88857200 | |
| Magnetic bar | Fisher | 1451352 | |
| Micropipette | Sigma | Z683884-1EA | |
| 25 mm gauge needle | Fisher | 14-826-49 | |
| Microscalpel | Roboz Surgical | RS-6270 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Hot bead sterilizer | Sigma | Z378550-1EA | |
| Stereoscope | Nikon | SMZ800N | Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication. |
| Rat tail type I collagen | Corning | 354236 | Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use. |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 02-681-256 | |
| Mouse laminin | Corning | 354232 | Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use. |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | SS2661 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher | SA48-1 | |
| Litmus paper | Fisher | 09-876-18 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14170112 | Store at 4 ºC. |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I | Sigma | 10104159001 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 12587010 | Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| Sprague Dawley embryonic day 18 rats | Charles River | Strain 001 | |
| Pasteur pipette | Fisher | 22-042816 | |
| 15 mL centrifuge tube | EMESCO | 1194-352099 | |
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Fisher | 05-413-115 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Objet30 3D-Printer | Stratasys | ————– | Used to fabricate the pyramidal micro-well molds. |
| 3D-printed pyramidal well mold | Custom-made | ————– | Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent | Fisher | NC9285739 | Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood. |
| Funnel | Fisher | 10-348C | |
| 1 ml pipette bulb | Sigma | Z509035 | |
| Micro-spatula | Fisher | S50821 | |
| 12-well culture plate | EMESCO | 1194-353043 | |
| Oven | Fisher | 11-475-154 | |
| Incubator | Fisher | 13 998 076 | |
| AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | UPenn Vector Core | 36373 | Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator. |
| Formaldehyde 40% | Fisher | F77P-4 | Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes. |
| Horse serum | Gibco | 16050-122 | |
| Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody | Sigma | T8578-200UL | Store at -20ºC. |
| Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody | Synaptic Systems | 106-001 | Store at -20ºC. |
| Donkey anti-mouse 568 secondary antibody | Invitrogen | A10037 | Store at 4ºC. |
| Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody | Invitrogen | A21206 | Store at 4ºC. |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Invitrogen | H3570 | Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container. |
| A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ————– | Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs. |
| Eclipse Ti-S Microscope | Nikon | ————– | Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01). |
| High-speed Fluorescence Microscope | Nikon | ————– | Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging. |
| NIS Elements AR 4.50.00 Software | Nikon Instruments | ————– | Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. |
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