تقنيات المختبر تستخدم للحفاظ على والتمايز بيوتيبس * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وتصف هذه المخطوطة تقنيات صيانة الكوليرا فيبريو المناسبة بالإضافة إلى سلسلة من المقايسات الكيميائية الحيوية، وتستخدم بشكل جماعي للتمييز السريع والموثوق به بين السريرية والبيئية V. كوليراي، بيوتيبس، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، المختبر، الإطار.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brumfield, K. D., Carignan, B. M., Ray, J. N., Jumpre, P. E., Son, M. S. Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (123), e55760, doi:10.3791/55760 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البكتيريا السالبة الغرام المائية فيبريو الكوليرا هي العامل المسببة للكوليرا المعدية المعوية المرض. بسبب الانتشار العالمي وشدة هذا المرض، V. وقد تم دراسة الكوليرا على نطاق واسع في كل من البيئة والمختبرات البيئات، التي تتطلب الصيانة المناسبة وتقنيات زراعة. الكلاسيكية و إل تور نوعان بيولوجي رئيسيان يؤلفان V. الكوليرا O1 المصلية، كل منها عرض الخصائص الوراثية والمظهرية فريدة من نوعها التي توفر آليات موثوقة لتوصيف النمط البيولوجي، وتتطلب فوعة متميزة تحفز ظروف زراعة. وبغض النظر عن النمط الحيوي للسلالة المسببة لأي عدوى أو تفشي معين، فإن العلاج المعياري للمرض ينطوي على العلاج بالإماهة المكمل مع نظام من المضادات الحيوية. ومع ذلك، قد يكون تصنيف النمط البيولوجي ضروريا للدراسات المختبرية وقد يكون له تأثيرات أوسع في مجال الطب الحيوي.في أوائل عام 2000 تم التعرف على العزلات السريرية التي تظهر سمات النمط الوراثى والمظاهر الظاهرية من كل من البيوتيب الكلاسيكية و إل تور. وقد تسببت الهجينة التي تم تحديدها حديثا، والتي يطلق عليها اسم متغيرات إل تور، في عزل بيوئي سريري وبيئي ليصبح أكثر تعقيدا من البروتوكولات التقليدية السابقة لتحديد الهوية. بالإضافة إلى وصف V. ( كتكسب و تكبا ) الشاشات الوراثية المستندة إلى ير والفحوصات المظهرية (بوليميكسين B المقاومة، الأيض سترات، النشاط بروتين، النشاط الانحلالي، الحركة، واستقلاب الجلوكوز عبر Voges- بروسكاور مقايسة) تستخدم بشكل جماعي لتمييز و / أو التمييز بين النمط الكلاسيكي والتور بيوتيبس. معا، هذه المقايسات توفر نهجا منهجيا فعالا لاستخدامها كبديل، أو بالإضافة إلى ذلك، مكلفة، والتجارب كثيفة العمالة في تشاراكتريزاتيون أوف V. الكوليرا السريرية (والبيئية) العزلات.

Introduction

الكوليرا مرض في الأمعاء الدقيقة البعيدة الناجمة عن استهلاك المواد الغذائية الملوثة أو المياه التي تحتوي على بكتيريا سلبية الغرام المائية فيبريو الكوليرا . وتشمل أعراض الكوليرا القيء والإسهال المائي الذي لا يمكن السيطرة عليه، مما يؤدي إلى الجفاف الشديد، والذي إذا لم يعالج بشكل صحيح، سيؤدي إلى الوفاة. V. الكوليرا يمكن تقسيمها إلى أكثر من 200 المجموعات المصلية على أساس هيكل سطح الخلية عديد السكاريد O- المستضد. ومع ذلك، أظهرت فقط 2 المجموعات المصلية، O1 و O139، وباء أو جائحة المحتملة 1 ، 2 . وعلاوة على ذلك، كانت المجموعة المصلية O139 معزولة في المقام الأول إلى جنوب شرق آسيا 3 ، 4 ، في حين يتم توزيع المجموعة المصلية O1 في جميع أنحاء العالم. وعلاوة على ذلك، يمكن تقسيم المجموعة المصلية O1 إلى 2 بيوتيبس الرئيسية: الكلاسيكية و إل تور. وكان النمط البيولوجي الكلاسيكي مسؤولا عن أول وباء للكوليرا 6بين عامي 1817 و 1923. الجائحة السابعة الحالية هي نتيجة للنمط الحيوي إل تور، الذي نزح عالميا النمط البيولوجي الكلاسيكي في البيئة 5 ، 6 ، 7 . في الآونة الأخيرة، نشأت سلالات التي تحتوي على الخصائص المميزة لكل من البيوكاليب الكلاسيكية و إل تور 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ومنذ ذلك الحين كانت تسمى متغيرات الطور 13 ، 17 . وقد أظهرت بعض المتغيرات إل تور قدرات الفوعة مرتفعة مع تطور المرض السريع والحاد أكثر مما لوحظ سابقا، مؤكداوالحاجة إلى نهج أكثر شمولا لتحديد هوية الوكلاء والوقاية من الأمراض والعلاج 8 ، 9 ، 18 . في حين أن تحديد النمط الحيوي لا يملي على الفور العلاج، قد تستفيد المزيد من التقدم في تطوير اللقاحات وكلاء العلاجية في المستقبل من التمييز بيوتيب.

السلسلة الأولى من البروتوكولات المدرجة هنا سوف تمكن المحققين من الحفاظ على V بشكل صحيح. كوليراي، السلالات، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، المختبر، الإطار. ويتطلب الاتساق والتحليل اللاحق إعداد المخزونات ونمو العزلات التي لا تعتمد على النمط الحيوي. ومع ذلك، على النحو الأمثل للحث على الفوعة التعبير الجيني، مطلوبة بيوتيب تقنيات زراعة مستقلة مستقلة 19 . بالإضافة إلى ذلك، تم إعداد التحضير لمختلف المقايسات الوراثية والبيوكيميائية في هذه المخطوطة.

سرطان الكوليرا (كت) والسمية المشتركة(تكب) هما نوعان من عوامل الفوعة الرئيسية التي يسيطر عليها المنظم الرئيسي توكست في كلا النوعين من V. الكوليرا O1 سيروغروب 20 . كت هو ثنائي السموم يتكون من خمسة كتكس الوحدات الفرعية المحيطة وحدة واحدة كتكسا، وهي المسؤولة عن فقدان بالكهرباء السريع المرتبطة الكوليرا. تكب هو نوع من الطفرة إيف المشفرة من قبل تكب أوبيرون ( تكبابكردستف )، وتشارك في مرفق واستعمار الأمعاء الدقيقة البعيدة. تكبا هو الجين الأول من تكب أوبيرون الذي ترميز وحدات البيلين الفردية الضرورية لبناء بيلوس 8 . يتم حفظ تسلسل الجينات ل كتكسا تماما بين النمط الكلاسيكي و إل تور بيوتيبس ، في حين أن كتسب و تكبا تختلف عبر اثنين من بيوتيبس ولكن يتم حفظها داخل كل النمط الحيوي 8 . يتم حفظ كتكس تماما بين الأنواع الحيوية إلا في اثنين بوسي قاعدة(115 و 203). في النمط الحيوي إل تور، ثيمين يقيم في المواقف الأساسية 115 و 203، في حين أن النمط الحيوي الكلاسيكي يحتوي على السيتوزين في هذه القواعد. يتم حفظ تكبا تماما داخل كل نوع بيوتيب، ولكن تختلف في قواعد متعددة بين الأنماط الحيوية. هذه التمايز الجيني بمثابة علامات تحديد النمط الحيوي الأولي، وبعد تسلسل المنتج تضخيم البوليميراز (ير) المنتج بما في ذلك هذه المواقع، ويمكن مقارنة تسلسل عزل البرية نوع (وت) الكلاسيكية O395 أو وت إل تور N16961 لتحديد الخلفية النمط الحيوي من كت و تكب، على التوالي، في عزل V الكوليرا .

وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتمييز الفوارق المظهري بين الكلاسيكية و إل تور بيوتيبس 21 ، 22 ، 23 . بوليميكسين B هو مضاد حيوي الببتيد الذي يضر بسلامة غشاء الخلية الخارجية في البكتيريا سلبية الغرامتيريا، ومقاومة بوليميكسين B يمكن تصور من خلال فحص البوليمكسين B المقاومة 21 . السيترات هو الركيزة الأساسية لدورة كريب، والقدرة على استقلاب سترات كمصدر وحيد الكربون يمكن تحديدها باستخدام فحص الأيض سترات 22 . هابر ترميز منظم عالمي والمنظم النصاب النصاب في V. الكوليرا، هابر، الذي يرتبط إلى مختلف المناطق المروج وينظم الجينات والتعبير أوبيرون 24 . بعض السلالات المسببة للأمراض من ضمة الكوليرا لها طفرة تحول الإطار بشكل طبيعي في الجين هابر التي تسببت في هذا التنظيم تعتمد على الكثافة من الفوعة التعبير الجيني إلى أن تفقد 24 ، 25 . قياس النشاط البروتيني هابر باستخدام وسائل الإعلام آغار الحليب يسمح للباحث لتحديد ما إذا كان عزل معين يحتوي على هابر وظيفية 23 . الانحلال الدم اختبارات الفحص لقدرة سلالة لإفراز الإنزيمات الانحلالية التي تحلل خلايا الدم الحمراء. يمكن أن تصور درجة انحلال الدم على لوحات أجار الدم 23 . وغالبا ما ترتبط الحركة مع الفوعة في ضمة الكوليرا ويمكن تحليلها باستخدام لوحات أجار الحركة 23 . اختبارات فوجيس-بروسكور فحص لقدرة سلالة لتخمر الجلوكوز كمصدر وحيد الكربون وإنتاج أسيتوين ثانوي 21 . مع ظهور المتغيرات إل تور، فمن الصعب التنبؤ نتائج أي فحص المظهري معين دون فحص وراثي واسع، وقبل استنتاج الخلفية بيوتيب من V. العزلات الكوليرا ، فمن المستحسن لأداء هذا التجمع من المقايسات 23 ومقارنة النتائج لسلالات مرجعية كما هو موضح في الجدول 2 .

هنا، قدمنا ​​سلسلة من البروتوكولات، والاستفادة بشكل جماعي من أفوريمنتيونيد وراثي والمظاهر الظاهرية لنهج أكثر شمولا لوصف V. الكوليرا . وعلاوة على ذلك، فقد وصفنا التمايز الجيني والمظاهر الظاهرية من V المعروفة. الكوليرا المتغيرات إل (MQ1795 و با-2163)، بالمقارنة مع السلالات المرجعية النمط البيولوجي تستخدم عادة (وت الكلاسيكية O395، وت إل تور C6706، و وت إل تور N16961؛ الجدول 1 ). وقد ظهرت ظهور المتغيرات إل تور تحديات لموثوقية من قبل واحد فحص بروتوكولات التوصيف النمط البيولوجي مقايسة؛ ومع ذلك، فإن هذا نظام تحديد مقايسة متعددة تسمح لتوصيف أكثر موثوقية من الخامس والبيئية السريرية. عزلة الكوليرا .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تؤخذ اعتبارات الوقت لكل فحص كما تتطلب الاستعدادات وسائل الإعلام الفردية أوقات مختلفة. على سبيل المثال، ينبغي السماح لوسائل لوحة أجار الصلبة لتبرد بما فيه الكفاية وجافة (1-2 أيام). يتم تحديد اعتبارات الوقت الإضافي ( أي مستعمرة واحدة ونمو الثقافة بين عشية وضحاها) في كل بروتوكول ويرد في الجدول 2 .

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس)
    1. تزن 4.0 غرام كلوريد الصوديوم، 0.1 غرام بوكل، 0.72 غرام نا 2 هبو 4 ، و 0.12 غرام خ 2 بو 4 . الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني وإضافة هكل قطرة قطرة إلى الحل، وتعقيم الأوتوكلاف أو تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. 1X بس يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هو حمض مركزة ويجب التعامل معها وفقاإلى اللوائح المؤسسية والمحلية، والولائية، والاتحادية. للحصول على إرشادات التعامل المناسبة، يرجى الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  2. لوريا-بيرتاني (لب) مرق
    1. تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، و 2.5 غرام كلوريد الصوديوم. الجمع بين المكونات في زجاجة 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، الأوتوكلاف، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. لبيولوجية النمط البيولوجي الفوعة تسبب الظروف، وضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك قبل التعقيم.
  3. أكي متوسطة تحتوي على 0.03٪ (ث / ت) ناهكو 3
    1. للمكون 1 (وسط أكي): وزن 7.5 غرام من الببتون، 2.0 غرام استخراج الخميرة، و 2.5 غرام كلوريد الصوديوم. الجمع بين المكونات في زجاجة 1 لتر، وضبط حجم إلى 450 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. أكي المتوسطة يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. للمكون 2 (ناهكو 3 ): تزن 1.5 غرام ناهكو 3 ، وضبط حجمإلى 50 مل مع الماء منزوع الأيونات في حويصلة معقمة. تصفية تعقيم ناهكو 3 باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. ناهكو 3 يجب أن يكون مستعدا على الفور قبل الاستخدام.
    3. الجمع بين العقيم مكونة معقمة إنشاء نسبة 01:10 عن طريق تصفية المكون 2 في المكون 1 قبل استخدامها.
  4. لوريا-بيرتاني (لب) أجار لوحات
    1. تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 7.5 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، الأوتوكلاف، وإعداد في حجم قياسي 100 مم × 15 ملم أطباق بتري معقمة. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 6 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  5. لب أجار لوحات مكملة مع بوليميكسين B
    1. للمكون 1 (لب أجار): تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 7.5 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل وايدي الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (بوليميكسين B): حل بوليميكسين B في الماء منزوع الأيونات في معقمة أنبوب مل ميكروسنتريفوج 2 مل لتركيز 50،000 وحدة دولية / ميكرولتر وتصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون.
    3. مرة واحدة المكون 1 هو بارد لمسة، ولكن لم تصلب بعد، إضافة العقيم 500 ميكرولتر من المكون 2 إلى المكون 1 خلق تركيز النهائي من 50 وحدة دولية / ميكرولتر وتخلط جيدا. إعداد في الحجم القياسي 100 مم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 3 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  6. طبق سيترات متوسط ​​أجار متوسط
    1. للمكون 1 (آغار مع الأزرق بروموثيمول): تزن 7.5 غرام أجار و 0.02 غرام من البروموثيمول الأزرق. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 450 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف الخليط.
    2. للمكون 2 (10x فمم): تزن 1.0 g مغسو 4 7H 2 O و 10.0 g حامض الستريك H O و 50.0 g اللامائي K 2 هبو 4 و 17.5 g نانه 4 هبو 4 4H 2 O. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف أو تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. 10x فم يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة تصل إلى 6 أشهر.
    3. إضافة 50 مل من المكون 2 إلى المكون 1 وإعداد في الحجم القياسي 100 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أغار مختلطة في أطباق بتري. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 6 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  7. لوحات أغار الحليب
    1. للمكون 1 (الحليب): تزن 8.0 غرام حليب جاف غير حليب فوري في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (أجار مع ضخ الدماغ الدماغ): تزن 3.68 غرام ضخ القلب والقلب و 6.0 غرام أجار. الجمع بين يخدعستيتينتس في 500 مل إرلنمير قارورة، وضبط حجم إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    3. الجمع بين اثنين من المكونات عن طريق صب المكون 2 في المكون 1، بعد التعقيم وتخلط جيدا. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة. لوحات الحليب يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد ملفوفة في البلاستيك، الجانب الجانب أسفل في 4 درجات مئوية. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري.
  8. لوحات أجار الحركة
    1. للمكون 1 (لب أجار): تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 2.0 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (1٪ (ث / ت) كلوريد تريفنيلتيترازوليوم؛ تك): تزن 0.25 ز تك. ضبط حجم إلى 25 مل مع الماء منزوع الأيونات في حويصلة معقمة وتصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة ملفوفةفي احباط لتقليل التعرض للضوء.
    3. إضافة 2.5 مل من 1٪ (ث / ت) العقيمة تك إلى وسائل الإعلام تعقيمها.
    4. صب وسائل الإعلام سميكة قدر الإمكان (≥50 مل / لوحة) إلى كبير 150 مم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى أسبوع واحد، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري.
  9. فوجيس بروسكاوير
    1. للمكون 1 (مرق أحمر-فوج-بروسكور مرق؛ مر-ف): تزن 1.7 غرام مر-ف المتوسطة في قارورة إرلنماير 500 مل، وضبط حجم إلى 100 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. يمكن تخزين مرق مر-ف العقيمة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. للمكون 2 (5٪ (ث / ت) ألفا (α) نفثول): تزن 1.0 غرام α-نفثول في حويصلة معقمة وضبط حجم إلى 20 مل مع الايثانول 95٪. α-نفثول يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 أسبوع ملفوفة في احباط للحد من ضوء إكسosure.
    3. للمكون 3 (40٪ (ث / ت) هيدروكسيد البوتاسيوم؛ كوه): تزن 20.0 غرام كوه في حويصلة معقمة، وضبط حجم إلى 50 مل مع الماء منزوع الأيونات معقم. يمكن تخزين كوه لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة في وعاء من البلاستيك.

2. صيانة ونمو الخامس . سلالات الكوليرا

  1. إعداد واستخدام الثقافات الأسهم المجمدة
    1. بيليه 1.8 مل من الثقافة بين عشية وضحاها السائل لمدة 2 دقيقة بواسطة الطرد المركزي (≥8،600 x ج) في معقمة 2 مل أنبوب ميكروسنتريفوج، وإزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 900 ميكرولتر من مرق لب الطازجة التي بيبتينغ.
    2. إضافة 900 ميكرولتر من العقيمة 60٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين إلى الثقافة ومزيج من فورتيكسينغ.
    3. نقل الخليط إلى معقمة أنبوب 2 مل المبردة وتخزينها إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية.
    4. لاستخدام، وإزالة كمية صغيرة من الأسهم المجمدة باستخدام عقيمة تطعيم حلقة وخطوط لمستعمرات واحدة على لب أغأر. على الفور عودة الأسهم المجمدة إلى -80 درجة مئوية بعد الاستخدام لمنع الثقافات من الذوبان تماما. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. نمو الثقافات بين عشية وضحاها في السائل المتوسطة
    1. متتالية للمستعمرات واحدة (وفقا للقسم 2.1.4) من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 4 مل من السائل مرق لب في معقمة 10 مل أنبوب الثقافة مع مستعمرة واحدة عن طريق لمس سطح مستعمرة واحدة مع عصا العقيمة قضيب ونقل المستعمرة في مرق السائل.
    3. احتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. منحنى النمو
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. جعل 1: 100 التخفيف من الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق نقل 250 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 25 مل من مرق لب الطازجة في معقمة 250 مل قارورة إرلنمير.
    3. قياس كثافة بصرية من الثقافات السائلة في 600 نانومتر (أود 600 ) كل ساعة ابتداء من وقت التلقيح (T 0 ).
    4. احتضان 1: 100 التخفيف من الثقافة بين عشية وضحاها مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 30 ساعة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تصل الثقافة الكثافة القصوى.
    5. رسم بياني أود 600 مقابل الوقت واستخدام الانحدار الخطي لتحديد الوقت التقريبي مضاعفة لكل سلالة.
  4. إل تور بيوتيب فيروولنس إندوسينغ كونديتيونس
    1. الإنتصارات لمستعمرات واحدة من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل، لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 10 مل من أكي المتوسطة تحتوي على 0.03٪ (ث / ت) ناهكو 3 مع مستعمرة واحدة.
    3. احتضان الثقافة دون تهوية عند 37 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة.
    4. إزالة 7 مل من الثقافة واحتضان 3 مل المتبقية من كولتوإعادة مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات إضافية.
  5. الكلاسيكية بيوتيب الفوعة حالات تحريض
    1. الإنتصارات لمستعمرات واحدة من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 4 مل السائل مرق لب (الرقم الهيدروجيني 6.5) مع مستعمرة واحدة.
    3. احتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة في 30 درجة مئوية.
  6. غسل خلية بيليه في برنامج تلفزيوني 1X
    1. بيليه 1.8 مل من الثقافة بين عشية وضحاها لمدة 2 دقيقة بواسطة الطرد المركزي (≥8،600 x ج) في معقمة 2 مل أنبوب ميكروسنتريفوج وإزالة طاف باستخدام ماصة. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1.8 مل 1X بس بواسطة بيبتينغ.
    2. كرر غسل الإجراء ثلاث مرات تليها إعادة تعليق النهائي في 1.8 مل 1X بس.

3. توصيف V. الكوليرا

  1. Pالشاشات الوراثية المستندة إلى كر باستخدام كتكس و تكبا
    1. تصميم مجموعة من الاشعال، والتي تصلب ما يقرب من 50-70 نقطة أساس المنبع والمصب من بداية متعدية ومواقع وقف كتكسب و تكبا ، على التوالي.
    2. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    3. عزل الحمض النووي الكروموسومات باستخدام مجموعة متاحة تجاريا مصممة للبكتيريا سالبة الجرام. يمكن تخزين الحمض النووي الكروموسومات المنقى إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية. العزلة الكروموسومية الحمض النووي باستخدام مجموعات متاحة تجاريا يستغرق عادة حوالي 4 ساعات.
    4. استخدام مقياس الطيف الصغير الحجم لضمان عينة الحمض النووي الكروموسومات هي ذات جودة عالية (A 260/280 > 1.8).
    5. لكل عزل الكروموسومات الحمض النووي، وإعداد تفاعل البوليميراز (ق) (ير) على الجليد في العقيمة 200 ميكرولتر ير أنبوب (ق) وتضخيم المناطق كتكسب و تكبا باستخدام مكونات ير القياسية: بوليميراز طق وبو(أو ما يعادلها)، حل دنتب، و الاشعال إلى الأمام / عكس. استخدام معايير ير القياسية (~ 3 ح). على سبيل المثال، استخدم البروتوكول التالي:
      1. انكماش الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 120 ثانية.
      2. ينكر عند 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.
      3. أنيل الاشعال في 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
      4. تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
      5. كرر الخطوات من 3.1.5.2 خلال 3.1.5.4 لمدة 34 دورات.
      6. التمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 600 ثانية.
      7. عقد لانهائية في 4 درجات مئوية.
    6. صبغ 5 ميكرولتر من كل المنتج ير (ق) باستخدام معيار 6X الحمض النووي هلام تحميل الصبغة، وتحميل ما يقرب من 10 ميكرولتر من سلم 1 كيلو بايت و 10 ميكرولتر من المنتج ير على هلام الاغاروز 1٪ في 1X تريس-بورات-إدتا (تب) متعادل.
    7. تشغيل الكهربائي هلام في 130 V حتى يصل صبغ الجبهة نهاية، ولكن ليس خارج، من هلام (حوالي 90 دقيقة). ويوصى الرصد المستمر كما الجهد وتشغيل مرات يمكن أن تختلف اعتمادا على المعدات.
    8. عند التحقق منناجحة ير التضخيم في الحجم المتوقع، وتنقية المتبقية 45 ميكرولتر ير المنتج (ق) باستخدام دنا المتاحة تجاريا نظيفة ومكثف عدة.
    9. تسلسل ير المنتج (ق) تنظيف باستخدام الاشعال المستخدمة في التضخيم ير، وإعداد لكل المبادئ التوجيهية المحلية تسلسل المرفق.
    10. قارن تنسيق فاستا من تسلسل الجينات من كل عزلة إلى تسلسل المنشورة المتاحة على الموقع نسبي (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)، من خلال البحث في أرقام الانضمام التالية في مربع الاستعلام البحث.
    11. كتكس : المنطقة (الكلاسيكية) بين VC0395_A1059 إلى VC0395_A1060 (إل تور) VC_1456
    12. تكبا : (كلاسيكال) VC0395_A0353 (إل تور) VC_0828
  2. المقايسات النمطية لتصنيف بيوتيب عن طريق الإكتشاف
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. غسل بيليه الخلية (ق) على النحو المحدد في بروتوكول 2.6.
    3. استخدام ماصة لبقعة 1 ميكرولتر من ثقافة غسلها على المتوسطة منها. بالنسبة للمواصفات المتوسطة والحضانة، يرجى الرجوع إلى الجدول 2.
  3. فحص الحركة
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها (ق) في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. غسل بيليه الخلية (ق) على النحو المحدد في بروتوكول 2.6.
    3. تطعيم لوحات أجار الحركة عن طريق إدخال طعم تطعيم في ثقافة السائل غسلها و "طعن" عموديا في وسائل الإعلام. بين كل التلقيح، تعقيم طعنة الأسلاك باستخدام الموقد بنسن، وعندما طعن أجار، وضمان طعن تطعيم لا ينحني، وهذا يمكن أن يغير النتائج.
    4. احتضان لوحات غطاء الجانب حتى لمدة 14 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد 14 ساعة، رصد لوحات الحركة بشكل وثيق لمنع فرط نمو الثقافات.
  4. فوجيس-بروسكور (ف) الفحص
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها (ق) في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. تطعيم 4مل من ميثيل الأحمر فوجيس بروسكاور، أو مرق ف م، عن طريق بيبتينغ 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها أعدت سابقا إلى 4 مل مر-ف مرق في أنبوب الثقافة العقيمة واحتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 150 ميكرولتر من 5٪ (ث / ت) α-نفثول و 50 ميكرولتر 40٪ (ث / ت) كوه إلى 1 مل قسامات من مر-ف الثقافة بين عشية وضحاها في أنابيب الثقافة العقيمة، على التوالي.
    4. دوامة لفترة وجيزة والسماح الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 ساعات حتى يتغير لون يتطور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للصيانة المناسبة واستخدام أي سلالة بكتيرية، فمن المستحسن أن نعرف الوقت مضاعفة من سلالة (ق) من الفائدة. هنا، ومعدلات النمو المتفاوتة من شائعة الاستخدام V. وظهرت سلالات الكوليرا من خلال منحنى النمو، وتحسبت مرات مضاعفة تقريبية باستخدام الانحدار الخطي. أظهرت وت إل تور N16961 و إل تور البديل MQ1795 أقصر مضاعفة مرات (~ 1 ساعة و ~ 1 ساعة، على التوالي) من وت الكلاسيكية O395 (~ 2 ساعة) ( الشكل 1 ؛ الجدول 2 ).

V. الكوليرا التلاعب الجيني والتحليل اللاحق غالبا ما تعتمد على القدرة على التمييز بشكل صحيح بين الأنماط الحيوية. وقد تم تنفيذ شاشات الجينية الوراثية القائمة على ير والفحوصات المظهري بشكل جماعي كنظام يمكن الاعتماد عليه للتمييز بين الخلفيات بيوتيب من V. الكوليرا السريرية والبيئية طsolates. لتمثيل، سلالات مرجعية النمط الحيوي (وت الكلاسيكية O395، وت إل تور C6706، وت إل تور N16961) وتم تضمين المتغيرات إل تور ممثل (MQ1795 و با-2163) ( الجدول 1 ). أظهرت وت الكلاسيكية O395 الكلاسيكية كتسكب وتسلسل تكبا. وعلى العكس من ذلك، أظهرت سلالات وت إل تور N16961 و C6706 متواليات إل تور كتكس و تكبا. ومن المثير للاهتمام، MQ1795 و با-2163 تحتوي على الوحدات النمطية الكلاسيكية كتكسب بيوتيب مماثلة ل O395، ولكن كلا المتغيرات إل تور الواردة تكبا يدل على خلفية النمط إل تور ( الجدول 1 ). اظهرت السلالة البيولوجية الكلاسيكية سلالة O395 حساسية ل بوليميكسين B، في حين أظهرت سلالات الطور البيولوجي وت إل تور (C6706 و N16961) المقاومة وعرضت النمو على لوحات أجار لب تستكمل مع بوليميكسين B. ممثل إل تور سلالات البديل (MQ1795 و با-2163) أظهرت مقاومة مماثلة للمضادات الحيوية نسبة إلى وت إل تور النمط الحيوي سترا(C6706 و N16961) ( الشكل 2 ؛ الجدول 2 ). لم تنمو وت الكلاسيكية سلالة بيوتيب O395 على وسائل الإعلام سيترات الحد الأدنى، في حين كانت سلالات وت إل تور (C6706 و N16961) قادرة على الاستفادة من سيترات كمصدر الكربون ونمو المعرض على الحد الأدنى من وسائل الإعلام سترات. وأظهرت السلالات النموذجية إل تور البديل بيوتيب (MQ1795 و با-2163) نمو مماثل لتلك التي سلالات وت تو تور النمط البيولوجي (C6706 و N16961) ( الشكل 3 ، الجدول 2 ). وت سلالة O395 الكلاسيكية و وت إل السلالة N16961 تمتلك هابر غير وظيفية، وبالتالي لم تثبت هابر تنظيم النشاط البروتيني. (TQ1795 و با-2163) هي هابر -positive وتصور كمنطقة التخليص المنبثقة من نقطة التلقيح ( الشكل 4 ، الجدول 2 ). وت سلالة O395 الكلاسيكية لا تفرز الإنزيمات الانحلالية وكان لذلك(β-γ- انحلالي الدم)، بينما تفرز السلالات ذات النبائط البيولوجية (T6706 و N16961) و سلالة إل تور (MQ1795 و با-2163) الإنزيمات الانحلالية التي تخفف تماما خلايا الدم الحمراء المحيطة بنقطة التلقيح و أظهرت انحلال الدم β 5 ؛ الجدول 2 ). الحركة تختلف عبر، وداخل، سلالات بيوتيب. ومع ذلك، أظهرت السلالة T تور السلالة N16961 ومتغيرات إل تور (MQ1795 و با-2163) فرط الحركة بالمقارنة مع أقل نسبيا حركية وت سلالة O395 الكلاسيكية و وت إل تور سلالة C6706 ( الشكل 6 ؛ الجدول 2 ). ولم يتغير O395 سلالة الكلور الكلاسيكية وممثلة إل تور لمتغيرات الجلوكوز لإنتاج أسيتوين، في حين أن سلالات وت إل تور من النمط الحيوي تنتج أسيتوين كمنتج ثانوي لتخمر الجلوكوز، كما يتضح من تطور لون أحمر عميق أثناء فحص فوجيس-بروسكور ( الشكل 7 ؛ الجدول 2 ).

التواء كتكسب جين TCPA مرجع
بيس 115 القاعدة 203 نمط حيوي نمط حيوي
O395 C C كلاسيكي كلاسيكي 8
C6706 تي تي إل تور إل تور 8
N16961 تي تي إل تور إل تور 8
MQ1795 C C كلاسيكي إل تور 13
ايه-2163 C C كلاسيكي إل تور 8

الجدول 1: بيوتيب ديستندنت ديستنتيونس ديكتيون أوف فيبريو كوليراي سترينس. يظهر في هذا الجدول التغييرات قاعدة الحمض النووي والمواقف النسبية في الجينات كتكسب و تكبا . وت الكلاسيكية O395 و وت سلالات إل تور N16961 و C6706 تستخدم عادة سلالات مرجع النمط البيولوجي. MQ1795 و با-2163 معروفة المتغيرات إل تور.

فحص الوضعية اختيار متوسط حضانة نتائج متوقعة
O395 C6706 N16961 MQ1795 ايه-2163
2.3) منحنى النمو 27 يحدد أوقات مضاعفة مختلف سلالات الكوليرا 1.2) السائل لب المرق تصل إلى 30 ساعة (37 درجة مئوية مع التهوية) ~ 2 ساعة ND * ~ ساعة واحدة ~ ساعة واحدة ND *
3.1) ير على الشاشة الجينية باستخدام كتكسب و تكبا 8 يميز بين الكلاسيكية و إل تور بيوتيب الخلفيات من كتكس N / A N / A كلاسيكي إل تور إل تور كلاسيكي كلاسيكي
يميز بين الكلاسيكية و إل تور بيوتيب الخلفيات من تكبا N / A N / A كلاسيكي إل تور إل تور إل تور إل تور
3.2) بوليميكسين B المقاومة 21 الحساسية للمضادات الحيوية بوليميكسين B 1.5) لب أجار لوحات تستكمل مع بوليميكسين B 18 ساعة (37 درجة مئوية) - + + + +
3.2) الأيض سيترات 22 القدرة على استقلاب السترات كمصدر وحيد للكربون 1.6) الحد الأدنى من السيترات لوحات أجار متوسطة 24 ساعة (37 درجة مئوية) - + + + +
3.2) الكازين التحلل 23 نشاط البروتيني هابر 1.7) لوحات أجار الحليب 18 ساعة (37 درجة مئوية) - - + + +
3.2) انحلال الدم 23 يقيس النشاط الانحلالي لوحات أجار الدم 48 ساعة (37 درجة مئوية) غاما بيتا بيتا بيتا بيتا
3.3) الحركة 23 تدابير درجة من الحركة 1.8) لوحات أجار الحركة 14-24 ساعة (37 درجة مئوية) 10 ملم 15 ملم 21 ملم 25 ملم 29 ملم
3-4 فوجيس-بروسكور 21 تدابير القدرة على تخمر الجلوكوز وإنتاج أسيتوين كمنتج ثانوي 1.9) السائل فوجيس-بروسكاور المتوسطة تصل إلى 4 ساعات (درجة حرارة الغرفة) - + + - -
ملاحظة: "ند *" يدل على عدم تحديد؛ "+" يدل على نتيجة إيجابية. "-" يدل على نتيجة سلبية

الجدول 2: ملخص الفحوصات الوراثية والوضعية المستخدمة في ضمة الكوليرا بيوتيب التميز. يلخص هذا الجدول مختلف المقايسات الوراثية والمظاهر الظاهرية، والتطبيقات، والنتائج المتوقعة المستخدمة بشكل جماعي للتمييز بين النمط الكلاسيكي و إل تور بيوتيبس المستخدمة في هذه الدراسة. يشار إلى أرقام البروتوكول والمراجع إلى بروتوكولات محددة في العمود فحص. "ند *" تدل على عدم التحديد؛ "+" يدل على نتيجة إيجابية. "-" يدل على نتيجة سلبية.

شكل 1
الشكل 1: V. الكوليرا منحنى النمو من وت الكلاسيكية O395، وت إل تور N16961، والطور البديل MQ1795. تم تحليل معدلات نمو السلالات المرجعية بيوتيب (وت الكلاسيكية O395 و وت إل تور N16961) وممثل إل تور متغير MQ1795، نمت في مرق لب مع التهوية عند 37 درجة مئوية، وقياس أود 600 هساعة جدا تبدأ في T 0 . تم تنفيذ منحنيات النمو على 8 مكررات تجريبية مستقلة، مع كل تكرار يمثل حدث زراعة مستقلة لكل تجربة. أظهرت السلالة T تور T16171 و إل تور البديل MQ1795 مرات مضاعفة أقصر (~ 1 ساعة و ~ 1 ساعة، على التوالي) نسبة إلى وت سلالة O395 الكلاسيكية (~ 2 ساعة)، كما لوحظ من قبل وقتا أطول مضاعفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تحديد بوليميكسين B المقاومة باستخدام لب أجار تكملة مع بوليميكسين B. تم تحديد مقاومة الببتيد المضادات الحيوية بوليميكسين B من القدرة على النمو على لب أجار تستكمل مع 50 وحدة دولية / ميكرولتر ميكسولتر B. وت السلالة الكلاسيكية O395 أظهرت أي نمو على أجار ملحقإيمنتيد مع بوليميكسين B واعتبرت حساسة للمضادات الحيوية. في حين أظهرت سلالات وت إل تور (C6706 و N16961) ومتغيرات إل تور ممثل (MQ1795 و با-2163) النمو في وجود المضادات الحيوية واعتبرت مقاومة للبوليمكسين B. تم تحضين لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: قياس الأيض السيترات باستخدام وسائل الإعلام السيترات الحد الأدنى. وقد تم تحديد القدرة على استخدام السترات كمصدر وحيد للكربون من خلال قدرة العزلة على النمو على وسائل الإعلام السيترات الدنيا. وت سلالة O395 الكلاسيكية لم تنمو على الحد الأدنى من الوسائط سيترات (سلبية). وكان النمو واضحا من قبل جميع السلالات وت إل تور (C6706 و N16961) وممثل إلتور (MQ1795 و با-2163)، مما يدل على القدرة على استخدام سيترات كمصدر وحيد الكربون (إيجابي). وحضنت لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: قياس التحلل الكازين التحلل الكازين بروتين باستخدام حليب وسائل الإعلام. تم تحديد تحلل الكازين من خلال نشاط البروتيني الذي ينظم هابر عن طريق منطقة بصرية من إزالة المحيطة نقطة التلقيح على آغار الحليب. سلالات تحتوي على هابر غير وظيفية، مثل وت سلالة O395 الكلاسيكية وسلالة وت إل تور N16961، لم تنتج منطقة إزالة المحيطة نقطة التلقيح ( هابر - سلبية). وت إل تور سلالة C6706 وممثل المتغيرات إل تور (MQ1795 و با-2163) يحتوي على هابر وظيفية، والتي يمكن تصورها على أنها مناطق مختلفة الحجم من التخليص ( هابر -positive). وحضنت لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: قياس النشاط الانحلالي باستخدام الدم أجار وسائل الإعلام. تم قياس النشاط الانحلالي باستخدام لوحات أجار تستكمل مع دم الأغنام. وت سلالة O395 الكلاسيكية لا تفرز الإنزيمات التي تحرر خلايا الدم الحمراء (γ الانحلالي). تفرز سلالات تور تور (N16961 و C6706) ومتغيرات إل تور ممثل (MQ1795 و با-2163) تفرز الإنزيمات الانحلالية، مما أدى إلى منطقة شفافة من إزالة المحيطة نقطة التلقيح (β الانحلالي). وحضنت لوحات في 37° C لمدة 48 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: تحديد الحركة باستخدام لوحات أجار الحركة. تم الإشارة إلى منطقة الحركة بتغير لون بصري لملح تك الذي يتحول من واضح إلى أحمر عند استقلابه، مما يشير إلى المكان الذي انتقلت فيه البكتيريا. أظهرت السلالة الكلاسيكية O395 (10 ملم) وسلالة إل تور C6706 (15 ملم) الحركة الدنيا، بينما سلالة إل تور N16961 (21 مم) ومتغيرات إل تور التمثيلية (MQ1795 (25 مم) و با-2163 (29 مم) ) أظهرت فرط الحركة مقارنة ب O395 و C6706. وحضنت لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. من فضلك اضغطهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: فوجيس-بروسكور الفحص. تم تحديد إنتاج أسيتوين عن طريق تخمير الجلوكوز باستخدام مقايسة فوجيس-بروسكور. لم ينتج عن السلالة الكلاسيكية O395 و متغير إل تور (MQ1795 و با-2163) أسيتوين نتيجة تخمر الجلوكوز (سلبي). سلالات وت إل تور (N16961 و C6706) تنتج أسيتوين ثانوي ويمكن تصور من قبل تغيير لون أحمر عميق (إيجابي). تم تحضين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من أكثر من 200 حددت V. مجموعات كوليراي، O1 فقط و O139 لديها إمكانات وبائية. يمكن تقسيم المجموعة المصلية O1 إلى نوعين بيوتيبس: الكلاسيكي و إل تور. ومع ذلك، ظهرت سلالات هجين، وصفت المتغيرات إل تور 13 ، 17 ، التي تمتلك الخلفية النور إل تور، وخصائص الكلاسيكية الميناء 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . تم تصميم البروتوكولات الموصوفة في هذه المخطوطة لتوفير المحققين، المهتمين في وصف و / أو التمييز بين مختلف العزلات السريرية وغير السريرية للفصمة الكوليرا ، مع يمكن الاعتماد عليهامتعددة-- تحديد نظام الفحص. استخدام نظام التعرف متعددة مقايسة يمكن الاعتماد عليها كبديل هو تحسين على أنظمة تحديد مقايسة واحدة أنشئت سابقا والشاشات الوراثية كثيفة العمالة. يجب أن تشمل جميع المقايسات الوراثي والمظاهر الظاهرية وت سلالة O395 الكلاسيكية و وت سلالات إل تور C6706 و N16961 للمقارنة ( الجدول 1 ). في حين يتم تضمين سلالات البيوتيب الكلاسيكية و إل تور للمرجعية، والعزلات، مثل MQ1795 و با-2163 المدرجة في دراساتنا، ويمكن عرض ملامح المظهري من أي نوع بيوتيب ( الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7 ؛ الجدول 2 )، مما يدل على الحاجة إلى تحليل الصفات الوراثية والوراثية المظهرية متعددة لتوصيف يمكن الاعتماد عليها. وينبغي تنفيذ جميع البروتوكولات من العقيملي 26 في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. V. الكوليرا هو مستوى السلامة الأحيائية 2 (بسل-2) الممرض الذي هو العامل المسببة للكوليرا مرض الجهاز الهضمي المحتمل أن تكون قاتلة. يجب أن يتم التعامل مع جميع المواد والمنتجات النفطية والتخلص منها بشكل سليم وفقا للوائح المؤسسية والمحلية والولائية والفيدرالية.

يجب أن يتم إعداد جميع وسائل الإعلام والكواشف باستخدام الكواشف الصف التحليلية والماء منزوع الأيونات منزوع الأيونات إلى الحد الأدنى من حساسية 18 MΩ-سم. قبل المعالجة، يجب إعداد وسائل الإعلام والسماح لها الجافة بما فيه الكفاية (1-2 أيام). تعتبر لوحات جافة بما فيه الكفاية عندما لا يوجد سائل المتبقية على سطح أجار. نظرا إلى مجموعة الحركة ومناطق إزالة المحيطة النمو البكتيري، يجب إعداد لوحات الحركة والحليب في أطباق بتري كبيرة (150 ملم × 15 ملم) تصل إلى 50 مل لكل لوحة، ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 أسبوع ملفوفة في البلاستيك ، ليد الجانب أسفل في 4 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبط تركيز أجار لوحات الحركة لإبطاء الحركة. ومع ذلك، فمن غير المستحسن أن يتجاوز 3 غرام من أجار لكل 500 مل الحل، وهذا سوف يقلل بشكل كبير من الحركة الشاملة بحيث الفروق لن تكون قابلة للرصد. وينبغي إعداد جميع وسائط لوحة أخرى إلى حوالي 25 مل لكل لوحة في أطباق بتري القياسية الحجم (100 مم × 15 مم) ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى ستة أشهر ملفوفة في البلاستيك، جانب الجانب أسفل في 4 درجة مئوية. لإعداد لوحات بوليميكسين ب، فمن المهم السماح للالوسائط المنصهرة لتبرد بعد التعقيم قبل إضافة البوليمكسين B، والحرارة المفرطة يمكن أن تتحلل المضادات الحيوية. لوحات بوليميكسين B يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أشهر ملفوفة في البلاستيك، الجانب الجانب أسفل في 4 درجة مئوية. تتطلب الفحوصات التي نوقشت في هذه المخطوطة يوما لنمو مستعمرة واحدة (12-16 ساعة)، يوما إضافيا لنمو الثقافات بين عشية وضحاها (12-16 ساعة)، واليوم الثالث لاعتبارات التراكيب الوراثية (~ 4 ساعات ل دن الكروموسوماتعزل و ~ 3 ساعة ل ير) أو المقايسات المظهري (18-48 ساعة؛ الجدول 2 ). قبل التحليل الكيميائي البيوكيميائي للفحوصات المظهري وصفها في هذه المخطوطة، يجب غسل الثقافات في برنامج تلفزيوني 1X لمنع المتبقية نقل وسائل الإعلام ثقافة من الانحراف النتائج. بالإضافة إلى ذلك، بوليميكسين B، سترات، النشاط البروتيني، انحلال الدم، وفحوصات الحركة يمكن تلقيحها في وقت واحد باستخدام ثقافة واحدة بين عشية وضحاها غسلها. عند اكتشاف وسائل الإعلام مطلي، قد تحدث البقع من الثقافات ويمكن أن يؤدي إلى تلوث الصليب بين السلالات. لمنع ترشيش، وتجنب تماما إخراج الثقافة من ماصة، بدلا من ذلك وقف إخراج الثقافة في المحطة الأولى من ماصة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح البقع على استيعاب كامل في سطح أجار قبل الحضانة، ورعاية عدم ثقب أجار، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج. المقايسات النمطية مما أدى إلى مناطق التخليص ( الشكل 4 ؛ الشكل 5 ؛ الجدول 2) و / أو الحركة ( الشكل 6 ؛ الجدول 2 ) المحيطة نقطة التلقيح، ينبغي أن تكون متباعدة إلى أقصى حد لمنع دمج مناطق التخليص أو النمو، على التوالي، والتي يمكن قياس أقطار كل منها للتحليل المقارن. بعد أوقات حضانة المشار إليها، ويمكن تصوير العزلات وتحليلها النسبية لسلالات مرجعية بيوتيب (وت الكلاسيكية O395، وت إل تور C6706، وت إل تور N16961).

ويمكن استخدام الشاشات الوراثية المستندة إلى ير من خلال تسلسل المبينة في هذه المخطوطة لتحديد خلفية العزلة بيوتيب فيما يتعلق كتكسب و تكبا ، بعد التضخيم ير الأولية. تتطلب المبادئ التوجيهية التسلسل القياسية كمية محددة من المنتج ير اعتمادا على حجم المنطقة تضخيم (580 نقطة أساس ل كتكسب و 1420 نقطة أساس ل تكبا )، ولإعداد ردود الفعل، ويمكن اتباع بروتوكولات أنشئت. باختصار، الفردية إلى الأمام و rوينبغي إعداد ردود الفعل تسلسل إيفرس مع 3-5 بمول من التمهيدي / رد فعل، وحجم يجب تعديلها إلى 20 ميكرولتر مع الماء عالى النقاء العقيمة في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. للمساعدة في تصميم التمهيدي لكل من التضخيم ير والتسلسل، يمكن استخدام أداة تصميم التمهيدي نسبي http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. تم إنجاز التضخيم وتسلسل كتكسب و تكبا بنجاح باستخدام الاشعال التالية (5 '→ 3'): كتكسب- غواردغتكتاغاتكاتغاتاغاتاتاك، كتكس- ريفيرز كاتكاتسغاكاكاغكتاكتاغ، تكبا -forward كغكاكاتغاكتغتغ، تكبا -reverse غغغاكاتاكاككتغغكاغ. وتجدر الإشارة إلى أن منطقة الترميز بأكملها من كتكس يتم الحفاظ على كل من بيوتيبس باستثناء المواقف الأساسية 115 و 203 (على حد سواء السيتوزين في الكلاسيكية والثيمين في إل تور). بالإضافة إلى ذلك، في تكبا ، يتم حفظ تغييرات قاعدة متعددة بين الأنماط الحيوية التي دإفر عبر اثنين من بيوتيبس ( الجدول 1 )، والتي يمكن استخدامها للمساعدة في التمييز بين الأنماط الحيوية.

في العديد من الدراسات المختبرية التي تنطوي على كائن نموذج V. الكوليرا ، الصيانة المناسبة وتقنيات زراعة حاسمة 27 . معدلات النمو من شائعة الاستخدام V. كوليرا السلالات المرجعية النمط الحيوي، مثل وت سلالة O395 الكلاسيكية و وت إل السلالة N16961، يمكن أن توفر نظرة مفيدة في توصيف العزلات البديل إل تور ( الشكل 1 ، الجدول 2 ). بسبب معدلات النمو المتفاوتة عبر V. عزلات الكوليرا ، فمن المهم أن تأخذ قراءات الامتصاصية الطيفية كل ساعة حتى تصل الثقافات أقصى قدر من التعكر خلال المرحلة الثابتة في وقت متأخر. قد لا تصور مرحلة الوفاة من منتصف إلى متأخرة بسبب هضبة في العكارة الناتجة عن الحطام الخلوي الزائد. A 1: 4 تخفيف الثقافة إلى L العقيمة وينبغي إجراء مرق B للحصول على منحنى النمو الكامل والحفاظ على دقة الصك، وقراءات الامتصاصية الذروة في أود 600 ≈ 1.0. عند تنفيذ منحنيات النمو على سلالات متعددة، وقراءات الامتصاصية يجب أن يكون توقيت ما يقرب من 5 دقائق بعيدا عن كل سلالة لضمان الاتساق بين القراءات. فهم V. تعد معدلات نمو النمط البيولوجي من الكوليرا أمرا بالغ الأهمية بالنسبة للعديد من التحقيقات بما في ذلك دراسات تعبير الجينات الفوعة وتحليل الأنشطة الأيضية وظروف الحفظ والتخزين المناسبة. لتحليل لاحق، ينبغي معالجة الثقافات بين عشية وضحاها في سجل متأخر إلى مرحلة ثابتة ثابتة من النمو (12-16 ساعة) لتحقيق أقصى قدر من نمو الخلايا بعد الحفاظ على سلامة الخلوية.

ظروف زراعة السلالات الكلاسيكية و إل تور بيوتيب متشابهة، ومع ذلك، تحليل الفوعة التعبير الجيني في V. الكوليرا يتطلب الفوعة النوعي الفوعة الظروف المحرضةالمرجع "> 19. يتم التحكم في اثنين من عوامل الفوعة الرئيسية كت و تكب، من قبل منظم الرئيسي توكست، ويتم التعبير عنها على النحو الأمثل في ظل ظروف نمو محددة؛ على سبيل المثال، تحت إل تور الفوعة الظروف تحفيز يمكن تحليل توكست عن طريق معالجة استخراج خلية كاملة ( وس)، أو بيليه الخلية، في 3.5 ساعة، في حين يمكن تحليل كت و تكب التعبير عن طريق معالجة طاف خالية من الخلايا و وس في 7.5 ح، على التوالي 8 ، 20. وتظهر الصفات الجينية والوراثية المظهرية المتفاوتة التي تظهر في جميع هذه المخطوطة كيف متنوعة V. كوليراي بيوتيبس يمكن أن يكون، وتوضيح الحاجة إلى بديل من التوصيف البيولوجي وحيد المقايسة المستخدمة سابقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

البحوث التي تدعمها نيو هامبشاير-إنبري من خلال جائزة التنمية المؤسسية (إيديا)، P20GM103506، من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% Glycerol Calbiochem 356352 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar Becto, Dickinson and Co. 214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusion Becto, Dickinson and Co. 237500 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agarose Peqlab 732-2789 https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4 Fisher Scientific P288-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar Plates Remel R01200 Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric Acid Fisher Scientific A73-500 https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol Blue Fisher Scientific B388-10 https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2O Fisher Scientific S72836-3 https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit New England Biolabs N0446S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTA Fisher Scientific S311-500 https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit Zymo Research D4007 http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid Stain Biotium 41005 https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208100 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit Qiagen 158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl Fisher Scientific A144-212 Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KCl Fisher Scientific P217-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOH Fisher Scientific P250-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le Loop Decon Labs Inc. MP190-25 http://deconlabs.com/products/leloop/
Le Stab Decon Labs Inc. MP186-5 http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2O Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio Rad Labs 1704406 http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP Broth Difco 216300 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaCl Fisher Scientific S271-10 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4·4H2O Fisher Scientific S218-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite Spectrophtometer Thermo Scientific ND-LITE-PR https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milk Nestle Carnation N/A N/A
Peptone Becto, Dickinson and Co. 211677 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Petri Dishes (150 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875714 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Polymyxin B sulfate salt Sigma-Aldrich P1004-10MU Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction Buffer New England Biolabs M0273S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs 1840148 http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chloride Alfa Aesar A10870 https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
Tryptone Becto, Dickinson and Co. 211705 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Yeast Extract Becto, Dickinson and Co. 212750 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-napthol MP Biomedicals 204189 http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28, (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71, (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177, (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342, (8868), 387 (1993).
  5. Barua, D. History of Cholera. Cholera. Barua, D., Greenough III, W. B. Plenum Publishing Corporation. 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. Caister Academic Press. 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77, (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49, (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48, (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. The Mozambique cholera vaccine demonstration project coordination group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10, (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297, (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40, (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40, (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55, (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. Horizon Scientific Press. 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55, (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42, (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1, (5), e00253 (2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30, (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57, (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218, (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46, (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3, (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics