FRET de haute précision au niveau d'une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Biochemistry

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Summary

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

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Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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Abstract

Un protocole sur la façon d'effectuer des mesures de distances interdyeuses de haute précision en utilisant le transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) au niveau de la seule molécule dans le mode de détection de fluorescence multiparamètre (MFD) est présenté ici. MFD maximise l'utilisation de toutes les "dimensions" de la fluorescence pour réduire les artefacts photophysiques et expérimentaux et permet de mesurer la distance interdyeuse avec une précision allant jusqu'à ~ 1 Å dans les biomolécules rigides. Ce procédé a été utilisé pour identifier trois états conformationnels du domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA) pour expliquer l'activation du récepteur lors de la liaison du ligand. En comparant les structures cristallographiques connues avec les mesures expérimentales, elles ont accepté moins de 3 Â pour des biomolécules plus dynamiques. La collecte d'un ensemble de restrictions à distance qui couvre toute la dimension des biomolécules permettrait de fournir un modèle structurel de biomoléculaire dynamiqueEs.

Introduction

Un objectif fondamental des études de biologie structurale est de démêler la relation entre la structure et la fonction des machines biomoléculaires. La première impression visuelle de biomolécules ( p. Ex., Protéines et acides nucléiques) s'est produite dans les années 1950 à travers le développement de la cristallographie aux rayons X 1 , 2 . La cristallographie aux rayons X fournit des informations structurales statiques à haute résolution contraintes par l'emballage en cristal. Par conséquent, l'immobilité inhérente des modèles structurels aux rayons X évite la nature dynamique des biomolécules, un facteur qui affecte la plupart des fonctions biologiques 3 , 4 , 5 . La résonance magnétique nucléaire (RMN) 6 , 7 , 8 a fourni une solution alternative au problème en résolvant des modèles structurels dans des solutions aqueuses. Un grand avantageDe la RMN est sa capacité à retrouver la nature dynamique intrinsèque des biomolécules et des ensembles conformationnels, ce qui aide à clarifier les relations intrinsèques entre structure, dynamique et fonction 3 , 4 , 5 . Néanmoins, la RMN, limitée par la taille de l'échantillon et de grandes quantités d'échantillons, nécessite des stratégies complexes d'étiquetage pour les grands systèmes. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes alternatives dans la biologie structurale.

Historiquement, le transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) 9 n'a pas joué un rôle important dans la biologie structurale en raison de l'idée fausse selon laquelle FRET fournit des mesures de distance à faible précision. C'est le but de ce protocole de revoir la capacité de FRET à déterminer les distances à l'échelle nanométrique, de sorte que ces distances peuvent être utilisées pour la construction de modèles structurels de biomolécules. La première vérification expérimentaleLa dépendance à la R - 6 de l ' efficacité de FRET a été effectuée par Stryer en 1967 10 en mesurant des polyprolines de différentes longueurs comme une «règle spectroscopique». Une expérience similaire a été réalisée au niveau de la seule molécule en 2005 11 . Les molécules de polyproline se sont avérées non idéales et, par conséquent, les molécules d'ADN double brin ont été utilisées plus tard 12 . Cela a ouvert la fenêtre pour des mesures de distance précises et l'idée d'utiliser FRET pour identifier les propriétés structurelles des biomolécules.

FRET est optimal lorsque la distance de distance interdye est de ~ 0.6-1.3 R 0 , où R 0 est la distance de Förster. Pour les fluorophores typiques utilisés dans des expériences FRET à une seule molécule, R 0 est de ~ 50 Å. Généralement, FRET offre de nombreux avantages par rapport à d'autres méthodes dans sa capacité à résoudre et à différencier les structures et la dynamique dansSystèmes hétérogènes: (i) En raison de la sensibilité ultime de la fluorescence, les expériences 1 , 14 , 15 , 16 de FRET à une molécule 13 , 14 , peuvent résoudre des ensembles hétérogènes en comptant directement et en caractérisant simultanément les structures de leurs membres individuels. (Ii) Les voies de réaction complexes peuvent être directement déchiffrées dans les études FRET à une seule molécule car aucune synchronisation d'un ensemble n'est nécessaire. (Iii) FRET peut accéder à une large gamme de domaines temporels qui s'étend sur 10 décennies dans le temps, couvrant une grande variété de la dynamique biologiquement pertinente. (Iv) Les expériences de FRET peuvent être effectuées dans toutes les conditions de solution, in vitro aussi bien qu'in vivo . La combinaison de FRET avec microscopie à fluorescence permet d'étudier les structures moléculaires et les interactions directement dans les cellules vivantes 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , même avec une haute précision 20 . (V) FRET peut être appliqué à des systèmes de presque n'importe quelle taille ( par exemple, les oligomères de polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , la transcriptase inverse du VIH 26 et les ribosomes 27 ). (Vi) Enfin, un réseau de distances qui contient toute la dimension des biomolécules pourrait être utilisé pour dériver des modèles structurels de molécules statiques ou dynamiques 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Par conséquent, la spectroscopie FRET à une seule molécule peut être utilisée pour dériver des distances suffisamment précises pour être utilisées pour la modélisation structurelle à distance 26 . Ceci est possible en profitant de la détection de fluorescence multiparamètre (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , qui utilise huit dimensions de l'information de fluorescence ( c'est-à-dire le spectre d'excitation, le spectre de fluorescence, l'anisotropie, la durée de vie de la fluorescence, le rendement quantique de fluorescence, Le temps macroscopique, les intensités de fluorescence et la distance entre les fluorophores) pour réparer de manière précise et précise les contraintes de distance. En outre, l'excitation entrelacée pulsée (PIE) est combinée avec MFD(PIE-MFD) 42 pour surveiller la fluorescence de l'accepteur d'excitation directe et pour sélectionner les événements d'une seule molécule découlant d'échantillons contenant une stoechiométrie donateur-accepteur 1: 1. Une configuration typique de PIE-MFD utilise des lasers d'excitation entrelacés à deux impulsions connectés à un corps de microscope confocal, où la détection de photons est divisée en quatre canaux différents dans différentes fenêtres spectrales et caractéristiques de polarisation. Vous trouverez plus de détails dans la Figure 1 .

Il est important de noter que FRET doit être combiné avec des méthodes de calcul pour obtenir des modèles structurels atomiques compatibles avec les résultats FRET 26 , 30 . Ce n'est pas l'objectif du protocole actuel de passer en revue la méthodologie associée pour construire des modèles structurels avec des distances dérivées de FRET. Cependant, ces approches ont été appliquées en combinaison avec d'autres techniques ( p. Ex., La dispersion des rayons X à angle petitOu la résonance paramagnétique électronique), donnant naissance au domaine de la biologie structurale intégrative 43 , 44 , 45 , 46 . L'objectif actuel est d'ouvrir la voie à FRET en tant qu'outil quantitatif en biologie structurale. À titre d'exemple, cette méthodologie a été utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand (LBD) du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Le but ultime est de surmonter les limitations précitées et d'introduire FRET parmi les méthodes d'intégration utilisées pour la détermination structurale des biomolécules en fournissant des distances mesurées avec une haute précision.

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Protocol

1. Préparation du tampon PBS et traitement de la chambre

REMARQUE: Portez une gaine de laboratoire et des gants jetables lors d'essais chimiques humides. Utilisez une protection des yeux lors de l'alignement du laser.

  1. Préparation du tampon PBS
    1. Dissoudre 4,5 g de Na 2 HPO 4 , 0,44 g de NaH 2 PO 4 et 3,5 g de NaCl dans 400 ml d'eau distillée. Assurer un pH de 7,5 et stériliser la solution en autoclave sur un cycle de liquide pendant 1 h (selon l'autoclave).
    2. Prendre 15 ml de la solution PBS et mélanger avec 0,1 g de charbon de bois. Filtrer le mélange en utilisant un filtre de seringue régulier de 20 mL avec une taille de pores de 0,2 μm . Sceller et stocker le tampon PBS à température ambiante.
  2. Traitement au verre de couverture à chambre à microscope
    1. Ajouter 500 μL d'eau distillée et 5 μL de tensioactif non ionique au polysorbate 20 (voir la liste des matériaux)À un système de verre recouvert en chambre (voir la liste des matériaux) et bien mélanger. Laissez-le tremper pendant 30 min. Retirer la solution de polysorbate 20 et laver la chambre avec de l'eau distillée deux fois. Laissez-le sécher.
      REMARQUE: la chambre est maintenant prête à l'emploi.

2. Préparation de l'échantillon d'ADN

REMARQUE: Utilisez des brins d'ADN étiquetés conçus (voir la liste des matériaux) pour la création d'échantillons standard d'ADN double brin (ADND). Les oligos conçus ne doivent pas avoir de colorants à la fin d'un polymère afin d'éviter les artefacts qui peuvent compromettre la distance déterminée. La séquence d'ADN doit être choisie pour se comporter comme un corps rigide.

  1. Ajouter 1,5 μL d'un brin d'ADN marqué par un donneur et 4,5 μL d'un brin d'ADN complémentaire (accepté ou non marqué) dans un tube à microcentrifugeuse et les mélanger avec 24 μL d'eau exempte de nuclease.
    NOTE: Selon le mélange des oligonucléotides sélectionnés, les échantillons suivants seront générés: non-FRET, loW-FRET, ou les dsDNA à haute liberté.
  2. Hybrider l'ADN en utilisant un mélangeur thermique et le procédé suivant: 95 ° C pendant 10 min, 90 ° C pendant 10 min, 80 ° C pendant 10 min, 70 ° C pendant 10 min, 60 ° C pendant 10 min, 50 ° C Pendant 10 min, 40 ° C pendant 10 min, 30 ° C pendant 10 min, 20 ° C pendant 10 min, 10 ° C pendant 10 min et maintien à 5 ° C.
    REMARQUE: Les normes dsDNA générées peuvent être conservées dans un congélateur de -20 ° C pour un stockage à long terme ou peuvent être utilisées immédiatement.

3. Préparation de l'échantillon de protéines

Note: À partir de l'ADN recombinant pour l'expression de la protéine d'intérêt dans les systèmes bactériens, il est possible de muter les résidus à partir desquels les distances doivent être mesurées en cystéines. Pour ce faire, utilisez des techniques standard de mutagenèse dirigées 47 . Pour faciliter la purification des protéines, cloner l'ADN recombinant et muté dans un vecteur contenant un marqueur de purification ( par exemple,Un His-tag). Le domaine de liaison au ligand de la sous-unité 1 de glutamate (LBD) à partir du récepteur ionotropique du glutamate de NMDA (GluN1) LBD ( c.-à-d. NMDA GluN1 LBD clone dans le vecteur pET-22b (+) a été utilisé.

  1. Expression protéinique
    1. Transformer le plasmide d'ADN de construction dans le système d'expression de choix 48 .
      NOTE: Les étapes suivantes supposeront que l'expression d'une protéine soluble est transformée en Escherichia coli . La purification à partir, par exemple, de cellules de mammifères transfectées 49 ou de cellules d'insectes transduites 50 , est également possible, et des étapes détaillées peuvent être trouvées ailleurs. Assurez-vous que la souche de E. coli choisie est appropriée pour la protéine d'intérêt. Par exemple, l'expression de protéines contenant des ponts disulfure nécessite une souche de cellules compétentes avec un compartiment intracellulaire moins réducteur (voir la liste des matériaux).
    2. Inoculer un démarreur <Em> E. Coli en utilisant une pointe de pipette stérile pour ramasser une seule colonie transformée 48 . Déposez-le dans 100 mL de milieu LB sélectif (voir la Liste des matériaux) et permettent à la culture de croître pendant une nuit à 37 ° C.
    3. Préparez le bouillon LB (voir la liste des matériaux). L'autoclave pour stériliser.
    4. Inoculer des cultures à grande échelle d' E. coli transformé en ajoutant la culture de nuit à 2 L de milieu LB sélectif à un rapport 1: 500.
    5. Au cours des prochaines heures, évaluer la croissance de la culture en surveillant les lectures d'absorbance (Abs) de la culture à 600 nm, parfois appelée densité optique à 600 nm (OD 600 ), ou en utilisant un compteur de densité cellulaire. Notez que les lectures augmentent avec le temps.
    6. Induire l'expression de la protéine avec une concentration finale d'isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside 0,5 mM (IPTG) lorsque la culture atteint une DO 600 de 0,7. Shake induit E. coli à 20 ° C pendant 20-24 h.
    7. Après l'induction de protéines, granuler le E. coli en faisant tourner pendant 20 min à 3 000 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et stocker la pastille de E. coli contenant la protéine intracellulaire à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
  2. Purification des protéines
    1. Lyse E. coli en utilisant une méthode de lyse choisie ( p. Ex., Sonication, presse française, cavitation à l'azote, etc. ) 51 .
    2. Faites tourner la membrane et les débris cellulaires en centrifugant le lysat pendant 1 h à 185 000 xg et 4 ° C.
    3. Pour une protéine étiquetée par His, charger le surnageant sur une colonne de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) équilibrée, chargée de nickel en utilisant un système de chromatographie liquide à protéines rapide (FPLC) (voir la Table des matériaux ) 52 .
      NOTE: Un tampon d'équilibrage pour NMDA GluN1 LBD: 200 mM de NaCl, 20 mM de Tris et 1 mM de Glycine, pH 8. Le tampon d'élution pour NMDA GluN1 LBD: 200 mM de NaCl, 20 mM de Tris, 1 mM de Glycine et 400 mM d'Imidazole, pH 8.
      1. Lavez la colonne IMAC avec un tampon contenant une faible quantité (~ 12 mM) d'imidazole.
      2. Eluer la protéine de la colonne IMAC en utilisant un gradient linéaire d'imidazole de 12 mM à 400 mM.
    4. Dialysez la protéine pendant une nuit dans un tampon d'équilibrage sans imidazole 53 en plaçant l'éluat de l'étape 3.2.3.2 dans un tube de dialyse et en le submergeant dans le tampon d'équilibrage sous agitation continue pendant 2-3 h. Répétez au moins une fois de plus.
      REMARQUE: Les étapes 3.2.3-3.2.6 supposent la purification d'une protéine étiquetée par His. Si vous purifiez par une autre méthode, ajustez le protocole en conséquence.
    5. Quantifier la quantité de protéines en prenant l'absorbance à 280 nm de la protéine dialysée et en utilisant la loi de la bière ( unité Absorbance = ε L c , où ε Est le coefficient d'extinction (M -1 cm -1), Qui peut être obtenu ici 54 ; L est la longueur du trajet lumineux (cm); Et c est la concentration en protéines (M)).
      NOTE: Différents tests de quantification de protéines sont disponibles, y compris le dosage de Bradford et l'essai d'acide bicinconinique. Les deux fournissent des résultats précis.
  3. Étiquetage des protéines
    1. Ajouter des colorants fluorés de donneur (colorant cyan-vert réactif maléimide) et d'accepteur (colorant farineux réactif maléimide) à la protéine purifiée à un rapport molaire de protéine 1: 1: 8: donneur: accepteur.
    2. Incuber le mélange de protéines et de fluorophores sur de la glace pendant 30 min. Des temps d'incubation plus longs sont possibles.
    3. Emballer une colonne d'agarose à 0,5 ml de Ni-Nitrilotriacetic (Ni-NTA) (voir la Liste des matériaux) et l'équilibrer en utilisant le même tampon d'équilibrage qu'à l'étape 3.2.3 pendant que la protéine est en incubation.
      REMARQUE: Conservez la quantité de protéines chargées en fonction de la capacité de liaison de la résine.
    4. Après les 30 minutes enEn couche, charger le mélange protéine / fluorophore sur la colonne préparée à l'étape 3.3.3 et purifier par écoulement par gravité.
    5. Laver l'excès de fluorophore avec 5 ml de tampon d'équilibrage.
    6. Eluir la protéine marquée par gravité à partir de la colonne quatre fois avec 0,5 ml de tampon d'élution. Parce que la protéine a déjà été purifiée à partir d'autres protéines, aucun gradient n'est nécessaire.
    7. Vérifier chaque éluat avec un spectromètre UV-Vis pour identifier quelle fraction contient la protéine marquée. Numériser l'absorbance de 230 à 700 nm afin de s'assurer que les pics d'absorbance de la protéine (280 nm) et de chaque fluorophore (493 nm pour le fluorophore cyan-vert et 651 nm pour le fluorophore lointain) sont visibles dans le Éluat.
      NOTE: Typiquement, la protéine élue dans la fraction 2.
    8. Equilibrer une colonne de dessalage (voir la Table des matériaux ) avec du PBS traité au charbon (étape 1.1).
    9. Chargez la protéine marquée sur la colonne de dessalage par écoulement par gravité.
      REMARQUE: conservez la quantité de protéine chargée en fonction de la capacité de la colonne de dessalage sélectionnée 55 .
    10. Elute en utilisant 3,5 ml de PBS traité au charbon par écoulement par gravité et collecter des fractions de 0,5 ml de l'éluat.
    11. Utiliser un spectromètre UV-Vis pour analyser l'absorbance de chaque éluat de 230 à 700 nm pour identifier quelle fraction contient des protéines marquées.
      REMARQUE: les étapes 3.3.8-3.3.11 servent essentiellement d'étape d'échange de tampon. D'autres protocoles qui répondent à ce but sont également possibles ( p. Ex. Dialyse étendue). Alternativement, on pourrait passer directement à l'étape 3.3.8 de l'étape 3.3.2.

4. Mesures nécessaires dans les conditions d'ensemble (en Cuvette)

  1. Détermination de la constante de Förster
    1. Scan f D , l'émission de fluorescence fluorophore (cps), dans un fluorimètre en excitant le donneur à 15 nm jusqu'à sa longueur d'onde d'absorbance maximale afin d'obtenir le pleinSpectre ission. Surveiller l'émission à partir de 5 nm après la longueur d'onde d'excitation et se terminer 150 nm plus tard. Utilisez des conditions d'angle magique en réglant le polariseur d'émission à 54,7 ° Et les polariseurs d'excitation à 0 ° 56 .
      NOTE: Pour le fluorophore donneur utilisé ici, le maximum Abs se produit à 490 nm; 475 nm est utilisé comme longueur d'onde d'excitation, et l'émission de 480-650 nm est surveillée. Pour l'accepteur, le maximum Abs atteint 645 nm; 630 nm est utilisé pour la longueur d'onde d'excitation, et l'émission de 635-735 nm est surveillée.
    2. Utilisez le fluorimètre pour effectuer un balayage d'excitation du fluorophore accepteur (Abs A ) allant de 400-700 nm et utilisez des conditions d'angle magique en réglant le polariseur d'émission à 54,7 ° Et les polariseurs d'excitation à 0 ° 56 . Réglez le monochromateur d'émission à 15 nm après la longueur d'onde maximale d'émission. Normalize au maximum de l'excValeur de répartition.
    3. Sur les tableaux publiés, localiser le coefficient d'extinction de l'accepteur, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , ou utiliser les valeurs fournies par le fabricant.
      NOTE: La valeur publiée pour le fluorophore accepteur utilisé dans ce manuscrit est ε A647 = 270 000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calculer le chevauchement spectral en utilisant J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , où f D , Abs A et ε A ont été définis au-dessus de λ et sont la longueur d'onde (nm). Utilisez une feuille de calcul pour répertorier dans les colonnes toutes les valeurs dépendant de la longueur d'onde obtenues aux étapes 4.1.1-4.1.3. Alignez-les en fonction de la longueur d'onde. Effectuer la sommation à partir de la longueur d'onde minimale de l'émission du donneur (λ min ) à la longueur d'onde maximale de l'absorbeur accepteurE (λ max ).
    5. Calculez la constante de Förster (R o ) en utilisant la formule suivante R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , où J est le chevauchement spectral préalablement calculé à l'étape 4.1.4, Κ 2 Est le facteur d'orientation, Φ F, D Est le rendement quantique de fluorescence du fluorophore donneur, et n est l'indice de réfraction du milieu dans lequel se situe le fluorophore.
      REMARQUE: Utilisez n = 1.33 (si le tampon aqueux est utilisé) et κ 2 = 2/3.
    6. Localisez la valeur de rendement quantique du fluorophore donneur (Φ F, D , Dépendant de l'environnement) sur les tableaux publiés (voir Référence 57) et utiliser la valeur du chevauchement spectral obtenu à l'étape 4.1.4 pour calculer la valeur finale de la constante de Förster en utilisant l'eqDe l'étape 4.1.5.
      REMARQUE: si le rendement quantique n'est pas disponible, suivez l'étape 4.2 ci-dessous pour le calculer. Dans ce cas, utilisez Φ F, D = 0,8, ce qui correspond à une durée de vie du donneur τ D, r = 4,0 ns.
  2. Détermination du rendement quantique de fluorescence
    REMARQUE: la procédure suivante ne suppose que la trempe dynamique. Pour considérer la trempe statique, reportez-vous à la référence 56. Cependant, les expériences PIE-MFD sont également utiles pour déterminer le rendement quantique, même dans le cas de la trempe statique (voir les résultats).
    1. Sélectionnez un fluorophore de référence avec des profils d'absorbance et d'émission similaires pour les fluorophores accepteurs et donneurs pour lesquels le rendement quantique (Φ r ) a été déterminé.
      NOTE: Pour le donneur, Φ r = 0.8 et τ r = 4 ns, alors que pour l'accepteur, Φ r = 0.32 et τ r = 1.17 ns, WQui correspondent aux Φ r et τ r pour les fluorophores cyan-vert et les oligonucléotides marqués au fluorophore, respectivement 57 .
    2. Mesurez la carie de fluorescence résolue dans le temps (f (t)) en utilisant la méthode de comptage à un seul photon corrélée dans le temps (TCSPC) dans des conditions d'angle magique.
    3. Ajuster la carie de fluorescence avec une fonction de désintégration mono- ou multi-exponentielle sous la forme de f (t) = Σ i x i e -t / τ i , où x i Est la fraction de population et τ i Est la durée de vie de la fluorescence de la population.
    4. Calculer les durées de vie moyen de l'espèce, <τ> x = Σx i τ i , Où x i Est la fraction de population et τ i Est la durée de vie de la fluorescence de la population.
    5. Utilisez thE formule Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Pour calculer le rendement quantique de fluorescence du fluorophore donneur en branchant la durée de vie de fluorescence et le rendement quantique de la référence, ainsi que la durée de vie de fluorescence du fluorophore donneur.
      REMARQUE: cette méthode suppose une trempe dynamique. Pour d'autres déterminations Φ F, D , suivez Lakowicz 56 .

5. Alignement de l'expérience pour PIE-MFD Détection d'une seule molécule (SMD)

REMARQUE: il est préférable d'éteindre les lumières lors de la mesure.

  1. Réglage de l'équipement (Figure 1)
    REMARQUE: Une installation MFD à la maison représentée sur la figure 1 , avec deux lasers pulsés et 4 canaux de détection dans un corps de microscope inversé, est utilisée pour cette expérience. Il existe des systèmes commerciaux similaires.
    1. Activez les lasers 485 nm et 640 nm et tous les détecteurs de la configuration MFD. Ouvrez le logiciel qui contrôle l'acquisition TCSPC et les lasers. Assurez-vous que le taux de répétition laser est de 40 MHz.
    2. Réglez la puissance laser pulsée de 485 nm à 60 μW à un plan d'image de l'objectif d'immersion en eau de 60X 1.2 NA et de la puissance laser pulsée de 640 nm à 23 μW en mode d'excitation entrelacé pulsé (PIE-MFD) 42 .
      REMARQUE: pour régler PIE-MFD, les deux impulsions laser sont retardées dans le logiciel de contrôleur laser. Pour une excitation laser de 485 nm, les canaux TCSPC de détection (canaux TAC) sont de 1 à 12 499 (canal "prompt"). Pour une excitation laser de 640 nm, les canaux TCSPC de détection (canaux TAC) sont 12,499-50,000 (canal "delay").
    3. Ajouter un liquide d'immersion objectif (une goutte d'eau double-distillée) entre l'objectif d'objectif du microscope et une glissière en verre de couverture. Pour s'assurer que le plan de l'image est à l'intérieur de la solution et loin de la surface de verreTournez le bouton de réglage une fois et demie après avoir trouvé le deuxième point focal brillant en raison de la réflexion des lasers à l'interface verre-liquide.
    4. Ajouter 1 μL de Rhodamine 100 nM 110 à 50 μL d'eau distillée au centre du verre de couverture. Assurez-vous que la solution est également au centre de l'objectif du microscope.
    5. Ajustez les positions des trous d'épingle (taille: 70 μm) (direction x et y en une à la fois) tout en surveillant le taux de comptage des photons sur le logiciel d'acquisition afin de maximiser le nombre de photons détectés.
  2. Mesure standard SMD (travail dans une pièce sombre)
    1. Utilisez l'échantillon à partir de l'étape 5.1.4 et enregistrez 120 s du taux de comptage en cliquant sur le bouton "Démarrer" sur le panneau de contrôle résolué dans le temps (TTTR) dans le format "* .ht3" 58 sur le logiciel d'acquisition.
    2. Calculer la spectroscopie de corrélation de fluorescence hors ligne (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( c.-à-d. Mesure FCS) pour déterminer le temps caractéristique de la diffusion, le nombre de molécules dans le volume confocal, la cinétique de l'état triplet et la luminosité moléculaire 62 .
      1. Ouvrez le logiciel pour FCS (Kristine, suite MFD). Sélectionnez les paramètres expérimentaux en cliquant sur "Options" -> "Sélectionner Configurer". Sélectionnez un fichier avec des paramètres expérimentaux similaires et cliquez sur "obtenir des paramètres du fichier" pour lire les informations d'en-tête sur le fichier.
      2. Sélectionnez "Opérer" -> "Corréler" pour effectuer le FCS.
        REMARQUE: assurez-vous que les numéros de chaîne sont correctement spécifiés et que la "porte TAC" (canaux TCSPC) est cochée pour sélectionner en conséquence les canaux d'invite ou de retard.
      3. Sélectionnez "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" pour ouvrir la routine d'ajustement. Utilisez "l'équation # 24" sur la softwarE et cliquez sur "Démarrer".
        NOTE: L'équation n ° 24 sur le logiciel décrit la fonction d'autocorrélation ( G c ) de molécules fluorescentes diffusant librement sur un profil d'éclairage gaussien tridimensionnel tel que 61 :
        L'équation 36
        N est le nombre moyen de molécules dans le volume de détection, x T est la fraction de molécules exerçant la cinétique du triplet-état avec le temps caractéristique t T , t c , c'est le temps de corrélation, t diff est le temps de diffusion lié à la géométrie Le paramètre ω , et ω décrit le profil d'éclairage gaussien. Après l'ajustement, prenez note du temps de diffusion et du nombre de molécules dans le volume confocal.
    3. Ajouter 10 μL de Rhodamine 101 100 nM dans 50 μL de distilléEau et bien mélanger. Placez ce mélange sur le dessus du couvercle et assurez-vous que la gouttelettes est au centre de l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" sur le panneau de contrôle TTTR pour enregistrer 120 s de données au format TTTR.
    4. Ajouter 1 μL de fluorophore lointain à 100 nM dans 50 μL d'eau distillée et bien mélanger. Placez ce mélange au centre de l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 120 s de données au format TTTR.
    5. Placer 50 μL d'eau distillée au centre de la lentille d'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 300 s de données au format TTTR.
    6. Placer 50 μL de tampon PBS au centre de la lentille d'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 300 s de données au format TTTR.
    7. Prendre 1 μl du mélange de l'étape 5.1.4 et mélanger avec 50 μL d'eau distillée. Placez ce mélange sur le couvercle. Tout d'abord, cliquez sur le bouton "Démarrer" et collectez 10 s de données en mode TTTR. Ensuite, analysez le TTLe fichier de mode TR utilisant le logiciel d'analyse Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) (Paris, MFD suite), comme décrit à l'étape 5.3.
      REMARQUE: Vérifiez le nombre de salves par seconde à partir du logiciel de sélection et d'analyse de rafale 26 , 61 . Si le niveau de rafale est d'environ 35 à tous les 10 s, il est approprié pour la mesure d'une seule molécule.
    8. Continuez à enregistrer le taux de compte rendu au format TTTR pendant 1,5 h ( c.-à-d. TCSPC à SMD) pour traiter comme une norme de mesure à une seule molécule.
      REMARQUE: en raison de la grande taille du fichier, diviser les fichiers "* .ht3" en fichiers de taille réduite pour charger et traiter à l'aide de BIFL.
  3. Analyse des échantillons standard utilisant le BIFL
    1. Ouvrez le logiciel BIFL (Paris).
    2. Sélectionnez la configuration de PIE dans la fenêtre contextuelle "Confirmer la configuration" et lisez l'en-tête en sélectionnant le fichier avec des paramètres expérimentaux similaires. Cliquez sur "obtenir des paramètresM. "Cliquez sur" OK ". Notez que la fenêtre pop-up se ferme et est intégrée dans le front-end de Paris. Cliquez sur" OK "sous" Suivant ".
    3. Choisissez les fichiers à analyser en cliquant sur "Sélectionner" sur "Data Path Array" pour sélectionner la mesure à analyser.
      1. Cliquez sur "Étalage vert" (pour une mesure de l'eau), "Vert BG" (pour une mesure tampon), "Vert épais" (pour une mesure 2 nM Rhodamine 110), "Écartement rouge" (pour une mesure de l'eau), " Red BG "(pour une mesure de tampon ou d'eau)," Rouge épais "(pour une mesure de Rhodamine 101 de 20 nM)," Étalage jaune "(pour une mesure d'eau)," BG jaune "(pour une mesure tampon) et "Yellow Thick" (pour une mesure de fluorophore lointain de 2 nM).
      2. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
        REMARQUE: Le canal "Vert" correspond au signal des détecteurs verts dans les canaux TCSPC "prompt". le4; Red "correspond au signal des détecteurs rouges dans les canaux TCSCP" prompt ". Le canal" Yellow "correspond au signal des détecteurs rouges dans les canaux TCSPC de retard.
    4. Cliquez sur "Ajuster" à côté de "Données coupées en ébullition" pour ajuster les paramètres de sélection d'une seule molécule. Dans la nouvelle fenêtre contextuelle, sélectionnez les événements à une seule molécule avec deux écarts types par rapport à l'heure moyenne d'arrivée d'interphoton («dt») en modifiant l'heure d'arrivée d'interphotones sous «Seuil» et le nombre minimum de photons par événement de molécule unique en «min . #. Cliquez sur "Retour" pour fermer la fenêtre contextuelle. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
      REMARQUE: Le seuil, en unités ms, dépend du taux de compte en arrière-plan. Le nombre minimum typique de photons utilisé est de 60.
    5. Ajustez la durée de vie de fluorescence initiale "Paramètres d'ajustement de couleur" ( p . Ex ., De, vers, et convolution) pour générerD paramètres de désintégration de fluorescence sur les couleurs "Vert", "Rouge" et "Jaune". Dans la même fenêtre, réglez les valeurs «de» et «à» pour «Demander» et «Délai». Cliquez sur "Retour" pour fermer la fenêtre contextuelle. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
      REMARQUE: assurez-vous que la case à cocher d'excitation à 2 couleurs est sélectionnée. "From" et "to" correspondent aux bacs initial et final sur l'histogramme de dégradation de fluorescence (numéro de canal TAC). Si les paramètres d'ajustement initiaux sont sélectionnés correctement, une fonction d'ajustement est ajoutée aux décades de fluorescence sur chaque canal.
    6. Sélectionnez l'emplacement sur le disque dur sur lequel enregistrer tous les fichiers ascii traités dans un dossier parent.
      REMARQUE: Paris traite toutes les rafales sélectionnées et crée plusieurs fichiers de sortie ascii que d'autres programmes pour la visualisation ( par exemple, Margarita MFD suite).

6. Normes dsDNA et échantillon de mesureUrements

  1. Ajouter 500 μL de tampon PBS sur un verre de couverture à chambre et placer une goutte d'eau distillée entre la chambre et l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" sur la pédale de commande et collectez 5 minutes de données en mode TTTR à utiliser pour l'analyse.
  2. Prenez une petite quantité (habituellement autour de 0,1 μL, concentration d'environ 1 μM) de la norme dsDNA, ajoutez-la au tampon PBS et mélangez bien. Tout d'abord, collectez 10 s de données en cliquant sur "Démarrer". Ensuite, vérifiez le rafale pour obtenir 35 éclats par 10 s (comme aux étapes 5.2.7 et 5.3). Enfin, collectez> 2 h de données au format TTTR, comme décrit ci-dessus.
  3. Analyser les données recueillies pour les échantillons dsDNA, comme à l'étape 5.3.3.
  4. Visualisez les histogrammes de rafale à l'aide de la suite MFD (Margarita) et affichez l'efficacité de FRET contre <τ D (A) > f ou F D / F A versus <τ D (A) > f .
    1. Open tLe logiciel Margarita et sélectionnez "Fichier" -> "Importer tous les fichiers *. ?? 4 et * .mti." Sélectionnez le dossier parent contenant différents sous-dossiers.
    2. Sélectionnez les paramètres à visualiser en cliquant à côté de "X" (abscisse) d'un des paramètres dérivés de Paris ( par exemple, tau green ou <τ D (A) > f ); De même, répétez ceci pour que l'ordonnée "Y" sélectionne le paramètre souhaité à visualiser ( p. Ex., Efficacité FRET, F D / F A ou S PIE PIE).
      REMARQUE: Dans ce cas, l'efficacité FRET, F D / F A ou S PIE est correcte pour un taux de compte rendu approprié dans les canaux vert, rouge et jaune; Pour les rendements quantiques du donneur et de l'accepteur; Pour le rapport d'efficacité de détection (g G / g R ); Et pour la diaphonie (α). Ici, g G / g R = 3.7 et α = 0.017, en fonction uniquement de l'instrument. Taux de compte rendu d'arrière-planDépend du tampon utilisé, et les valeurs de rendement quantique sont déterminées précédemment.
    3. Ajoutez une ligne FRET en ouvrant la fenêtre "Overlay Equation" en cliquant sur "Display" -> "Overlay Equation". Sélectionnez la ligne FRET statique dans le menu contextuel. Sélectionnez les durées de vie appropriées des donneurs et les paramètres de rendement quantique pour générer la bonne ligne FRET.
      REMARQUE: les lignes FRET pour la corrélation de différents indicateurs FRET peuvent être générées.
  5. Déterminer le facteur de correction pour l'excitation de l'accepteur par la source d'excitation du donneur (β) en utilisant le paramètre stoechiométrie en affichant l'efficacité FRET par rapport à la stoechiométrie (S PIE ) à Margarita (équation 1 ci-dessous).
    NOTE: β est choisi de telle sorte que l'échantillon donneur ait un pic à S PIE = 1,0 dans l'échelle stoechiométrique; L'échantillon accepteur-seulement devrait avoir une stoechiométrie de S PIE = 0,0, et l'ADNc avec les deux étiquettes devrait avoir une stoechiométrie de S PIE ~ 0,5. <Br /> NOTE: L'instrument est maintenant prêt, et il est possible de mesurer des échantillons étiquetés FRET.
  6. Mesurer et analyser les échantillons marqués FRET préparés dans la section 3 en suivant les étapes 6.3-6.4.

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Representative Results

Dans les expériences typiques smFRET utilisant une configuration MFD (lignes laser: 485 nm à 60 μW et 640 nm à 23 μW, section 5.1), l'échantillon de fluorescence est dilué à une faible concentration picomolaire (10 -12 M = 1 pM) et placé Dans un microscope confocal, où une impulsion laser sous-nanoseconde excite des molécules marquées diffusant librement à travers un volume d'excitation. Un volume confocal typique est <4 femtoliters (fL). À de faibles concentrations, seules des molécules individuelles sont détectées une à la fois. La fluorescence émise par les molécules marquées est collectée à travers l'objectif et est filtrée spatialement à l'aide d'un trou d'épingle. Cette étape définit un volume de détection confocal efficace. Ensuite, le signal est divisé en éléments parallèles et perpendiculaires à deux (ou plusieurs) fenêtres spectrales différentes ( p. Ex., "Vert" et "rouge"). Chaque canal de détecteur de photons est ensuite couplé au comptage à un seul photon corrélé dans le temps (TCSPC) Électronique pour l'enregistrement des données ( Figure 1 ).

Après avoir suivi l'étalonnage de l'installation MFD, une procédure résumée dans le tableau 1 (étapes 5-6), la mesure des normes dsDNA peut être démarrée. Ensuite, PIE-MFD est utilisé pour analyser plusieurs paramètres, tels que la macrotime moyenne, la durée de vie de la fluorescence, l'anisotropie intégrée au rayonnement, le rapport du signal en vert sur le signal en rouge, la durée de l'éclatement dans le canal d'invite (T (G + R) | D ), durée d'éclatement dans le canal retardé (T R | A ), et autres 65 , 66 ( Figure 2 ). Important dans cette analyse, le paramètre stoechiométrie ( S PIE ), défini comme suit:

L'équation 45

F G | D = F D , F R | D = F A et F R | UNE Sont des intensités de fluorescence corrigées en arrière-plan 63 . Par exemple, F G | D = I G | D - < B G >, I G | Est l'intensité détectée dans le canal vert du donneur et < B G > Est le taux moyen de compte en arrière-plan sur le canal vert. Des corrections similaires sont effectuées pour la fluorescence de l'accepteur à partir de l'excitation directe de l'accepteur ( F R | A ) et pour l'émission sensibilisée de l'accepteur ( F R | D ). Dans l'équation 1, α est le facteur de correction pour don-fluoLa diaphonie de résaison dans le canal accepteur; Β est le facteur de correction pour l'excitation de l'accepteur par la source d'excitation des donneurs; Et γ , où

L'équation 56

Est une fonction des rendements quantiques du donneur et de l'accepteur, Φ F, D Et Φ F, A , Respectivement, et de l'efficacité de détection sur les détecteurs vert et rouge, g G et g R. À l'aide de S PIE , il est possible de calibrer les facteurs instrumentaux appropriés, tels que α, β et γ , pour satisfaire S PIE = 1 pour l'échantillon marqué uniquement par le donneur, S PIE = 0 pour l'échantillon accepteur, et S PIE = 0,5 pour l'échantillon de FRET. Alternativement, ilEst possible d'utiliser:

L'équation 59

Pour dériver le rendement quantique d'un second échantillon, étant donné que le rendement quantique d'un échantillon ( L'équation 60 ) Est connu et que le Équation 61 et Équation 62 Sont déterminés à partir de l'expérience PIE-MFD. Dans ce cas, on suppose que le rendement quantique du dsDNA à haute FRET est de 0,32 et que le rendement quantique du dsDNA à faible FRET est déterminé. La raison de cette procédure est que l'on a noté que le S PIE est différent pour les échantillons à faible FRET et à haute FRET, même si les deux ont un donneur au même endroit et un seul accepteur, mais au diffEmplacements errants. Après avoir déterminé le rendement quantique approprié des échantillons standard, comme décrit dans l'équation (3), l'efficacité FRET ( E ) contre < τ D ( A ) > f Et F D / F A versus < τ D ( A ) > f représentations sont utilisées pour une évaluation ultérieure. La relation paramétrique entre l'efficacité FRET ( E statique ), F D / F A et < τ D ( A ) > f Les paramètres sont décrits par l'ensemble d'équations suivantes (équation 4):

L'équation 63

L'équation 64

Ici, F D | D est la fluorescence du donneur détectée dans le donneur ou le canal vert; F A | Est l'émission sensibilisée par l'accepteur; Équation 67 Est la durée de vie de la fluorescence des donneurs en l'absence de l'accepteur; Et < τ D ( A ) > x Est la durée de vie moyenne de l'espèce, qui est liée à la durée de vie moyenne de fluorescence par un polynôme empirique L'équation 69 56 , 57 . Ces équations sont connues sous le nom de lignes FRET statiques 57 , 67 car les lignes doivent traverser les deux populations aussi bien, en l'absence oF dynamique ( Figure 3 ).

Enfin, l'analyse des histogrammes d'efficacité FRET ( Figure 4 ) en utilisant l'analyse de la distribution de probabilité (PDA) pour les deux échantillons d'ADNd 68 , 69 . PDA a été utilisé pour modéliser les histogrammes smFRET avec une grande précision 57 . L'information d'espèces uniques ou multi-statiques peut être obtenue à partir d'un seul histogramme. Après avoir ajusté la forme de la distribution attendue aux données expérimentales obtenues, la distance entre le donneur et l'accepteur peut être révélée. En bref, l'efficacité FRET, ou les distributions F D / F A , sont calculées en obtenant d'abord la probabilité [Équation] d'observer une certaine combinaison de photons collectés dans les canaux de détection "vert" ( G ) et "rouge" ( R ) Donné un certain temps-vent Ow; Utilisez l'équation 5:

Équation 71

Ici, la distribution d'intensité de fluorescence, P ( F ), est obtenue à partir de la distribution d'intensité de signal totale P ( S ), en supposant que les signaux de fond B G et B R sont répartis selon les distributions de Poisson, P ( B G ) et P ( B R ), avec des intensités de fréquence de comptage moyennes connues, < B G > et < B R >. La probabilité conditionnelle P ( F G , F R | F ) est la probabilité d'observer une combinaison particulière de photons de fluorescence verte et rouge, F G et F R , pour un état FRET donné.

E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> L'analyse PDA montre que la distance interdye pour l'ADNd haute FRET est < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, alors que pour l' ADNd à faible FRET, La distance < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Par rapport aux distances attendues en utilisant le système de repérage et de dépistage FRET (FPS) 26 , une distance interdyeuse attendue < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å était Trouvé comme dérivé à l'aide de FPS pour le dsDNA à haute FRET et < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å pour l' ADNd de faible FRET. AV signifie le calcul du volume accessible incorporé dans la trousse d'outils FPS. AV est un calcul grossier- Simulation de Monte Carlo granulée, où les fluorophores représentent trois rayons modèles de sphères rigides reliés à un point de fixation dans la biomasseUne molécule avec une liaison flexible 26 , 57 . Une correction pour le rendement quantique pour l'ADNd à faible FRET est requise, en fonction du S PIE mesuré. Avec ces conditions, il est possible d'obtenir un accord de ~ 1 Å entre la valeur expérimentale et la valeur attendue des simulations AV.

Ensuite, le NMDA GluN1 LBD est mesuré. Le récepteur NMDA (NMDAR) est un canal cationique hétéromère et non sélectif qui nécessite la liaison de la glycine et du glutamate pour le déclic 70 . Le LBD, qui a une structure semblable à une clapet, est connu pour adopter une clapet ouverte et une configuration fermée en forme de clapet sur une liaison de ligand basée sur des informations cristallographiques 71 , 72 . Pour les expériences MFD, le NMDA GluN1 LBD a été muté à Ser507 et Thr701 (séquence complète) sur les côtés opposés deLa fente, comme cela a déjà été décrit. Il a ensuite été marqué en utilisant la paire FRET d'un fluorophore cyan-vert et d'un fluorophore lointain (voir la liste des matériaux), avec un R 0 de 52 Â. Cette construction a été utilisée pour étudier le mouvement du domaine de liaison au ligand, sans la complexité associée au travail avec un récepteur solubilisé. À l'aide de cette construction, au moins trois configurations du LBD ont été trouvées. Il a été suggéré qu'un mécanisme de sélection conformationnel a séquestré une des populations identifiées après la liaison au ligand 73 . Dans la forme inactivée ou en présence de l'acide antagoniste 5,7-dichlorokynurénique (DCKA), les états FRET de moyenne à faible intensité sont explorés, avec une plus longue durée de vie de la fluorescence des donneurs et un plus grand indice de fluorescence du donneur à l'accepteur À F D / F A = 3,3 ( figure 5A ). Ceci est cohérent avec la stabilisation d'une conformation à fente ouverte.L'analyse de PDA et de fenêtre de temps a été utilisée pour identifier trois configurations que la LBD peut adopter (la haute-FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), moyenne-FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Et les états à faible FRET (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Cependant, la plupart du temps, le FRET moyen et le FRET faible ont été peuplés. Cela suggère que le FRET élevé est l'état qui conduit à l'activation du NMDAR. Il convient de noter que les distances dérivées expérimentalement et celles dérivées par le FPS en utilisant un marquage silico et l'utilisation de l'information cristallographique (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 et 1PBQ) ont été comparées. On a constaté que la distance interdyeuse pour les populations FRET moyenne et faible FRET était < R DA > E , AV = 48,7 Å et 54,2 Å pour les deux structures, respectivement ( figure 5B). La plus grande déviation de 2,9 Å a été trouvée dans l'état de FRET moyenne. En considérant l'incertitude de la distribution, de l'hypothèse de κ 2 = 2/3, il y a une erreur maximale de 2,5% dans la distance mesurée. Bref, on peut conclure qu'il est possible d'atteindre la précision d'Angstrom sur des distances déterminées expérimentalement.

Figure 1
Figure 1: Configuration expérimentale et enregistrement des données pour PIE-MFD. ( A ) Une configuration de détection de fluorescence multiparamètre typique est représentée et se compose de quatre détecteurs couvrant deux fenêtres spectrales différentes. Les détecteurs sont connectés à l'électronique de comptage à un seul photon corrélée en temps (TCSPC). ( B ) Dans TCSPC, chaque photon est identifié par trois paramètres: (i) micro-temps, ou temps après l'impulsion d'excitation; (Ii) macro-time, ou le nombreDes impulsions d'excitation depuis le début de l'expérience; Et (iii) numéro de canal. Ces trois paramètres sont nécessaires pour l'analyse hors ligne. ( C ) Des molécules simples se diffusent librement à travers le volume confocal, et des photons sont émis, laissant un éclat de photons en fonction du temps. ( D ) Chaque éclatement sélectionné est adapté en conséquence et utilisé pour l'affichage d'histogrammes multidimensionnels. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Analyse en rafale utilisant divers paramètres de fluorescence. ( A ) Efficacité FRET par rapport à la macrotime, ( B ) Efficacité FRET par rapport à T (G + R) | D - T R | A , et ( C ) Efficacité FRET par rapport à S PIE pour laDsDNA à faible FRET ou 15 pb. T (G + R) | D est la durée de l'éclatement dans le canal d'invite, et T R | A est la durée de l'éclatement dans le canal retardé (T R | A ) Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: F D / F A et durée de vie de l'efficacité du donneur par rapport à la FRET. Histogrammes bidimensionnels pour représenter l'efficacité FRET ( A ); Le rapport du donneur sur la fluorescence accepteur, F D / F A , ( B ); Et l'anisotropie du donneur r D ( C ) par rapport à la durée de vie de fluorescence moyenne du donneur en présence de l'accepteur < τ D ( A ) > f . Le correctif déterminéSur les facteurs sont: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, β = 0,08 (la fraction de l'excitation directe de l'accepteur avec le laser d'excitation des donneurs), α = 0,017 et g G / g R = 3,7 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Comparaisons PDA d'ADNc à faible FRET et faiblement FRET. Analyse PDA de la fenêtre de temps à 2 ms, avec une demi-largeur de 6% de la distance d'efficacité FRET moyenne. Chaque distance est répartie avec Gaussian avec 6% du < R DA > E comme largeur (hw DA ). ( A ) Pour l'échantillon HFRET, la distance interdye est < R DA > E (HF)RET) = 45,7 Å. ( B ) Pour l'échantillon LFRET, la distance est < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: PIE-MFD du domaine de liaison au ligand du récepteur NMDA en présence de l'antagoniste, DCKA. ( A ) Histogramme bidimensionnel de F D / F A par rapport à la durée de vie du donneur en présence de l'accepteur < τ D ( A ) > f et de l'anisotropie du donneur versus < τ D ( A ) > f Pour le LBD avec DCKA. Une dimensionToutes les projections pour F D / F A et sont également affichées. La ligne FRET statique est affichée en rouge. La fluorescence des donneurs et des accepteurs purs ( F D et F A ) est corrigée pour l'arrière-plan (< B G > = 0.940 kHz et < B R > = 0.522 kHz), le spectromètre (α = 1.7%) et l'efficacité de détection Ratio (g G / g R = 3,7). Sur l'anisotropie par rapport aux histogrammes < τ D ( A ) > f , l'équation de Perrin a une corrélation de rotation de ρ = 2.5 ns. ( B ) PDA dans une fenêtre de temps de 10 ms Δt. Un seul état est nécessaire. Le modèle s'adapte parfaitement à tous les horaires. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

action Objectif
Rayon laser central.
Alignez le trou d'épingle. Expérience FCS (section 5).
Aligner les détecteurs. Maximisez le CPM.
Ajustez la bague de correction de l'objectif. Minimiser t diff et maximiser le CPM.
Déterminer la fonction de réponse de l'instrument (IRF). TCSPC @ SMD en mode TTTR. Mesurez le diagramme de désintégration de dispersion.
Déterminez le facteur G pour chaque fenêtre spectrale. TCSPC @ SMD en mode TTTR. Comparez les intensités de la queue de désintégration pour les polarisations.
Déterminer le taux d'efficacité de détection dans les fenêtres spectrales (g R / g G ). (I) Mesures d'intensité d'un colorant avec un large spectre d'émission (concentration de nM). (Ii) Mesurer les règles FRET (pM concentrAtion). Dans MFD, la sous-population devrait tomber sur la ligne FRET statique.
Effectuer un contrôle final (durée de vie et anisotropie). Contrôler la durée de vie et l'anisotropie à partir d'une mesure unique d'un colorant diffusant librement avec une seule dégradation exponentielle ( p. Ex . Rhodamine 110).
Déterminer le taux d'accepteur par rapport au rendement quantique des donneurs. (I) Tracé de stoechiométrie (S PIE ) Eq. 1. et 4.2.
Déterminer le taux de compte rendu de fond. Mesures d'intensité du "tampon" sélectionné.
Déterminer le cross-talk (α). Les mesures d'intensité du colorant donneur tiennent compte du spectre d'émission de fluorescence et de l'efficacité de détection.

Tableau 1: Étapes d'étalonnage pour les expériences FRET dans des expériences à une seule molécule.

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Discussion

Dans ce travail, le protocole d'alignement, d'étalonnage et de mesure des distances interdyeuses avec une grande précision en utilisant des expériences FRET à une seule molécule PIE-MFD est présenté. En calibrant soigneusement tous les paramètres instrumentaux, on peut augmenter la précision des distances mesurées et atteindre la précision d'Angstrom. Pour ce faire, divers histogrammes multidimensionnels sont utilisés pour analyser et identifier les populations pour une caractérisation plus poussée. En utilisant le temps moyen de la macro pour vérifier la stabilité des échantillons mesurés, il est possible de corriger la photoblanchiment des donneurs et des accepteurs et de sélectionner les populations FRET en fonction du paramètre stoechiométrique. Cependant, les propriétés photophysiques de l'accepteur peuvent changer en fonction de l'emplacement de l'étiquette. Ainsi, on peut utiliser une distribution S PIE pour corriger correctement le rendement quantique accepteur. Une caractérisation photophysique appropriée est nécessaire pour déterminer le facteur gamma (ƴ) qui, conjointement avec d'autres faits de correctionOrs ( p. Ex., Α pour diaphonie et β pour l'excitation accepteur avec le laser donneur), peuvent être utilisés pour augmenter la précision de la distance interdyeuse mesurée. Cette approche a été corroborée en utilisant deux échantillons standard dsDNA conçus, et une précision de ~ 1 Å par rapport aux valeurs attendues a été déterminée.

Différentes sélections de colorants nécessitent l'adaptation des éléments optiques du microscope, tels que les filtres dichroïques et passe-bande, pour tenir compte de la fenêtre spectrale appropriée des colorants sélectionnés. En conséquence, les lasers pulsés doivent être sélectionnés. Plus important encore, la sélection des colorants est cruciale en raison de plusieurs artefacts photophysiques possibles, tels que le blanchiment de l'accepteur et du donneur, le triplet ou le clignotement de la teinture, ou le colorant collant aux surfaces protéiques. Ces artefacts pourraient compromettre l'interprétation des données expérimentales. MFD est idéal dans ce scénario car, en inspectant plusieurs paramètres, il est possible d'identifier les sources de ces artefacts, corrigerPour eux, ou du moins être au courant de leur existence. Le paramètre d'orientation dipôle, la plupart du temps pris comme κ 2 = 2/3, peut entraîner des écarts plus importants de la distance déterminée si le colorant se colle préférentiellement à la surface des biomolécules. L'anisotropie de l'échantillon donneur, l'échantillon accepteur et l'accepteur des donneurs peuvent aider à résoudre si cette hypothèse est valable ou non. Dans cette expérience, il a été constaté qu'il y avait une erreur maximale de ~ 2,5% sur la distance mesurée, par rapport à ne pas effectuer la correction correcte et à obtenir une erreur de 10 à 20%. Le rendement quantique de l'accepteur peut créer une plus grande source d'erreur. Ainsi, S PIE est important pour résoudre ce problème important.

Il est possible d'appliquer une stratégie similaire pour comprendre le paysage conformationnel du domaine de liaison au ligand du récepteur NMDA pour comprendre le mécanisme de l'agonisme sur le NMDAR. On a constaté que le LBD dans tLa présence d'un antagoniste évite l'accessibilité d'un état de haute FRET, a postulé être responsable de l'ouverture du canal 73 . Lorsqu'on compare les distances expérimentales dérivées et les valeurs attendues basées sur des informations cristallographiques, un accord de 3 Å a été atteint. Plus important encore, les nouveaux états peu peuplés peuvent être identifiés avec une précision similaire.

En résumé, les expériences de FRET à une seule molécule en mode MFD 42 permettent de prendre en compte correctement les artefacts expérimentaux et de dériver une distance interdyeuse dans la plage de ~ 30-70 Å. Si, au lieu d'une seule distance mesurée, un réseau de distances est dérivé, il est possible de les utiliser comme contraintes dans la modélisation structurelle, en particulier pour les états difficiles à caractériser avec des méthodes plus standard de biologie structurale.

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Disclosures

Tous les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents avec le contenu de cet article.

Acknowledgments

VJ et HS reconnaissent le soutien du NIH R01 GM094246 à VJ. HS reconnaît les fonds de démarrage du programme d'enquête créative de l'Université de Clemson et du Centre de technologie des sciences et d'ingénierie des matériaux optiques à l'Université Clemson. Ce projet a également été soutenu par une bourse de formation du Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training du Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) et la Fondation Schissler pour les études translationnelles des maladies humaines communes à DD. Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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