Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus es el ectoparásito más significativo en términos de impacto económico en el ganado como vector de varios patógenos. Se han dedicado esfuerzos al control de garrapatas para disminuir sus efectos deletéreos, centrándose en el descubrimiento de vacunas candidatas, como la BM86, localizada en la superficie de las células epiteliales de la garrapata. La investigación actual se centra en la utilización de cDNA y bibliotecas genómicas, para seleccionar otras vacunas candidatas. El aislamiento de las células intestinales de garrapatas constituye una ventaja importante en la investigación de la composición de las proteínas de superficie sobre la membrana de las células del intestino de garrapatas. Este trabajo constituye un método novedoso y factible para el aislamiento de células epiteliales, a partir de los contenidos de intestino de garrapata de R. microplus. Este protocolo utiliza TCEP y EDTA para liberar las células epiteliales de los tejidos de soporte subepiteliales y un gradiente de densidad discontinua gradieNt para separar las células epiteliales de otros tipos de células. Las proteínas de la superficie celular fueron biotiniladas y aisladas de las células epiteliales de la tripa de la garrapata, usando perlas magnéticas unidas a estreptavidina permitiendo aplicaciones posteriores en análisis FACS o LC-MS / MS.

Introduction

Rhipicephalus microplus es la ectoparásita más significativa en términos de impacto económico en la industria ganadera de las regiones tropicales y subtropicales, ya que vectores de la fiebre de la garrapata bovina (babesiosis), la anaplasmosis y la piroplasmosis equina 1 , 2 , 3 , 4 . Sin embargo, los métodos convencionales como el uso de acaricidas químicos tienen inconvenientes implícitos, como la presencia de residuos químicos en la leche y la carne, y el aumento de la prevalencia de garrapatas químicamente resistentes 5 , 6 , 7 . En consecuencia, se ha estudiado el desarrollo de métodos alternativos de control de garrapatas, como el uso de resistencia natural bovina, el control biológico (biopesticidas) y la vacunaInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

En la búsqueda de proteínas capaces de ser utilizadas como vacunas candidatas, la investigación actual se centra en la garrapata intestinal. La pared del intestino medio se construye a partir de una sola capa de células epiteliales descansando sobre una fina lámina basal, con el exterior de la lámina basal formando una red de músculos. Las observaciones del microscopio electrónico y de luz indican que el intestino medio consiste en tres tipos de células: reserva (indiferenciada), secretora y digestiva. El número de tipos de células varía considerablemente dependiendo de la fase fisiológica. Las células secretoras y digestivas proceden de células de reserva 18 , 19 , 20 .

La construcción de bibliotecas de cDNAPara examinar la composición de la tripa de la garrapata ha llevado a la identificación de proteínas antigénicas, como Bm86, como potencial vacuna candidatos 2 , 3 , 4 . La glicoproteína Bm86 se localiza en la superficie de las células de la garrapata e induce una respuesta inmune protectora contra la garrapata del ganado vacuno ( R. microplus ). Las IgG anti-Bm86 producidas por el huésped inmunizado son ingeridas por la garrapata, reconocen este antígeno en la superficie de las células del intestino de garrapatas y, posteriormente, alteran la función e integridad del tejido del intestino de garrapata. Las vacunas basadas en antígenos Bm86 han mostrado un control efectivo de R. microplus y Rhipicephalus annulatus, al reducir el número, el peso y la capacidad reproductora de las hembras engorciadoras, lo que resulta en una infestación larval reducida en las generaciones subsiguientes de garrapatas 4 . Sin embargo, las vacunas basadas en Bm86 no son eficaces contra todas lasDemostró una eficacia insatisfactoria frente a algunas cepas geográficas de R. microplus , por lo que las industrias lecheras y de vacuno han adoptado mal estas vacunas 2 , 4 .

La capacidad de aislar las células epiteliales de la tripa de la garrapata es una innovación significativa que permitiría la progresión de la investigación para determinar la composición de la membrana de proteínas, incluyendo la morfología y la fisiología en diferentes condiciones ambientales. El método aquí descrito utiliza el agente quelante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el agente reductor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para liberar el epitelio de sus tejidos de soporte subepitelial 10 . El epitelio se recupera tras la interrupción mecánica de los tejidos por agitación, seguido de centrifugación discontinua en gradiente en Percoll. Este artículo describe una técnica factible y novedosa para el aislamiento de la epi de garrapatasLas células celulares. Las proteínas de superficie celular biotiniladas, aisladas de la superficie de estas células epiteliales pueden analizarse subsiguientemente en aplicaciones aguas abajo tales como análisis FACS y / o LC-MS / MS.

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Protocol

1. Disección del epitelio intestinal de R. microplus

  1. Recoger las garrapatas semi-engorged de ganado en el día del experimento. Diseccionar las garrapatas dentro de las 24 h después de la remoción del huésped.
  2. Adhiera una tira de cinta adhesiva al fondo de la placa de Petri de 92 mm x 16 mm. Añadir una gota de super pegamento a la cinta. Coloque la garrapata, lado ventral hacia abajo sobre el super pegamento, deje que se seque durante 2 min.
  3. Verter 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa de Petri, o hasta que la garrapata esté completamente sumergida.
  4. Utilizando un bisturí de tamaño 11, corte desde la parte superior de los ojos hasta los festones inferiores, a ambos lados de la garrapata.
  5. Usando fórceps estériles, quite completamente el scutum y alloscutum , para exponer los órganos internos.
  6. Retire los órganos finos como rosca blanca (tráquea) y otras membranas para prevenir la contaminación.
  7. Quitar el intestino usando fórceps, pinzando la región superior y tirando de lacuerpo. Quite cualquier resto de tejido intestinal, asegurando que no se han disecado otros tejidos.
  8. Guarde el intestino en una solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada sin cloruro de calcio y sulfato de magnesio con un cóctel inhibidor de proteinasa (PIC). Snap congelar las tripas en hielo seco y guardar a -20 ° C.
    Nota: Para ayudar con la disección intestinal y los detalles de los órganos internos de la garrapata, consulte el Capítulo 3.1 de D. Sonenshine, "Biology of Ticks" 19 .

2. Disociación de células epiteliales

  1. Vierta el intestino diseccionado en un colador de células de 70 μm dentro de un tubo de 50 ml.
  2. Enjuague el tejido intestinal con 50 mL de HBSS helado con PIC hasta que la solución se aclare y las tripas tomen un aspecto blanco / transparente.
  3. Vuelva a suspender las tripas en 30 mL de HBSS frío con hielo con PIC, mezclar suavemente y centrifugar a 500 xg a 4 ° C durante 10 minutos para sedimentar el intestino. Retire el sobrenadante y repita el proceso de lavado tres veces.
  4. Filtrar la suspensión a través de un colador de células de 250 μm, vórtice el flujo a través y filtrar a través de un colector de células de 70 μm recolectando el flujo de flujo restante.
  5. Centrifugar la suspensión a 500 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar las células individuales.

3. Aislamiento de células epiteliales simples usando un gradiente de densidad de centrifugación

  1. Preparar el gradiente de densidad de centrifugación ( por ejemplo , Percoll) filtrando a través de un papel pre-filtro AP15. Preparar 40% y un 20% Percoll en mqH 2 0 (v / v) y enfriar a 4 ° C durante 1 h antes de la capa del gradiente.
  2. Utilizando un sistema peristálticoBomba ajustada a la velocidad más baja, aplicar 3 mL de gradiente de concentración de densidad al 40% en un tubo de ultracentrífuga de 16 mL, dejándolo reposar en hielo durante 15 min. La velocidad de la bomba debe conducir a un caudal <1 ml por minuto.
  3. Inclinando el tubo a un ángulo de 45 °, utilice la bomba peristáltica para cubrir el gradiente de centrifugación de 20% de densidad sobre la capa de 40%. La velocidad de la bomba debe conducir a <1 ml por minuto de caudal. Deje que las capas se depositen en hielo durante 15 min.
  4. Utilice la bomba peristáltica a una velocidad de flujo de <1 ml por minuto a la capa 3 ml de medio DMEM que contiene células intestinales de garrapatas sobre el gradiente de 20-40% de densidad de centrifugación.
  5. Programe la centrífuga para obtener una aceleración máxima y una desaceleración mínima. Centrifugar a 600 xg durante 10 min. Recoja las interfases entre el gradiente de DMEM: 20% de densidad y los gradientes de centrifugación de 20%: 40% de densidad para aislar células individuales epiteliales. Almacene las interfases recogidas a 4 ° C para los análisis posteriores.

4. Evaluación del aislamiento celular

  1. Hemocitómetro
    1. Limpie la diapositiva del hemocitómetro con alcohol.
    2. .Re-suspende las células pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo. Pipetear 100 μl de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Añadir 400 μl de azul Trypan al 0,4%. Mezcle suavemente agitando el tubo.
    4. Pipetear 100 μl de la suspensión de células tratadas con Blue Trypan para llenar lentamente ambas cámaras del hemocitómetro.
    5. Coloque el hemocitómetro bajo un microscopio óptico, centrándose en las líneas de cuadrícula del hemocitómetro con un objetivo de 10X.
    6. Utilizando un contador de recuento manual, cuente las células vivas no teñidas dentro de un conjunto de 16 cuadrados. Dentro de la misma plaza, cuente las células muertas de color azul. Continúe contando hasta que se cuenten cuatro series de 16 cuadrados.
    7. Calcular las células totales por ml usando la fórmula:
      47eq1.jpg "/>
    8. Calcular el porcentaje de viabilidad celular usando la fórmula:
      Ecuación 2
  2. Visualización de aislamiento celular
    1. Diluir 1 μl de las células aisladas en 9 μl de HBSS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agite suavemente el tubo de microcentrífuga para mezclar.
    2. Pipetear 5 μl de células aisladas en HBSS en el centro de un portaobjetos de vidrio. Aplicar tres gotas de medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    3. Incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque cuidadosamente una cubierta sobre la preparación, evitando burbujas de aire.
    4. Visualizar células teñidas con DAPI a 360 nm de excitación y emisión a 460 nm bajo un microscopio fluorescente.

5. Biotinilación de Proteínas de Superficie Celular

  1. Biotinilato 100 μL de células epiteliales de célula única usando Biotina (Tipo A) ConjugaciónKit, en una proporción molar de proteína de superficie 1: 1 para conjugar, según las instrucciones del fabricante
  2. Para la lisis celular, añadir 100 μL de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, 100 μM de glutatión oxidado y PIC a las células biotiniladas. Incubar en hielo durante 1 h con una mezcla suave cada 10 min.
  3. Centrifugar las células biotiniladas a 20.000 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar el material insoluble Recoger el sobrenadante que contiene proteínas de membrana citoplásmicas y biotiniladas.
  4. Determine la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford.

6. Aislamiento de proteínas de superficie biotiniladas

  1. Agregue 50 μL de Perlas Magnéticas de Estreptavidina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Coloque el tubo en un soporte magnético, recogiendo las perlas contra el lado del tubo. Eliminar y desechar el sobrenadante.
  3. Añadir 1000 μl de TBS, 0,1% de Tween-20 al tubo. Mezclar suavemente y recoger las perlas con el stan magnéticore. Eliminar y desechar el sobrenadante.
  4. Combinar 40 μg de proteínas de superficie celular biotiniladas, diluidas a 300 μl en 1x PBS con perlas magnéticas lavadas. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente con agitación.
  5. Recoger las perlas con un soporte magnético, eliminar y descartar el sobrenadante.
  6. Añadir 300 μl de TBS, 0,1% de Tween-20 al tubo, mezclando suavemente para volver a suspender las perlas. Recoger bolas, eliminar y desechar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.
  7. Añadir 100 μl de glicina 0,1 M pH 2,0 a las perlas magnéticas, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Recoger bolas y eliminar el sobrenadante que contiene proteínas de superficie biotiniladas eluidas.
  8. Visualizar las proteínas de superficie aisladas en un gel SDS-PAGE Tris-MOPS al 4-20%.

7. Evaluación de la proteína de superficie biotinilada

  1. Mancha de puntos
    1. Corte una tira de membrana de nitrocelulosa de 7 cm x 3 cm.
    2. Aplicar 10 μg de garrapata totalT (de 1,8 anterior), y 10 μg de proteína de superficie biotinilada a la membrana. Dejar secar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    3. Transferir a un recipiente y sumergirlo en 100 ml de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente con agitación durante una hora. Descartar el buffer de bloqueo.
    4. Lavar la membrana de nitrocelulosa en 100 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 minutos con agitación. Deseche el tampón de lavado y repita los lavados por tres veces.
    5. Incubar en 1/5000 Streptavidin-peroxidasa de rábano picante (HRP) en 100 μL de PBS, Tween-20 al 0,05% durante 2 h con agitación a temperatura ambiente, y descartar cualquier solución restante.
    6. Lavar la membrana de nitrocelulosa en 100 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 minutos con agitación. Deseche el tampón de lavado y repita el lavado tres veces.
    7. Para la detección, disolver 1 comprimido de 4-cloro-1-naftol en 10 ml de metanol enfriado con hielo. Añadir 4 ml de concentrado de metanol a 20 ml de TBS. Añadir 10 μl de peróxido de hidrógeno al 30% fresco yLa membrana de nitrocelulosa.
    8. Incubar con agitación a temperatura ambiente hasta que el sustrato produzca un producto final azul insoluble. Esto puede tomar entre 2-15 min.
    9. Desechar la solución de detección y lavar la membrana tres veces en 100 μL mqH 2 O.
  2. Ensayo ELISA
    1. Diluir 200 ng de cada muestra con 400 μl de tampón de revestimiento de carbonato 100 mM y cubrir 2 carriles de la primera fila (A #) de la placa ELISA (pocillos de fondo plano)
    2. Añadir 100 μl de tampón de revestimiento de carbonato 100 mM a todos los demás pocillos correspondientes en filas (BH).
    3. Preparar diluciones en serie de cada muestra pipeteando 100 μL de cada pocillo en la fila A y transfiriéndolo a la fila B. Mezcle suavemente pipeteando y evite producir burbujas. Repetir las diluciones en cada fila, descartando los 100 μL finales de cada pocillo en la hilera H.
    4. Cubrir la placa con parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
    5. Lavar la plataformaE con 200 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 por pocillo tres veces.
    6. Añadir 200 μl de tampón de bloqueo a los pocillos revestidos, cubrir con Parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
    7. Diluir 1 / 15.000 Streptavidin-HRP en tampón de bloqueo y añadir 100 μL a cada pocillo de la placa. Cubrir con parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
    8. Lave la placa en 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por pocillo cinco veces.
    9. Para detectar, añada 100 μl de reactivo TMB por pocillo. Después de suficiente desarrollo del color, usualmente entre 10-15 minutos, agregue 100 μl de ácido fosfórico 1 M para detener la reacción.
    10. Leer la absorbancia de cada pocillo a λ = 450nm.

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Representative Results

Se aislaron células epiteliales de los tejidos intestinales de R. microplus según el esquema presentado en la Figura 1 . Las imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de las células epiteliales de la tripa de la garrapata preparadas usando este protocolo se muestran en la Figura 2A Y 2B. Como el aislamiento celular se realiza sobre R. microplus semi-engorged , las células aparecen como una morfología superficial única, esférica, lisa y un tamaño consistente a través de la muestra. Las diferencias en el tamaño y tipo de las poblaciones de las células intestinales, son más evidentes una vez que la garrapata se convierte en adultos completamente engorged.

La tinción fluorescente del núcleo de células epiteliales aisladas con DAPI ayuda a visualizar las células. Los aislamientos deficiente se visualizan para contener la disociación incompleta de la epífeElial células con diferentes poblaciones de células identificadas a través de la variedad de tamaños de células y morfologías ( Figura 2C y 2D )

Utilizando este protocolo, se aislaron exitosamente aproximadamente 1,2 x 10 7 células por / ml de 50 disecciones de tripa de garrapata, con un 75-80% de viabilidad de R. g . La contaminación cruzada de las proteínas del huésped ( Figura 3A ) puede minimizarse enjuagando adecuadamente las tripas de la garrapata hasta que tengan un aspecto blanco que resulte en un gradiente de Percoll blanco / claro ( Figura 3B ).

Las proteínas unidas a la superficie se aislaron mediante biotinilación de proteínas unidas a la superficie, destrucción de membranas celulares y la purificación de proteínas de superficie biotiniladas con perlas de estreptavidina magnética. Un total de 20-24 μg de biotina purificadaSe pueden aislar las proteínas de superficie lagadas para aplicaciones descendentes a partir de una disección inicial de 50 veces la tripa de garrapata utilizando este protocolo. La comparación de proteínas mediante SDS-PAGE ( Figura 4A ), Mancha de plata ( Figura 4B ), Dot blot ( Figura 5 ) y ELISA ( Figura 6 ) indica que la metodología descrita purificó con éxito proteínas de superficie biotiniladas a partir de células epiteliales aisladas de la garrapata R. microplus intestino.

Figura 1
Figura 1 : Representación esquemática para aislar las proteínas biotiniladas presentes en la superficie de las células del intestino medio de R. microplus . Por favor clHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 : Visualización del microscopio de fluorescencia (100x) de las células epiteliales del intestino medio de R. microplus teñidas con DAPI. El software se utilizó para realizar la superposición de fluorescencia. A & B) Representan células epiteliales aisladas con éxito del intestino medio de R. microplus . C / D) Células epiteliales aisladas del intestino de R. microplus contaminadas con tejidos de garrapatas más grandes.

figura 3
Figura 3 : Gradiente de Percoll que contiene DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Las capas de células epiteliales se formaron entre el DMEM: 20% de PErcoll y el 20: 40% Percoll. ( A ) Marque la disección del intestino sin paso de lavado adecuado. ( B ) Marque la disección intestinal con un paso de lavado adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 : Separaciones electroforéticas de proteínas de superficie biotiniladas funcionadas con gel Tris-MOPS al 4-20%, a 140 V durante 55 min con 10 μg de muestra utilizada. (L) escalera proteína PageRuler preteñidos (1) no marcado R. microplus muestra intestino conjunto (2) proteínas biotiniladas extrae de toda R. microplus intestino como en la etapa 6. (3) Las proteínas de las células epiteliales extraídas de no marcado intestino microplus R. (4 ) Proteínas biotiniladas extraídas de R. microplusCélulas epiteliales según el paso 6. ( A ) SDS-PAGE teñidas por azul Comassie ( B ) mancha de plata.

Figura 5
Figura 5 : Análisis de transferencia de puntos. Estreptavidina - HRP conjugada diluida 1 / 5.000. ( A ) Un total de 10 μg de extracto de proteína de tripa cruda ( B ) Proteínas de superficie biotiniladas extraídas de células epiteliales purificadas (10 μg).

Figura 6
Figura 6 : Evaluación de la viabilidad de las proteínas de superficie biotiniladas utilizando ELISA. ELISA de proteínas de superficie se desarrolló por Strep-HRP conjugado anticuerpo diluido 1 / 15.000 frente a diferentes concentraciones de biotinylated ticK proteínas gut (de 0,7 ng a 100 ng). Como control negativo del ELISA se utilizaron proteínas de intestino de garrapatas no marcadas y albúmina de suero bovino (BSA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las infestaciones de garrapatas de ganado constituyen un problema importante para la industria ganadera en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con el método de control más común dependiente del uso de acaricidas 1 , 4 . Bm86 fue identificado previamente dentro de la superficie epitelial del intestino de garrapata como un antígeno protector contra la infestación de R. microplus 10 , con éxito limitado como una estrategia de la vacuna debido a la variación de la secuencia geográfica Bm86 y el requisito de un aumento regular 4 .

Las publicaciones anteriores centradas en las metodologías de aislamiento epitelial se centraban principalmente en especies de vertebrados o insectos 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Por ejemplo, el fraccionamiento precoz intenta aislar el intestino medioUtilizando técnicas de mamíferos, encontró que la misma metodología no se podía aplicar a los insectos debido a la estructura celular diferente y las organizaciones [ 12] . Además, las técnicas de mamíferos se basan en el uso de dipase o colagenasa, para digerir enzimáticamente las proteínas de unión célula-célula 9 , 13 . Dipasa y colagenasa afectan considerablemente a las proteínas de la superficie celular ligado, y por lo tanto las técnicas dependientes de su uso no son adecuados para la proteína de superficie celular estudios [ 15] . Los aislamientos de las células del intestino medio de insectos se centran actualmente en dos técnicas. El primero utiliza la interrupción mecánica del intestino medio a través de ultrasonidos seguido de separación sobre un gradiente lineal de sacarosa lineal 8 , 11 , 12 , 14 . Esta técnica mecánica produce muestras casi limpias de contaminantes,Ver produce un bajo rendimiento de microvillarmembranes [ 14] . La segunda técnica se basa en Tris interrupción de las membranas para liberar microvillar membranas [ 8] .

La técnica descrita en este documento permite el aislamiento de células epiteliales, la biotinilación de proteínas de superficie y su aislamiento 16 , lo que permite estudios adicionales a través de aplicaciones de aguas abajo, tales como espectrometría de masas o FACS. El método descrito aquí utiliza el agente quelante EDTA y el agente reductor TCEP. EDTA funciona para secuestrar los iones de calcio, inhibiendo las cadherinas, rompiendo la cadherina mediada por las células de células de las uniones, mientras que TCEP reduce los enlaces disulfuro que confiere viscosidad de la rica en glicano muco-como la matriz peritrófica que separa la luz intestinal del epitelio. El epitelio se recupera tras la interrupción mecánica de los tejidos por agitación, seguido de centrifugación discontinua en gradiente en el densitY gradiente de centrifugación. Se aislan células epiteliales entre el gradiente DMEM: 20% de densidad y 20%: 40% de densidad.

La utilización de una temperatura más alta durante la disociación de las células epiteliales hará que los tejidos grandes se disoquen del intestino, lo que conduce a la falta de aislamiento de las células epiteliales. Asegurar que la disociación de las células epiteliales se realice inmediatamente después de la disección de la garrapata; La utilización de tampones enfriados con hielo y la evitación de altas velocidades de centrifugación es crítica para retener células viables vivas. A pesar de esto, el desprendimiento de células más grandes de la lámina basal puede proporcionar cierta contaminación. Además, el epitelio del intestino medio de la garrapata se altera dramáticamente dependiendo del tiempo transcurrido desde la última comida de sangre 18 , 19 , 20 .

Como tal, este protocolo ha sido diseñado y accedido en R. microplus Figura 1 ] son ​​de naturaleza uniforme.

En conclusión, los métodos utilizados en este estudio con éxito las células epiteliales aisladas de todo el intestino de R. microplus . Se obtuvieron proteínas de la superficie de células epiteliales de R. microplus para análisis y estudios adicionales. Por último, el protocolo desarrollado ha demostrado el potencial de rendimiento de las células epiteliales de la garrapata intestinal, y la eficiencia de las proteínas de superficie biotiniladas de la célula. El protocolo desarrollado puede ser utilizado en cualquier especie de garrapata de importancia económica en un esfuerzo para investigar las interacciones de garrapatas: huésped estudiando la proteína de membrana comPosición del intestino.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a la Colonia Tick de Bioseguridad (Departamento de Agricultura y Pesca de Queensland, Australia) por la provisión de garrapatas Rhipicephalus microplus utilizadas para este estudio, y Lucas Karbanowicz para asistencia con filmación de video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

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