Anatomisk inspirerte tredimensjonale mikrovev-konstruerte nevrale nettverk for nervesystemet Rekonstruksjon, modulering og modellering

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette manuskriptet beskriver fremstillingen av mikrovev-manipulerte nevrale nettverk: tredimensjonale mikronstørrelses konstruksjoner bestående av langjusterte aksonale kanaler som spenner over aggregerte nevronpopulasjoner som er innkapslet i en rørformet hydrogel. Disse levende stillasene kan fungere som funksjonelle reléer for å rekonstruere eller modulere nevrale kretser eller som biofideliske test-senger som etterligner grå-hvitt materie-neuroanatomi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Funksjonell gjenoppretting forekommer sjelden etter skade eller sykdomsfremkalt degenerasjon i sentralnervesystemet (CNS) på grunn av det hemmende miljø og den begrensede kapasiteten for neurogenese. Vi utvikler en strategi for samtidig å behandle nevron- og axonal baneutslipp i det skadede CNS. Dette manuskriptet presenterer fremstillingsprotokollen for mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner), implanterbare konstruksjoner som består av nevroner og justerte aksonale kanaler som spenner over den ekstracellulære matriksen (ECM) lumen av en forformet hydrogelcylinder, hundrevis av mikron i diameter som kan utvide sentimeter I lengde. Neuronale aggregater er avgrenset til ekstremer av den tredimensjonale innkapslingen og spennes av aksonale fremspring. Mikro-tenner er unikt posisjonert som en strategi for CNS rekonstruksjon, emulerende aspekter av hjernekobling cytoarchitecture og potensielt gir midler for nettverksutskifting. Den neuRonale aggregater kan synaps med vertsvev for å danne nye funksjonelle reléer for å gjenopprette og / eller modulere manglende eller skadet kretsløp. Disse konstruksjonene kan også fungere som pro-regenerative "levende stillas" som er i stand til å utnytte utviklingsmekanismer for celle-migrasjon og aksonal pathfinding, som gir synergistiske strukturelle og løselige signaler basert på regenereringsstatus. Mikro-tenner fremstilles ved å helle flytende hydrogel inn i en sylindrisk form som inneholder en langsgående sentrert nål. Når hydrogelen har gelert, blir nålen fjernet, og etterlater en hul mikrokolonne. En ECM-løsning legges til lumenet for å gi et miljø egnet for nevronal adhesjon og aksonal utvekst. Dissocierte nevroner er mekanisk aggregerte for presis sådd i en eller begge ender av mikrokolonnen. Denne metoden gir pålitelig selvbetjente miniatyrkonstruksjoner med langprojiserende aksonale kanaler som kan rekapitulere trekkegenskaper i hjernens neuroanatomi. Synaptisk immUnolabeling og genetisk kodede kalsiumindikatorer antyder at mikro-tenner har omfattende synaptisk fordeling og inneboende elektrisk aktivitet. Følgelig representerer mikro-tennene en lovende strategi for målrettet nevrokirurgisk rekonstruksjon av hjerneveier, og kan også brukes som biofideliske modeller for å studere neurobiologiske fenomener in vitro .

Introduction

En vanlig egenskap for lidelser og sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som traumatisk hjerneskade (TBI), ryggmargsskade (SCI), hjerneslag, Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom, er frakoblingen av aksonale veier og nevroncelle Tap 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel, når et iskemisk slag går ubehandlet, anslås det at aksonene går tapt med en hastighet på 7 miles av axoner per minutt 5 . I tilfelle av TBI, som ca 1,7 millioner mennesker opplever hvert år i USA alene, kan aksonal degenerasjon fortsette å skje år etter traumer, da den første skaden utsettes for en langsiktig neurodegenerativ tilstand 4 . Forverrer disse skadelige effektene, har CNS en alvorlig begrenset capaBy for regenerering 1 , 7 , 8 , 9 . Etter skader utvikles et hemmende miljø som er preget av mangel på rettet veiledning til fjerne mål, tilstedeværelsen av myelin-assosierte hemmere som hindrer nevittutvæksten, og dannelsen av et glialær ved reaktive astrocytter 8 , 10 , 11 , 12 . Glialæret tjener som en biokjemisk og fysisk barriere for regenerering, med molekyler som kondroitinsulfatproteoglykaner som hindrer aksonutvokst 8 , 11 . Videre, selv om neurale stamceller er blitt funnet i den voksne CNS, er produksjonen av nye nevroner begrenset, da konsekvent bevis på nevrogenese kun er funnet i olfaktorisk pære, hippocampalSubgranulær sone, det periventrikulære området og den sentrale kanal i ryggmargen 13 , 14 . Disse hindringene hindrer den funksjonelle gjenoppretting av tapt nevroner og hvit materiell arkitektur etter skade eller sykdom, noe som resulterer i de ofte endringsmessige og langvarige effektene av disse forholdene.

Til tross for mangel på regenerativ kapasitet i den voksne CNS, har det vist seg at aksonal regenerering er mulig dersom tilstrekkelige miljøveiledninger presenteres for verten nevroner 15 , 16 , 17 , 18 . Forskere har forsøkt å levere og manipulere vekstfaktorer (for eksempel nervevækstfaktor, epidermal vekstfaktor, glialavhengig vekstfaktor og nevrotrofisk faktor 3) og andre veiledningsmolekyler for å stimulere plastisitet og axonregenerering 14 , </ Sup> 18 , 19 . Selv om disse studiene har bekreftet at voksenaksoner er i stand til å reagere på vekstfaktorer, er disse strategiene begrenset av lavt gjennomtrengelighet av blod-hjernebarrieren og de spesifikke romlige og tidsmessige gradienter som kreves for å fremme regenerering 14 , 18 , 19 . Andre tilnærminger har stått på hyperaktivering av regenereringsrelaterte transkripsjonsfaktorer i CNS-neuroner. For eksempel stimulerte overekspresjon av Stat3 transkripsjonsfaktoren aksonal regenerering i optisk nerve 20 . Likevel unnlater både biomolekylavgivelse og overekspresjon av transkripsjonsfaktorer å erstatte tapte nevronpopulasjoner. Cell-baserte strategier har hovedsakelig sentrert seg på transplantasjon av neuralstamceller (NSC) i CNS, og utnytter deres evne til å erstatte CNS-neuroner, frigjøre trofiske faktorer,Og støtte forsøk på neurogenese som oppstår etter skade 17 . Til tross for dette er det fortsatt presserende utfordringer som hindrer denne tilnærmingen, inkludert den hindrede evne til transplanterte nevrale celler til å overleve, integrere med verten, og forblir romlig begrenset til det skadede område 6 , 14 , 17 , 21 . I tillegg er cellelevering alene ikke i stand til å gjenopprette cytoarkitekturen av skadede eller tapte aksonale veier. En alternativ tilnærming som løser problemene med celle- og stoff- / kjemisk leveringsstrategier, er å kombinere disse tilnærmingene med bruken av biomaterialene 14 , 22 , 23 . Biomaterialer som hydrogeler er i stand til å emulere de biokjemiske og fysiske egenskapene til den ekstracellulære matriksen (ECM), som bidrar til cellelevering ogD oppbevaring i det skadede området, og levere vekstfaktorer og andre bioaktive molekyler med kontrollert frigivelse 22 . De attraktive egenskapene til disse biomaterialebaserte strategiene har resultert i bevis på in vivo axonal regenerering etter transplantasjon av stillaser til det lesioned området 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Imidlertid erstatter acellulære biomaterialestrategier ikke tapte nevronpopulasjoner; Når de brukes som leveringsvogner for nevron-, glial- eller neuronprekursorceller, er biomaterialer ikke i stand til å rekonstruere langdistansaksonale nettverk. Utfordringen med å utvikle en tilnærming som takler både den aksonale banedegenerasjonen og nevrolog tap forbundet med CNS-skade og sykdom forblir fortsatt <Sup class = "xref"> 31.

Vår forskningsgruppe rapporterte tidligere utviklingen av implanterbare mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner), som er en type "levende stillas" bestående av neuronelle celleorganer begrenset til en eller begge ender av en agarosehydrogel-ECM mikrosøjle , Med justerte aksonale kanaler som strekker seg gjennom det indre av denne tredimensjonale (3D) innkapslingen 1 , 10 , 31 , 32 . En av de viktigste forskjellene mellom denne teknikken og tidligere tilnærminger er at cytoarkitektur av mikro-tenner er opprettet helt in vitro og transplanteres etterpå 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro- fremstilling gir omfattende romlig og tidsmessig kontroll av cellulær fenotype og orientering, mekaniske / fysiske egenskaper, biokjemiske tegn og eksogene faktorer, noe som fordeler integrasjonen av disse stillasene med verten etter implantasjon 41 , 42 . Mikro-tenner er anatomisk inspirert fordi de etterligner hjernens neuroanatomi, viser aksonale kanaler som ligner de som knytter distinkte funksjonsområder av hjernen ( figur 1A ) 1 . Derfor kan denne strategien fysisk erstatte tapte hvite materielle kanaler og nevroner etter implantasjon i en lesioned region. Denne teknikken er også inspirert av utviklingsmekanismer der "naturlige levende stillaser" dannet av radiale glialceller og banebrytende axoner fungerer som veiledende guider for celleMigrasjon fra subventricular sonen og aksonal utvekst, henholdsvis 43 . Disse mekanismene er rekapitulert i de justerte aksonale kanaler av mikro-tenner, som kan presentere levende veier for nevralcellemigrasjon og aksonal regenerering ved akson-mediert aksonal utvekst ( figur 1C ) 43 . Videre utnytter denne strategien seg av synaptisk integrasjon mellom mikro-TENN-neuronene og det nasjonale kretsløpet, og danner nye reléer som kan bidra til funksjonell gjenoppretting ( figur 1B ) 43 . Kapasiteten til synapsdannelse kan også gi denne tilnærmingen muligheten til å modulere CNS og reagere på vertsvev i henhold til nettverks tilbakemelding. For eksempel kan optogenetisk aktive nevroner i levende stillasene stimuleres til å modulere vertsneuroner gjennom synaptiske interaksjoner ( Figur 1D ).

I tillegg er den biomaterialebaserte rørformede konstrUgn av mikro-tenner gir et tilstrekkelig miljø for celleadhesjon, vekst, neurittforlengelse og signalering, mens de minste dimensjonene av konstruksjonene muligens muliggjør minimal invasiv implantering og gir et delvis sekvestrert mikromiljø for gradvis integrering i hjernen. Faktisk har nyere publikasjoner vist potensialet for mikro-tenner til å etterligne nevrale veier etter implantasjon i rottehjerne. Etter stereotaksisk mikroinjeksjon rapporterte vi tidligere bevis for mikro-TENN-neuronal overlevelse, vedlikehold av aksonalkanalarkitektur, og nevittforlengelse i vertscortexen i minst 1 måned in vivo 10 , 31 . Dessuten ga merking med synapsin histologisk bevis på synaptisk integrasjon med nativt vev 10 , 31 . Samlet sett kan mikro-tenner være unikt egnet til å rekonstruere og modulere skadetCNS ved å erstatte tapte nevroner, synaptisk integrering med vertskretsløp, gjenopprette tapt axonal cytoarkitektur og i visse tilfeller å gi regenererende axoner med de riktige stikkordene.

Figur 1
Figur 1: Prinsipper og inspirasjon bak utviklingen av mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner). ( A ) Mikro-Tenner etterligner cytoarkitekturen til hjernekoblingen (lilla), hvor funksjonelt forskjellige regioner er forbundet med lange, justerte aksonale kanaler i en retningsriktet (rød, grønn) eller toveis (blå) måte. Som et eksempel kan mikro-tenner rekonstruere tapte forbindelser i kortikothalamiske og nigrostriatale veier eller i perforantveien fra entorhinal cortex til hippocampus (tilpasset fra Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram over en enhetlig retningL og toveis mikro-TENN (henholdsvis rød og blå) synaptisk integrering med vertskretsen (lilla) for å fungere som et funksjonsrelé mellom begge ender av en lesjon. ( C ) Skjematisk av axonaltraktene i en ensrettet mikro-TENN (grønn) som tjener som en veiledning for aksonforenklet regenerering av vertsaxoner (lilla) mot et mål som mikro-tennene samhandler med. ( D ) Konseptbasert diagram for bruk av optogenetisk aktive mikro-TENNS som nervemodulatorer, utnytte synaptisk integrasjon med eksitatoriske eller hemmerende nevroner (bunn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det nåværende manuskriptet beskriver metoden som ble benyttet for å fremstille mikro-tenner ved bruk av embryonalt avledede cerebrale kortikale nevroner. Spesielt kan mikro-tenner fremstilles med andre typer nevrale celler. For eksempelRikelig, de første rapportene om vellykket mikro-TENN-utvikling inneholdt dorsal root ganglion (DRG) nevroner 32 . Hydrogelmikrokolonnene kan genereres ( figur 2A ) ved å tilsette flytende agarose til en skreddersydd, laser-kuttet sylindrisk kanalgruppe eller til kapillærrør, begge inneholdende justerte akupunkturnåler. Nålen danner lumenet og bestemmer mikrokolonnens indre diameter (ID), mens kapillærrøret ID og diameteren av sylindrene i den laserskårne anordningen dikterer den ytre diameter (OD) til konstruksjonene. OD og ID kan velges i henhold til ønsket søknad ved å velge forskjellige diametre for henholdsvis anordning / kapillærrør og akupunktur nåler. Lengden på mikrokolonnene kan også varieres; Til dags dato har vi rapportert bygging av mikro-tenner opptil 20 mm i lengde 10 og driver aktivt lengre lengder. Etter agarose geler og akupunktur nEedler fjernes, en ECM-løsning som vanligvis består av type I kollagen og laminin tilsettes i konstruksjonslumenet ( figur 2C ). ECM-kjernen gir et stillas for å understøtte nevroncelleadhesjon og aksonal utvekst. I første omgang ble primære rotte-kortikale nevroner plettet i mikrokolonnene ved anvendelse av dissocierte cellesuspensjoner 10 , 31 , 32 . Imidlertid produserte denne tilnærmingen ikke mål-cytoarkitekturen i alle tilfeller, som ble definert som neuronelle celleorganer begrenset til endene av mikrokolonnene, med det sentrale lumen bestående av renjusterte aksonale kanaler. Siden da har bruken av en tvungen neuronal aggregeringsmetode (basert på protokoller tilpasset Ungrin et al .) Gjort det mulig for en mer pålitelig og konsekvent fremstilling av mikro-tenner med den ideelle strukturen ( figur 2B ) 44 . I tillegg til å beskrive dagensMetodikk, vil denne artikkelen vise representative fasekontrast og konfokale bilder av mikro-tenner som demonstrerer dannelsen av aksonale kanaler over tid, samt den ferdige mål-cytoarkitekturen. Dette manuskriptet vil også utvide på bemerkelsesverdige aspekter av protokollen og gjenværende utfordringer og fremtidige retninger av mikro-TENN teknologien.

Figur 2
Figur 2: Skjematisk diagram av tre-trinns mikro-TENN fabrikasjonsprosess. ( A ) Utvikling av agarosehydrogelen: (i) Først settes en liten akupunkturnål ( f.eks . 180-350 μm i diameter) inn i de sylindriske kanalene i en skreddersydd, laserskåret form eller et kapillarrør ( f.eks. , Diameter 380-700 μm). I det neste trinnet blir flytende agarose i DPBS introdusert i de sylindriske kanalene eller kapillærrørene. (Ii) Etter agarose gelene fjernes nålen ogFormen er demontert for å gi de hule agarosemikolonner. (Iii) Disse konstruksjonene steriliseres deretter og lagres i DPBS. ( B ) Primærnekonkultur og aggregatmetode: (i) Neuronal aggregering utføres i pyramidale mikrobrønn-arrays, støpt av 3D-trykte støper, som passer inn i brønnene på en 12-brønn kulturplate. (Ii) Mikro-TENNer inkluderer primære rotte-neuroner dissosiert fra føtalhjerner av embryonaldag-18-rotter. Etter vevsdissociasjon med trypsin-EDTA og DNase I fremstilles en celleoppløsning med en densitet på 1,0-2,0 x 106 celler / ml. (Iii) 12 μl av denne løsningen overføres til hver brønn i den pyramide mikrobrønn array. Platen som inneholder disse mikrobrønnene, blir sentrifugert for å produsere celleaggregater. (Iv) Disse inkuberes deretter over natten før plating i mikrokolonnene. ( C ) ECM-kjernefabrikasjon og cellesøing: (i) Før cellesøing ble en ECM-løsning inneholdende 1 mg / ml type I kollagen og 1 mg / mlLaminin overføres til det indre av mikro-tennene og får lov til å polymerisere. (Ii) Avhengig av om enveis eller toveis mikro-TENN er tilveiebragt, blir et aggregat plassert ved henholdsvis en eller begge ytterpunkter av mikrokolonnen. (Iii) Etter en inkuberingsperiode for å fremme vedheft blir mikro-TENN dyrket i petriskåler oversvømt med supplert embryonalt nevronbasalt medium. Iv) Etter 3-5 dager i kultur bør den endelige mikro-TENN-strukturen demonstrere celleaggregater ved ekstremer av mikrokolonnen, med aksonale kanaler som strekker seg over lengden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteer ved University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center og fulgte retningslinjene i NIHs folkehelsepolitiske retningslinjer for human omsorg og bruk av laboratorium Dyr (2015).

1. Utvikling av agarosehydrogelen (akellulær komponent av mikro-tenner)

  1. Agaroseoppløsningspreparat
    1. Innenfor et biosikkerhetskapasitet skal du lagre reservoarer for mikrokolonnene ved å overføre 20 ml Dulbeccos fosfatbufferte saltoppløsning (DPBS) til hver av to 10 cm petriskål. Steriliser fine pincett og mikroskalpeller med en varm pearl sterilisator.
    2. Vekt 3 g agarose og overfør den til et sterilt beger inne i biosikkerhetsskapet. Tilsett 100 ml DPBS for en endelig konsentrasjon på 3% vekt / volum (w / v). Ta med en ren magnetisk bar og dekk bøkene med alumiNum folie.
    3. Med en kokeplate / omrører, varmet begeren ved 100 ° C og rør ved 120-200 omdr./min for fullstendig oppløsning av agarosen (løsningen vil vende seg fra overskyet til tømmer). Vedlikehold oppvarming og omrøring etterpå for å forhindre gelering og endre varmetemperaturen etter behov for å unngå å brenne agarosen.
      MERK: Produksjon med både laserskjæret og kapillærrør presenteres nedenfor i henholdsvis underavsnittene 1.2 og 1.3. Fortsett til underavsnitt 1.4 etter å ha fullført trinnene beskrevet i begge underavsnitt. For begge mikrokolonnefabrikkeringsmetoder, legg raskt væskarakarosen, da agarose størkner raskt etter hvert som det avkjøles. Når du steriliserer med en autoklav i noen av de følgende trinnene, bruk standardbetingelsene som brukes på glassvarer.
  2. Mikro-kolonne forberedelse ved hjelp av en laser-cut-enhet
    MERK: Laserskåret enheten er kuttet av gjennomsiktig akryl ved hjelp av en kommersiell CO 2 laserkutter. FabKation av strukturer og enheter gjennom laserskjæring er godt dokumentert for en rekke tekniske og forskningsapplikasjoner 45 , 46 , 47 . Denne molden ( figur 3 ) består av en rekke fem sylindriske kanaler, hver med en diameter på 398 um og en lengde på 6,35 mm. Disse sylindriske arrays er utformet langs deres lengde med to deler: en bunnhalvdel (lengde: 25,4 mm, bredde: 6,35 mm, høyde: 6,0 mm) og en topphalvdel (lengde: 31,5 mm, bredde: 6,35 mm, høyde: 12,7 mm ), Som vist i henholdsvis figurene 3A og 3B . De to halvdelene kan klemmes sammen av de fremre og bakre kappene som observeres i figur 3C (lengde: 31,5 mm, bredde: 6,35 mm, høyde: 12,7 mm), som har fire justeringshull som sammenfaller med to hull hver på topp og bunn Stykker og som bidrar til å sikre alle delene sammen når de er skrudd. Disse kappene øker ogsåLude fem hull, konsentriske mot de sylindriske kanalene, i hvilke akupunktur nålene kan settes inn for å danne lumen av mikro-kolonner.
    1. Steriliser enheten vist på figur 3 ved å dekke den med aluminiumsfolie og autoklavering. Monter enheten som vist på Figur 3D ved å tilpasse de fremre og bakre kappene med bare bunnhalvdelen og fest de tre delene med to # 4-40 skruer og muttere (tråddiameter: 3,05 mm) i bunnjusteringshullene.
    2. Fullfør en akupunkturnål (diameter: 180 μm, lengde: 30 mm) inn i nålhullene på enten den fremre eller bakre delen av enheten ( Figur 3D ). Med en mikropipett, hell nok væskeagarose (~ 1 ml for de fem kanalene) på bunnhalvdelen for å fylle hver av de sylindriske kanalhalvene fullstendig.
    3. Sett straks halvparten av enheten over bunnen og legg på trykk til den er ordentlig iSted for å fullføre sylindriske kanaler (friksjon mellom kappene og toppstykket vil holde sistnevnte på plass). Vent ~ 5 minutter ved romtemperatur etter agarose tillegg for å tillate gelering i kanalene på enheten.
    4. Trekk ut nålen manuelt fra hvert av hullene på apparatets kapsler. Fjern skruene og skift manuelt de to kappene og den øverste halvdelen fra bunnhalvdelen, hvor sistnevnte holder hydrogelmikrokolonnene.
    5. Bruk fine tang for å forsiktig fjerne mikrokolonnene fra kanalene på bunnhalvdelen og plasser dem i den tidligere tilberedte petriskålen som inneholder DPBS (trinn 1.1.1). Reutilize enheten for en annen runde med mikro-kolonne fabrikasjon. Fortsett til underavsnitt 1.4.
  3. Mikro-kolonne fabrikasjon ved hjelp av kapillærrør
    1. Overfør glasskapillærrør (diameter: 398.78 μm, lengde: 32 mm) til innsiden av biosikkerhetsskapet. Bryt manueltLange rør inn i 2,0-2,5 cm fragmenter og sett helt inn en akupunkturnål (diameter: 180 μm, lengde: 30 mm) i hvert fragment ( figur 2A ).
    2. Overfør 1 ml flytende agarose fra begeret til overflaten av en tom petriskål. Hold kapillærrøret og den introduserte nålen, plasser den ene enden av røret i kontakt med væskens agarosebasseng for å fylle det ved kapillærvirkning. Rør røret for å fremme kapillærstigning.
      MERK: Fyll kapillærrørene med flytende agarose så høyt som kapillærvirkningen tillater; Etterpå kan disse mikrokolonnene kuttes i mindre konstruksjoner avhengig av ønsket lengde. 1 ml agarosepuljen brukes vanligvis kun for ett rør, siden agarosen avkjøler og geler raskt, og forhindrer ytterligere kapillærvirkning.
    3. Når væsken slutter å stige, fjern kapillærrøret fra bassenget og legg det horisontalt på overflaten av en petriskål. Vent i 5 minutter for å la agarosegelen inni rørene. </ Li>
    4. Sett tommelen og pekefingeren på hver side av røret og trykk mot den. Bruk den andre hånden til å raskt trekke ut nålen mens du bruker tommelen og pekefingeren for å forhindre at mikrokolonnen slipper ut av røret. Sett inn en 30-gauge nål i kapillærrøret for langsomt å skyve mikrokolonnen ut i en tallerken som inneholder DPBS (trinn 1.1.1).
  4. Micro-kolonne trimning og sterilisering
    1. Overfør en mikrokolonne delelig fra DPBS til en tom tallerken ved hjelp av fine tang. Tilsett 10 μL DBPS til toppen av mikrokolonnen med en mikropipett for å forhindre tørking. Plasser sistnevnte tallerken under et stereoskop for visuell veiledning.
      MERK: Gjennom protokollen refererer mikrokolonne tørking eller dehydrering til oppkjøpet av en krøllet struktur som er synlig å skille fra det typiske hydratiserte utseendet til disse konstruksjonene. Dehydrerte mikrokolonner festes fast til overflaten av petriskålene og cAnnot blir lett flyttet, mens hydraterte konstruksjoner har en tendens til å glide over overflaten etter å ha blitt manipulert med tang. Et fasekontrastbilde av en helt tørket mikrokolonne er vist i figur 8A .
    2. Trim mikrokolonnen med en mikroskalpel for å forkorte den til ønsket lengde (her 2-5 mm). Transport den trimmede mikrokolonnen med fine tang til den andre DPBS Petri-skålen, utarbeidet i trinn 1.1.1.
    3. Gjenta trinn 1.4.1 og 1.4.2 for hver fabrikert mikrokolonne.
    4. Steriliser mikrokolonnene i DPBS-inneholdende petriskål under ultrafiolett (UV) lys i 1 time. Oppbevar petriskålene ved 4 ° C før ECM tillegg og celleplating.

2. Primære neuronkultur og tvungen celleaggregeringsmetode

  1. Fremstilling av den pyramide mikrobrønn-arrayen
    MERK: Denne delen benytter en 3D-trykt form bestående av en sylindrisk base (diameter: 2,2 cm, høyde: 7,0 mm) aNedenfor ni firkantede pyramider på toppen (sidelengde: 4,0 mm, skrå vinkel: 60 °), organisert i et 3 x 3-array, som vist i figur 3E . Tilleggsfremstillingsprosessen ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 3D-skrivere er godt dokumentert. Datamaskinstøttet designprogramvare kan brukes til å designe molden. Den resulterende designfilen kan deretter konverteres digitalt til en verktøylinje for en 3D-skriver. Hver skriver har forskjellige spesifikasjoner, og instruksjonene for å sette opp og betjene en 3D-skriver varierer tilsvarende.
    1. Bruk en 3/32 "borekrone til å punktere 16 hull i en 4 x 4-serie (sidelengde: 4 cm, hullseparasjon: 1 cm), sentrert i lokket på en 10 cm petriskål. Inne i en kjemisk avtrekksdeksel, bruk Bunnstykket av petriskålen til å veie 27 g polydimetylsiloksan (PDMS) og 3 g herdemiddel (for forholdet 1:10). Rør med en mikrospatel for å fordele midlet jevnt.
    2. Dekk PDMS / herdemiddelet med det punkterte lokket. Koble den ene enden av en slange til vakuumetM avtrekksdeksel og sett den andre enden inn i stammen til en trakt (munndiameter: 10 cm, stengelengde: 3 cm, stengediameter: 1,5 cm).
    3. Lag en åpning med en 3/32 "borekrone på toppen av en 1 ml pipettepære og sett inn og fest en 1000 μL mikropipettespiss i åpningen (med spiss ende oppover). Legg pæren og spissen inn i slangen og trekk Slangen oppover til pæren tetter slangen inn i traktens stamme.
    4. Plasser tragten på det punkterte parabolen og fest slangen med en tilgjengelig, solid støtte. Åpne vakuumventilen i 5 minutter til suging og ta luftboblene til overflaten.
    5. Lukk ventilen, fjern trakten og trekk Petri-skålen mot overflaten av avtrekksventilen ~ 3 ganger for å sprenge gjenværende luftbobler.
    6. Plasser en pyramidisk brønn 3D-trykt form i hver av brønnene i en 12-brønn kulturplate, med pyramidene peker opp. Hell PDMS / herdemiddelet på toppen av formen til hver brønn på tHan platen er fylt. Dekk 12-brønnsplaten med lokket og overfør den til en ovn i 1 time ved 60 ° C for å tørke.
    7. Fjern forsiktig hver PDMS-mikrobrønnplate ( Figur 3F ) fra platen med en mikrospatel. Dekk PDMS-arrays med aluminiumsfolie og steriliser ved autoklavering. Inne i et biosikkerhetsskap, sett inn ett mikrobrønnsystem i hver brønn på en 12-brønnplate ( figur 2B ).
  2. Kortikal neuron isolasjon fra rottefostre
    1. Tilsett ~ 20 ml Hank balansert saltløsning (HBSS) til hver av fire til seks 10 cm Petri-tallerkener (ett for hver dissekert vev) inne i et biosikkerhetsskap. Overfør disse rettene til en disseksjons hette og legg dem på is. Steriliser disseksjonsinstrumenter, som mikroskopeller, saks og pincet, med en sterilisator med sterilisator.
    2. Forvarmet embryonalt nevronbasalt medium + 2% serumfritt supplement + 0,4 mM L-glutamin (referert til som "kulturmedium" herafteR) og 0,25% trypsin + 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved 37 ° C. Tine deoksyribonuklease (DNase) I ved å plassere den ved romtemperatur. Lag 1,5 ml av en 0,15 mg / ml DNAse I løsning i HBSS og opprettholder løsningen på is.
    3. Euthaniser en tidsbestemt gravid embryonal-18-rotte ved innånding av karbondioksid og bekreft døden ved avtapping. Overfør slagtekroppen til en steril disseksjons hette og legg den ventral-side opp. Skyll magen grundig med 70% etanol.
    4. Åpne livmoren og fjern fostrene (vanligvis ~ 11) fra amniotiske sekker med sakse og overfør dem med tau til en petriskål som inneholder kaldt HBSS, som beskrevet 48 . Plasser en nedkjølt (-20 ° C) granittblokk under stereoskopet. Plasser Petriskålen på overflaten av denne kaldblokken for å spare den lave temperaturen til HBSS gjennom disseksjonsprosedyren.
    5. Skyll puppene ved å svinge HBSS rundt og deretter overføre dem til neste rene tallerkenInneholdende HBSS. Ved hjelp av stereoskopet og disseksjonsinstrumentene fjernes sekvensielt hodene, hjernehalvene og cortices av fostrene og overfører hvert vev med pincet til en ny HBSS-fylt parabolen etter hver disseksjon 48 .
    6. Aspirer bare cortices med en Pasteur pipette og legg vevet i et sterilt 15 ml sentrifugerør. Kast de andre dissekerte vevene. Skyll cortices tre ganger ved å sekvensielt legge til og fjerne ~ 5 mL HBSS med en serologisk pipette. Plasser røret på is når det ikke er i bruk.
    7. Overfør cortices med en Pasteur pipette til et 15 ml rør som inneholder forvarmet trypsin-EDTA (4-6 kortikser per 5 ml trypsin-EDTA). Rør røret manuelt og plasser det ved 37 ° C. Inverter røret hvert 3. minutt for å hindre at vevet klumper seg.
    8. Stopp eksponeringen for trypsin etter ~ 10 minutter ved å fjerne vevet med en Pasteur pipette og overføre den til en ren 15 ml sentrifugerør. Tilsett 0,15 mg / ml DNase I-oppløsningen (1,5 ml) til røret med en pipette.
    9. Bruk en Pasteur pipette for å bryte opp vevklumper manuelt og deretter virvel (~ 30 s) til løsningen virker homogen, og det er ingen gjenværende vevfragmenter i væsken. Hvis det ikke er mulig å homogenisere løsningen helt, trekk de uoppløselige fragmentene ved å trekke dem inn i spissen av en Pasteur pipette.
    10. Sentrifuger den homogene celleoppløsningen oppnådd i trinn 2.2.9 ved 200 xg i 3 minutter. Fjern supernatanten med en Pasteur pipette, pass på å ikke forstyrre de pelleterte cellene. Tilsett 2 ml kulturmedium med en serologisk pipette og hvirvel for å resuspendere cellene.
    11. Telle antall celler i løsningen fremstilt i trinn 2.2.10 ved å bruke et hemocytometer; Det forventede utbyttet er 3,0-5,0 x 106 celler / kortikale halvkule. Forbered 1 ml eller mer av cellesuspensjon i dyrkningsmedium, med en densitet på 1,0-2,0 x 106 celler / ml.
  3. Formasjon av neuronelle celleaggregater
    1. Med en mikropipett, tilsett 12 μL av 1,0-2,0 x 10 6 / ml cellesuspensjonen i hver mikrobrønn i PDMS-arrayet (som ble plassert i platen i trinn 2.1.7).
      MERK: Cellekonsentrasjonen kan justeres avhengig av mikrokolonne ID og ønsket celleaggregatstørrelse, da høyere konsentrasjoner gir større aggregater.
    2. Sentrifuger platen ved 200 xg i 5 minutter for å tvinge aggregasjonen av celler i bunnen av mikrobrønnene ( figur 2B ). Legg forsiktig til ~ 2 ml kulturmedium til toppen av hver PDMS-matrise for å dekke alle de seedede mikrobrønnene, pass på å ikke forstyrre de aggregerte cellene.
    3. Hvis celler ikke blir transdusert med en virusvektor, inkuber platen i 12-24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 og fortsett deretter til avsnitt 3. Hvis aggregatene blir transdusert, hopper du over inkubasjonen og fortsetter til avsnitt 2.4 .
  4. TranSvekking med en viral vektor for å observere kalsiumsignalering
    Merk: Disse trinnene utføres for å transducere nevroner med en viral vektor som inneholder en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI). Resultatene vist i denne artikkelen ble oppnådd ved bruk av et kommersielt tilgjengelig adenoassosiert virus (AAV) (serotype 1) med GCaMP6f, en GECI med hurtig kinetikk bestående av grønt fluorescerende protein (GFP), calmodulin (CaM) og M13 peptidet, Drevet av den humane Synapsin I-promotoren. Den virale vektoroppløsningen kan kreve fortynning i sterilt DPBS før transduksjon, avhengig av konsentrasjonen av stamopløsningen. Cellhelse / morfologi og GCaMP6f signalstyrke må observeres over tid for en rekke vektorkonsentrasjoner. Denne optimaliseringsprosedyren må utføres av hver undersøker for å bestemme passende titer for sine egne cellekulturer. Den typiske GCaMP6f ekspresjonstiden er 7-8 dager etter transduksjonen som oppstår under inkuberingen som er gjort i stEp 2.4.2.
    1. Med en mikropipett, legg til ønsket volum av virusvektiløsning (for en endelig konsentrasjon på ~ 3,0 x 10 9 genomiske kopier per aggregat) til dyrkningsmediet som dekker aggregatene. Sakte pipetter opp og ned for å sikre at vektoroppløsningen er homogent fordelt gjennom kulturmediet.
    2. Inkuber platen med de seedede pyramide mikrobrønner i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 for å tillate viral transduksjon av GCaMP6f.

3. Utvikling av den cellulære komponenten av mikro-tenner

  1. ECM kjernefabrikasjon
    1. Etter aggregatinkubering, tilsatt type I kollagen og laminin til dyrkningsmediet (for en konsentrasjon på 1 mg / ml hver) i et mikrocentrifugerør for å fremstille ECM-løsningen. Utfør trinn 3.1.2-3.1.4 ved romtemperatur, men opprettholder røret med ECM på is når det ikke er i bruk for å forhindre for tidlig gelering.
    2. Juster pH i ECM-løsningen ved å overføre 1-2 μL til litmuspapir for å verifisere den opprinnelige pH, tilsette 1 μL 1 N natriumhydroksid (NaOH) og / eller 1 N saltsyre (HCI) til ECM, etter behov, Og gjenta til pH er 7,2-7,4. Sørg for homogenisering av ECM-løsningen ved pipettering opp og ned, samtidig som du unngår dannelse av luftbobler.
    3. Overfør mikrokolonnene med steriliserte pincetter fra oppvasken i trinn 1.4.3 for å tømme 35 eller 60 mm petriskål. Arbeid på 4-5 mikrokolonner om gangen for å forhindre dehydrering. Fest en 10-μl-tipp festet til en 1000-μl-tipp til en mikropipett. Ved hjelp av stereoskopet for visuell veiledning, plasser spissen i den ene enden av mikrokolonnene og sug for å ekstrahere resterende DPBS og luftbobler fra lumen.
    4. Rask opp 4-5 μL ECM i en mikropipette. Observasjon under en steReoskop, plasser toppen av mikropipetten i en av endene på mikrokolonnene og fyll ut nok ECM til å fylle lommen. Bekreft fravær av luftbobler i lumenet, da disse kan hemme aksonal utvekst gjennom ECM. Hvis det finnes luftbobler, fjern ECM, som forklart i trinn 3.1.3, og legg til ECM igjen.
    5. For å forhindre dehydrering, legg til ~ 2 μL ECM rundt hver mikrokolonne. Inkuber hydrogel / ECM mikrokolonnene i petriskålene ved 37 ° C og 5% CO2 i 25 minutter. Fortsett med cellesedning umiddelbart etter inkubasjon.
      MERK: Inkubasjonsperioden i trinn 3.1.5 er ment å tillate tid for polymerisering av kollagen og laminin inne i mikrokolonnene.
  2. Neuronal celledyring i mikrokolonnene
    MERK: For å endre kulturmediet til de transduserte aggregatene, vippe platen, bruk en mikropipett for å fjerne mediet som svømmer på brønnveggen, og deretter sakte ~ 1 ml motVeggen (for å unngå å forstyrre aggregatene i pyramidale mikrobrønner). Gjenta denne middelsendringen en gang til.
    1. Etter inkuberingsperioden i trinn 3.1.5, overfør ca. 10-20 μL dyrkningsmedium til to frie områder i petriskålene som holder mikrokolonnene. Bruk en mikropipette til å overføre aggregatene individuelt til petriskålen som inneholder konstruksjonene og flytte dem med tanger til en av de små bassengene av kulturmedium for å bevare cellehelsen.
    2. Mens du observerer under et stereoskop, sett inn et aggregat i hver ende av mikrokolonnene for toveis mikro-tenner eller i den ene enden for en ensrettet arkitektur (som ønsket) ved hjelp av pincet. Bekreft plasseringen av aggregatene inne i mikrokolonnene ved hjelp av stereoskopet. Bruk tanger for å flytte de podede mikrokolonnene til det andre små bassenget av kulturmedium for å unngå dehydrering og for å bevare aggregathelsen.
    3. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 45 minutter til aLa aggregatene holde seg til ECM. Kontroller at aggregatene forblir i enden av mikrokolonnene ved hjelp av stereoskopet; Reintroducere celleaggregatene og gjenta inkubasjonstrinnet etter behov.
    4. Overfløt forsiktig Petri-diskene som inneholder mikro-TENN med kulturmedium (3 eller 6 ml for henholdsvis en 35 eller 60 mm petriskål) ved bruk av en serologisk pipette. Plasser oppvasken i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for langsiktig kultur.
    5. Utfør halvmedieendringer hver 2. dag med kulturmedium. Fjern forsiktig halvparten av det gamle mediet med en pipette og bruk stereoskopet for visuell veiledning for å unngå suging av mikro-tennene. Erstatt ved langsom tilsetning av frisk, forvarmet medium med pipette.
    6. For å gjenbruke PDMS mikrobrønn-arrays, fjern kulturmediet, kok arraysene i avionisert vann i 30 minutter, og steriliser i en autoklav for en annen runde av aggregatdannelse og -kultur.
      MERK: På ønsket tidspunkter, vilCytoarkitektur av mikro-tenner kan verifiseres ved bruk av faskontrastmikroskopi. Her ble det brukt en eksponeringstid på 5-8 ms og 10X (0,64 μm / pixel) og 20X (0,32 μm / pixel) mål for å fange fasekontrastbilder. Fluorescensen forbundet med kalsiumkonsentrasjonsendringer i viraltransducerte mikro-TENN ble fanget ved bruk av et høyhastighets fluorescensmikroskop med en eksponeringstid på 50 ms, en 10X objektiv (0,64 um / pixel) og solid-state lys med bandpassfiltre på ~ 480 Nm og ~ 510 nm for henholdsvis excitasjon og utslipp for å visualisere GCaMP6f fluorescenssignalet.

4. Immunocytokjemi for In vitro- studier

Merk: For bildene som vises her, ble følgende primære antistoffer brukt: mus anti-Tuj-1 / beta-III tubulin (1: 500) og kanin-anti-synapsin-1 (1: 500) for merking av axoner og pre -synaptiske boutons, henholdsvis. De sekundære antistoffene var esel-anti-mouse 568 (1: 500) og esel-anti-kanin 488 (1: 500). De nødvendige volumer av de forberedte primære og sekundære antistoff-løsninger, samt volumene av formaldehyd-, hesteserum- og vaskemiddelløsninger, avhenger av volumet som er nødvendig for å dekke konstruksjonene helt. Disse volumene kan minimeres ved hjelp av en hydrofob barrierepenn for å begrense området rundt hver mikrosøjle.

FORSIKTIG: Denne delen benytter formaldehyd og Hoechst. Formaldehyd er en giftig forbindelse som er kjent for å være kreftfremkallende, og Hoechst er en kjent mutagen. Derfor må disse forbindelsene kastes i en egnet avfallsholder. Bruk alltid dem i en kjemisk avtrekksdeksel mens du bruker passende personlig verneutstyr, for eksempel et laboratoriejakke, vernebriller og hansker.

  1. Forbered en 4,0% volum / volum (volum / volum) formaldehydoppløsning i 1x fosfatbuffert saltvann (PBS) inne i en kjemisk avtrekksdeksel.
  2. Fjern kulturmediet fra Petri-skåleneNg mikro-tennene med en mikropipette. Tilsett nok volum av formaldehydoppløsningen til oppvasken for å dekke mikro-tennene helt. Sug mikro-tennene i formaldehydoppløsningen i 35 minutter ved 18-24 ° C for å fikse cellene i mikrokolonnene.
  3. Fjern 4,0% formaldehydoppløsningen fra petriskålene med en pipette og kast dem i henhold til retningslinjer for håndtering av farlig avfall.
  4. Utfør to hurtigspyling ved å legge til nok PBS til å dekke de faste mikro-tennene helt og deretter fjerne PBS med en pipette. Utfør en tredje lang skylning ved å suge konstruksjonene i PBS i 10 minutter.
    FORSIKTIG: Fjerne PBS som brukes til skylling som muligens inneholder spor av formaldehyd.
  5. Klargjør en 0,3% volum / volumløsning av ikke-ionisk vaskemiddel i 4% v / v hesteserum i PBS. Fjern PBS fra petriskålene som inneholder faste mikro-tenner og tilsett et tilstrekkelig volum av 0,3% vaskemiddeloppløsningen for å dekke konstruksjonene. Soak i 60 min på 18-24 & #176; C for å permeabilisere cellene.
  6. Fjern vaskemiddeloppløsningen med en pipette. Utfør to hurtige skyllinger ved å legge til og deretter fjerne PBS. Etterpå utfør tre lengre skyll ved å suge konstruksjonene i PBS i 5 minutter under hver skylling.
  7. Fortynn primære antistoffer i 4% hesteserum. Fjern PBS fra petriskålene som inneholder faste og permeabiliserte mikro-tenner. Legg til nok primær antistoffløsning til mikrokolonnene for å dekke dem helt. Tørk Petri-diskene med parafilm for å forhindre fordampning og inkuber natten over (12-16 timer) ved 4 ° C.
  8. Fjern den primære antistoffløsningen fra oppvasken og skyll som beskrevet i trinn 4.6. I mørket lagrer du den sekundære antistoffoppløsningen i 4,0% hesteserum. Legg til nok sekundær antistoffløsning for å dekke konstruksjonene helt, dekk dekkene med aluminiumsfolie og inkuber i 2 timer ved 18-24 ° C.
  9. Klargjør Hoechst-løsningen (1: 10 000) i PBS for å flekke kjernene.
  10. MERK: Bilder til de immunomerkede mikro-tennene ble tatt med et laser-konfokalmikroskop med en oppløsning på 2.048 (~ 8 s / ramme), en 10 x objektiv (0,64 μm / pixel), 487 nm excitasjon og ~ 525 nm utslippsbølgelengder for Grønn fluorescens, 561 nm excitasjon og ~ 595 nm utslippsbølgelengder for rød fluorescens og ~ 3,22 μm / skive med ~ 60 skiver i gjennomsnitt for z-stablene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikro-tenner ble overvåket ved bruk av faskontrastmikroskopi for å vurdere deres cytoarkitektur og aksonal utvekst ( figur 4 ). Innen unidirectional, 2 mm lange mikro-TENN ble neuronalaggregater begrenset til den ene enden av mikrokolonnen og projiserte en bunke av aksoner gjennom den indre kjerne. Axons spredde hele lengden av kolonnen med 5 dager in vitro (DIV) ( figur 4A ). Det var en større innledende aksonal vekstrate i toveis 2 mm lange mikro-tenner, da aksonene spredte hele mikrokolonnen med 3 DIV ( figur 4B ). Ved 5 DIV inneholdt toveis mikro-tenner tette axonale kanaler som forbinder aggregatene som ble holdt i ekstremer av mikrokolonnen. Denne cytoarkitekturen ble også observert i 5 mm mikro-TENN, med aksoner som spenner over mikrokolonnen med 5 DIV ( figur 4C ). Som observert i alle tilfeller, ECM i lumen og geometrisk restriCtion presentert av agarose ga den retningen som kreves for å danne aksonale kanaler som strukturelt etterligner trekk ved naturlig neuroanatomi.

Immunocytokjemiteknikker ble anvendt i denne protokollen, og konfokale bilder ble tatt for å verifisere komponentene i mikro-TENN-arkitekturen. Cellkjerner farget med Hoechst (blå) ble lokalisert nesten utelukkende innenfor aggregater ved ekstremer av ensrettet og toveis mikrokolonne, med i det vesentlige ingen Hoechst-farging i det indre ( Figur 5 ). Denne observasjonen bekreftet hva som ble avledet fra fasekontrastbildene: Nevronbefolkningen ble begrenset til endene, og bare axoner (i rødt) spredde lumen av mikro-tennene. Imidlertid, etter at axonene krysset aggregatene, ble cellemigrasjon observert langs aksonale kanaler inn i indre lumen, som observert av nærvær av kjerne (blå) i interiøret ved 28 DIV for en 2 mm lang bidirektorCtional mikro-tenn ( figur 6 ). Videre ble synapsin I immunomerkning (grønn) funnet i hele cellelegemene og aksonale kanaler ( figur 6 ). Synapsin I er et presynaptisk terminalprotein som er implisert i reguleringen av frigjøring av nevrotransmitter og er indikativ for nærværet av presynaptiske terminaler når det er funnet i en punktutdeling; Det har tidligere vært korrelert med dannelsen av aktive synapser ved hjelp av helcellepatchopptak 49 . Synapsinfargingen i den aksonrike sentrale sonen til mikro-TENN er sannsynligvis en kombinasjon av puncta og synapsin transporteres ned axons mot pre-synaptiske terminaler. Tilstedeværelsen av synapsin puncta i mikro-TENN aggregatene antyder likevel at disse konstruksjonene har kapasitet til å kommunisere gjennom synaps, selv om kolokalisering av synapsin med et postsynaptisk protein ville være nødvendig for ytterligere strukturelle tegn på funksjonelle synapser./ P>

Mikro-TENNer ble også fremstilt med aggregerte nevroner som ble transdusert med en AAV som inneholdt GCaMP6f kalsiumindikatoren for å forsøke de elektrofysiologiske egenskapene til disse konstruksjonene. Disse konstruksjonene uttrykte kalsiumindikatoren gjennom hele sin lengde, som vist ved fluorescens i både nevronalaggregatene og aksonale kanaler ( figur 7A ). Merk at på grunn av mikroskopinnstillinger som har til hensikt å maksimere intensiteten i aggregatene, så viste fluorescensen i aksonalkanene svakere. Disse transduserte mikro-tennene ble analysert over tid med høyhastighetsfluorescensmikroskopi (uten ekstern elektrisk stimulering), og flere cellestørrelsesområder av interesse (ROI) ble valgt tilfeldig i et representativt mikro-TENN for å karakterisere signalkapasiteten til disse konstruerer. Kalsiumkonsentrasjonsutbrudd ble observert i nesten alle avkastninger, som reflektert med assocIerte fluktuerende fluorescensintensiteter over tid ( Figur 7B ). Spesielt viste ulike avkastningstendenser å vise en nesten konstant periodisk kalsiumkonsentrasjonsøkning ( figur 7B ). Disse kalsiumkonsentrasjonsendringene er utledet som følge av spontane, iboende virkningspotensialer, cellesignalering i individuelle aggregater og / eller signalering over aksoner fra forskjellige aggregater. Videre analyser kreves for å fullt ut karakterisere de elektrofysiologiske egenskapene til nevroner og aksonale kanaler innenfor mikro-tenner. Ikke desto mindre viser disse innledende resultatene at mikro-tenner utviser robust endogen / baseline elektrisk aktivitet.

Figur 3
Figur 3: Blueprints av den laserskårte mikrokolonnefabrikasjonsenheten og den 3D-trykte pyramidale mikrobrønnformen for celleaggregasjon. ( A) - ( B ) Blåkopi og bilde av bunn og topphalvdelene av henholdsvis den sylindriske kanalarray, som brukes til å fremstille hydrogelmikrokolonnene. ( C ) Blåkopi og bilde av kappene som brukes til å holde enheten sammen. Både for- og bakstykker deler de samme dimensjonene. ( D ) Bilde av den monterte enheten som kreves for å fremstille mikrokolonnene. Bare de to kappene og bunnhalvdelen klemmes sammen med skruer i de nedre to justeringshullene (venstre). De ødelagte linjene viser plasseringen av akupunkturnålene gjennom de fem hullene på hver hette. Den flytende agarosen legges til bunnhalvdelen av sylinderene, og etterpå plasseres den øverste halvdelen (høyre) på anordningen for å forme væskagaroten i form. ( E ) Blueprint av 3D-trykte muggene som brukes til å lage PDMS mikrobrønn-arrays. ( F ) Bilder av 3D-trykt form (venstre) og PDMS mikrobrønn-arrays (høyre). Alle dimensjoner er i milli Meter (mm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Observasjon av aksonal vekst i mikro-TENNS ved fasekontrast avbildning av ensrettet og toveis konstruksjoner som en funksjon av dager in vitro . ( A ) Enveis 2 mm lange mikro-tenner viser aksonale kanaler som strekker seg nesten hele lengden av mikrokolonnen med 5 DIV. ( B ) Sammenlignet med ensrettet mikro-TENN, viser toveis 2 mm mikro-tenner en raskere aksonal vekstrate. ( C ) For 5 mm toveis mikro-tenner, fyller aksonale kanaler lengden på mikrokolonnen ved 5 DIV. Denne arkitekturen opprettholdes minst til 10 DIV. Skalestenger = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Mikro-Tenn-cytoarkitektur observert med konfokale bilder av immunomerkede enriktede og toveis mikro-tenner. Celler ble farget for cellekjerner (Hoechst; blå) og axoner (Tuj1; rød). ( A ) Fase-kontrastbilde av en 5 mm toveis mikro-TENN (28 DIV). Konfokale rekonstruksjoner ( D ) - ( F ) og ( I ) - ( K ) av en 5 mm toveis (28 DIV) og en enriktet (25 DIV) mikro-TENN, viser merkede cellekjerner ( D ), ( I ) Og axoner ( E ), ( J ), samt overlegget ( F ), ( K ). Skalestenger: 500 μm. Innspill i ( A F ) og ( K ) refererer til fasekontrast ( B ) - ( C ) og konfokal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) zoom-ins av neuronal aggregater og aksonale kanaler . Bildene viser aggregatene begrenset til endene av mikro-tennene, mens lumen spennes av justerte aksonale kanaler. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: Ekspresjon av den presynaptiske terminale proteinsynapsin I i en representativ toveis mikro-TENN. Konstruksjonen ble farget for cellekjerner (Hoechst; blå), axoner (Tuj1; rød) og presynaptiske bons (synapsin I; green). ( A ) Phase-contrAst bilde av en 2 mm toveis mikro-TENN ved 28 DIV. ( D ) - ( G ) Konfokale rekonstruksjoner som viser cellekjernene ( D ), axons ( E ), presynaptiske boutons ( F ) og en overlegg ( G ) av de tre kanalene. Bokser viser henholdsvis zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) av fasekontrast- og overleggsbildene for de nevrale aggregatene. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7
Figur 7: Spontan signalaktivitet i en toveis mikro-TENN observert gjennom ekspresjon av en genetisk kodet kalsiumindikator. ( A ) FluorescensE-mikroskopi bekreftet uttrykket for GCaMP-reporteren, som observert ved fluorescens gjennom aggregatene og axonene. Skalbjelke = 100 μm. ( B ) Fluorescensforandringer assosiert med kalsiumkonsentrasjonsvariasjoner ble målt uten ekstern stimulering ved flere interessante regioner (ROI) som en funksjon av tiden. De nummererte fargede sirkler i ( A ) angir disse avkastningene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8
Figur 8: Fase-kontrastbilder av vanlige sviktmoduser i mikro-TENN-metoden. ( A ) En fullstendig dehydrert / tørket agarosemikrokolonne som et resultat av fjerning og / eller fordampning av DPBS i de innledende fremstillingsstadier. Skalbjelke = 5081; m. ( B ) Hydrogelmikrokolonne med lumen som føyer konstruksjonsens yttervegg på grunn av mangel på konsentrisk justering av akupunkturnålen med kapillærrøret. Skalbjelke = 100 μm. ( C ) Seeded micro-TENN med begge aggregater tilstede ved 1 DIV. ( D ) En av aggregatene falt av fra samme mikrokolonne som ( C ) ved 3 DIV. ( E ) Enveis mikro-TENN ved 4 DIV. ( F ) De samlede og aksonale kanaler falt ut fra mikrokolonnen i ( E ) og holdt seg flytende i dyrkningsmediet ved 5 DIV. Målestang for ( C ) - ( E ) = 300 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS-skade og sykdom resulterer vanligvis i tap eller dysfunksjon av langdistansaksonalbanene som omfatter hjernekoblingen, med eller uten samtidig neuronal degenerasjon. Dette forsterkes av den begrensede kapasiteten til CNS for å fremme neurogenese og regenerering. Til tross for jakten på reparasjonsstrategier som vekstfaktor, celle og biomateriallevering som individuelle eller kombinatoriske tilnærminger, feiler disse teknikkene samtidig ikke for både degenerasjonen av nevronceller og tapet av aksonale forbindelser 14 , 22 . Disse hullene i teknologi begrenser muligheten til å reparere, endre og sonde nevrale nettverk på en kontrollert og vedvarende måte. Følgelig ble mikro-TENN-teknologien utviklet for å imøtekomme behovet for en nevrale reparasjonsstrategi som i motsetning til eksisterende metoder letter både neuronal erstatning og rekonstruksjon av lange aksonale forbindelser. MicRo-tennene er implanterbare levende stillaser med en preformed cytoarkitektur som nærmer seg byggeklossene på systemnivå i hjernekoblingen som er spesielt utviklet for målrettet rekonstruksjon, erstatning og modifikasjon av vertsnorskretsene. Disse stillasene består av diskret populasjon (er) av nevroner forbundet med lange aksonale kanaler innenfor det ECM-holdige lumen av miniatyrsylindriske agarose hydrogeler. Disse konstruksjonene kan være i stand til å fungere som synaptiske reléer for å erstatte tapte baner og dynamisk modulerende innfødte kretser. I tillegg, i tilfeller av isolert aksonal degenerasjon (med kildegeneroner som er intakt), kan mikro-tenner muligens tjene som guider for aksonal regenerering basert på mekanismen for aksonforenklet aksonregenerering. Dette manuskriptet presenterte fremstillingsprotokollen for å på en pålitelig måte lage mikro-tenner, med kontrollert geometri, fenotype og funksjonelle egenskaper. Fase-kontrastmikroskopi, immuncytokemiStry og konfokal mikroskopi viste at mikro-TENN produsert med protokollen utviser den nødvendige cytoarkitektur og uttrykker presynaptisk terminal proteinsynapsin. Videre ble det vist at mikro-TENN har egen signalaktivitet, muligens på grunn av handlingspotensialer, i fravær av ekstern simulering. Dette ble fastslått ved nærvær av nærsynkroniske fluktuasjoner i fluorescensen assosiert med en genetisk kodet kalsiumrapportør.

Mikro-Tenn-utvikling kan oppsummeres ved tre trinn: (1) fremstilling av det hule hydrogelrøret, (2) tilsetningen av ECM-løsningen til rørets lumen, og (3) sådd av aggregater av isolerte neuroner inn i Ender av røret. Mikrokolonnene kan fremstilles med glasskapillarrør eller med en mikrofabrikert anordning som inneholder sylindriske kanaler. Denne enheten kan opprettes med enhver mikrokonserveringsmetode med høy presisjon som er tilgjengelig for etterforskeren. VæskeAgarose helles i kanalene til anordningen eller i kapillærrør inneholdende en sentrert akupunkturnål for å danne hydrogelmikrokolonnene. Etter agarose gelering fjernes akupunkturnålen for å produsere det hule lumen. Flere vanlige fallgruver som oppstår under fabrikasjon eller vekst er fremhevet i figur 8 . Legg merke til at noen av bildene som vises i figur 4 og et ekstremt tilfelle i figur 8B viser den luminale delen uforholdsmessig nær sylinderveggen. For å produsere en jevn veggtykkelse ved bruk av kapillærrørmetoden, bør rørnålen monteres oppreist når den kommer i kontakt med agarose, og nålen skal opprettholdes i midten av røret. Å holde rørnålenheten i en vinkel i forhold til agaroseoverflaten fremmer desentralisering av nålen. Likevel er disse forholdsregler vanskelig å implementere, og nålen er oftere enn ikke hviler aleneG veggene i kapillærrørene. Tvert imot er det viktigste aktivet til den mikrofabrikerte enheten at den har nålhull konsentrert rettet inn mot de sylindriske kanaler, som fremmer en tilstrekkelig sentralisering av nålen og lumen i forhold til kanalen og mikrokolonnen. I tillegg øker enheten en gjennomstrømning ved å legge til rette for fremstilling av flere mikrokolonner samtidig. Til tross for fordelene som tilbys av enheten, kan det fremdeles være utenfor sentrums lumens ved å bruke bøyede akupunkturnåler. Mikrofabrikasjonsteknikker har også en inneboende toleranse som begrenser deres effektivitet. Generelt bør mikrokolonne dehydrering, som et ekstremt tilfelle er vist i Figur 8A , ikke være en hindring hvis anbefalingene gitt i protokollen følges. Merk at de fysiske egenskapene til agarosen som brukes til ytre innkapsling, kan trenge optimalisering for alternative neuronale subtyper, som forbedret kortikale nevroner sUrvival og neurit utvækst ved høyere (3-4%) versus lavere (1-2%) agarosekonsentrasjoner ble observert 10 .

Mikro-TENN-utviklingen fortsetter med introduksjonen av ECM i mikrokolonne lumen, som tjener til å gi et miljø som er tilstrekkelig for nevrononadhesjon, overlevelse og utvekst. I tillegg begrenser ECM i kombinasjon med den geometriske restriksjonen og lav porøsitet fra agarosehydrogelen aksonal vekst i lengderetningen for å frembringe den nødvendige arkitektur. Innholdet i ECM-løsningen kan optimaliseres for den anvendte typen av nevron. For eksempel fremmer kollagen alene overlevelse og aksonal utvekst i DRG-mikro-tenner, mens en kombinasjon av kollagen og laminin er nødvendig for kortikale neuroner 10 . Videre er ECM-polymerisering inne i mikrokolonnen kritisk før celleplating, idet samlevering av celler med upolymerisert ECM fører til redusert neurit outgrOwth og fasciculation 31 . Merk at selv om mikrokolonnen først er fylt med ECM-løsning, polymeriserer innholdet i en myk gel og har en tendens til å trekke seg sammen under inkubasjonsperioden, og skape et rom som tillater innføring av celleaggregatene. I tillegg er det viktig å bekrefte at ECM har kommet inn i mikrokolonnens indre ved å inspisere under stereoskopet; Fullstendig fravær og / eller lommer med manglende ECM-resultater i mangel på aksonal utvekst fra aggregatene. Mikro-TENN-fabrikasjon kulminerer i såing av kortikale neuronaggregater ved ytterstene av stillaset. Disse nevronene ble dissekert fra rottefoster ved bruk av kjente prosedyrer 48 . Det kan utledes at flertallet av isolerte celler er nevroner fordi den embryonale rottecortexen i svangerskapet som brukes til isolasjon, består av 99% nevroner, og det definerte kulturmedium som anvendes i protokollen, er metabolisk begrenset for glialproliferasjon 49 . Følgelig bør det være minimal glial forurensning, selv om farging for bestemte markører kreves for bekreftelse. Mens dette manuskriptet presenterte mikro-TENN-fremstilling med kortikale nevroner, kunne nevroner fra forskjellige hjernegrupper ( f.eks. Nigral, thalamid og hippocampal) eller med forskjellige fenotyper ( f.eks. Eksitatorisk, inhibitorisk og dopaminerg) bli anvendt i henhold til den ønskede anvendelse og Implantasjonsområde. Tidligere iterasjoner av mikro-TENN-fremstillingsprotokollen involverte seeding dissocierte celler 10 , 31 , 32 . Selv om den ønskede cytoarkitektur er blitt oppnådd ved anvendelse av dissocierte metoden, ble det ikke oppnådd i alle tilfeller. I mange tilfeller oversvømmet dissocierte celler interiøret og resulterte i flere celleklynger i hele lumen, med prosesser som forbinder dem i et omfattende 3D-nettverkRef "> 10 , 31. Den samlede metoden, derimot, sikrer inneslutning av cellelegemer til ekstremerne, og er derfor integrert i suksessen til mikro-TENN-teknologien ( figur 5 ). De representative mikro-TENN-er vist I figurene 4-6 ble det produsert større aggregater som ikke var helt innført, og dette kan noen ganger føre til at aggregater faller ut av mikrokolonnene i kultur, som eksemplene vist i figur 8D og 8E . For å forhindre dette kan aggregatene Settes helt inn i mikrokolonnens indre. Hvis denne situasjonen presenterer seg selv etter å ha anvendt den tidligere strategien, kan den første inkubasjonsperioden utvides for å gi tilstrekkelig tid for aggregatadhesjon til ECM. Under kulturen er mild behandling av mikro-tenner Anbefales for å bevare integriteten til hydrogelkroppen og cytoarkitekturen, problemer under mikro-TENN-manipulasjon er årsaken til krumningene som er oppnådd i ellers rettede aksonale kanaler ( figur 5 ). Ikke desto mindre, etter protokollen som presenteres i denne artikkelen, bør det resultere i en konsekvent fremstilling av mikro-tenner med forventet nevronal / aksonal arkitektur, presynaptisk boutfordeling og inneboende elektrisk aktivitet.

Til tross for løftet om at mikro-TENN holder, er det gjenværende utfordringer som kan begrense bruken av denne teknologien. Den nåværende mikrokolonnefabrikasjonsteknikken er begrenset av desentralisering av mikrokolonne lumen, noe som kan føre til en inkonsekvent presentasjon av mekaniske signaler til celler ( f.eks stivhet), rupturering av mikrokolonnemuren og den påfølgende eksponering av aksonale kanaler Til utsiden og problemer under implantasjon. Selv om bruken av en mikrofabrikerte enhet har forbedret utfallet sammenlignet med kapillærrør, høyere presisjonsmikro-fabricatioN teknikker kreves for å øke den dimensjonale reproduserbarheten av disse konstruksjonene. Resultatene i dette manuskriptet viste at mikro-TENN-metoden på en pålitelig måte kan produsere levende stillaser som består av nevroner og aksonale kanaler som ligner naturlig nevroanatomi, spesielt de aksonale kanaler som forbinder forskjellige hjernegrupper. Likevel er mikro-tennlengden en hindring, avhengig av lengden på værsaksonal banen som må byttes ut. For eksempel er vev-manipulerte nervegraver (TENG) en egen levende stillasestrategi benyttet av vår forskningsgruppe for å reparere ekstremt lange nerveskader. For å erstatte disse lange hullene, kan axonene i TENG bli forlenget til titalls centimeter ved å bruke kontinuerlig mekanisk spenning i tilpassede mekano-bioreaktorer 1 , 23 , 50 . Denne "strekkvekst" -teknikken har også blitt anvendt for å manipulere astrocytisk prosesslengde til betteR etterligne strukturen av radiale glialbaner 51 . Tvert imot tilbyr den nåværende mikro-TENN-teknologien ennå ikke denne kontrollen; Maksimal oppnåelig lengde er for tiden begrenset av hvor lenge axonalt kan vokse in vitro basert på tradisjonell vekstkegleformidlet forlengelse. Dessuten, selv om CNS har en egenkapasitet for nevrofysiologisk rewiring som svar på forskjellige stimuli, og transplanterte celler har evne til synaptisk integrering med innfødte kretser, er en ytterligere begrensning av denne teknologien at mikro-tenner stole på plastisiteten til den opprinnelige hjernen Og vertskapets evne til funksjonelt å integrere med den implanterte konstruksjonen 52 , 53 , 54 , 55 . Endelig er en medfødt mangel på alle implantatbaserte tilnærminger, som mikro-tenner, deres invasivitet. Siden nevroner erGenerelt i nærheten av kapillærene, kan enhver type kirurgisk prosedyre forårsake forstyrrelser i blod-hjernebarrieren, lekkasje av blodfaktorer i hjernens parenchyma og en akutt (og til og med kronisk) inflammatorisk respons 31 . Dette svaret kan skade verts- og mikro-tenn-neuroner, negere de gunstige aspektene ved denne teknikken. Ikke desto mindre overlevde mikro-tenner som ble implantert i kortikothalamusveien til rotter i minst 1 måned og viste tegn på strukturell integrasjon med verts cerebral cortex 10 , 31 . Videre presenterte en tidligere publikasjon fra vår forskergruppe en metode som muliggjorde nåleløs implantasjon av mikro-tenner i rottehjerter 31 . I denne tilnærmingen ble denne hydrogel-innkapslingsstrategien utvidet til å inkludere et tynt (~ 20 um) belegg av karboksymetylcellulose, som ved mild dehydrering fremsto tilstrekkelig stivhet til å penetrereHjernen uten å kreve en nål eller guide 31 . Denne nål-mindre implantasjonsmetoden, kombinert med det lille tverrsnittet av mikrokolonnene, bør minimere skade på hjernen under og etter den stereotaksiske implantasjonsprosedyren.

Til tross for den foreløpige suksessen til mikro-TENNer in vivo , må fremtidige studier bekrefte at disse konstruksjonene synaptisk integrerer med nativt vev og undersøke om funksjonell utvinning er oppnådd i modeller av CNS-skade og nevrogenerativ sykdom 10 , 31 . For eksempel kan skreddersydde mikro-tenner bli utformet med spesifikke cellefenotyper og implantert i den tilsvarende degenererte banen for å rekonstruere nettverks- og gjenopprettingsfunksjonen. For å redusere den akutte inflammatoriske responsen etter implantasjon, kan mikro-TENN hydrogelskallet dopes med antiinflammatoriske og pro-overlevelsesmidler. Alternativ fabrikasjonTeknikker ( f.eks. 3D-utskrift) kan utvikles for å generere hydrogelmikrokolonnene med større enkelthet og med mer presise egenskaper, inkludert konsistent sentralisering av lumen og reproduserbarhet av dimensjoner. Den samme biomaterialeskjema som anvendes ved mikro-TENN kan modifiseres for å takle andre karakteristiske patologier av CNS-skade og sykdom. For eksempel har vår gruppe tidligere utviklet konstruksjoner som består av longitudinelt rettede astrocytiske bunter langs den kollagenbelagte lumen av en agarosehydrogel som strukturelt emulerer radiale glialbaner og glialrøret for å lette aksonal regenerering og nevronmigrasjon 56 . I tillegg kan stamceller, slik som humane embryonale stamceller (HESCs), inducerte pluripotente stamceller (iPSCs) og adipose-avledede stamceller (ASCs), inkorporeres for å fremstille autologe mikro-TENNer på en per-patient basis til mer Tett ligner den tapte cytoarkitekturen og cellefenotypen. Disse futuRe-modifikasjoner ville øke muligheten for mikro-tenner til å erstatte degenererte veier in vivo og ville muliggjøre rekonstruksjon av mer sofistikerte vevsarkitekturer, inkludere astroglial støtte og axonal myelinering blant andre funksjoner. Genetisk utviklede nevroner kan også frøes for å enten øke regenerativ virkning av mikro-TENN gjennom frigjøring av trofiske faktorer eller muliggjøre modulering av CNS ved den optogenetiske stimulering av lysgjennomførte ionkanaler 43 . Disse stillasene kan fremstilles med excitatoriske eller hemmerende nevroner for å synaptisk modulere eksisterende dysfunksjonelle vertsforbindelser i forhold som epilepsi, depresjon, narkotikamisbruk eller smerteforstyrrelser 1 . For eksempel kan mikro-tenner som danner overveiende GABAergiske eller glutamatergiske synapser konstrueres for å undertrykke eller stimulere henholdsvis opp- eller de-regulerte veier via synaptisk integrasjon og / eller ved bulknerveOtransmitter utgivelse. Viktig er at slike selvforsynte modulerende konstruksjoner i teorien vil være responsive basert på vertsnettverks tilbakemelding 1 . På samme måte kan mikro-tenner brukes som hjernedatamaskingrensesnitt (BCI), med optogenetisk utviklede mikro-tenner som tjener som mellomprodukter mellom hjernen og uorganiske stimulerende eller opptaksenheter. Denne applikasjonen kan være et alternativ til mikroelektrode-BCIer, som mangler spesifikk celleinriktning og mekanisk stabilitet og har forårsaket inflammatoriske responser, glialærdannelse og nevronmigrasjon eller tap ved penetrering i hjernen 57 , 58 .

Som in vitro- test-senger kan mikro-tenner gi en kraftig plattform for studiet av nevrobiologi og elektrofysiologi, som fungerer som biofideliske modeller av nervesystemet. I tillegg kan 3D-konstruksjoner fungere som test-senger for behandlingsstrategier når de brukes som nevrale injUry og sykdom modeller 59 . Som 3D-konstruksjoner er mikro-TENNer i stand til å simulere in vivo- miljøet, som er preget av komplekse celleceller og celle-ECM-interaksjoner i alle romlige retninger som ikke kan representeres nøyaktig i plankulturer 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . Faktisk har mange undersøkelser funnet ut at typen miljø er kritisk for at cellene skal presentere morfologi, proliferasjon, migrasjon, genuttrykk, differensiering og signalering som er vist i den innfødte innstillingen 60 . Likhetene mellom 3D-miljøet til disse stillasene og selve hjernen suppleres av graden av kontroll som disse konstruksjonene tilbyr over deres fysiske og biokjemiske prOperties 42 . Dette tillater konstruksjon av mikro-tenner med forskjellige sett med mekaniske, haptotaksiske og kjemotaksiske signaler for å studere effekten av disse indikatorene, individuelt eller synergistisk, på neuronal overlevelse, modning, aksonal forlengelse, synaptogenese og mekanotransduksjon 32 , 42 , 63 . Videre tillater fleksibiliteten til denne mikroprosesssteknikkteknikken konstruksjonen av levende stillas som etterligner andre trekk i hjernevæv, som den kolonnerte, komprimerte strukturen til neocortexen, spenet av aksonalbanene i forbindelsen, for ytterligere å øke Kraften til dette systemet som en in vitro- plattform for å studere hjernen 65 . Som undersøkelsesplattformer utnytter mikro-tennene den kontrollerte innstillingen av typiske in vitro- modeller, den ekspansive tilgjengeligheten av designparametere i vev ogGineering tilnærminger, og den økte fysiologiske og patofysiologiske relevansen av 3D-plattformer for å bli en ideell test-seng for å fremme nevrobiologisk kunnskap. Den myriade av fremtidige retninger for denne teknologien illustrerer allsidigheten til mikro-tenner. Dette manuskriptet har vist at mikro-TENN-protokollen på en pålitelig måte kan produsere vev-konstruerte levende stillaser som etterligner viktige trekk ved hjernens nevroanatomi, for å gi ny innsikt i nevrobiologiske fenomener, inkludert utvikling, sykdom og reparasjonsprosesser. Disse konstruksjonene kan også synaptisk integreres med nativt vev for å rekonstruere skadede hvite materielle kanaler, erstatte tapte nevrale celler og modulere dysregulerte veier etter CNS-skade og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Finansiell støtte ble gitt av National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) og F31-NS090746 (Katiyar)), Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen)), Penny Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation (Graduate Research fellowships DGE-1321851 (Struzyna og Adewole)), Department of Veterans Affairs (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), American Association Av neurologiske kirurger og kongress for neurologiske kirurger (Codman-fellesskapet i Neurotrauma og Critical Care, 2015-2016) og US Army Medical Research and Materials Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) og W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics