형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

Biology

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Summary

세포 이온 수송 종종 세포내 pH를 모니터링 하 여 평가 될 수 있다 (pH). 유전자 Encoded pH-지표 (GEpHIs) 그대로 셀에 세포내 pH의 부 광 량을 제공합니다. 이 프로토콜 내용을 통해 셀룰러 ex vivo 라이브 이미징 pHerry와 초파리 melanogaster 의 말 tubules의 세포내 pH의 정량화, 의사 비율 유전자 인코딩 pH 지시자.

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Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

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Abstract

상피 이온 수송 체계 이온 항상성 뿐만 아니라 필수적인 세포 전기 화학 기온 변화도의 유지 보수에 필수적입니다. 세포내 pH (pH)은 많은 이온 운송업 자에 의해 영향을 하 고 따라서 pH모니터링은 운송업 자 활동을 평가 하기 위한 유용한 도구. 현대 유전자 인코딩 pH-지표 (GEpHIs) 세포 및 subcellular 규모 pH 그대로 셀에의 부 광 량을 제공합니다. 이 프로토콜 설명 세포질 pH 규제의 초파리 melanogaster 의 말 Tubules (MTs)에서 ex vivo 라이브 이미징 통해 pHerry, pK의사 비율 GEpHI의 실시간 정량화를 는 cytosol에서 pH 변화 추적에 적합. 추출 된 성인 비행 MTs 단일 셀 레이어 epithelia의 형태학 상으로 그리고 기능상 다른 섹션으로 구성 되며 상피 전송의 조사를 위해 접근 가능 하 고 유전자 세공 모델으로 사용할 수 있습니다. GEpHIs 기존 pH에 민감한 형광 염료와 이온 선택적 전극 위에 여러 가지 이점을 제공합니다. 적절 한 모터 요소 사용할 수 있습니다 제공 GEpHIs 뚜렷한 세포 인구 레이블을 수 있습니다. 이 라벨은 전 비보 vivo에서, 그리고 제자리에 , 준비는 본질적으로 다른 유형의에 특히 유용 합니다. GEpHIs 또한 반복된 염료 치료 또는 조직의 외부화에 대 한 필요 없이 시간이 지남에 그대로 조직에 pHi 의 정량화를 허용합니다. 현재 GEpHIs의 주요 단점은 경향을 cytosolic 포함 조직 손상에 대 한 응답에서에서 집계-표현식을 구성 합니다. 이러한 단점, 그들의 솔루션 및 GEpHIs의 고유의 장점은 추출 된 MTs의 기능적으로 명료한 원금과 방사상 세포의 basolateral 양성자 (H+) 교통의 평가 통해이 프로토콜에서 설명 했다. 기술과 분석 설명 다양 한 척추 동물 및 무척 추 동물 준비에 쉽게 적응할 수 있다, 분석 결과의 세련 특정 전송기를 통해 이온 플럭스의 복잡 한 결정을 연구소 교육에서 조절 될 수 있습니다.

Introduction

이 프로토콜의 목표는 정량화의 세포내 pH (pHi)는 유전자 인코딩 pH-표시기 (GEpHI)를 사용 하 여 설명 하 고 어떻게 모델 곤충 (디의에서 basolateral H+ 교통을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다 설명 melanogaster) 신장 구조, 말 관 (MT). MTs 과일 파리의 배설 기관으로 봉사 하 고 몇 가지 주요 측면1포유류 nephron 기능적으로 비슷합니다. MTs는 흉부와 복 부의 tubules (앞쪽에 및 사후)의 2 쌍으로 정렬 됩니다. 각 산의 단일 셀 상피 튜브 metabolically 활성 주 셀의 독특한 꼭대기 구성 (luminal)과 basolateral (hemocoel) 극성으로 삽입된 방사상 세포. 형태학 상으로, 기능적으로, 앞쪽 MTs 3의 구성 그리고 발달 별개 세그먼트, 특히 초기 크기 세그먼트, 전환 세그먼트, 및2ureter 조인 분 비 주요 세그먼트. 셀룰러 규모 루멘으로 트랜스 상피 이온 수송 basolateral 나+-K+뿐만 아니라 꼭대기 원형질 막 V ATPase3 와 알칼리-금속/H+ 교환기에 의해 수행 됩니다-ATPase4, 내부 정류기 K+ 채널5, 나+-구동 Cl/HCO3 교환기 (NDAE1)6및 Na+-K+-2 Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, 방사상 세포 중재 Cl-8,9전송 하는 동안. 이 복잡 하지만 액세스할 수 physiologic 시스템 초파리의 유전 및 행동 다양 한 도구와 함께 내 생 이온 전송 메커니즘의 조사를 위한 우수한 기회를 제공 합니다.

이 프로토콜에 대 한 근거는 행동과 다른 모델 시스템 도구의 수출을 셀에서 통합에 대 한 잠재력을 가진 상피 이온 수송을 공부에 대 한 유전자가 단 시스템을 설명 했다. PHerry10의 표현, 녹색 pH에 민감한 슈퍼 황도 pHluorin11,12 (SEpH) 및 빨간색 pH을 구분 하지 않는 mCherry13, MTs의 융합에서 파생 된 GEpHI 허용에 H+ 전송의 정량화 높은 K+/nigericin 교정 기술14를 통해 단일 산 세포. 마찬가지로 많은 이온 운송업 자 H+ 해당 이동, 세포내 pH 의 정량화 전송기의 다양 한 통해 이온 이동의 기능적 표현으로 제공 합니다. 또한 조직의 특정 transgene15 에 RNA 간섭 (RNAi)16 식 세포 이미징 및 전체-기관 분석17 와 결합 될 수 있는 강력한 유전자 도구를 제공 하는 초파리 MT 모델 시스템 , 18 , 19 관 기능 동작에 분자에서 수직 통합 된 강력한 도구 집합을 만들 수의. 이 스탠드 반면 다른 많은 프로토콜으로 역사적으로 그러한 측정 의존 해야 복잡 한 상피 생물학을 평가 하 고 마이크로 해 부, 정교한 이온 선택적인 전극20,21, 발굴 그리고 비싼 pH에 민감한 염료22 제한적인 로드 요구와 다른 유형의 조직에 가난한 세포 특이성. GEpHIs는 광범위 하 게 pH 다양 한 세포 유형23을 측정 하기 위해 사용 되어 왔습니다. 초기 작품 고유의 pH 감도의 녹색 형광 단백질 (GFP) pH배양된 상피 세포24 을 모니터링 하는 데 악용 하지만 지난 2 년간 본 균27 뉴런25명과26, 사용 GEpHIs , 그리고 식물 세포28. 세포질 GAL4/UAS 식 시스템15초파리 MT의 생리 적인 접근을 통해 유전 구성의 대상에 대 한 잠재력의 조합을이 pH의 조사에 대 한 이상적인 준비 하 게 나 레 귤 레이 션 및 상피 이온 수송.

pH규제 수십 년 동안 공부 되었습니다 하 고 생활에 필수적 이다. MT 준비는 강력한 모델 pH 규제의 생리학을가 르 치지만 또한 수행을 정교한의 pH 레 귤 레이 션 ex vivo에서 비보조사를 제공 합니다. 이 프로토콜 초파리 NH4Cl 펄스 산 기술21, 로드를 사용 하 여 산의 상피 세포의 basolateral 막에 걸쳐 H+ 움직임의 정량화를 설명 하지만 pH 지시자로 유전자 인코딩, 의무가 transgenesis 및 라이브 이미징 모든 준비를 이러한 메서드 및 그들의 이론적인 틀을 적용할 수 있습니다.

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Protocol

이 프로토콜의 모든 단계는 메이 요 클리닉 (로체스터, 미네소타) 동물 사용 지침을 준수합니다.

1. 비행 축산

  1. 인상 파리와 세트 표준 축산29에 따라 십자가.
    참고: 형광 기자 식 GAL4/UAS 시스템 온도에 비례 하 고 따라서 양육 온도 식 수준 변경 조정 될 수 있다. 높은 식 수준 동안 종종 더 나은 신호 대 잡음 비율에이 상태는 또한 증가 cytosolic와 organellar 집계와 관련 pHerry10, 같은 구문을 GFP 레드 형광 단백질 (RFP) 퓨전을 사용 하 여 때 30,31. 수행 하 여 정량화는 여전히 가능한 집계를 피할 수 없는 경우는 pH 7.0에 해당 하는 1.0의 형광 비율 교정 각 실험 및 정규화 데이터 포인트 (단계 7.4 참조 교정 아래에 참고).
  2. 설정 homozygous capaR GAL432 남성 십자가 homozygous UAS-pHerry10 처녀 암컷과 homozygous c724 GAL4이미징 수 있도록 homozygous UAS-pHerry 처녀 암컷에 수 컷2 산도주 셀에는 MT의 방사상 세포의 각각. 음식과 28 ° c.에 친구를 두고 신선한 튜브로 3 GAL4 남성과 장소 6 UAS-pHerry 여성
    참고: 애벌레 4 d 이내 분명 해야한다 고 성인 eclose 10 일 주위에 시작 됩니다.
  3. 일수로 시 여성 파리를 수집 하 고 10 d 28 ° c.에 대 한 나이를 따로합니다
    참고: 어떤 제한적인 행동 분석 실험 (램지 분 비 분석 결과17,19) 같은 세포내 라이브 pH 이미징에 상관 될 것입니다 그에 해당 하는 실험의 타이밍을 조정할 수 있습니다. 남성 파리 사용할 수 있지만 여성에서 tubules는 더 크고 더 강력한.

2. 폴 리-L-리 신 슬라이드 준비 합니다.

  1. 표준 75 x 25 mm 슬라이드의 상단 주위 소수 PAP 펜 40 x 20 m m 테두리를 그리고 슬라이드 광학 이미징와 호환 되지 않는 경우 실시간 사용 큰 coverslips에 15 분 동안 건조 따로 설정 합니다.
  2. 각 슬라이드에 재고 0.01% 폴 리-L-리 신 (PLL) 솔루션의 2 개 mL를 전송 하 고 실시간에 1 시간을 위해 따로
  3. 피 펫과 초과 PLL을 제거 합니다. 나중을 위해 50 mL 원뿔 유리병에서 솔루션을 저장 합니다. 4 ° c.에 게
  4. 진공 라인으로 모든 나머지 솔루션 발음 슬라이드에 없습니다 솔루션 되도록 전체 슬라이드 표면 진공 라인을 실행 합니다.
  5. 사용 하기 전에 RT에서 옆으로 1 추가 시간에 대 한 슬라이드를 설정 합니다. 표준 슬라이드 책에 최대 1 달 동안 건조 RT에 슬라이드를 저장 합니다.

3. 해 부 접시 및 유리 막대의 준비

  1. 4.5 mL 탄성 깊이의 5. 믹스 일회용 피 펫 팁을 생산 하는 RT에 페 트리 접시 35 x 10 m m 폴리스 티 렌에 기본의 고무 경화제 0.5 mL를 추가 합니다. O/N 실시간에 치료 하는 탄성을 허용
    참고: 탄성 중합체는 명확 하 고 거품의 무료 되어야 합니다. 거품의 붓는 후 10-15 분 동안 진공 항아리에 탄성 번호판을 유지 하 여 촉진 수 있습니다.
  2. 손 사이 5mm 유리 막대를 개최 하 고 떨어져 끝을 당기면 조명된 분 젠 버너에 막대의 센터를 녹여. 유리로 녹아 당겨 더 신속 하 게 얇고 (0.1 m m) 및 테이퍼 샤프트 (그림 1).
    참고: 칼에서 45 ° 각도 종종 tubules를 처리 하는 데 도움이. 이 ( 그림 1참조) 칼을 뽑아로 서 한 손으로 낮추는 방법으로 얻을 수 있습니다.
  3. 단일 모서리 탄소 강철 면도날의 무딘 쪽과 중간에 얇은 샤프트를 휴식. 휴식 깨끗 한 되도록 해 범위에서 막대의 얇은 끝을 검사 합니다.

Figure 1
그림 1: 말 Tubules를 처리 하기 위한 유리 막대를 조작.
A-E입니다. 난방 및 MTs. 화살표를 처리 하기 위한 적합 한 테이퍼를 생산 하 고 각도를 유리 막대를 당기의 과정 방향 및 적용 되는 힘의 크기를 나타냅니다. F. 적절 하 게 조작된 유리 도구 사진. 눈금 막대 = 10 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4입니다. 솔루션 및 관류 시스템 준비

참고: 관류 시스템 제조 업체에 의해 다릅니다. 이 프로토콜 기반으로 합니다 중력 먹인 8 채널 오픈 저수지는 입력된 흐름 속도 레 귤 레이 터와 진공 기반 유출 하지만 MTs 여기에 설명 된 대로 적용할 수 있습니다 어떤 관류 시스템과 작동 하도록 설치 하는 방법.

  1. 다음과 같은 솔루션을 준비:
    1. Aliquot 슈나이더의 매체 (40 mL 50 mL 원뿔 튜브로)와 4 ° c.에 게
    2. 솔루션을 준비 (예: 곤충 Phosphate-Buffered 염 분 (iPBS)와 NH4Cl iPBS) RT 표 1에 따라 필요한 경우에). 실험의 날에 사용 하기 전에 RT 따뜻한 솔루션.
      참고: iPBS 40 mM NH4Cl iPBS 수 대용량 (1 리터 이상) 준비와 4 ° c.에 저장
    3. 8 교정 솔루션 500ml 볼륨 pH에서 준비 = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0과 9.0 표 1 및 4 ° c.에 저장소에 표시 된 대로 N-메 틸-D-glucamine (NMDG)와 HCl로 적정 하 여 각 솔루션의 pH를 조정 합니다.
    4. 실험 당일 rt 교정 솔루션의 5 mL aliquots 따뜻한 고 10 µ M의 최종 농도 생산 재고 nigericin 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 20 m m)를 추가 합니다.
      주의: 장갑 nigericin을 처리 합니다. 일회용으로 nigericin를 접촉할 모든 장비 취급. Nigericin 유리 및 플라스틱에 남아 있고 생물학 준비 장비를 다시 사용 하는 경우 손상 됩니다.
  2. 관류 시스템:
    1. 관류 시스템 모든 저수지 ddH2O (그림 2)를 작성 하 여 프라임. 모든 라인을 채우기 위해 흐름 속도 레 귤 레이 터에 인접 수 있도록 한 번에 하나의 채널을 엽니다.
      참고: 그것은 실속 된 채널을 열고 저수지에서 드라이브 흐름에 플런저를 사용 하 여 라인에 공기를 필요할 수 있습니다.
    2. 2 채널을 열고 ddH2O 배수를 허용 합니다. 일단 저수지는 거의 비어, iPBS와 NH4Cl 펄스 iPBS 두 번째 저수지 첫 번째 저수지를 작성. 설정 유량 최대 흐름 속도 레 귤 레이 터 원심 라인을 채우기 위해 1 분을 각 솔루션을 허용 다음 흐름 (그림 2)를 중지 합니다.
    3. 위치 2 영상 현미경 스테이지의 "손 돕기" 클램프를 납땜의 세트. 이미징 플랫폼의 각 측면에 하나의 클램프를 배치 합니다.
    4. 조심 스럽게 열 모 세관 유리의 조각의 원심 0.5 인치 (내부 직경 1.5 m m, 외경 0.86 m m, 길이 100 m m)는 분 젠 버너에. 중력에 의해 구 부 선단부를 수 있도록 원하는 각도 달성 되 면 불꽃에서 유리를 제거 하 여 45 ° 굴곡을 만듭니다. 유리 모 세관의 두 번째 작품으로이 과정을 반복 합니다.
    5. 구부러진된 유리 모 세관 흐름에 선 및 유출 진공 연결 라인에 각각 넣고 손에 "도움" 탑재 (그림 3) 현미경의 이미징 단계와 함께 그들을 정렬.

Figure 2
그림 2: 관류 시스템 및 이미징 구성입니다.
MT basolateral 전송 기능의 동시를 통해 생리 적 평가에 필요한 구성 요소 형광 이미징 및 빠른 솔루션 교환 라이브. 가스 라인 표시 사항이 고 HCO3- 전송의 평가 실험의 확장을 허용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 관류 장치 NH4Cl 펄스의 흐름 회로도 실험.
화살표는 흐름 경로 포인트 전환 밸브를 묘사. 솔루션 중력 흐름에 의해 견본에 저수지에서 이동 하 고 진공 흡입에 의해 폐 플라스 크를에 견본 약 실에서 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5. 성인 초파리 앞쪽 말 Tubules의 해 부.

  1. 해 부 접시를 수집 섹션 3에서에서 유리 막대, 단면도 2에서 PLL-코팅 슬라이드, 접착 관류 잘 분배기, 진공 그리스, 4 x 2"스트립 영화 씰링의 뽑아, # 5의 2 쌍 좋은 집게, 그리고 차가운 슈나이더의 매체와 RT iPBS의 40 mL aliquots.
  2. 씰링 테이프에 진공 기름 확산 하 고 윤활제와 하단 코트 테이프에 접착 관류 잘 분배기를 누릅니다. 접착제 관류 잘 분배기를 벗기십시오 고 그리스-사이드-다운 PLL 코팅된 슬라이드 위에 놓습니다. 두고 개별 견본 소수 성 기름에 추적 하는 웰 스 관류 잘 분배기를 제거 합니다.
  3. 그리스 둘러싸고에 RT iPBS의 장소 200 µ L PLL 코팅된 슬라이드에 잘 하 고는 stereoscope 아래 슬라이드를 이동 합니다.
  4. 장소는 빈 비행에 UAS-pHerry/capaR-GAL4 파리 유리병 그리고 10 분 동안 얼음에 그들을 anesthetize.
    참고:이 방법은 마 취, CO2, 달리의 파리 탈수 하지 않습니다 보장 합니다.
  5. 해 접시에 얼음 처럼 차가운 슈나이더의 매체를 부 어 그리고 좋은 집게를 사용 하 여 하나의 마 취 여성 비행 해 stereoscope 아래 접시에 전송.
  6. 집게의 세트로 흉부에 의해 비행을 누른 다른을 사용 하 여 부드럽게 복 부의 후부 그립. 즉,는 집게를 사용 하 여 비행 신중한 움직임의 후부 오픈 당겨. 여 hindgut 표시 되 면 선단부를 반복, 짧은 잡아당김을 통해 신체에서 hindgut 당겨서 기본 tracheoles에서 용기와 MTs를 무료.
    참고: 앞쪽 및 후부 MTs 표시 됩니다 midgut 강과 hindgut ureter 통해 만나는. 자유의 지 가능성이 되도록 MTs의 첫 번째 쌍 수 후부 tubules는 hindgut를 둘러싸십시오. 이들은 일 수 있다 (그림 4A) 무시 됩니다.
  7. 꼬집어 ureter에서 앞쪽 MTs 미세 집게로 일단 MTs의 두 번째 집합은 복 부의 무료. 이 앞쪽 MTs 용기에서 분리 되며 ureter을 닫습니다.
  8. 하는 tubules가 양쪽을 ureter 아래 막대를 밀어서 당겨 유리 막대와 무료 앞쪽 MTs를 선택 합니다. 솔루션에서 위로 MTs를 들어 냅니다.
  9. MTs와 ureter 막대의 아래쪽을 준수 하 고 내려 ureter 바로 슬라이드에 유리 막대를 설정 합니다. Ureter을 부착 하 고 유리 슬라이드 (그림 4B)에 다운 ureter을 눌러는 MTs의 원심 끝 인감. MTs 조작할 필요 이상 더 이상 하지 않습니다. MTs ureter 슬라이드에 고정 된 솔루션에서 최대 부동 한다.
  10. 유리 막대의 정밀한 끝을 사용 하 여 슬라이드 표면에 걸쳐 부드럽게 각 관을 청소. 중괄호는 관을 분쇄 피하기 위해 PLL-코팅 슬라이드 (그림 4C)의 표면에 각 관의 전체 길이 연결할 인접 하 원심 이동 관의 정상에 막대를 슬라이드를 슬라이드에 대 한 막대.
  11. 탑재 된 관 이상의 유체 가득한 작은 형성을 슬라이드에 다시 접착 관류 잘 분배기를 놓습니다.
  12. 표본을 현미경 스테이지에 배치 합니다. 유입을 놓고 각각 입구와 콘센트 열기, 관류의 모 세관 유출.
    참고: 잘 분배기 오픈 관류 챔버를 바란다면 남아 있을 수 있습니다. 이 경우 유입 및 유출 모세 혈관 잘 한 이미징의 반대편에 정렬 수 있습니다.

6. 프로토콜 및 관 건강 이미징의 유효성 검사

참고:이 프로토콜에 수행 GFP (SEpH)와 RFP (mCherry) 필터 세트 거꾸로 넓은 필드 epifluorescent 현미경 ((예) 470/40 nm 여기, 515 nm longpass 방출 (em), 전 500 nm dichroic 및 546/10 nm, 590 nm longpass em, 565 nm dichroic), 10 X / 0.45 공기 목표, 라이브 이미지 캡처 및 이미징 소프트웨어에 대 한 단색 카메라. 프로토콜 모든 직 립에 대 한 적응 시킬 수 있다 또는 최적의 노출 시간과 빛의 강도, 범주화 매개 변수 달라 지기는 하지만 GFP와 RFP 광학 및 이미지 수집 소프트웨어, 사이 전환 하는 자동된 필터와 현미경을 거꾸로. 배경 빼기와 ROI를 사용 하 여 각 채널에 포함 아무 형광 신호 ROI에 인접 한 후 모든 분석, 형광 강도 (ROI)의 지역에서 평균 픽셀 강도으로 분석 합니다.

  1. 현미경, 광원, 및 이미징 시스템을 켭니다.
  2. 오픈 관련된 이미징 소프트웨어입니다.
  3. 접 안 렌즈를 통해 모양과 MT의 루멘 전송된 빛에서 명확 하 게 표시 될 때까지 수동으로 초점을 조정.
  4. 이미지 분석 소프트웨어에서 "인수" 탭을 클릭 하 고 "획득 모드" 섹션에서 "범주화" 풀 다운 메뉴에서 "2 x 2"를 선택 합니다.
  5. 조명 빛을 photobleaching 최소화 가벼운 경로에 5% 중립 밀도 필터를 삽입 합니다.
  6. GFP (SEpH) 채널 "채널" 메뉴에서 클릭 "라이브" 카메라를 통해 형광 신호를 관찰 합니다.
  7. 강도 히스토그램의 밝은 픽셀 값이 최대 값의 약 40%는 노출 시간을 설정 하려면 "시간" 슬라이더를 조정 다음 "" 조명 중지 하려면 중지를 클릭 합니다.
  8. Cytosolic mCherry의 부재 (조직 손상이 나 overexpression의 표시) 집계 단계 6.6 6.7 RFP (mCherry) 채널 및 앞쪽 산의 동 공이 확장 되어 초기 세그먼트의 존재를 확인 반복 (그림 4D).
    참고: 확대 세그먼트는 관의 가장 인접 세그먼트 이며이 세그먼트의 내부 루멘의 직경은 인접 한 전환 세그먼트의 보다 큰 ~ 20 µ m로 명확 하 게 명백한 해야 합니다. 2 x 2 픽셀 binning 자주 충분 하지만 필요한 조명 농도를 더 증가 시킬 수 있다. 전형적인 노출 시간은 150 & 800 ms/채널 사이입니다. Photobleaching를 최소화 하기 위해 최대한 작은 빛으로 사용 합니다. Photobleaching를 최소화 두 fluorophores 수 표 백제 하지 독립적으로, 따라서 어떤 비율 보정을 무효화 하는으로 pHerry 같은 듀얼 fluorophore 지표의 사용에 필수적입니다.
  9. "시계열" 확인란을 클릭 하 여 시간 경과 영상 프로토콜을 사용 합니다.
  10. 조정 "기간" 10 분 "간격" 슬라이더를 "시계열" 섹션에서 풀 다운 메뉴에서 0 최대 이미지 수집 속도와 총 캡처 시간을 설정 합니다. 0.2 Hz의 총 획득 율은 종종 충분 합니다.
  11. GFP (SEpH) 및 "채널" 섹션에서 RFP (mCherry) 상자를 확인 하십시오.
  12. 적절 한 밸브 컨트롤러를 활성화 하 여 살포 시스템의 iPBS 라인을 열고 "시작 실험."를 클릭 하 여 이미징 프로토콜을 시작 1 분 후 전환 NH4Cl 펄스 솔루션 20 여 적절 한 밸브를 개폐 iPBS 라인 s 다음 NH4Cl 라인을 폐쇄 하 고 iPBS 밸브를 재개 하 여 iPBS에 반환. 관류 시스템을 중지 하기 전에 완료 하려면 전체 이미징 프로토콜을 허용 합니다.
    참고: 시간 경과 분석 안정적인 mCherry 신호 및 NH4Cl의 증가, 유실, 따라 냉각 하 고 점차적으로 복구 SEpH 신호 계시 해야 한다.
  13. 2-포인트 캘리브레이션을 수행 합니다.
    1. 기본 슬라이드에서 필 링으로 잘 분배기를 제거 하 고 잘 영상에서 모세 혈관 관류 및 클램프를 제거.
    2. 200 µ L 교정 iPBS (pH 7.4, 10 µ M nigericin) 200 µ L 피 펫와 영상에 적용 됩니다. 피 펫와 영상에서 솔루션 다음 보정 솔루션의 또 다른 200 µ L를 바꿉니다. 4 번 완벽 한 솔루션 교류를 보장 하기 위해이 프로세스를 반복 합니다.
    3. 이미징 하기 전에 30 분 동안 교정 솔루션에서 준비 품 어. 반복 단계 6.6-6.11에서 동일한 매개 변수를 사용 하 여 이미징 프로토콜, 캡처 이미지의 불과 1 분의 수정.
      참고: 관류 시스템 및 모세 혈관이이 단계에서 필요 하지 않습니다과 영상에 첨부할 수 없습니다 nigericin 모세 혈관을 노출 하지 않으려면 잘.
    4. 200 µ L 피 펫으로 잘 이미징에 200 µ L 교정 iPBS (pH 9.0, 10 µ M nigericin)를 추가 합니다. 피 펫와 영상에서 솔루션 다음 보정 솔루션의 또 다른 200 µ L를 바꿉니다. 4 번 완벽 한 솔루션 교류를 보장 하기 위해이 프로세스를 반복 합니다.
    5. 10 분 전에 이미징에 대 한 두 번째 교정 솔루션에서 준비 품 어. 반복 단계 6.13.3는 이미징 프로토콜.
    6. 어느 채널에서 아무 픽셀 "의미 투자 수익"를 클릭 하 여 스크롤 하지만 강도 막대 그래프에 값이 없는 보고 관찰 하는 동안 "프레임" 슬라이더 이미지 스택 포화는 것인지 이미지 분석 소프트웨어에서 캡처한 이미지 스택을 검토합니다 최대 감지 값에 도달 합니다. 어떤 프레임 픽셀 최대 키 강도 도달 하는 경우, 노출 시간 또는 조명 강도 및 반복 섹션 6 줄일.
      참고: 일단 각 준비에 사용 되는 포인트 교정 하지 않는 한 실험 또는 교정 사이 이미지 매개 변수를 변경 하지 마십시오 설립 (8.3 단계 참조).
  14. 이미지 스택 시간의 기능으로 형광의 강도와 형광 비율 (SEpH/mCherry)를 분석 합니다.
    1. "말은 투자 수익"를 클릭 하 고 자유 변형 도구 선택 합니다. 산의 ~ 50 µ m 길이 추적 하는 마우스를 잡으십시오 ROI, 그리기 완료 클릭 마우스 오른쪽 다음 배경 ROI (그림 5A)를 정의 하는 산에 인접 한 지역에 반복.
    2. "측정"에서 "평균 강도"를 클릭 클릭 하 여 강도 값의 테이블을 만들 "내보내기 > 데이터 테이블 > 만들기."
    3. 구성 톱니 아이콘을 클릭 하 고 "시간"와 "강도 뜻"를 제외한 모든 매개 변수를 선택 취소 새로 만든된 데이터 테이블에 대 한 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "다른 이름으로 저장" 선택한.csv 파일로 데이터를 내보냅니다.
      참고: 유사한 측정 할 수 있다 또한 ImageJ 같은 무료 소프트웨어를 사용 하 여.
    4. 스프레드시트 테이블을 열고 "텍스트"에서 "데이터" 탭을 선택 하 여 데이터 테이블을 가져올 합니다.
    5. 스프레드시트에 함수를 사용 하 여 각 시간 점에서 SEpH 신호 강도에서 SEpH 배경 강도를. MCherry 신호에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
    6. 시간 및 배경 수정 강도 데이터와 클릭을 포함 하는 열을 선택 하 여 시간의 기능으로 각 채널 강도 플롯 "삽입 > 분산형 (차트) > 직선으로 분산형" (그림 5B).
    7. 스프레드시트 함수를 사용 하 여 각 시간 점에서 SEpH/mCherry 형광 비율을 계산.
    8. 시간 및 비율 데이터와 클릭을 포함 하는 열을 선택 하 여 시간의 기능으로 음모 형광 비율 "삽입 > 분산형 (차트) > 직선으로 분산형" (그림 5C).

7. 전체 말 Tubules Ex Vivo에서 pHerry의 구경 측정.

  1. 해 부 고 섹션 5에에서 설명 된 대로 이전 MTs의 신선한 세트를 탑재.
  2. 6.13.2 단계에서 설명한 대로 교정 iPBS (pH 7.4, 10 µ M nigericin)에 대 한 iPBS를 교환 합니다. 30 분 동안 품 어.
  3. MTs 찾아서 단계 6.1-6.11에에서 설명 된 대로 SEpH/mCherry 이미지의 쌍을 수집 합니다. IPBS 6.13.4, 단계에서 설명한 대로 10 분 기다려야 및 다시 이미지 교정의 다른 재고 솔루션을 교체 합니다. 이 프로세스를 반복 하 여 SEpH/mCherry 비율 모든 솔루션에 몇 군데 되었습니다. 구하는 pH 9.0 이미지는 견본 거의 높은 pH에서 복구 마지막.
  4. 플롯 SEpH의 형광 비율 mCherry에 교정 8 표본에서에서 부과 pH의 함수로 단계 6.14.9에에서 설명 된 대로. 공식 1 (그림 5D)에 따르면 전체 보정 기능을 볼츠만 곡선으로 캘리브레이션 데이터에 맞게. 데이터 일치 하지 않는 경우 교정 세트 1.0의 형광 비율 pHi 7.0에 해당 되도록 정규화 각 표본에서 플롯 하 고 다시 분석 (그림 5E).
    참고: 후자의 과정은 필요한 경우 개별 실험 필요 합니다 그들의 자신의 내부 포인트 교정33 (정량화 아래 절차 (단계 8.3) 참조).
  5. 공식 1
    Equation 1
    여기서 R = SEpH/mCherry 비율 및1,2, xo, 그리고 dx 는 커브 피팅 매개 변수를 나타내는 최소 형광 비율, 최대 형광 비율, pK, 함수의 폭 각각. xo 명백한 pK 7.1와 7.4 셀 유형 및 정확한 교정 상태에 따라 다를 수 있습니다 pHerry의 =.

8. 전 비보 말 관 Epithelia에서 Basolateral 산 압출의 정량화.

  1. 이미지 pHerry 표현 방사상 세포와 pHerry 표현 교장 동시에 세포.
    1. 섹션 5에에서 설명 된 대로 이전 MTs UAS-pHerry/capaR-GAL4 즉석에서 해 부 하지만 잘 이미징에 해 슈나이더의 중간에서 MTs 전송 하지 마십시오.
    2. 섹션 5에에서 설명 된 절차를 사용 하 여 같은 해 접시에 UAS-pHerry/c724-GAL4 비행에서 앞쪽 MTs를 해 부.
    3. 같은 이미징 단계 5.8-5.11에에서 설명 된 대로 잘으로 MTs의 2 세트를 전송 합니다.
      참고: 슬라이드 아래로 MTs의 팔을 강타 하는 때 배치 UAS-pHerry/c724-GAL4 와 서로 가까이 UAS-pHerry/capaR-GAL4 tubules의 MTs pHerry 표현 원금과 방사상 세포 동일한 필드 (구상 될 수 있다 그림 6A)입니다.
  2. NH4Cl prepulse 6.12 단계에 설명 된 대로 적용 됩니다.
    참고: 경우에 일관 된 보정 (그림 4B) 달성 될 수 없었다, 접착제 후 보정 iPBS (pH 7.0, 10 µ M nigericin, 30 분 부 화)와 각 실험의 끝에 7.0 pHi 를 설정 하 여 포인트 교정 수행 관류 잘 구분선과 관류 장비 제거 되었습니다.
  3. 방정식 2 다른 산 세그먼트 (를 사용 하 여 절대 또는 표준화 된 비율 적절)의 방사상과 교장 세포에서 추적을 보정 하 고 NH4Cl 철수 후 복구 단계를 사용 하 여 지 수 감퇴 기능을 적용 하 여 분석 통계 분석 소프트웨어와 붕괴 상수 (τ) (그림 6B) 지적.
    공식 2
    Equation 2
    어디 R = SEpH/mCherry 비율 및1,2, xo, 그리고 dx 는 커브 피팅 매개 변수 보정 단계 7.4 (공식 1)에 의해 결정 됩니다.
    1. PHpH 고 산 준비34사이 로드 휴식에서 유사 하의 기능으로 (JH +, 방정식 3참조) 산 압출 속도 계산 합니다. 단계 8.3에서에서 파생 하는 지 수 함수를 사용 하 여 pH시간 각 시간 간격에서의 파생을 계산.
      식 3
      Equation 3
    2. 계산 하는 기본 버퍼링 용량 (βi; 방정식 4) 단계 8.3.1에서에서 각 간격의 시작에서 이전 문학에 따라 pH에 cytosol의 ( 식 4참조).
      참고: 초파리에 βi 의 가장 철저 한 특성화 애벌레 모터 신경 맨끝35 와 이러한 데이터 산 셀 다른 사용 가능한 데이터의 부재에 대 한 개최 추측 될 수 있다.
      방정식 4
      Equation 4
    3. JH + (식 3) 확인 βT (8.3.2 단계)에서 /dt dpH (8.3.1 단계)에서 제품을 계산 합니다.
      참고:이 프로토콜에서 설명 된 같은 명목상 중 탄산염-무료 솔루션, 중 탄산염-파생 된 용량을 버퍼링 (βb) 것으로 간주 됩니다 ~ 0mm. 총 용량 (βT) 버퍼링 ββb, 그리고 따라서 β의 합계는나 = βT HCO3-/CO236의 부재.
    4. 플롯 JH + 는 pH 의 함수로 단계 6.14.9에에서 설명 된 대로 각 시간 간격의 시작 부분에.
    5. 지 수 감퇴 기능 pH통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 겹치는 모든 집합의 부분에 적용 됩니다. 셀과 MT 세그먼트 (그림 6 c) 간의 산 압출 속도 비교 결과 기능 변화의 속도 비교 합니다.
      참고: 커브 피팅 사용 하는 가장 적절 한 함수 항상 수 없습니다 단일 지 수 없습니다. 없습니다 그들은 적합의 미 덕을 개선 하는 경우 다른 함수를 교체하실 수 있습니다.
    6. 계산 하는 산 성 pH 셀 크기와 모양에서 유사 하의 기능으로 ( 방정식 5참조)를 유출.
      방정식 5
      Equation 5
      참고: 셀 크기 수 수 이미지에 직접 측정 하거나 근사 합니다. 주 셀 다음 크기와 빈 관의 반쪽으로 대표 될 수 있다: 내경 24 µ m; 외경 48 µ m; 높이 50 µ m. 과도 방사상 세포 변수 이지만 약 50 µ m의 높이와 직경 10 μ m의 원통형으로 대표 될 수 있다. 아래의 대표 결과 의 마지막 단락을 참조 하십시오.
    7. 지 수 감퇴 기능 pH 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 겹치는 모든 데이터 집합의 부분에 적용 됩니다. 산 용 셀과 MT 세그먼트 (그림 6D) 간의 비교 결과 기능 변화의 속도 비교 합니다.

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Representative Results

건강 한 조직 및 앞쪽 MTs의 적절 한 식별이이 프로토콜의 성공에 생명 이다. 해 부, 동안 주의 해야 직접 터치 하는 MTs와만 핸들을 그들은 MTs를 직접 잡지로 ureter 파손 (그림 4A- B)로 이어질 것입니다. MTs는 플랫 슬라이드에 휩 쓸, tubules는 가능한 조금만 진 해야 합니다 고이 피할 초과 모션 단일 셀 상피 층 (그림 4C)를 손상 할 것 이다. 제대로 해 부 앞쪽 MTs 상피 세포의 형태학 상으로 다른 관 세그먼트 cytosol 통해 빨간색과 녹색 형광의 동등한 배급을 보여줄 것 이다. Tubules 부적절 한 관류에 의해 손상 되 고 또는 빨간색 형광 아무 짝 녹색 집계의 집계 표시 됩니다 실패 잘못 식별된 후부 MTs 원심 ureter (그림 4D)에 근 눈 끝에서 균일 한 형태를 보여줄 것 이다 . 

PHerry의 적절 한 기능을 확인 해야 하지만 생리 평가 뿐만 아니라 형태. 적절 한 pH 감지 확인의 가장 합당 방법은 NH4Cl 펄스를 적용 하는 것 이다. 이러한 조건 녹색 SEpH 신호 예상된 pH 변화를 보고 해야 합니다 (pH NH3 펄스 동안에 상승 입력 셀, 펄스 동안 점차적인 쇠퇴로 NH4+ + K 전송기를 통해 입력 하 고 채널, 그리고 급속 한 산성화 및 NH4Cl 철수21, 빨간 mCherry 신호 일정 하 게 유지 해야 하는 동안 시 점진적 회복 (그림 5A- B). SEpH 신호에 있는 변화의 크기 프로토콜에 따라 다릅니다 것 이다 세포 유형, 하지만 mCherry 신호는 모든 경우에서 안정 되어야. 개별 실험 동안 mCherry 신호에 변화는 운동 또는 세포의 손상으로 인해 센서의 진보적인 세대를 나타냅니다. 후자 pH의 정량화를 방지 하 고 피해 야 한다. NH4Cl 펄스 시 2-포인트 캘리브레이션을 수행 하는 것이 중요 하다 (교정 iPBS, pH 7.4와 9.0, 10 µ M nigericin) 확인 하는 휴식 pH7.4 근처 고 현재 이미징 매개 변수의 채도으로 이어질 하지 않습니다 확인 형광 탐지 형광은 pH 9.0 (그림 5C)에서 최대화. 건강 한 MTs;와 프로토콜을 반복 한다 휴식 pH 7.4 보다 훨씬 낮은 경우 그리고 포화 pH 9.0에서 발생, 프로토콜 낮은 조명 강도 또는 노출 시간을 반복 한다. 적절 한 이미지 매개 변수를 확인 하는 그들은 해야 하지 경우 변경할 수 실험 또는 교정 사이 절대 형광 비 사용할 수 있다. PHerry의 의사 비율 자연 준비 운동 하는 경향이 있는 움직임 보정 또는 셀 직경에서 변화 하는 방법을 제공할 수 있습니다, 산도 의 절대 정량화 합니다 SEpH pHerry의 전체 체계적인 상관 관계 / pH nigericin/높은 K+ 기술을 통해에 mCherry 비율. 건강 한 준비에 pHerry의 교정 된 명백한 pK 세포 유형 및 교정 조건 (그림 5D)에 따라 7.1-7.4의 일관 된 보정 곡선을 생산 한다. 준비는 mCherry 집계는 피할 수, 비율 값의 정규화에 대 한 1.0의 형광 비율 pH에 해당 되도록 7.0 비슷한 결과 (그림 5E) 항복 한다. 포인트 교정 및 정규화 곡선 사용 됩니다, 각 준비에 대 한 이미지 매개 변수를 최적화할 수 있습니다. 

보정 된 pH 추적 세포 유형 사이 pH 규제 메커니즘을 비교를 사용할 수 있습니다. 주 전지와 앞쪽 산 (그림 6A)의 방사상 세포에서 pHerry 표현 하 초파리 에 GAL4/UAS 식 시스템을 사용할 수 있습니다. pH 규제 산 로드 셀 NH4Cl 펄스와 pH 복구의 속도 측정 하 여 평가 될 수 있다. 이것은 더 빠른 복구를 (그리고 따라서 τ의 값) 더 빠른+ H 경과 된 셀 표시 됩니다으로 붕괴 상수 (τ)를 추출 하는 다른 실험 조건에서 복구 단계에 지 수 함수를 피팅 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석을 바탕으로, MT의 방사상 세포 주 세포 (그림 6B) 보다 더 강력한 산 압출을가지고 나타납니다. 이 분석으로는 휴식 pH, 산, 로딩과 버퍼링 용량의 실험적인 그룹 사이 유사를 개최 한다. 그러나, 이러한 조건이 충족 되지 않습니다 때 그것은 pH 의존35,,3738 많은 세포의 cytosol (βi)의 기본 버퍼링 용량 자체는 관찰에 대 한 계정을 하는 데 필요한 그리고 따라서 변화의 속도 pH 다른 pHi 에서 직접 비교 되지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에 지 수 곡선에 맞게 산 돌출 단계 다음 NH4Cl 펄스 및 기본 버퍼링 용량 (βi)의 이전 결정된 견적 기능으로 산 압출 속도 (JH +)를 사용할 수 있습니다. 산도 의 산 성 돌출 (방정식 3 & 4)의 보상된 율 결정. 차이 산 로드 및 pH휴식에 대 한, 그것은 분명 차지는 일단 전환 세그먼트의 주 세포에서 산 압출 방사상 세포 (그림 6 c)의 초과. 경쟁력, 하는 동안이 분석 주소 하지 않습니다 측정 하는 pH 플라즈마 막에 걸쳐 산 압출은 막 표면적의 기능 볼륨의 기능입니다. JH + 관심의 셀의 볼륨 비 표면적에 의해 분할 되므로 셀 크기와 형태에 차이 대 한 보정 (식 5), 단위 시간당 단위 면적 당 산 등가물의 사마귀에 값 얻을 것입니다. 약 2 개의 주요한 세포 구성 과도 세그먼트에서 산의 둘레 하 고 따라서 단일 셀 튜브 (내경 24 µ m, 외경 48 µ m, 높이 50 µ m)의 절반으로 만들어진 수 있습니다. 방사상 세포 작은 고 바 모양의 산2의 전환 세그먼트에 있을 하는 경향이 있다. 면적 및 볼륨의 정확한 정량화는 곤란 하지만 과도 방사상 세포 모양 (50 µ m의 높이와 10 µ m의 직경 실린더)의 보수적인 근사 나타냅니다 볼륨 비율 적어도 2 표면적 주 셀의 x. 이것을 고려는 방사상 세포 산 성 플럭스 크게 전환 주 셀의 아래 그리고 사실 초기 세그먼트 주 세포 (그림 6D)의 접근을 보여준다.

Figure 4
그림 4: 성인 초파리 앞쪽 말 Tubules의 해 부.
A. 냉장된 슈나이더의 매체에 정밀한 집게의 2 쌍으로 앞쪽 산 제거의 도식 대표. "A. 관" 앞 산 "임 관" = = 후부 산 B. 검색 하 고 설치 프로세스 MTs 얇은 유리 막대를 사용 하 여 추출. C. 과정의 전체 길이 준수의 이미징 및 생리 적인 평가 대 한 슬라이드를 MTs를 추출. D.는 SEpH의 대표 widefield 이미지 (470/510 nm ex / em) 및 mCherry (556/630 ex nm / em) UAS-pHerry 구동 capaR GAL4 묘사에 의해 건강 한 앞쪽의 구성 요소 MTs, 앞쪽 MTs 부족 관류에 의해 손상 및 건강 한 앞쪽 MTs 분명 확대 맹인 초기 세그먼트, UAS-pHerry capaR-GAL4, 그리고 원심 주에 의해 구동 될 때의 상대적으로 증가 식이 죄이 고 전환 세그먼트 표시 잘못 식별된 후부 MTs. 참고 세그먼트입니다. 손상 없이 해당 SEpH 형광와 mCherry 형광의 MTs 디스플레이 눈에 띄는 집계. 후부 MTs는 형태학 상으로 다른 세그먼트가 직경 균일. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 유효성 검사 및 말 Tubules에 pHerry의 교정.
A.는 SEpH의 대표 widefield 이미지 (470/510 nm ex / em) 및 mCherry (556/630 ex nm / em) 구성 요소 UAS-pHerry capaR-GAL4 건강 앞쪽 MTs. "투자 수익"를 묘사에 의해 구동의 마크 관심 영역 신호. 같은 채널에 신호 투자 수익에서에서 뺀 이후에 관심의 "BG" 마크 배경 영역입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. B. PHerry 20 s 40 mM NH4Cl 펄스 응답에서의 SEpH 및 mCherry 신호에 상대 형광 변화. MCherry 신호는 안정 SEpH 신호 펄스 동안 특성 증가 표시 하는 동안 (자율 지표, 증가 pH) 유실 (산성화, 지표에 따라 날카로운 감소 감소 pH). C. pHerry (SEpH/mCherry)의 형광 비율 교정 iPBS (10 µ M nigericin, 130 m K m+, pH 7.4와 9.0) 부 화 30 분 후 추가 데이터와 b에서 데이터에서 계산. D. 절대 pHerry 비율에서 건설 하는 보정 곡선 (SEpH / mCherry)으로의 기능은 노출 보정 iPBS 8 pH 값 중 하나를 버퍼링 하는 동안 pH 를 부과. 회색 서클은 개별 값 형식 8 준비. 검은 사각형 및 바는 의미 ±SD. 커브는 볼츠만 적합 이다. E. D 에서처럼 동일한 데이터 정규화 등 그 형광 pH 7.0에서 비율은 1.0. 곡선 자형 곡선 (7.4, 방정식 1단계 참조)에 맞게 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 말 관 Epithelia 산 돌출의 정량화.
A. 앞쪽 산의 주 세포에서 (pHerry)에서 SEpH 형광의 Widefield 이미지 (왼쪽, capaR GAL4 드라이버에 의해 구동) 앞쪽 산의 방사상 세포 (오른쪽,에 의해 구동 c724 GAL4). Note 방사상 세포 초기 세그먼트, 가변 전환 세그먼트에에 바 모양 및 주요 부문에서 뚜렷한 세포 예측을 표시. 눈금 막대 = 100 µ m. B. PH변경 20 s 40 mM NH4Cl 펄스 전환 세그먼트, 초기 세그먼트의 주 세포 및 전환 세그먼트의 방사상 세포 (주 셀)에 표시 된 관심 영역에 대 한 응답에서을 조정. 파선된 곡선 Cl 철수 명시 붕괴 상수 (τ) 값은 파생 된 NH4다음 산 복구 단계에 적용 된 단일 지 수 맞는 나타냅니다. C. 산 압출 속도 (JH +) 지 수에서 파생 된 함수 pHi b에서 볼 맞는 플롯 8.3.1 JH + 계산 (식 3)에 대 한 단계를 참조 하십시오. 파선된 커브는 pH회색 상자에 의해 표시 된 겹치는 영역 내에서 각 데이터 플롯에 적용 하는 지 수 맞는. D. 산 유량 지 수에서 파생 된 함수 pHi B와 방정식 5본 맞는 플롯. 파선된 커브는 pH회색 상자에 의해 표시 된 겹치는 영역 내에서 각 데이터 플롯에 적용 하는 지 수 맞는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

iPBS NH4Cl 펄스 iPBS 교정 iPBS
NaCl 121.5 81.5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
포도 당 20 20 20
버퍼 HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES, 또는 도청; 8.6
NaHCO3 10.24 10.24 0
NaH24 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30.5
pH 6.8 6.8 다릅니다.
Osmolarity 350 ± 5 350 ± 5 350 ± 5

표 1: 실험적인 비행 솔루션입니다.
iPBS 솔루션은 실 온에서 준비 하 고 pH는 HCl과 NaOH로 적정 하 여 설정 됩니다. 교정 솔루션은 HCl와 NMDG 적정. 버퍼의 캘리브레이션 솔루션은 원하는 pH에 따라 다양 [2-(N-morpholino) pH에 대 한 ethanesulfonic 산 (MES) = 4.0-6.0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH = 6.5-7.5; N-[트리 (hydroxymethyl) 메 틸]-3-aminopropanesulfonic 산 (도청) pH = 8.0 9.0]. M m, pH (단위) 및 osmolality (mmol/kg)을 제외 하 고 모든 값입니다. DMSO에 주식 nigericin는 그냥 사용 하기 전에 10 µ M의 최종 농도에 교정 솔루션에 추가 됩니다.

GEpHI 흥분 (nm) 방출 (nm) pK 노트
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 큰 선형 범위, 큰 배 (50 x) 증가 pH에 민감한 형광 선형 범위에 걸쳐
Pt GFP42 390, 475 540 7.3 식물 세포에서 사용 하기 위해 확인
Superecliptic pHluorin-mCherry 퓨전31 488, 556 530, 620 7.2 일부 셀에 생산 하 고 짝이 없는 mCherry 집계
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6.8 pH 그리고 Cl- 센서입니다. 업데이트 ClopHensorN30 변종 신경 덜 집계에서는
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 ClopHensor에서 링커 함께 업데이트 SEpH mCherry 퓨전
mNectarine44 558 578 6.9 Photobleaching에 대 한 보정은 종종 필요
pHluorin245 395, 475 509 6.9 비율 기준 pHluorin12 의 변종
pHred47 440, 585 610 7.8 긴-Stokes shift mKeima49, FLIM NIR 2 광자 영상 호환 업데이트 변종
pHuji43 566 598 7.7 MApple;의 변종 일부 셀에 예상된 pH 감도 보다 낮은
pHtomato46 550 580 7.8 기공을 endocytosis, 가난한 cytocolic pH 감도 추적 확인
pHoran443 547 561 7.5 향상 된 pH에 민감한 오렌지 형광 단백질
SypHer 248 427, 504 525 8.1 비율의 밝은 변종 SypHer51, 원래 미토 콘 드리 아 측정에 대 한

표 2: 목록 게시 Cytosolic GEpHIs
여기 맥시 마, 방출 맥시 마, 그리고명백한 pK값은 대략적인 식 시스템, 이미징 기술, 및 교정 방법에 따라 다를 수 있습니다. FLIM 현미경 이미징 형광 일생을 =. NIR 적외선 근처 =.

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Discussion

Drosophila MTs에 pH 의 정량화의 성공을 전적으로 추출 된 MTs와 장착 및 해 부그림 A - ( C)의 품질의 상태에 따라 달라 집니다. 따라서, 조직으로의 주의 깊은 취급 설명은 필수적입니다. PLL에 갓 코팅 슬라이드 실질적으로 솔루션 이전 노출 슬라이드 원조 마운트 장착 그들 보다 훨씬 더 많은 접착제 경향이. 주의 설치 또한 뚜렷한 산 세그먼트 (그림 D)의 식별에 도움이 됩니다. 건강 한 MTs mCherry 집계 산 돌출의 훨씬 더 일관성 있는 정량화를 각각 저조한 여 pHerry 및 기능 평가의 캘리브레이션을 촉진 한다. 경우에 따라 mCherry 집계 피하 불가능 실험 조건 수 있습니다 본질적으로 MT epithelia 손상 또는 중요 한 오버 표현의 형광 기자를 생산 합니다. 이러한 경우에 의사 비율 교정 정규화는 pH 7.0에 해당 하는 형광 비 1.0 포인트 교정 정량화 (그림 E)을 허용 합니다. 유리와 플라스틱 준수 합니다 포인트 교정은 ionophore로 nigericin 관류 및 이미징 시스템의 영구적인 요소 노출 피하기 위해 수행 하는 경우 주의 해야 합니다. 심지어 의사 비율 교정 불가능 있는 실험적인 조작 실험, 동안 세포 손상을 유도 하는 상황에 대 한 이 손상 명백한 진보 하면 mCherry 형광 증가 전체 실험. 이러한 나중 경우 SEpH 형광 신호 정규화 된 교정 곡선과 함께 사용할 수 없습니다 하 고 포인트는 영상 더 이상 운동 유물과 초점 교대에 대 한 올바른 것입니다 경고와 교정.

GEpHIs 몇 가지 일반적인 제한 형광 염료의 pH 정량화에 비해 수행. 염료 고정 막 무결성과 세포 건강39, 표시기로 사용할 수 있습니다 하지만 아무 해당 분석 결과 GEpHIs 사용할 수 있습니다. 따라서, 준비 건강 세포 손상 예측 결과 혼동 하는 경우 독립적인 수단을 통해 메시지를 모니터링 해야 합니다. GEpHIs 잠재적으로 최소한 방해 vivo에서 준비에서 이미지를 허용 하지만 조직의 무결성 본질적으로 제한 하는 실험 조작 교정 불가능 한 포인트를 만들 수 있습니다. 또 다른 특정 한계 pHerry 및 다른 cytosolic 듀얼 fluorophore pH 지시자 (ClopHensor40) 등을 사용 하 여 고유의 파생 서로 pH모두 독립적으로 그들의 형광을 변경 하는 두 개의 fluorophores의 경향에서 나 . RFP 집계 아티팩트는이 제한의 가장 중요 한 발현 하지만 정량화도 하나 또는 둘 모두 fluorophores의 photobleaching에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서, 프로토콜 이미징 많은 photobleaching, 긴 노출 시간 및 수집 속도 이어질 수 있는 최소화 하기 위해 조정 될 < 0.2 Hz. 긴 노출 시간 급속 한 pH 보고 실패 합니다 이동. SEpH 형광 대부분 준비에 pH 6.8-7.8에서에서 pH 를 선형 상관 관계를 보여줍니다 하지만 이러한 측정의 정확도 nigericin/높은 K+ 기술의 정확도에 따라 달라 집니다. Nigericin/H K++ ionophore 역할 고 적절 한 보정 세포 외 [K+] 세포내 [+k] 평형 한다. 세포내 [+K]의 견적을 사용할 수 또는 모든 실험 시스템에 대 한 쉽게 얻을 수 없습니다. PH 부 량의 정확도 pH 상대적 변화의 속도 일치 될 있지만 세포내 [+K]의 견적으로 믿을 수 있을 것입니다. 세포내 [h+]이이 제한 및 pH 의 역 수 관계를 감안할 때, 그것은 항상 보고서 데이터 보다 pH, 변경의 산 압출 속도 (JH +, 그림 6 c), 또는 산 유량 (그림 6D) pH절대 변화 보다는. 분석 데이터의 산 유량 표면에 차이 대 한 교정의 혜택을 추가 했다 셀 형식 간의 볼륨 비율에 있습니다.

성인에서 통역 데이터가이 프로토콜에서 설명 하는 MT 준비 때 여러 주의 평가 해야 합니다. 초기, 과도, 및 주요 세그먼트의 형태학 상 구별은 아마 MTs2에 기능과 유전자에 해당 하는 도메인의 진정한 다양성의 단순화 이다. 또한,이 프로토콜은 basolateral 산 전송기의 기능을 탐지 하도록 설계 되었습니다 동안 꼭대기 전송 뿐만 아니라 pHi 측정을 좌우할 수 있다 가능 하다. ureters 솔루션 교환이 보장 MTs (단계 5.9)를 장착 하는 경우 주로 씰링 basolateral 표면에 발생 하지만 이온의 파라-휴대 및 꼭대기 움직임 여전히 영향을 미칠 수 pHi basolateral 전송 궁극적으로 변경으로 루멘/cytosolic 이온 기온 변화도의 세포질 측입니다. 꼭대기의 절대 분리 basolateral 함수는 독립적으로 luminal perfusing에 의해 달성 될 수 있다 및 그들이 필요로 micropipette cannulation41 MT 하지만 이러한 방법의 basolateral 표면 실질적으로 더 많은 기술적으로 요구 .

GEpHIs 측정 하는 pH, 기존의 방법에 비해 많은 장점을 제공 하며 이러한 강점을 결합 유전자가 단성 고 초파리 MT 준비의 저가 증폭 됩니다. PH 의 정량화는 역사적으로 (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 또는 이온 선택적인 전극20 통해 복잡 한 electrophysiological 평가 등 형광 염료에 의존 ,21. PHerry 유전자 인코딩, 그것은 표현 될 수 있습니다 특정 세포 인구에 있는 특정 발기인 (에서 같이 여기 주 세포 및 MT, 그림 6의 방사상 세포)과 순종 transgenesis, 대상이 어떤 조직에서 사용 하는 transfection, 또는 중재 바이러스 성 감염입니다. 염료는 개별 준비 및 다른 유형의 조직에 없는 세포 특이성을 전달 하는 잠재적으로 복잡 한 응용 프로그램 프로토콜의 비용에 의해 제한 됩니다. 이온 선택적인 전극 제조 및 측정을 위한 특수 장비를 요구, 반면 pHerry 유일한 widefield epifluorescent 현미경 검사 법으로 기존의 GFP와 RFP 필터 세트. 염료 및 전극의 사용 해야 관심의 조직에 광 액세스 뿐만 아니라 물리적 동안 갓 추출 된 조직에서 그리고 vivo에서시간에 GEpHIs를 모니터링할 수 있습니다. 라이브 영상 그대로 준비에 대 한 기회 때 특정 관심의 pH 생 버퍼링 존재의 정량화를 허용 세포질 생리학의 pH 다른 기술 평가 메커니즘입니다.

초파리 의 성인 MT 준비 세포질 pH 조절 및 이온 수송에 관심이 많은 매력적인 기능을 제공합니다. 초파리 축산은 저렴 하 고 바이오 센서 유전자 인코딩 구문 등 RNAi 식 삽입 도구 재고 센터 (블루밍턴의 초파리 재고 센터 인디애나 대학;에서 다양 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 비엔나 초파리 연구 센터)입니다. 초파리 MTs는 transepithelial 이온 수송의 조사에 대 한 이상적 편광 된 상피 세포의 층으로 구성 됩니다. Basolateral 전송 수 수 쉽게 분석 (같이 여기) 꼭대기의 전체 평가 하지만 그리고 basolateral 이온 운동 micropipette cannulation41로 가능 하다. 램지 분 비 분석 결과17 luminal 칼슘 oxalate 증 착18 잘 특징 및 액체 분 비의 모델에 상피 세포 생리학의 상관 관계를 허용과 같은 장기의 기능 또한, 분석 실험 및 nephrolithiasis, 각각. 이러한 기능은 강력한 분석에 대 한 기회를 제공 하는 동안 epifluorescent 현미경 검사 법의 저가 및 넓은 가용성은 초파리 MT 모델 이상적 셀룰러 및 전체 기관 생리학의 논증 가르치는 실험실.

이러한 방법의 basolateral H+ 유출 성인 초파리 MTs를 액세스할 수 있는 아직 강력한 모델 transepithelial 이온의 수송에 의해 pH규제의 정량화를 허용 합니다. 사용 GEpHIs의 pHerry 다른 무척 추 동물 세포 유형에 pH 규칙을 평가 하기 위해 쉽게 적응 시킬 수 있다와 같은 교양 포유류 세포, 그리고 vivo에서 준비 새로운 GEpHIs의 개발 가능성이 따를 유전자 인코딩 칼슘 지표의 가시 스펙트럼 및 집계 유물30,42, 등 현재 제한 해결 새로운 세대와 함께 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs 이미 사용 되었습니다 광범위 하 게 보고 미토 콘 드 리아 매트릭스 pH50,51, 및 subcellular 타겟팅 전략 바인딩과 그물52, 핵 바이오 센서를 지역화 하기 위해 존재 53, 시 냅 스 소포12,43, 세포질5455 세포 원형질 막 외부 표면 (게시 된 시 약의 목록은 표 2 참조). 같은 도구를 사용할 수 그들은 허용할 것 이다 다른 측면 Ca2 + 처리 등 세포내 신호 전달, 세포 생리학, 및 전체 기관 기능 하위 휴대 전화 규제의 수직 통합 다양 한 등뼈 동물에서 그리고 무척 추 동물 준비입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH DK092408에 의해 지원 되었다 그리고 MFR. AJR에 DK100227 T32-DK007013에 의해 지원 되었다. 저자 CapaR GAL4와 c724 GAL4 박사 줄리안 A.T. 다우 감사 하고자 초파리 주식. 우리는 또한 실험적인 비행 십자가 유지 하는 지원에 대 한 야 곱 B. 앤더슨을 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

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