न्यूरोटॉक्सिसीटी परीक्षण के लिए न्यूरॉन्स की मिश्रित संस्कृतियों और ग्लिया में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल

Developmental Biology
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Summary

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) दवा और रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण और विषाक्तता परीक्षण के लिए इन विट्रो मॉडल में नए विकास के लिए माना जाता है, जिसमें न्यूरोटॉक्सिकता शामिल है। यहां, एनएचओएससीएस के न्यूरॉन्स और ग्लिया में भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

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Pistollato, F., Canovas-Jorda, D., Zagoura, D., Price, A. Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing. J. Vis. Exp. (124), e55702, doi:10.3791/55702 (2017).

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Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं जो मानव- इन विट्रो विषाक्तता assays में लागू किया जा सकता है। एक प्रमुख फायदा यह है कि मानव प्रेरित प्लूिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) का निर्माण करने के लिए दैहिक कोशिकाओं के पुनर्रोग्रैग्रामिंग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के उपयोग से संबंधित नैतिक और विधायी मुद्दों से बचा जाता है। हाईपीएससी को विस्तारित और कुशलता से विभिन्न प्रकार के न्यूरॉनल और ग्लिअल कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है, जो विषाक्तता परीक्षण के लिए टेस्ट सिस्टम के रूप में सेवा कर रहे हैं और, विशेष रूप से, न्यूरोटॉक्सिकिटी में शामिल विभिन्न मार्गों के मूल्यांकन के लिए। इस काम में एचईपीएससी के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है जो न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के मिश्रित संस्कृतियों में है। न्यूरोनल भेदभाव से विनियमित और / या सक्रिय किए जाने वाले सिग्नलिंग मार्गों को परिभाषित किया जाता है। यह जानकारी नई विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान के लिए सेल मॉडल के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें रसायनों का आकलन उनकी क्षमता के आधार पर किया जाता है।जंगली जैविक मार्ग अवधारणा का एक प्रमाण के रूप में, रोटोनोन, मिटोकॉन्ड्रियल श्वसन जटिल का अवरोध करने वाला, का उपयोग एनआरएफ 2 सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण का आकलन करने के लिए किया गया था, एंटीऑक्सिडेंट-प्रतिक्रिया-तत्व- (एआरई) -ड्रवियन सेलुलर डिफेंस तंत्र के ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रमुख नियामक ।

Introduction

अमेरिकी नेशनल रिसर्च काउंसिल की रिपोर्ट 1 ने एक नई विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान की कल्पना की, जिसमें विनियामक विषाक्तता परीक्षण पशु कोशिकाओं में मानव कोशिकाओं का उपयोग करते हुए इन विट्रो एशेज में यंत्रवत् पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक दृष्टिकोण के अनुसार दिखाई जाने वाले फेनोटाइपिक परिवर्तनों पर निर्भर एक दृष्टिकोण से स्थानांतरित किया जाएगा। प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) डेरिवेटिव कैंसर सेल मॉडल के विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, क्योंकि प्राप्त कोशिकाएं मानवीय ऊतकों की शारीरिक स्थितियों के समान निकटता से और रासायनिक प्रेरित प्रतिकूल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अधिक प्रासंगिक उपकरण प्रदान कर सकती हैं। पीएससी संस्कृतियों के दो प्रमुख प्रकार जो कि विषाक्तता परीक्षण के लिए सबसे अधिक आशाजनक हैं मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाएं (एचईएससी) और इंसान से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) हैं, जो वर्तमान में बुनियादी शोध और पुनर्योजी दवाओं 2 , 3 के क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस विशेषज्ञता को अब एक नए वर्ग के toxicolo के विकास के लिए उपयोग किया जा सकता हैजीआईएल इन विट्रो परीक्षणों के उद्देश्य से विवो में प्रतिकूल प्रभाव के विकास के साथ जुड़े परेशान शारीरिक रास्ते की पहचान करने के उद्देश्य से। हालांकि, एचईएससी के आधार पर नियामक सुरक्षा आकलन के लिए परीक्षण विधियां संभावित ईसाई सदस्य राज्यों और दुनिया भर में संभावित नैतिक चिंताओं और भ्रूण-व्युत्पन्न कोशिकाओं के उपयोग को विनियमित करने वाली विविध राष्ट्रीय विधायी नीतियों के कारण स्वीकार करने की संभावना नहीं होगी।

एचईपीएससी 4 , 5 के समान ही एचपीसीसीएस विशेषताओं को साझा करते हैं और इन्हेट्रो मैट्रिक्स के लिए महान क्षमता रखते हैं, दोनों के लिए चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान करने के साथ-साथ सुरक्षा मूल्यांकन के लिए भी। इसके अलावा, हायपीएससी टेक्नोलॉजी सीमित दाता पूल की बाधाओं और भ्रूण-व्युत्पन्न कोशिकाओं से जुड़े नैतिक चिंताओं को कम करता है। हायपीएससी के लिए एक बड़ी चुनौती प्रदर्शन है कि ये कोशिका विषाक्तता से प्रासंगिक सेल डेरिवेटिव की एक महत्वपूर्ण श्रेणी उत्पन्न कर सकती हैं,मानवीय ऊतकों की विशिष्टताओं और प्रतिक्रियाओं के साथ चयनित मार्करों के पूर्वनिर्धारित स्तर आमतौर पर भेदभाव की प्रक्रिया के बाद सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए और भेदभाव प्रक्रिया की स्थिरता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है।

पिछला कार्यों ने न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के मिश्रित संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए और एनटीएफ 2 मार्ग के सक्रियण पर मिटोकॉन्ड्रियल श्वसन परिसर के एक अवरोध करनेवाला, एंटि ऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के एक प्रमुख नियामक के प्रभावों का आकलन करने के लिए hiPSCs की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया है। कई सेल प्रकार 6 , 7

यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एचईपीएससी के मिश्रित न्यूरॉनल और ग्लियाल संस्कृतियों में भेदभाव के लिए उपयोग किया जाता है, जो न्यूरोनल / ग्लिलियल भेदभाव पर सक्रिय होते हैं, सिग्नलिंग पथ (जीन और प्रोटीन स्तर) पर विवरण प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह दर्शाता है कि यह कैसे दिखाता है कि यह प्रदर्शन दर्शाता हैहायपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरोनल और ग्लियाल सेल मॉडल का उपयोग एनआरएफ 2 सिग्नलिंग एक्टिवेशन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है जो तीव्र (24-एच) रोटोनोन से प्रेरित होता है, जिससे ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरण के आकलन की अनुमति मिलती है।

पीएमआईआईआई वैक्टर 6 का इस्तेमाल करते हुए 2 प्रतिलेखन कारकों (अक्टूबर 4 और सॉक्स 2) के वायरल ट्रांसडकेशन द्वारा आई-एम -9 9 एफआईबीआरबीएलस्ट्स को आई-स्टेम (फ़्रांस) में hiPSCs में पुनर्मुद्रित किया गया था। एनालॉगस हायपीएससी मॉडल भी लागू किया जा सकता है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल, एचईपीएससी के तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) में भिन्नता के सभी चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं और आगे में मेटाटिक्स न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं (चरण 1 और 2 के मिश्रित संस्कृतियों में भी) के विस्तृत विवरण के लिए ईआरआरसी ईसीवीएएम डीबीलम वेबसाइट देखें प्रोटोकॉल) 8

अलगाव, विस्तार, क्रियोपेशेशेशन और एनएससी के मिश्रित न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं में आगे भेद करने के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल का विवरण चरण 3 और 4 में बताया गया है (यह भी ईआरआरसी ईसीवीएएम डीबीलम को देखेंइस प्रोटोकॉल के विस्तृत विवरण के लिए bsite) 9 चरण 5 उन विश्लेषणों का वर्णन करता है जो प्रतिबद्धता और भेदभाव के कई चरणों के दौरान कोशिकाओं के फेनोटाइपिक पहचान का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

1. मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल (HIPSC) विस्तार

नोट: एमईटीएसआर 1 5x सप्लीमेंट युक्त एमटीएसआर 1 माध्यम की उपस्थिति में एक उचित प्रोटीन मिश्रण सब्सट्रेट पर उच्च पीएससी को सुसंस्कृत किया जा सकता है (निर्माता के निर्देशों के बाद तैयार किया गया है, प्लेट ~ 100 कॉलोनी टुकड़े / 60 मिमी पेट्री डिश)। जब हायपीएससी कॉलोनियों एक उपयुक्त आकार ( चित्रा 2 ए में एक कॉलोनी का एक उदाहरण देखें) तक पहुंचते हैं, तो नीचे बताए गए कक्षों (एक बार एक हफ्ते) के अनुसार रसीदें।

  1. एचईएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (जिसे "योग्य मैट्रिक्स" कहा जाता है) या किसी भी अन्य उपयुक्त प्रोटीन सब्सट्रेट के साथ कोट व्यंजन।
    1. ठंडे 1.5 एमएल ट्यूब और ठंडा 5 या 10 एमएल पिपेट में 200-μL अल्कोहट में योग्य-मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका देखें) -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. पारगमन से पहले, बर्फ पर 200 μL योग्य मैट्रिक्स का पिघलना।
    3. 20 मी में योग्य मैट्रिक्स के 200 μL पतलाडीएमईएम / एफ 12 मध्यम (1: 100 कमजोर पड़ने) का एल
    4. इस समाधान (5 एमएल / डिश) के साथ कोट 60 मिमी पेट्री डिश।
    5. कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित व्यंजन सेते हैं।
  2. हायपीएससी कॉलोनी टुकड़ा cryopreservation और विगलन
    1. हायपीएससी कॉलोनियों को काटने के बाद (हायपीएससी कॉलोनी काटने की प्रक्रिया के लिए चरण 1.3 देखें), धीरे-धीरे और धीरे-धीरे स्टेम सेल फ्रीजिंग माध्यम में hiPSC कॉलोनी के टुकड़े, ~ 100 टुकड़े / 250 μL (सामग्री की तालिका देखें) को फिर से फिर से खोलें।
    2. Cryopreservation (250 μL / शीशी) के लिए उपयुक्त शीशियों में कॉलोनी के टुकड़े को विभाजित करना।
    3. 2-प्रोपेनॉल से भरा कंटेनर में शीशियों को रखें और न्यूनतम-2 घंटे तक 2 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनर रखें।
    4. एक तरल नाइट्रोजन टैंक के भाप चरण में शीशियों को स्थानांतरित करें।
    5. संस्कृति को पुन: प्रारंभ करने के लिए, 1 डिग्री सेल्सियस पर जल स्नान में 1 जमे हुए शीशी पिघलना
    6. धीरे-धीरे 7 मिलीलीटर पूर्व-गर्म पूरे एचपीएससी में हायपीएससी कॉलोनी के टुकड़े एकत्र करेंएक 15 एमएल ट्यूब में एक 1, 2, या 5 एमएल विंदुक का उपयोग करते हुए माध्यम (सामग्री की तालिका देखें)।
    7. 3 मिनट के लिए 130 xg पर हायपीएससी कॉलोनी टुकड़े अपकेंद्रित्र
    8. सतह पर तैरनेवाला को निकालें और 1, 2 या 5 एमएल विंदुक के उपयोग से 1 hi हिमाचल प्रदेश के हायपीएससी माध्यम में हायपीएससी कॉलोनी टुकड़े को फिर से खोलें।
    9. आगे पूरे हाईपीएससी माध्यम के 3 या 4 एमएल में सेल निलंबन पतला।
    10. एक योग्य मैट्रिक्स-लेपित 60-एमएम पेट्री डिश (~ 100 टुकड़े / डिश; कोट के रूप में वर्णन किया गया व्यंजन, चरण 1.1 में वर्णित है) में हायपीएससी कॉलोनी टुकड़े प्लेटें
    11. एचपीएससी 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में सेते हैं।
    12. हर दिन कुल मध्यम परिवर्तन करें
  3. हायपीएससी कॉलोनियों का पासिंग
    नोट: अपरिवर्तित HIPSCs आकार में गोल होना चाहिए, बड़े एनक्लियोली के साथ और प्रचुर मात्रा में कोशिकाग्राम के बिना। बिना पृथक्कृत कालोनियों को एक सपाट और कसकर पैक वाले आकारिकी द्वारा विशेषता होना चाहिए। केवल असाधारण कॉलोनियों (लगभग 1 मिमी iN व्यास) को आगे की तरंग के लिए कट जाना चाहिए।
    1. एक 30 एम सुई या किसी अन्य वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध उपकरण (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 1-एमएल सिरिंज का उपयोग करके लगभग 200 माइक्रोन एक्स 200 माइक्रोन के वर्गों में स्टेम सेल कॉलोनियों को काटें। कमरे के तापमान पर एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में 4x बढ़ाई पर एक त्रिविम माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
    2. टुकड़ों को उठाने के लिए मध्यम नीचे pipetting द्वारा 200-μL विंदुक का उपयोग डिश सतह से कॉलोनी टुकड़े अलग।
    3. कॉलोनी टुकड़े (~ 100 टुकड़े) को एक योग्य मैट्रिक्स-डीएमईएम / एफ 12-लेपित प्लेट में स्थानांतरित करें, जिसमें 4 एमएल का पूर्ण हायपीएससी माध्यम है (सामग्री की तालिका देखें;
    4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में नई प्लेट सेते हैं।
    5. प्रत्येक दिन कुल मध्यम परिवर्तन करें और 4x और 10x आवर्धन पर एक चरण-विरोधाभासकोस्कोप का उपयोग करके कालोनियों के आकारिकी का निरीक्षण करें।

2. हाईपीएससी अंतरमिश्रित न्यूरॉन्स और ग्लिया में अभिव्यक्ति

नोट: चित्रा 1 (ऊपरी भाग) में उल्लिखित मुख्य चरणों के साथ प्रक्रिया को पूरा करने में लगभग 28 दिन लगते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: न्यूरॉनल भेदभाव प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ऊपरी भाग) IMR90-hiPSC कॉलोनियों को भ्रूण निकायों (ईबी) बनाने के लिए टुकड़ों में काटा जा सकता है। इन विट्रो (डीआईवी) में 2 दिनों के बाद, ईबी को लैनिनिन- या मानक मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन पर चढ़ाया जा सकता है और न्यूरोएक्टेथेरल इन्डक्शन (एनआरआई) माध्यम की न्यूरोएक्टेडर्माल डेरिवेटिव (रोसेट्स, जो नेस्टिन (हरा) और β -III- ट्यूबिलिन (लाल)) रोजेट्स को अलग किया जा सकता है, इकट्ठा किया जाता है, लेमेनिन- या मानक मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन पर दोहराया जाता है, और आगे परिपक्व न्यूरोनल (एनएफ 200, लाल) और ग्लियाल में विभेदित किया जा सकता है।(जीएफएपी, हरे) न्यूरॉनल भेदभाव (एनडी) माध्यम की उपस्थिति में कोशिकाओं (लोअर भाग) रॉसेट-व्युत्पन्न एनएससी (नेस्टिन, लाल) को तंत्रिका प्रेरण (एनआई) माध्यम की उपस्थिति में विस्तारित किया जा सकता है, क्रियोप्रेसेब, या आगे एनडी माध्यम की उपस्थिति में विभेदित किया जाता है जिसमें मिश्रित न्यूरॉनल (एनएफ 200, ग्रीन) और ग्लियाल ( जीएफएपी, लाल) संस्कृतियों इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

  1. भ्रूण निकायों का निर्माण (ईबी) (दिन 0 → 1)
    नोट: इस प्रक्रिया में अच्छे मैन्युअल कौशल और परिशुद्धता की आवश्यकता है। अगले चरणों में समरूप भ्रूण निकायों (ईबी) प्राप्त करने के लिए हाईपीएससी कॉलोनी टुकड़े बराबर आकार का होना चाहिए। आंशिक रूप से विभेदित कालोनियों (बड़े cytoplasmic अंश और छोटे nucleoli के साथ) को त्याग दिया जाना चाहिए।
    1. अतिसंवेदनशील hiPSC कालोनियों को काटने से पहले hiPSC माध्यम (3 एमएल / 60 मिमी पेट्री डिश) को रीफ़्रेश करें (लगभग 1 मिमीतब, चित्रा 2 ए देखें) बाँझ शर्तों के तहत (जैसा चरण 1 में वर्णित है)।
    2. लगभग 30 ग्राम सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का इस्तेमाल करते हुए लगभग 200 माइक्रोन x 200 माइक्रोन के टुकड़ों में undifferentiated colonies ( चित्रा 2 ए और चित्रा 2 बी में दिखाए अनुसार) को काटें। कमरे के तापमान पर एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में 4x बढ़ाई पर एक त्रिविम माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
    3. टुकड़ों को उठाने के लिए धीरे-धीरे मध्यम नीचे pipetting द्वारा 200-μL विंदुक का उपयोग डिश सतह से कॉलोनी टुकड़े अलग।
    4. एक 1, 2, या 5 एमएल विंदुक का उपयोग करके सभी अलग-अलग टुकड़े और मध्यम 15-एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें।
    5. सभी टुकड़ों को पुनर्प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से हायपीएससी माध्यम के 2 एमएल के साथ पकवान कुल्ला।
    6. 1 मिनट के लिए 112 xg पर अपकेंद्रित्र
    7. सतह पर तैरनेवाला महाप्राणित होने और धीरे-धीरे पूरे एचपीसीई ईबी माध्यमिक (सामग्री की तालिका देखें) के 5 एमएल में टुकड़े को फिर से खोलें
    8. प्लेट सहएक 60 मिमी अल्ट्रा-कम अटैचमेंट पेट्री डिश (5 एमएल / 60 मिमी पेट्री डिश) में लोनी टुकड़े।
    9. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर पेट्री डिश सेते हैं।
    10. अगले दिन (दिन 1), एक 1, 2, या 5 एमएल विंदुक का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में ईबी और उसके माध्यम को इकट्ठा करें।
    11. 1 मिनट के लिए 112 xg पर ईबीएस अपकेंद्रित्र
    12. सतह पर तैरने वाले को ध्यानपूर्वक परामर्श लें और धीरे-धीरे 1, 2, या 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके पूरे एचपीसीई ईबी माध्यम के 5 एमएल में ईबी का पुन: resuspend करें।
    13. EBs को एक नए 60-एमएम अल्ट्रा-कम अटैचमेंट पेट्री डिश (5 एमएल / 60 मिमी पेट्री डिश) पर दोहराएं।
    14. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर पेट्री डिश सेते हैं।
  2. 1 दिन, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( उदाहरण के लिए, "मानक मैट्रिक्स" के रूप में बाद में उल्लिखित), या किसी अन्य उपयुक्त प्रोटीन सब्सट्रेट ( उदाहरण के लिए , लैमिनिन) के साथ व्यंजन को कोट करें।
    1. मानक- मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका देखें) -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें200-μL अल्कोट्स को ठंडे 1.5 एमएल ट्यूबों और ठंडा 5 या 10 एमएल पिपेट्स का उपयोग कर।
    2. बर्फ पर मानक मैट्रिक्स के 200 μL पिघलना।
    3. डीएमईएम / एफ 12 मध्यम (1: 100 कमजोर पड़ने) की 20 एमएल में मानक मैट्रिक्स के 200 μL को पतला।
    4. इस समाधान (5 एमएल / डिश) के साथ कोट 60 मिमी पेट्री डिश।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर लेपित व्यंजन सेते हैं।
      नोट: इन व्यंजनों का प्रयोग ईबीएस (लगभग 50 ईबी / डिश) को प्लेट में करने के लिए किया जाएगा और न्यूरोएपिटेलियल समुच्चय (रोसेट्स) उत्पन्न होंगे; चरण 2.3 देखें
  3. न्यूरोइपरिथेलियल समुच्चय (रोसेट्स) का निर्माण (2 दिन → 7)
    1. 2 दिन, मानक मैट्रिक्स कोटिंग समाधान को 60 मिमी पेट्री डिश से हटा दें (प्लेटों को कुल्ला करने की कोई ज़रूरत नहीं) और उन्हें 5 एमएल / पूर्ण न्यूरोइपीटीयलियल प्रेरण माध्यम (एनआरआई) के डिश के साथ भरें; सामग्री की तालिका देखें
    2. अस्थायी ईबीएस (चरण 2.1.14 से) को लेपित व्यंजन (~ 50 ईबी / डिश) में ट्रांसफरोस्कोपी मील के तहत 200 μL विंदुक4x बढ़ाई पर क्रॉसपॉप और लामिना का प्रवाह कैबिनेट में रखा गया।
      नोट: समरूप, मध्यम आकार के ईबीएस (व्यास में ~ 200-300 माइक्रोन) का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। बहुत-छोटे ईबीएस न्यूरोकेडर्मल भेदभाव के दौरान अच्छी तरह से जीवित नहीं रह सकते, जबकि बहुत बड़ी ईबीएस कोर नेक्रोसिस से गुज़रते हैं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में व्यंजन सेते हैं।
    4. दिन (3 दिन) के बाद, 10x बढ़ाई पर सूक्ष्मदर्शी के तहत व्यंजनों की जांच सुनिश्चित करें कि ईबी सभी संबंधित हैं।
    5. पूरी एनआरआई माध्यम से धीरे-धीरे कुल मध्यम परिवर्तन करें
    6. हर दूसरे दिन एनआरआई माध्यम को 7 दिन तक बदल दें, जब न्यूरोइपरिथेलियल समुच्चय (रोसेट्स) दिखाई देनी चाहिए।
    7. किसी भी आवश्यक प्लेट या डिश प्रारूप पर, दिन 7 में, कोट मानक मैट्रिक्स (या लामीनिन), जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है, 96-अच्छी प्लेट (100 μL / अच्छी तरह), 24-अच्छी प्लेट (250 μL / अच्छी तरह), 12- अच्छी प्लेट (500 μL / अच्छी तरह से), विदेश मंत्रालय की चिप्स (विद्युत गतिविधि के लिए, 1 एमएल / एकल-अच्छी चिप) या 60 मिमी पेट्री डिशएस (4 एमएल / डिश)
    8. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कम से कम 2 घंटे के लिए लेपित प्लेट्स / व्यंजन सेते हैं।
  4. रोसेट पृथक्करण और न्यूरोनल भेदभाव (दिन 8 → 28)
    नोट: इस प्रक्रिया में अच्छे मैन्युअल कौशल और परिशुद्धता की आवश्यकता है। मेसोडर्मल और एंडोडार्मल कोशिकाओं को एकत्रित करने से बचने के लिए, केवल एक्टोडर्म रोसेट जैसे संरचना अलग-अलग और एकत्र किए जाने चाहिए।
    1. 8 दिन, बाँझ परिस्थितियों में 10X बढ़ाई पर त्रिस्टोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत रस्सी जैसी संरचनाओं को टुकड़ों में काट दिया। 30 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। ध्यान दें कि सुई के साथ छूते हुए रस्सियों को आसानी से डिश से अलग करना पड़ता है।
    2. एक 200-μL विंदुक का उपयोग कर रोसेट टुकड़े की टुकड़ी को पूरा करें।
    3. लामिना का प्रवाह हुड के तहत डिश स्थानांतरण और एक 1, 2, या 5 एमएल विंदुक का उपयोग कर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में गुलाबी टुकड़े और उनके माध्यम को इकट्ठा। पकवान को 2 एमएल के एनआरआई माध्यम से पुनर्प्राप्त करेंसभी टुकड़े
    4. 2 मिनट के लिए 112 xg पर रोसेट टुकड़े नीचे स्पिन करें
    5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate
    6. धीरे से 1 एमबीएल 1x डीपीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) में गोली को फिर से फिर से खोलें और धीरे-धीरे उन हिस्सों को आंशिक रूप से विभाजित करने के लिए 1000-μL विंदुक का इस्तेमाल करके और नीचे पतले टुकड़े को पिपेट दें।
    7. पूरी एनआरआई माध्यम के 4 एमएल जोड़ें और ट्रिपन ब्लू और एक स्वचालित सेल काउंटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: 20 μL ट्रिपन ब्लू में 20 μL सेल निलंबन को पतला। यह कदम छोड़ा जा सकता है यदि कोशिकाओं को एकल-कक्ष निलंबन में नहीं लाया जा सकता है। यदि दांतेदार टुकड़े पूरी तरह से अलग नहीं होते हैं, तो लगभग 50 ईबी / 60 मिमी के डिब्बे से निकलने वाली रस्सीट टुकड़े को पूरे एनआरआई माध्यम के 50 एमएल में रीसशुप किया जा सकता है और तालिका 1 में बताए अनुसार।
    8. पेट्री डिश, प्लेट्स और / या एमईए चिप्स से मानक मैट्रिक्स (या लेमिनेन) कोटिंग समाधान का संकल्प लें (चरण 2.3 से।7)। उन्हें सूखा न दें
    9. अध्ययन योजना के अनुसार पूर्ण एनआरआई माध्यमों में कोशिकाओं को प्लेट (लगभग 15,000 कोशिका / सेमी 2 ; चढ़ाना मात्रा संकेतों के लिए तालिका 1 देखें)
    10. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रातोंरात सेते हैं।
    11. 10 दिन, पूरा न्यूरॉनल भेदभाव माध्यम (एनडी) का उपयोग करके कुल मध्यम परिवर्तन करें; सामग्री की तालिका देखें
    12. पूरे एनडी माध्यम को सप्ताह में दो बार 28 दिन तक रीफ़्रेश करें।
    13. चरण 5 में वर्णित अनुसार, न्यूरॉनल / ग्लियाल सेल डेरिवेटिव्स को दिखाएं (सामान्य स्वीकृति मानदंड के लिए तालिका 2 देखें)

3. मिश्रित न्यूरॉन्स और ग्लिया में हाईपीएससी-व्युत्पन्न तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) विस्तार और भेदभाव

नोट: नीचे दिए गए प्रक्रिया ( चित्रा 1 , निचले भाग) के अनुसार पेटी टुकड़ों से प्राप्त एनएससी का विस्तार और रखरखाव किया जा सकता है। यह वें बढ़ाने के लिए अनुमति देता हैई भेदभाव और रासायनिक परीक्षण के लिए कोशिकाओं की संख्या।

  1. मानक मैट्रिक्स डीएमईएम / एफ 12 कोटिंग समाधान के 5 एमएल के साथ एक 60 मिमी पेट्री डिश (या टी -25 फ्लास्क) को कोट और कम से कम 2 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है) के लिए सेते हैं।
  2. 2 मिमी के लिए 112 x ग्राम पर शंक्वाकार 15 एमएल ट्यूब में चरण 1-2 से प्राप्त रस्सीट टुकड़े को स्पिन करें (चरण 2.4 देखें।)
  3. तंत्रिका प्रेरण माध्यम (एनआई) के 5 एमएल में गोली को धीरे से फिर से खोलें; सामग्री की तालिका देखें
  4. एक मानक मैट्रिक्स-लेपित 60 मिमी पेट्री डिश (या टी -25 फ्लास्क) पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  5. एनआई माध्यमिक की उपस्थिति में संस्कृति रोसेट-व्युत्पन्न एनएससी, हर दूसरे दिन मध्यम ताज़ा करते हैं जब तक कोशिकाओं को संगम तक नहीं पहुंच जाता।
  6. जब मिला हुआ है, एनएससी को निम्नलिखित चरणों में वर्णित किया गया है।
    नोट: एनएससी के बारे में एक सप्ताह में एक बार पैसेंग; अध्ययन योजना के आधार पर ताजा लेपित व्यंजन, बोतल या प्लेटों का उपयोग करने पर विचार करें।
  7. पूर्ण एनआई मध्यम और सौम्य निकालेंवाई एनबीसी के साथ एनबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) कुल्ला।
  8. 60 एमएम पेट्री डिश (या टी -25 फ्लास्क) को कोशिकाओं से युक्त 0.05% 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के प्री-वार्मिंग के लिए 1.5 एमएल जोड़ें और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  9. कोशिकाओं को अलग करने के लिए डिश (या फ्लास्क) को धीरे से टैप करें
  10. ट्रिप्सिन अवरोधक के 1.5 एमएल को 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गर्म और 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  11. पेटी डिश (या टी -25 फ्लास्क) को एनआई मध्यम (1.5 एमएल) के समान मात्रा के साथ कुल्ला और उसी 15 एमएल ट्यूब में मात्रा एकत्र करें।
  12. 3 मिनट के लिए 130 xg पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र
  13. सतह पर तैरनेवाला हटा दें और धीरे-धीरे 1 एनएल माध्यमिक के 1 एमएल में 1,000-μL पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से खोलें।
  14. इसके अलावा पूरे एनआई माध्यमिक के 3 या 4 एमएल में सेल निलंबन को पतला और trypan नीला और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  15. प्लेट एनएससी को 60 मिमी पेट्री डिश (या टी -25 फ्लास्क) पर चरण 3.1 से लगभग 50,000 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर।
  16. चरण 5 में वर्णित अनुसार, न्यूरॉनल / ग्लियाल सेल डेरिवेटिव की उपस्थिति के लिए कोशिकाओं को दिखाएं।
    नोट: एनएससी को पूर्ण एनडी माध्यम (जैसा चरण 2.4.11-2.4.13 में वर्णित है) में न्यूरॉन्स और ग्लिया के मिश्रित संस्कृतियों में विभेदित किया जा सकता है, 21 दिनों के लिए पूर्ण एनडी माध्यमिक सप्ताह में दो बार ताज़ा किया जा सकता है।

4. हायपीएससी-व्युत्पन्न एनएससी क्रियोपेशेशेशन एंड थॉइंग

नोट: पारगमन पर, एनएससी को इस प्रक्रिया के बाद जमे हुए और फिर से जलाया जा सकता है।

  1. अपकेंद्रित्र एनएससी (चरण 3.12 से) 130 मिनट में 3 मिनट के लिए पारित
    नोट: कोशिकाओं को चरण 3.14 पर गिना जाना चाहिए।
  2. नरम और धीरे-धीरे एनएससी को 3 x 10 6 / एमएल फ्रीज़िंग माध्यम पर देखें (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. Cryopreservation (लगभग 0.5 एमएल = 1.5 x 10 6 / शीशी) के लिए उपयुक्त शीशियों में कोशिकाओं को विभाजित करना।
  4. कंटेनर फाई में शीशियों को रखें2-प्रोपेनॉल से भरा हुआ है और कम से कम 2 घंटे और 2 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनर रखें।
  5. एक तरल नाइट्रोजन टैंक के वाष्प चरण में शीशियों को स्थानांतरित करें।
  6. सेल संस्कृति को पुनः आरंभ करने के लिए, 1 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 1 जमे हुए शीशी पिघलना
  7. 1,000 एमएल विंदुक का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में धीरे-धीरे 7 एमएल पूर्व गर्म एनआई मध्यम के कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  8. 3 मिनट के लिए 130 xg पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र
  9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे-धीरे 1000 एमएल पिपेट का उपयोग करके पूर्ण एनआई माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खोलें।
  10. आगे पूरे एनआई माध्यमिक के 3 या 4 एमएल में सेल निलंबन को पतला करें और ट्रिपैन नीले और एक स्वचालित सेल काउंटर (नोट: कोशिका निलंबन के 20 μL में ट्रिपैन नीले रंग में पतला 20 μL का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें; विघटन के बाद व्यवहार्यता होना चाहिए 80 %)।
  11. प्लेट एनएससी को लगभग 60,000 मिलीमीटर पेट्री डिश (या टी 25 फ्लास्क) में लगभग 50,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर।

5. चाराहायपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉनल और ग्लियाल सेल का मकस्तिष्क

नोट: भेदभाव पर, न्यूरॉनल और ग्लिलियल डेरिवेटिव को विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे निम्न अनुभागों में वर्णित हैं।

  1. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) 10 का विश्लेषण करता है
    1. 3 मिनट के लिए 130 xg पर hiPSC कॉलोनी टुकड़े, ईबीएस, और / या एनएससी स्पिन करें
    2. आरएनए निकासी के लिए एक उपयुक्त किट में प्रदान की गई 100 μL ठंड आरएनए लिसन बफर में सेल गोली को फिर से खोलें।
    3. वैकल्पिक रूप से, प्लेटों से सीधे माध्यमों की महत्वाकांक्षा करके और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कुओं को ठंड आरएनए लिसन बफर जोड़ने से न्यूरॉनल / स्काईली डेरिवेटिव एकत्रित करें।
    4. निर्माता के निर्देश के बाद आरएनए को अलग करें
    5. आरडीए के लिए एक उपयुक्त किट का उपयोग करके सीएनएनए आरट्राट्रांस्क्रिप्शन के 500 एनजी रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करें।
    6. उचित मास्टर मिक्स और प्राइमर का उपयोग करके डुप्लिकेट में qPCR प्रतिक्रियाएं चलाएंसेट (सामग्री की तालिका देखें)
    7. वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को रिकॉर्ड करें: प्राइमरों के साथ 45 चक्र 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग
    8. संबंधित जीन के रूप में जीएपीएचएच और बीए-एक्टिन के रिश्तेदार आरएनए मात्रा को सामान्य करें और कैलिब्रेटिंग परिस्थितियों (ΔΔ सीटी विधि) के लिए असामान्य HIPSCs या अनुपचारित कोशिकाओं का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक अन्य उपयुक्त विधि का उपयोग करें
  2. Immunocytochemistry और उच्च-सामग्री इमेजिंग (एचसीआई) 6 , 11
    1. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ठंडे 4% पैराफॉर्माल्डहाइड युक्त हायपीएससी कालोनियों, एनएससी, और / या न्यूरोनल / स्काईलिक डेरिवेटिव को ठीक करें।
    2. धीरे से 1X पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें और प्लेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस तक 1 महीने तक स्टोर करें।
    3. जब धुंधला हो जाने के लिए तैयार हो, तो कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए permeabilization बफर (0.1x triton-X-100 और 3% बीएसए युक्त 1x डीपीबीएस) में कोशिकाओं को प्रचलित करें।
    4. Permeabilization बू निकालेंएंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अवरोधक बफर (3% बीएसए / 1 एक्स डीपीबीएस) में कोशिकाओं को फैछाएं और सेते हैं।
    5. अवरुद्ध बफर को निकालें और कोशिकाओं को रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस में अवरुद्ध बफर में उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त (सामग्री की तालिका देखें)।
    6. कोशिकाओं को 1 बार पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
    7. अवरुद्ध बफर युक्त फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) अवरुद्ध करने के लिए कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, डीएपीआई डाई के साथ नाभिक का प्रतिरोध करते हैं।
    8. एक उपयुक्त उच्च-सामग्री इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करते हुए, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता और सेल प्रकार के सापेक्ष प्रतिशत को बढ़ाएं, यदि उपलब्ध हो (सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि की तीव्रता का स्तर निर्धारित करने के लिए, कुछ कोशिकाओं / कुओं को केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। जीने के प्रवाह cytometric विश्लेषण (तय नहीं), undएसईसीई 4 (सामग्री की तालिका देखें) के रूप में पीएससी-विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए अनुषंगी HIPSCs किया जा सकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीसीआईपी / एनबीटी किटों का उपयोग करते हुए असंतुलित फॉस्फेट गतिविधि के लिए अन्तर्गित HIPSC कालोनियों का विश्लेषण किया जा सकता है, निर्माताओं के निर्देशों के बाद (सामग्री की तालिका देखें) इसके अतिरिक्त, रिवर्स चरण प्रोटीन सरणी (आरपीपीए) एसेज और विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि संदर्भ 12 में वर्णित है (परीक्षणित एंटीबॉडी की सूची के लिए, सामग्री की तालिका देखें)।
  3. इलेक्ट्रोफिजिकल मापन 13
    1. पूर्ण एनडी माध्यम (~ 1 x 10 5 कोशिकाओं / एकल-अच्छी तरह से MEA चिप) में लेपित मल्टीइलेक्ट्रोड एरेज़ (MEAs; सामग्री की तालिका देखें) पर रस्तियों से निकलने वाली अलग-अलग पेटी टुकड़े (7 डिविए के बाद) या प्लेटें।
    2. पूरे एनडी माध्यम में 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को अलग करें, ताज़ा वेंई माध्यमिक सप्ताह में दो बार।
    3. भेदभाव के अंत में, एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत अर्ध-पारगम्य झिल्ली के साथ विदेश मंत्रालय के चिप्स को सील करें ताकि दोहराए गए मापों के लिए संस्कृतियां बाँझ हो सकें।
    4. एक ग्राउंड संदर्भ के साथ एक इलेक्ट्रोड को बदलें, शेष इलेक्ट्रोड से रिकॉर्डिंग की अनुमति दें।
    5. 35 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए समायोजित एकीकृत तापमान प्रक्रिया नियंत्रण के साथ एक MEA एम्पलीफायर का उपयोग करते हुए औसत फायरिंग रेट (एमएफआर, संख्या / स्पाइक्स / मिनट) को रिकॉर्ड करें।
    6. -4.7σ (σ से बेसल शोर के मानक विचलन को दर्शाता है) की दहलीज सीमा का उपयोग करते हुए विदेश मंत्रालय के कच्चे डेटा से चोटियों का पता लगाएं।
    7. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर के साथ पोस्ट रिकॉर्डिंग डेटा पर प्रक्रिया करें।

Representative Results

अल्पसंख्यक HIPSCs के लक्षण वर्णन

हायपीएससी के फेनोटाइप का आकलन करने के लिए, कॉलोनी / सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण, पीएससी-विशिष्ट मार्करों के निर्धारण, और जीन की अभिव्यक्ति और क्षारीय फॉस्फेट की गतिविधि की जांच की जानी चाहिए। बिना पृथक किए HIPSCs को बड़े एनक्लियोली के साथ और प्रचुर मात्रा में कोशिका द्रव्य के बिना गोल होना चाहिए। अधिकांश कॉलोनियों को एक सपाट और कसकर पैक वाले आकारिकी की विशेषता, एक असामान्य फेनोटाइप ( चित्रा 2 ए और चित्रा 2 बी ) का संकेत होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, 80% से अधिक कालोनियों को क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि धुंधला हो जाना ( चित्रा 2 सी ) के लिए सकारात्मक होना चाहिए।

लगभग 80% कोशिकाएं क्लासिक पुलिप्रतिनिशी संबंधित मार्करों के लिए सकारात्मक होनी चाहिए, जैसे कि अक्टूबर 4, एसएसईए 3, एसएसईए 4 और ट्रा 1-60 ( चित्रा 2 डी-एच ), जैसा कि इम्युनोसायटोकैमिस्ट्री और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दिखाया गया है, जबकि नेस्टिन + और बी-III-ट्यूबुलिन + कोशिकाओं की प्रतिशतियां क्रमशः कम (लगभग 8% और 3%, क्रमशः 8% जैसा कि चित्रा 2 एच में दिखाया गया है)। ये परिणाम पारगमन पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करना चाहिए।

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2. अधिसंख्य IMR90-hiPSCs के लक्षण वर्णन (ए और बी) प्रतिनिधि चरण-विपरीत छवियों (10 एक्स और 20 एक्स आवर्धन) अधिसंख्य IMR90-hiPSC कॉलोनियों की। (सी) क्षारीय फॉस्फेट-सना हुआ कालोनियों की प्रतिनिधि छवियों (4X बढ़ाई)। (डीएफ) प्रतिनिधि इम्युनोकाइटेकैमिकल छवियाँ (डी ) अक्टूबर 4 (लाल), (ई) एसएसईए 3 (ग्रीन), और (एफ) ट्रए 1-60 (हरा) (जी) एसईईए 1 (सीडी 15) और एसएसईए 4 धुंधला के प्रतिनिधि डॉट प्लॉट, फ्लो साइटमैट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। (एच) बार ग्राफ में अक्टूबर 4 + (~ 75 - 80%), ट्रैस 1-60 + (~ 75 - 80%), एसएसईए 3 + (~ 75 - 80%), नेस्टिन + (~ 10 - 15% ), और β-III-tubulin + (~ 3-7%) कोशिकाओं, डीएपीआई के साथ counterstained और एचसीआई द्वारा मात्रा निर्धारित, 3-5 जैविक प्रतिकृति के साथ एसईएम (संदर्भ 6 से संशोधित ग्राफ) replicates। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

ईबी गठन के माध्यम से प्लुरिपोटेंसी का आकलन

हाईपीएससी प्लुरिपोटेंट हैं, जिसका अर्थ है कि वे उपयुक्त परिस्थितियों में तीन रोगाणु परत-संबंधित जीनों को अभिव्यक्त करते हैं। हायपीएससी प्लुरिपोटेंसी का आकलन करने के लिए, एक आम आवेदन करना संभव हैसहज ईबी गठन पर आधारित दृष्टिकोण, जो तीन रोगाणु परत 14 के गठन को प्रेरित करता है जीवाणु परत-विशिष्ट जीनों के विश्लेषण में एन्डोडार्म (α-fetoprotein (एएफपी) और साइटोकाटिन 18 (केआरटी 18)), एक्टोडम (नेस्टिन, एसआरवाई-बॉक्स 1 (एसओएक्स 1), और पेयर बॉक्स 6 (पीएक्स 6) की समय-निर्भर वृद्धि दर्शाती है। ), और मेसोडरम (नेत्रियोरेटिक पेप्टाइड ए (एनपीपीए) और ब्रैच्यूरि-टी) -संबद्ध जीन अभिव्यक्ति ( चित्रा 3 ए और चित्रा 3 बी ); सामग्री की तालिका देखें

चित्र तीन
चित्रा 3. ईबी गठन द्वारा Pluripotency के आकलन। (ए) प्रति दिन ईबीएस के प्रतिनिधि चरण-विपरीत छवि 1. (बी) बार ग्राफ मेडोर्मल (एनपीपीए और ब्रेचीर्य), एक्टोडर्मल (पीएक्स 6, एसओएक्स 1, और नेस्टिन) और एन्डोडर्माल (एएफपी और केआरटी 18) के एसपीपीसीआर विश्लेषण को दर्शाता है। ) जीन, संदर्भ जीन, बीए-एक्टिन और जीएपीडीएच को सामान्यीकृत और सामान्यीकृत कोशिकाओं (दिन 0) में कैलिब्रेटेड। यह ΔΔ सीटी पद्धति है, जिसमें 5 स्वतंत्र विश्लेषणों का मतलब है ± SEM * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0.001; ग्राफ संदर्भ से संशोधित 6. कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

न्यूरॉनल और ग्लिलियल भेदभाव का प्रेरण

आईएमआर 9 0-आईपीआरसी को चित्रा 1 और प्रोटोकॉल खंडों में संक्षेप में दिए गए चरणों के बाद पोस्ट-म्युटोटिक न्यूरॉन्स और ग्लिअल कोशिकाओं के मिश्रित संस्कृतियों में विभेदित किया जा सकता है। पूर्ण एनआरआई माध्यम की उपस्थिति में मानक मैट्रिक्स- या लेमनिन-लेपित व्यंजन पर ईबीएस चढ़ाने के 5-8 दिन बाद, रोसेट-जैसी संरचनाओं को दिखाई देना शुरू होना चाहिए (= "Xfig"> चित्रा 4 ए)। राज़ेट्स को कुछ β-III-tubulin + कोशिकाओं (प्रतिबद्ध न्यूरोनल कोशिकाओं, ~ 5-10%) के साथ, नेस्टिन + कोशिकाओं (न्यूरॉनल अग्रदूतों, ~ 9 0%) की उपस्थिति की विशेषता होती है, बाद में आमतौर पर मुख्य रूप से परिधि में परिसर में स्थानीयकरण होता है Rosettes ( चित्रा 4 बी , दिन 12 पर rosettes)।

रोसेट पृथक्करण पर और पूर्ण एनडी माध्यम की उपस्थिति में लैमिनिन- या मानक मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन या प्लेटों को प्रतिस्थापित करने पर, कोशिकाएं न्यूरॉन्स और ग्लिया के मिश्रित संस्कृतियों में भेदभाव से गुज़रना शुरू कर देती हैं, धीरे-धीरे न्यूरॉइट्स के बंडलों ( चित्रा 4 सी और चित्रा 4 डी )। न्यूरॉनल आबादी का विश्लेषण करते हुए रॉसेट-व्युत्पन्न एनएससी का विस्तार करके और न्यूरॉन्स और ग्लिया में अंतर करने के दौरान इसी तरह के परिणामों को प्राप्त किया जाना चाहिए। एनएससी को rosettes से विस्तारित किया जाना चाहिए nएस्ट्रिन + ( चित्रा 4 ई , इंसैट नेस्टिन + कोशिकाओं को दिखाता है)

विचलन के 21 दिनों के बाद, कोशिकाओं को β-III-tubulin के लिए सकारात्मक होना चाहिए; NF200; ताउ; और एमएपी 2, डैन्ड्रैइट्स के आखिरी मार्कर ( चित्रा 4 डी , 4 एफ , और आर्ट 4 एच), ग्लिबल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के लिए कम से कम 10 - 15% कोशिकाओं के सकारात्मक, एक एस्ट्रोगलियल मार्कर ( चित्रा 4 जी और आकृति 4 एच) । इसके अलावा, ~ 20 - 30% कोशिकाओं को भेदभाव के बाद नेस्टिन की अभिव्यक्ति को बरकरार रखना चाहिए ( चित्रा 4 एच )। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक सेल प्रकार का प्रतिशत ( यानी, न्यूरॉन, एस्ट्रोसाइट, नेस्टिन + कोशिका) अंश से भिन्न हो सकते हैं, और उपयोगकर्ता-आधारित परिवर्तनशीलता देखी जा सकती है।

विशिष्ट न्यूरॉनल उपपोपों का विश्लेषण करके, GABAergic neurons repreगामा-एमिनोब्युटिक एसिड (जीएबीए), ट्रायोसिन हाइड्रॉक्सीलेज़ (टीएच), और वेश्युलर ग्लूटामेट के लिए immunostaining द्वारा दिखाए गए अनुसार, कुल कोशिकाओं के ~ 15-20%, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स ~ 13-20%, और ग्लूटामेटेगिक न्यूरॉन्स ~ 35 - 42% ट्रांसपोर्टर 1 (वीजीएलयूटी 1) क्रमशः ( चित्रा 4 एच में प्रतिनिधि मात्रा का ठहराव देखें) भेदभाव को शामिल करने के लिए प्लुरिपोटेंसी से संबंधित मार्करों ( जैसे, अक्टूबर 4, ट्रा 1-60, और एसएसईए 3) के विश्लेषण के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसे अलग-अलग कोशिकाओं की तुलना में अल्पसंख्यक कोशिकाओं में अवरुद्ध किया जाना चाहिए (दिखाया नहीं, संदर्भ 6 देखें)। यह qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के माध्यम से भी पुष्टि की जा सकती है, जिसमें अक्टूबर 4 और नैनोग की कमी और न्यूरोनल जीन के अपरेगुलेशन, जैसे कि तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु 1 (एनसीएएम 1) और माइक्रोटूबुल-जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) का संकेत होना चाहिए; प्रीसंनाप्टिक जीन, सिनाइप्टोफिज़िन (एसआईपी); और पोस्ट- अन्तर्ग्रथनी जीन, माइक्रोटोबूल से जुड़े प्रोटीन टौ (एमएपीटी), जैसा कि < मजबूत वर्ग = "xfig"> चित्रा 4I इसके अलावा, डोपामिनर्जिक (टीएच और एनआर 4 ए 1), नॉरएड्रेनेजिक (पीएचओएक्स 2 ए और पीओओएक्स 2 बी), ग्लूटामेटरगिक (एनएआरजी 2, जीआरएए 1 और जीएपी 43), गैबर्जिक (गैब्रा 1 और जीएबीआरए 3), मोटर न्यूरॉन्स (आईएसएल 1 और एलएचएक्स 3), और कोलिनेर्जिक (एसएलसी 5 ए 7 और एसएलसी 18 ए 13) नतीजतन न्यूरोनल कोशिकाओं में परिणामस्वरूप, बिना कोशिकीय कोशिकाओं ( चित्रा 4 ज) की तुलना में

अलग-अलग HIPSCs में neuronal नेटवर्क की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए सहज विद्युत गतिविधि का विश्लेषण, विदेश मंत्रालय के माध्यम से एक मूल्यवान पढ़ा जाता है। भेदभाव की अवधि के अंत में, न्यूरॉनल डेरिवेटिव्स को आम तौर पर कम से कम 60 स्पाइक्स / मिनट ( चित्रा 4 ए में प्रतिनिधि रास्टर प्लॉट देखें) की एक औसत फायरिंग रेट (एमएफआर) की विशेषता है। हालांकि, बस्ट नहीं मनाया जाता है

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चित्रा 4. न्यूरॉन्स और ग्लिया के मिश्रित संस्कृतियों में आईएमआर 9 0-एचपीएससी के अंतर। (ए और बी) 7 डीआईवी (ए) और 12 डिवि (बी) के बाद rosettes की प्रतिनिधि छवि, नेस्टिन (हरा) और β-III-tubulin (लाल) के लिए दाग)। (सी और डी) 22 डीआईवी (सी) और 28 डीआईवी (डी) , β-III-tubulin (लाल) और एनएफ 200 (हरा)) के लिए दाग के बाद विभेदित कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों। (ई) पेटी पृथक्करण और विस्तार से प्राप्त एनएससी की प्रतिनिधि छवि (इनसेट नेस्टिन + कोशिकाओं, लाल से पता चलता है) (एफ और जी) एनएससी (21 डीआईवी के बाद) से विभेदित न्यूरॉनल कोशिकाओं ( एफ , एनएफ 200 (लाल) और ताऊ (हरा)) और ग्लियाल कोशिकाओं ( जी , जीएफएपी (लाल) के लिए दाग़ के लिए दाग़ की प्रतिनिधि छवियों)। (एच) नेस्टिन, एमएपी 2, जीएएफएपी, गामा-एमिनोब्यूटीआरिक एसिड (जीएबीए), वेश्युलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (वीजीएलयूटी) का मात्रा1), और एचसीआई द्वारा ट्रायोसिन हाइड्रॉक्सीलेज़ (टीएच) -कोजिटिव सेल, आईएमआर 990-हायपीएससी-डेरिवेटिव और आईएमआर 990-एचपीएससी-व्युत्पन्न एनएससी (संदर्भ से संशोधित ग्राफ) से विभेदित कोशिकाओं की तुलना करते हैं। (आई और जे) बार ग्राफ़, प्लिपिपोटेंसी जीन्स (अक्टूबर 4 और नैनोग) और न्यूरोनल जीन (एनसीएएम 1, एमएपी 2, एसआईपी, और एमएपीटी) (आई) और डोपामिनर्जिक (टीएच और एनआर 4 ए 1), नॉरएड्रेनेजिक (पीएचओएक्स 2 ए और पीएचओएक्स 2 बी) के क्यूपीसीआर विश्लेषण को दर्शाता है। ग्लूटामेटरगिक (एनएआरजी 2, जीआरएए 1 और जीएपी 43), जीएबीएआरजीक (गैब्रा 1 और जीएबीआरए 3), मोटर न्यूरॉन (आईएसएल 1 और एलएचएक्स 3), और कोललाइनगिक (एसएलसी 5 ए 7 और एसएलसी 18 ए 13) -संबंधित जीन (जे) । सभी विश्लेषणों को संदर्भ जीनों, बीए-एक्टिन और जीएपीडीएच में सामान्यीकृत किया गया था, और एडिटिफाइड सेल (हरी सलाखों) के लिए कैलिब्रेटेड। यह ΔΔ सीटी पद्धति है, जिसमें 5 स्वतंत्र विश्लेषणों का मतलब है ± SEM * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0.001। आई और जे में रेखांकन संदर्भ 6 से संशोधित किया गया। (के) आईएमआर 9 0-एनएससी-व्युत्पन्न न्यूर के प्रतिनिधि रास्टर प्लॉटओन्स (रिकॉर्डिंग को न्यूनतम 600 एस के लिए किया गया था, ऊर्ध्वाधर सलाखों के एकल स्पैक्स को प्रदर्शित करते हैं) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

न्यूरॉनल मार्करों के एक विशिष्ट हस्ताक्षर को आईएमआर 90-एचपीएससी के अलग-अलग तरीके से विभाजित किया गया है

नए विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान में, किसी विषाक्त पदार्थ के एक्सपोजर के बाद कोशिका के भीतर होने वाली आणविक और सेलुलर घटनाओं को परिभाषित करना आवश्यक है। इसलिए, जांच के तहत सेलुलर मॉडल के भीतर सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करने और / या अपग्रेड करने के लिए यह प्रासंगिक है।

प्रोटीन कीनेज जीन की अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एरेसेस विभेदित कोशिकाओं बनाम तुलनात्मक एचआईपीएससी की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एडवेंचर्सआईएमआर 9 0-एचपीएससी की निगरानी न्यूरोट्रोफ़ोन रिसेप्टर्स, एफ़ोन मार्गदर्शन निर्देशन, न्यूरिट आउटग्रोथ मॉड्यूलेशन, ग्लियाल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (जीडीएनएफ़) रिसेप्टर्स, अस्थि morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) / टीजीएफ-बीटा पथ, और प्लेटलेट- व्युत्पन्न वृद्धि कारक (पीडीजीएफ) रिसेप्टर्स ( चित्रा 5 ए और चित्रा 5 बी)।

आरपीपीए का विश्लेषण अलग-अलग आईएमआर 90-एचपीएससी में एक विशिष्ट न्यूरॉनल हस्ताक्षर को अपग्रेड दिखाता है। विशेष रूप से, एर्क / क्रैब, आक्ट / पीडीके 1 / एमटीओआर, और नोच 1 सिग्नलिंग पथ को भेदभाव ( चित्रा 5C ) पर सक्रिय किया जाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5. विभेदित न्यूरॉनल और ग्लियाल सेल न्यूरॉन से जुड़े रास्तेों की सक्रियता को प्रदर्शित करता है। (एऔर बी) बार ग्राफ़ न्यूरॉन से संबंधित कैनेज़ (ए) और अन्य किनाज से संबंधित जीनों (बी) के qPCR विश्लेषण की रिपोर्ट करते हैं। जीन अभिव्यक्ति डेटा संदर्भ जीनों 18S और GAPDH (सरणी में प्रदान) के लिए सामान्यीकृत थे और सामान्यीकृत कोशिकाओं के लिए कैलिब्रेटेड। इन विश्लेषकों के लिए, एक जीन को महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड माना जाता है जब इसकी अभिव्यक्ति कम से कम 2x उच्च असामान्य कोशिकाओं (2- ΔΔ CT ≥ 2) की तुलना में थी; एसईएम ± 3 स्वतंत्र विश्लेषण का मतलब है) (सी) बार ग्राफ़ आरपीपीए विश्लेषण के माध्यम से पूर्ण प्रोटीन मात्रा का पता चलता है, विभेदित (लाल सलाखों) की तुलना करते हुए और बिना आवर्तित कोशिकाओं (हरे रंग की सलाखों)। एक ही सिग्नलिंग मार्ग कैसकेड से जुड़े प्रोटीन एक साथ क्लस्टर होते हैं: क्रिब / एर्क / एक्ट, पीडीके 1 / एमटीओआर / एर्क / एक्ट, नोट 1, श्ह और डब्ल्यूएनटी, एसएपीके / जेएनके, और बीएमपी / एसएमएडी। 4 स्वतंत्र विश्लेषण के एसईएम का मतलब ±। * पी <0,05, ** p <0.01, *** p <0.001; ग्राफ संशोधित एफROM संदर्भ 6. इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

आईएमआर 9 9-एचपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरोनल / ग्लियाल संस्कृतियों का इस्तेमाल रोटोनोइन के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है

रोटोनन, मिटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के परिसर में एक अवरोधक, एनआरएफ 2 मार्ग के सक्रियण को ट्रिगर करके ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करने के लिए जाना जाता है। समीप स्थितियों के तहत, एनआरएफ 2 को कैप 1 (केल्च जैसे ईसीएच-प्रोटीन 1), एक एनआरएफ 2 रिप्रेसर द्वारा साइटोप्लाज्म में लंगर दिया जाता है, जो एनआरएफ 2 ubiquitination और प्रोटीलाइज़िस 15 की सुविधा देता है । ऑक्सीडेटिव तनाव को शामिल करने पर, एनआरएफ 2 नाभिक में अनुवाद करता है और एनआरएफ 2-एरे लक्ष्य जीन 16 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है।

आईएमआर 90-एचपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स एडीएच 2 सक्रियण पर रोटोनोन के प्रभावों का आकलन करने के लिए 24 घंटे के लिए रोटोनोन ( जैसे, 1, 10, और 100 एनएम) के विभिन्न सांद्रणों को उजागर करके डाय ग्लियाल कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है। ये सांद्रता पिछले अध्ययन 17 , 18 के अनुसार स्थापित की गई थी

इन सांद्रता और एक्सपोजर के समय में, रोटोनोन जीन डीएपीआई + सेल नाभिक ( चित्रा 6 ए ) की मात्रा का ठहराव के रूप में दिखाया गया था, साइटोटॉक्सिसिटी में न पड़े। Rotenone प्रेरित Nrf2 परमाणु हस्तांतरण, विशेष रूप से 100 एनएम रोटोनोन ( चित्रा 6 बी और चित्रा 6 ई ) के लिए कोशिकाओं को उजागर करने के बाद। एक ही एकाग्रता में, एनओडी (पी) एच क्विनोन ऑक्सिडेडक्टेज़ 1 (एनक्यूओ 1) और सल्फाल्डॉक्सिन 1 (एसआरएक्सएन 1) दोनों एनआरएफ 2-लक्ष्य एन में वृद्धि के साथ साथ, cytoplasmic Keap1 में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई ( चित्रा 6 सी ),ज़ैम्प्स 1 9 , 20 ( चित्रा 6 डी )

चित्रा 6
चित्रा 6. एनआरएफ 2 परमाणु ट्रांसलोकेशन, केएपी 1, एसआरएक्सएन 1, और एनक्यूओ 1 प्रोटीन स्तर पर रोटोनोन के प्रभाव। (ए) 1, 10, 100 एनएम रोटोनोन और अनुपचारित कोशिकाओं (नियंत्रण, सीटीआर) को सामान्यीकृत के साथ 24 घंटे के उपचार पर जीना डीएपीआई + कोशिकाओं ( यानी, गैर-पीयनेटिक नाभिक) की मात्रा। (बी) एनआरएफ 2 प्रोटीन परमाणु हस्तांतरण ( यानी, परमाणु / कोशिकालोगक अनुपात) रोटोनोन के संपर्क में 24 घंटे के बाद, एचसीआई विश्लेषण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता के माप द्वारा मूल्यांकन किया गया। (सी) रोटीन उपचार पर साइटोप्लास्मीक केएपी 1 प्रोटीन स्तरों का मात्राकरण, एचसीआई विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया। (डी) एनएडी (पी) एच क्विनोन ऑक्सिडेडेटस 1 (एनक्यूओ 1) और सल्फी का मात्रारोटोनोन के उपचार के 24 घंटे के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस और एचसीआई के माध्यम से रेडॉक्सिन 1 (एसआरएक्सएन 1)। (ई) Nrf2 प्रोटीन स्थानीयकरण की प्रतिनिधि छवियाँ (हरा) सभी मूल्यों को 3 जैविक प्रतिकृतियों के माध्य ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है। * पी <0,05, ** p <0.01; संदर्भ से संशोधित चित्रा 7. कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इन सांद्रता और उपचार के समय में, रोटेनोन ने एनएससी (नेस्टिन + ) और न्यूरॉन्स (एमएपी 2 + ) ( चित्रा ) के अनुपात को प्रभावित किए बिना, एस्ट्रोगलियल (जीएफएपी + ) सेल प्रतिशत ( चित्रा 7 और चित्रा 7 बी ) की एकाग्रता-निर्भर वृद्धि को हासिल किया। 7 बी ) विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकार, रोटोनोइन उपचार (10 एनएम और 100 एनएम) के अनुपात को देखते हुएडोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (टीएच + ) ( चित्रा 7 सी और डी ) की संख्या में काफी कमी आई है, जबकि GABAergic (GABA + ) और ग्लूटामेटरगिक (VGlut1 + ) न्यूरॉन्स की प्रतिशतियां ( चित्रा 7 डी ) बदलती नहीं हैं। अनुरूप, विवो में और पिछले इन विट्रो अध्ययन में एक रोटोनोन-निर्भर और चयनात्मक डोपामिनर्जिक न्यूरोनल सेल का मृत्यु 21 , 22 , 23 है

चित्रा 7
चित्रा 7. ग्लियाल कोशिकाओं और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पर रोटोनोन का प्रभाव। (ए) जीएफएपी + कोशिकाओं (लाल ) के प्रतिनिधि चित्र, जिनमें इंससेट में 40 एक्स बढ़ाई हुई, अनुपचारित या 24 घंटे के लिए 100 एनएम रोटोनोन के साथ इलाज किया गया। (बी) मात्रा नेस्टिन + , एमएपी 2 + और जीएफएपी + कोशिकाओं का, अनुपचारित कोशिकाओं (नियंत्रण, सीटीआर) में सामान्यीकृत। (सी) डोपमिनर्जिक टी + न्यूरॉन्स (हरा) की प्रतिनिधि तस्वीरें, इनसेट में 40 एक्स बढ़ाई, अनुपचारित या 24 घंटे के लिए 100 एनएम रोटोनोन के साथ इलाज के साथ। (डी) GABA + , VGlut1 + , और TH + न्यूरोनल कोशिकाओं का मात्राकरण, अनुपचारित कोशिकाओं (सीटीआर) में सामान्यीकृत। सभी मूल्यों को 3 जैविक प्रतिकृतियों के माध्य ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है। * पी <0,05, ** p <0.01, *** p <0.001; संदर्भ से संशोधित चित्रा 7. कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन एकमात्र एएनओवीए द्वारा डुनेटट के मल्टीपल तुलना टेस्ट के साथ पोस्ट-टेस्ट के रूप में किया गया था (नियंत्रण स्तंभ बनाम सभी स्तंभों की तुलना करना)Xref "> 24 या विश्लेषण के प्रकार के अनुसार दो-पूंछ अनियोजित या युग्मित टी-टेस्ट। सभी डेटा औसत (एसईएम) के मानक त्रुटि ± कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। नियंत्रण समूह के साथ एक महत्वपूर्ण अंतर। * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001

तालिका एक।
अलग-थलग रोटेट चढ़ाना घनत्व पर ध्यान दें: यदि रूपाट टुकड़े लगभग 15000 कोशिकाओं / सेमी 2 की कोशिका चढ़ाना घनत्व तक पहुंचने के लिए, लगभग 50 ईबी / 1 एक्स 60 मिमी-डिश से निकलने वाले टुकड़ों को पुन: resuspended किया जा सकता है। 50 एमएल का पूरा एनआरआई माध्यम और निम्नानुसार चढ़ाया (प्लेट प्रारूप के आधार पर):

मल्टीवेल प्लेट्स / एमईए विकास क्षेत्र (सेमी 2 प्लेट प्रति अच्छी तरह से सेल (निलंबन का वॉल्यूम (या MEA चिप) चढ़ाव की अधिकतम संख्या (सेल निलंबन के 50 मिलीलीटर के साथ) चढ़ाया जा सकता है
96 कुओं 0.3 100 उल 5
48 कुओं 0.7 220 उल 4
24 कुओं 2 625 उल 3
12 कुओं 4 1.25 मिलीलीटर 3
6 कुओं 10 3.125 मिलीलीटर 2
एकल अच्छी तरह से MEA चिप 3.5 1.1 मिलीलीटर 45

तालिका 2: स्वीकृति मानदंड

मार्कर /एंटीबॉडी 28 डीआईवी के बाद प्रतिशत (डीएपीआई + (लाइव) कोशिकाओं पर)
बी-III-ट्यूबिलिन (तुज 1) 35-45%
MAP2 50-60%
NF200 45-55%
GFAP 10-25%
nestin 15-25%

Discussion

यह काम आईएमआर 9 0-एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक मजबूत और अपेक्षाकृत तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो पोस्ट माइटोटिक न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं में है। एचईएससीएस और एचईपीएससी के आधार पर पूर्व में प्रकाशित न्यूरोनल भेदभाव प्रोटोकॉल आमतौर पर 25 , 26 के न्यूरल अग्रदूतों के उच्च प्रतिशत और 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 की एक महत्वपूर्ण संख्या में न्यूरॉनल लक्ष्य कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। समरूपता, यहाँ वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल ग्लैया और नेस्टिन + कोशिकाओं के असंतुलित अनुपात के साथ, गैबार्जिक, ग्लूटामेएटरजीक, और डोपामिनर्जिक न्यूरोनल कोशिकाओं के विषम संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त है। ग्लूटामेटरगिक (~ 35-42%) और गैबर्जिक (~ 15-20%) तंत्रिका कोशिकाओं की उपस्थिति से पता चलता है किइस संस्कृति में अग्रमस्तिष्क, कोर्टिकल जैसी विशेषताएं हैं, और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (~ 13-20%) की एक असतत संख्या की उपस्थिति भी मस्तिष्क की विशिष्टता का संकेत कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नेस्टिन + कोशिकाओं के एक मामूली अनुपात की स्थायित्व न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन और एनएससी पर रसायनों के संभावित प्रभावों के लिए उपयुक्त साबित हो सकती है, जो प्राथमिक रूप से पूर्वोत्तर 34 के हिप्पोकैम्पस और सब्विंटिक्कुलर ज़ोन (एसवीजेड) दोनों तक सीमित हैं। इसके अलावा इम्युनोकायटोकैमिकल और जीन एक्सप्रैशन एक्सपोज़िशन विभेदित सेल डेरिवेटिव के क्षेत्रीय विशिष्टता को बेहतर ढंग से परिभाषित करने में मदद करेगा।

इस दस्तावेज में वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) समरूप टुकड़े (जो समरूप आकार के साथ ईबीएस की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है) में hiPSC कॉलोनियों का काटने और (ii) न्यूरोरेकोडर्मल संरचनाओं का काटने (रोसेट्स ) एनएससी भेदभाव के लिए, जो महत्वपूर्ण पुस्तिका कौशल की आवश्यकता हैऔर मेसोडर्मल और एंडोडार्मल कोशिकाओं को एकत्रित करने से बचने के लिए परिशुद्धता जो भेदभाव पर प्राप्त न्यूरॉन्स और ग्लील कोशिकाओं के अनुपात को कम कर सकती है।

विस्तार के दौरान कोशिकाओं के फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसा कि undifferentiated colonies या एनएससी) और सभी भेदभाव चरणों के दौरान विशेष रूप से, न्यूरॉनल / ग्लियाल सेल डेरिवेटिव के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को न्यूरॉन से संबंधित सिग्नलिंग मार्गों के अपग्रेड और सक्रियण दिखाना चाहिए, जबकि प्लूरापोटेंसी मार्कर की अभिव्यक्ति कम होनी चाहिए।

ईबीएस और न्यूरोरेकोडर्मल डेरिवेटिव (रोसेट्स) की पीढ़ी मैन्युअल रूप से चुनौतीपूर्ण और परिवर्तनशीलता से ग्रस्त हो सकती है। इस कारण से, हमने रोसेट-व्युत्पन्न एनएससी के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया और उनके न्यूरोनल / ग्लियाल कोशिकाओं में भेदभाव विकसित किया।

इस भेदभाव प्रोटोकॉल की संभावित सीमाएं मुख्य रूप से हैं (i) घ के अपेक्षाकृत कम प्रतिशतअनुमेय glial डेरिवेटिव और (ii) परिपक्व न्यूरोनल नेटवर्क कार्यों की कमी (जैसा कि फटने की कमी के कारण दिखाया गया है)। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स के विशिष्ट उप-जनसंख्या प्राथमिक प्रजनन या एनएससी 35 के रूप में कार्य कर सकते हैं। हालांकि इस विभेदित सेल संस्कृति (डेटा नहीं दिखाया गया) में नेस्टिन / जीएफ़एपी डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को नहीं देखा गया था, यह अनुमान है कि इन मिश्रित संस्कृतियों में जीएफएपी + कोशिकाएं एस्ट्रोसाइटेटिक पूर्वज और एस्ट्रोसाइट्स हैं। यह विवेकपूर्ण है कि भेदभाव के समय को बढ़ाकर, एस्ट्रोसाइट्स की संख्या में वृद्धि हो सकती है, और उनका आकारिकी अधिक परिपक्व हो सकता है, जैसा कि झांग के समूह 36 , 37 से पहले के कामों से पहले ही बताई गई है।

नए विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान में, रासायनिक प्रतिकूल परिस्थितियों का आकलन करते समय जैविक मार्गों के रासायनिक प्रेरित अनुषानों पर ज्ञान अत्यंत महत्वपूर्ण है। इसलिए, इन विट्रो टेस्ट सिस्टम में सक्षम होना चाहिएप्रतिकूल परिणाम मार्ग (एओपी) की अवधारणा के अनुसार, सिग्नलिंग पथों की गड़बड़ी के लिए प्रतिकूल प्रभाव से संबंधित है। प्रूफ-ऑफ-अवधारणा के रूप में, रोटोनोन का उपयोग एनआरएफ 2 मार्ग की सक्रियता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जो ऑक्सीडेटिव या इलेक्ट्रोफिलिक तनाव के खिलाफ सेलुलर डिफेन्स में शामिल है 38 , और ऑक्सीडेटिव तनाव विभिन्न एओपी में एक महत्वपूर्ण और आम कुंजी घटना है विकास और वयस्क न्यूरोटॉक्सिसिटी 39

रोटोनोन को एनआरएफ 2 मार्ग की सक्रियता को प्राप्त करना चाहिए, जिसे एनआरएफ 2 प्रोटीन परमाणु हस्तांतरण और एनआरएफ 2-लक्ष्य एंजाइम की वृद्धि की अभिव्यक्ति, एनक्यूओ 1 और एसआरएक्सएन 1 सहित, का प्रदर्शन किया जा सकता है। यह पाया गया है कि रोटोनोन जीएफएपी प्रोटीन स्तर की खुराक पर निर्भर वृद्धि को प्रेरित करता है, एस्ट्रोसाइट सक्रियण 40 , 41 का संकेत देता है। रोटेनोन डोपामिनर्जिक (TH + ) कोशिकाओं की संख्या भी घटाता है, जो प्रीवी के साथ समझौता हैइन प्रकार के न्यूरॉन विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव 21 , 22 , 23 के प्रति संवेदनशील हैं, क्योंकि इन विट्रो और विवो अध्ययन में रोटोनोन-निर्भर डोपामिनर्जिक कोशिका मृत्यु का अध्ययन किया गया है।

निष्कर्ष में, यह हायपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरोनल और ग्लियाल सेल कल्चर मॉडल एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो कि रसायनों के न्यूरोटॉक्सिक प्रभाव का आकलन करता है जो एनएफएफ 2 मार्ग सक्रियण के परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव तनाव को प्राप्त करते हैं। चूंकि यह भेदभाव प्रोटोकॉल न्यूरॉनल कोशिकाओं (GABAergic, डोपामिनर्जिक, और ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स) और एस्ट्रोसाइट्स के मिश्रित संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, यह न्यूरॉइडजनरेटिव रोगों जैसे न्यूरॉन्स और ग्लिया के बीच क्रोसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त साबित हो सकता है, जैसे कि neurodegenerative रोगों ( जैसे, पार्किंसंस रोग)। इसके अलावा, एनएससी के एक महत्वपूर्ण अनुपात की उपस्थिति तंत्रिका कार्यक्रमों पर रसायनों के संभावित प्रभावों का आकलन करने में मदद कर सकती हैइनसेटर, जो कि रासायनिक प्रेरित म्यूटेशन या वायरल संक्रमण का मुख्य लक्ष्य है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

आईएमआर 90-एचपीएससी प्रदान करने के लिए लेखकों को डॉ। मार्क पेस्चन्स्की (आई-स्टेम, एवरी, फ़्रांस) को धन्यवाद देना चाहूंगा; डॉ। Giovanna Lazzari और डा। सिल्विया Colleoni (Avantea srl, Cremona, इटली); डॉ। सिमोन हौपट (बॉन, जर्मनी विश्वविद्यालय); डॉ। टिज़ियाना संतिनी (इटालियन इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी, रोम), immunofluorescence धुंधला मूल्यांकन पर सलाह देने के लिए; आरपीपीए विश्लेषण और एंटीबॉडी सत्यापन के लिए उनके योगदान के लिए डॉ। बेनेडेट्स एक्सीर्डी, डॉ। एलेना रैम्पजोजो, और डा। लुका पर्सानो (यूनिवर्सिटी ऑफ पडुआ, इटली) अनुदान: यह कार्य यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित परियोजना "एससीआर और टॉक्स" (अनुदान समझौता एन ° 266753) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium Stem Cell Technologies 05851 (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8 °C for up to 2 weeks. 5x Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20 °C. Use frozen aliquots within 3 months.
mTeSR1 5x Supplements Stem Cell Technologies 05852
Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium Stemgent 01-0013-50 Freeze ~ 100 fragments/250 μL/vial (Step 1.2.1)
Name Company Catalog Number Comments
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM Thermo-Fisher 10829-018 (Step 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR) Thermo-Fisher 10828-028 20% final concentration (Step 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 2.1.7)
β-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 31350-010 50 µM final concentration (Step 2.1.7)
Name Company Catalog Number Comments
Complete neuroepithelial induction medium (NRI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.3.1)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 2.3.1)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 20 ng/mL final concentration added before use (Step 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of cold DMEM/F12 medium.
Laminin Sigma-Aldrich L2020 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1x.
Name Company Catalog Number Comments
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium Thermo-Fisher 21103049 (Step 2.4.11)
B-27 Supplements (50x) Thermo-Fisher 17504044 (Step 2.4.11)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11)
GDNF Thermo-Fisher PHC7045 1 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
Name Company Catalog Number Comments
Neural induction medium (NI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 3.3)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 3.3)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 3.3)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 3.3)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 3.3)
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Thermo-Fisher 12587010 (Step 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 3.3)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
EGF Thermo-Fisher PHG6045 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Thermo-Fisher R007-100 Pre-warm at 37 °C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10)
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo-Fisher 15400054 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37 °C (Step 3.8)
CryoStor cell cryopreservation medium Sigma-Aldrich C2874-100ML (Step 4.2)
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
Name Company Catalog Number Comments
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis:
RNAqueous-Micro kit Thermo-Fisher AM1931 (Step 5.1.6)
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Thermo-Fisher 4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo-Fisher 4369016
GFAP Thermo-Fisher Hs00909233_m1
MAP2 Thermo-Fisher Hs00258900_m1
NQO1 Thermo-Fisher Hs02512143_s1
SRXN1 Thermo-Fisher Hs00607800_m1
HMOX1 Thermo-Fisher Hs01110250_m1
GSR Thermo-Fisher Hs00167317_m1
PAX6 Thermo-Fisher Hs01088112_m1
NES Thermo-Fisher Hs00707120_s1
GRIA1 Thermo-Fisher Hs00181348_m1
GAP43 Thermo-Fisher Hs00967138_m1
GABRA3 Thermo-Fisher Hs00968132_m1
GABRA1 Thermo-Fisher Hs00168058_m1
NR4A2 Thermo-Fisher Hs00428691_m1
TH Thermo-Fisher Hs00165941_m1
GAPDH Thermo-Fisher Hs02758991_g1
ACTB Thermo-Fisher Hs99999903_m1
MAPT Thermo-Fisher Hs00902194_m1
SYP Thermo-Fisher Hs00300531_m1
NANOG Thermo-Fisher Hs04260366_g1
POU5F1 (OCT4) Thermo-Fisher Hs04195369_s1
SOX1 Thermo-Fisher Hs01057642_s1
AFP Thermo-Fisher Hs00173490_m1
KRT18 Thermo-Fisher Hs01941416_g1
NPPA Thermo-Fisher Hs00383230_g1
T Thermo-Fisher Hs00610080_m1
NCAM1 Thermo-Fisher Hs00941821_m1
NR4A1 Thermo-Fisher Hs00374226_m1
PHOX2A Thermo-Fisher Hs00605931_mH
PHOX2B Thermo-Fisher Hs00243679_m1
NARG2 Thermo-Fisher Hs00973298_g1
SLC18A3 Thermo-Fisher Hs00268179_s1
SLC5A7 Thermo-Fisher Hs00222367_m1
ISL1 Thermo-Fisher Hs00158126_m1
LHX3 Thermo-Fisher Hs01033412_m1
TaqMan Human Protein Kinase Array Thermo-Fisher 4418721
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and reagents for immunostaining:
B-III-tubulin (Tuj1) Covance MMS-435P 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used.
MAP2 Sigma Aldrich M4403 1:500
NF200 Sigma Aldrich N4142 1:1000
GFAP Acris Antibodies GmbH AP02002SU-N 1:500
Nestin Sigma-Aldrich N5413 1:200
synaptophysin (SYN) Abcam AB14692 1:200
Tau Thermo-Fisher MA5-12808 1:100
Nrf2 Abcam AB62352 1:200
Keap1 Abcam AB66620 1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1) Abcam AB92298 1:200
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) Abcam AB2346 1:200
OCT4 Millipore MAB4401 1:100
SSEA3 Millipore MAB4303 1:100
Tra1-60 Millipore MAB4360 1:250
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 1:200
Gamma-aminobutyric acid (GABA) Sigma-Aldrich A0310 1:100
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) Abcam AB72311 1:500
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G 4% (4% formaldehyde can also be used)
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo-Fisher 14190144
Triton-X-100 Solution Sigma-Aldrich 93443-100ML 0.1%
BSA 35% Sigma-Aldrich A7979-50ML 3.5%
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate Thermo-Fisher SA5-10040 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser.
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10166 1:500
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10086 1:500
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo-Fisher 62248 1:1000 (Step 5.2.7)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA):
4E-BP1 (S65) Abcam AB81297 1:250 (Note after step 5.2.8)
Akt (T308) Cell Signaling 9275 1:100
Akt (S473) Cell Signaling 9271 1:100
AMPKalpha (T172) Cell Signaling 2531 1:100
AMPKbeta1 (S108) Cell Signaling 4181 1:100
ATF-2 (T71) Cell Signaling 9221 1:100
c-Jun (S63) Cell Signaling 9261 1:200
c-Jun (S73) Cell Signaling 9164 1:200
c-Kit (Y719) Cell Signaling 3391 1:250
CREB (S133) Cell Signaling 9191 1:100
EGFR (Y1068) Cell Signaling 2234 1:50
ErbB2/HER2 (Y1248) Cell Signaling 2247 1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) Cell Signaling 9101 1:2000
GSK-3alpha (S21) Cell Signaling 9337 1:50
Jak1 (Y1022/1023) Cell Signaling 3331 1:100
Lck (Y505) Cell Signaling 2751 1:500
LKB1 (S428) Cell Signaling 3051 1:100
mTOR (S2448) Cell Signaling 5536 1:100
NFkB p65 (S536) Cell Signaling 3031 1:50
p70 S6 Kinase (T389) Cell Signaling 9205 1:200
PDK1 (S241) Cell Signaling 3061 1:100
PKA C (T197) Cell Signaling 4781 1:250
PRAS40 (T246) BioSource 44-1100 1:2000
PTEN (S380) Cell Signaling 9551 1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) Cell Signaling 9511 1:500
Src (Y527) Cell Signaling 2105 1:500
Src Family (Y416) Cell Signaling 2101 1:200
Stat1 (Y701) Cell Signaling 9171 1:200
Stat3 (S727) Cell Signaling 9134 1:200
Zap-70 (Y319) Enogene E011159 1:100
βCatenin (S33/37/T41) Cell Signaling 9561 1:250
CREB Upstate Biotechnologies 06-863 1:100
Fos B Cell Signaling 2251 1:200
GRB2 Cell Signaling 3972 1:2000
HSP70 Stressgen SPA-810 1:100
c-Jun Cell Signaling 9165 1:100
Kip1/p27 BD 610241 1:100
Lck Cell Signaling 2984 1:250
Mcl-1 Cell Signaling 4572 1:80
Musashi Cell Signaling 2154 1:100
NOTCH1 Cell Signaling 3439 1:100
PTEN Cell Signaling 9552 1:500
SGK1 Abnova PAB4590 1:250
Zap-70 Cell Signaling 2705 1:250
β-Catenin Abcam AB32572 1:1000
Dll4 Abcam AB7280 1:500
Shh Abcam AB53281 1:250
HIF-1α BD 610958 1:50
NUMB PAN-ISO Upstate Biotechnologies 07-207 1:400
NUMB-L Chemicon AB15145 1:750
Cyclin B BD 610220 1:75
c-Myc Calbiochem OP-10 1:100
BCIP/NBT Kit Thermo-Fisher 002209 (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Flow Cytometry:
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate Thermo-Fisher MHCD1528 1:100 (Note after step 5.2.8)
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher SSEA421 1:100
Name Company Catalog number Comments
Specific instruments, tools and softwares:
Countess Automated Cell Counter Thermo-Fisher C10227 Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used.
MEA1060-Inv-BC Multichannel Systems MEA1060-Inv-BC (Step 5.3)
MEA1060-BC control software Multichannel Systems MEA1060-BC (Step 5.3)
NeuroExplorer Multichannel Systems NeuroExplorer (NE) (Step 5.3) For post-processing of MEA data
Multielectrode arrays (MEA) Multichannel Systems 60MEA100/10iR-Ti-gr (Step 5.3) Single-well MEA chip
ArrayScan XTI High Content Platform Thermo-Fisher ASN00002P (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo-Fisher 4351405 (Step 5.1.6)
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) BD 328280 (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1)
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool ThermoFisher 23181010 This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1)
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) Corning 10010582 (Step 2.1.8) Also other brands can be used.
Mr. Frosty Freezing container Sigma-Aldrich C1562-1EA

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References

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