Author Produced

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Biochemistry
 

Summary

هياكل الجمعيات البروتين سوبراموليكولار في قرار الذرية ذات أهمية عالية نظراً لدورهم الحاسم في مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية. وهنا، نقدم بروتوكولا لإجراء دراسات الهيكلية ذات الدقة العالية على التجميعات البروتين الجزيئات غير قابلة للذوبان وغير البلورية بالسحر-زاوية الغزل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر ماس).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التجميعات البروتين supramolecular أدواراً أساسية في العمليات البيولوجية التي تتراوح بين المضيف الممرض التفاعل، العدوى الفيروسية للدعوة لاضطرابات الأعصاب. هذه التجميعات تتألف من عدة مفارز البروتين نظمت بطريقة غير التساهمية لتشكل الأجسام الجزيئات الكبيرة التي يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية أو التسبب في آثار ضارة. الذرية ثاقبة آليات الجمعية وسير عمل هذه الجمعيات الجزيئات تظل غالباً النادرة منذ بهم إينسولوبيليتي الأصيل وغير كريستالينيتي يخفض بشكل كبير وكثيراً ما نوعية البيانات التي تم الحصول عليها من معظم التقنيات وتستخدم في علم الأحياء الهيكلية، مثل حل "الرنين المغناطيسي النووي" (الرنين المغناطيسي النووي) وعلم البلورات بالأشعة السينية. ونقدم هنا الغزل ماجيك-زاوية أطياف الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) كوسيلة قوية للتحقيق في هياكل الجمعيات الجزيئات في القرار الذري. سنمر يمكن أن تكشف عن تفاصيل الذري في المجمع تجميعها دون قيود الحجم والقابلية للذوبان. البروتوكول المقدمة هنا توضح الخطوات الأساسية من إنتاج 13ج/التجميعات المسماة النظائر الجزيئات بروتين15N للحصول على معيار سنمر الأطياف وتحليلها وتفسيرها. على سبيل مثال، نعرض الأنبوب التحليل الهيكلي سنمر جمعية البروتينات الخيطية.

Introduction

التقدم في الزاوية ماجيك الغزل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) توفر أداة فعالة لتحديد خصائص الهيكلية للتجميعات البروتين الجزيئات في قرار ذرية. هذه التجميعات البروتين هي نظم في كل مكان التي تلعب دوراً أساسيا في العديد من العمليات البيولوجية. هياكلها الجزيئي والتفاعلات والديناميات يتم الوصول إليها عن طريق الدراسات سنمر، كما أظهرت الفيروسية (كابسيدس1) وآليات العدوى البكتيرية (إفراز أنظمة2،3، بيلي4)، والغشاء البروتين المجمعات5،6،،من78 والوظيفية أميلويدس 9،،من1011. يمكن أيضا أن تثير هذا النوع من الجمعية الجزيئية الأمراض كما هو الحال في أمراض الأعصاب حيث التجمع في تجمعات، اميلويد الدول البروتينات ويسبب السلوك الشاذ الخلية أو الخلايا وفاة 12،13. غالباً ما يتم بناؤها التجميعات البروتين قبل أوليجوميريزاتيون متماثل من مضاعفات نسخاً من مفارز البروتين في الكائنات سوبراموليكولار كبيرة من مختلف الأشكال بما في ذلك ييفات، خيوط، المسام، وأنابيب، أو جسيمات نانوية. ويعرف هيكل رباعي التفاعلات الضعيفة بين مفارز البروتين لتنظيم الجمعية المكانية والزمانية والسماح للوظائف البيولوجية المتطورة. التحقيقات الهيكلية على نطاق الذري في هذه التجميعات تحديا لتقنيات عالية الدقة منذ على إينسولوبيليتي الذاتية وفي كثير من الأحيان على غير كريستالينيتي يقيد استخدام علم البلورات بالأشعة السينية التقليدية أو حل الرنين المغناطيسي النووي النهج. زاوية ماجيك الغزل سنمر (ماس) هو أسلوب ناشئة للحصول على بيانات القرار الذري على التجميعات الجزيئات غير قابلة للذوبان وأثبتت كفاءتها لحل نماذج ثلاثية الأبعاد الذرية لعدد متزايد من الأنظمة الجزيئية البيولوجية المعقدة، بما في ذلك خيوط البكتيرية وجمعيات اميلويد والجسيمات الفيروسية 14،،من1516،17،،من1819،20، ،من 2122. وقد أنشأت التقدم التقني في مجالات مغناطيسية عالية والتطورات المنهجية وإعداد نموذج "سنمر ماس" إلى وسيلة قوية للتحقيق في البروتينات غير قابلة للذوبان في بيئات مختلفة، لا سيما في تلك الناحية البيولوجية ذات الصلة بالجزيئات جمعت الدولة أو في الأغشية الخلوية، مما يجعل التقنية عالية مكملة الميكروسكوب الإلكتروني cryo. في كثير من الحالات، تميز بدرجة عالية جداً من التماثل هذه التجميعات البروتين. سنمر ماس يستغل هذه الميزة، كما أن جميع وحدات البروتين في تجميع هوموموليكولار نفس الهيكل المحلي وبالتالي تقريبا نفس سنمر التوقيع، الحد بشكل كبير إلى تعقيد التحليل.

بروتوكولا تتسم بكفاءة للدراسات الهيكلية للتجميعات البروتين الجزيئات بماس معتدلة (< 25 كيلو هرتز) سنمر يرد في هذا الفيديو، ويمكن تقسيمها إلى خطوات مختلفة (الشكل 1). وسوف نظهر المراحل الحرجة لسير العمل لدراسة هيكلية سنمر مثالاً على تجميع البروتينات الخيطية (انظر أبرز الخطوات في الشكل رقم 1)، باستثناء تنقية البروتين الوحيدات، مختلفة لكل بروتين الجمعية العامة ولكن من الأهمية الحاسمة للدراسات الهيكلية، ودون الخوض في التفاصيل التقنية/المنهجية سنمر حساب التحليل الطيفي، وهيكل لما البرامج التعليمية المتخصصة على شبكة الإنترنت. في حين أن هذا البروتوكول سوف تركز في المقام الأول على تجارب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة المؤداة بموجب شروط ماس، الاستخدام محاذاة البيئات البيولوجية 23،24،،من2526 , 27، مثل محاذاة بيسيليس، تسمح للتحقيق في تشكيل البروتين والتفاعل البروتين البروتين الحيوي في وسائل الإعلام مثل الغشاء دون تكنولوجيا ماس. ونحن سوف تظهر تعبير البروتين وخطوات الجمعية، فضلا عن تسجيل الأطياف سنمر الحاسمة، والتحليل والتفسير. أن هدفنا تقديم رؤى في خط الأنابيب التحليل الهيكلي مما يتيح للقارئ لإجراء دراسة هيكلية الذرية قرار جمعية الجزيئات بتقنيات سنمر.

ويشمل البروتوكول 3 أقسام:

1-الحالة الصلبة إنتاج نموذج الرنين المغناطيسي النووي

شرطا مسبقاً لإجراء تحليل الرنين المغناطيسي النووي الصلبة، مكونات البروتين من الجزيئات الجمعية الحاجة إلى التعبير عن، المسماة النظائر والمنقاه وتجميعها في المختبر في الدولة معقدة مثل أصلي (بالنسبة مثال انظر الشكل 2) . مطلوب تخصيب النظائر في 13ج و 15ن وسم لضمان حساسية الرنين المغناطيسي عالية، من خلال استخدام وسائط التعبير البكتيرية الحد الأدنى تستكمل مع 13ج و 15ن المصادر، مثل شكل موحد 13 ج-يسمى الجلوكوز/الجلسرين و 15NH4Cl على التوالي. في مرحلة لاحقة من البروتوكول، بشكل انتقائي عينات المسمى ج 13المنتجة بشكل انتقائي 13ج-وصفت مصادر مثل (1، 3-13ج)-و (2-13ج)-الجلسرين (أو (1-13ج)-و (2-13ج)- الجلوكوز) وتستخدم لتسهيل تحليل الرنين المغناطيسي النووي. عينة المسمى مختلطة المقابلة لأن خليط اكويمولار أما من 50% 15N-و 50% 13ج المسمى أو 50% (1، 3-13ج)-و 50% (2-13ج)-يتم إدخال الجلوكوز لوصف الكشف عن الجزيئات التفاعلات. درجة عالية من النقاء البروتين، فضلا عن شروط صارمة أثناء الخطوة الجمعية هي العوامل الرئيسية لضمان نظام هيكلية متجانسة من العينة النهائية.

2-أولى توصيف الهيكلية استناداً إلى الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي أحادي البعد (1-د)

نحن نقدم هذه التجارب ضرورية لإجراء تحليل هيكلية التي سنمر. أحادي البعد (1-د) عبر الاستقطاب (CP) وعنبة/رينيبت28 التجارب، والكشف عن نواة 13ج تستخدم للكشف عن شرائح البروتين جامدة ومرنة في الجمعية العامة، على التوالي، وتقدير درجة الهيكلية التجانس وتعدد الأشكال المحلية (بالنسبة مثال انظر الشكل 3).

رونغ > 3. تحليل كونفورماشونال و 3D تصميم هيكل

قلق الفقرتين الفرعيتين 1 و 2 في التحليل كونفورماشونال، الذي يرتكز على إحالة جميع المخلفات الصلبة الجمعية البروتين، صدى سنمر التحولات الكيميائية هي تحقيقات حساسة جداً للبيئة المحلية، ويمكن استخدامها للتنبؤ phi/المبادرة زوايا زوجية وثم تحديد هيكل الثانوية. ويبين الشكل 4 مثال على مهمة الرنين متسلسلة في صلب جامد جمعية البروتين. تحديد هيكل 3D يستند إلى جمع البيانات الهيكلية مثل إغلاق قيود المسافة ترميز التقارب (< Å 7-9)، التي تتضمن على حد سواء داخل ومعلومات الجزيئات. تصف الفقرتان الفرعيتان 3 و 4 جمع النفس بعيدة المدى وتفسيرها. يتم تعريف اتصالات بعيدة المدى كالتقارب13ج إينتراموليكولار 13ج-الناجمة عن بقايا أنا إلى ياء، مع | i-ي | إيه فور، تحديد وبالتالي إضعاف البروتين العالي فرعية أحادي، أو ك الجزيئات 13ج-13ج التقارب، وتعريف الواجهات الجزيئات بين مفارز البروتين في الجمعية العامة. داخلها وواجهات الجزيئات موضحة في الشكل 5. الكشف عن القيود سنمر من خلال 13ج-13ج وترميز 15N-13ج ريكوبلينج التجارب عادة لمسافات إينتيرنوكليار < 1 نانومتر. ويوضح البند الفرعي 4 الكشف عن قيود المسافة الجزيئات. في التجميعات البروتين متناظرة، استخدام عينات البلوتينيوم المسمى (أي 100% شكل موحد أو بشكل انتقائي المسمى) لتحديد التفاعلات بين الجزيئات وحدة فرعية-فرعية محدودة، ككل داخل-وبينها-موليكولار اتصالات تؤدي إلى إشارات قابلة للاكتشاف. ويتحقق الكشف لا لبس فيه عن التقارب الجزيئات باستخدام عينات المسمى المختلطة، التي تحتوي على خليط مادة اكويمولار من عينتين مسماة بشكل مختلف، جنبا إلى جنب قبل التجميع. ويدخل الجزء الفرعي 5 بإيجاز النمذجة هيكل.

Figure 1
الشكل 1 : سير العمل دراسة الهيكلية الذرية القرار بالرنين المغناطيسي النووي الصلبة. 13 ج، 15ن النظائر المسمى إنتاج البروتين، تنقية وحدة فرعية، فرعية للجمعية العامة، والسيطرة على تشكيل الجمعية وسنمر التجارب وتحليل التجربة سنمر والاستخراج من قيود المسافة، وتظهر بنية النمذجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

1. الرنين المغناطيسي النووي solid-state عينة برودوكتيونا

  1. إنتاج موحد 13 ج/مفارز البروتين المسمى ن 15
    1. استخدام تحويل طازجة، pET24-الببتيد-6his المحتوية على بلازميد BL21 كولاي الخلايا (DE3)، حصادها من لوحة أجار استعداد.
    2. تطعيم ثقافة ما قبل 15 مل من قبل حرارة متوسطة رطل مع مستعمرة واحدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 200 لفة في الدقيقة تهتز بين عشية وضحاها.
    3. نقل ثقافة ما قبل إلى 1 لتر للثقافة الرئيسية من قبل حرارة M9 المتوسطة (انظر تكوين الجدول 1)، التي تحتوي على المطلوبة المسمى نظائر الكربون والنيتروجين المصادر.
      ملاحظة: يمكن أن يكون هذا شكل موحد 13 ج-يسمى الجلوكوز، بشكل انتقائي (1-13 ج)-أو (2-13 ج)-المسمى (أو الجلوكوز 29 ، ، من 30 31 1، 3-13 ج)-أو (2-13 ج)-وصفت والغليسيرول 32 ، 33-
    4. احتضان هذا عند 37 درجة مئوية وقياس OD 600 حالما تصبح الثقافة عكر. عندما وصلت OD 600 قيمة 0.8، الحث على التعبير البروتين مع 0.75 مم إيبتج ل 4 h.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف شروط التعريف الأمثل من البروتين واحد إلى آخر-
    5. استعادة الخلايا بالطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 6000 × ز و 4 درجة مئوية.
  2. رسم تنقية (غير مبين في البروتوكول الفيديو)
    1. الخلايا باستخدام التقنيات القياسية مثل العلاج سونيكيشن أو lysozyme وتنقية فرعية البروتين باستخدام تقنيات المنشأة أو المعدلة حققت الجمعية البروتين.
      ملاحظة: البروتين يمكن التعبير عن إدراج الهيئات، تحقق لإضفاء الطابع المحلي على البروتين التي تحلل الخلية والطرد المركزي اللاحقة. إذا تم العثور على البروتين في الرواسب بالحطام خلية، تراكمت في إدراج الهيئات.
    2. التعبير
    3. الاختبار ونقاء العينة البروتين مثلاً بمعيار 12-15% تريس تريسيني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، انظر الشكل 2A. إذا كان النقاء الكافية، يمكن تجميع البروتين، خلاف ذلك القيام بخطوة تكميلية تنقية.
  3. الجمعية في المختبر من خيوط بروتين
    1. التحقق من تركيز البروتين في حل المنقي. إذا كان البروتين يحتوي على بقايا تستوعب، قياس الامتصاص في جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. المخزن المؤقت نقية بإدراج جهاز المطياف الضوئي معايرة وقياس ثم امتصاص البروتين.
    2. حساب تركيز البروتين باستخدام معامل امتصاص فرعية البروتين مع تكييف قانون بير لامبرت: λ = اليورو λ س لام كثافة س ج؛ هنا هو البصرية في λ طول موجه معين؛ اليورو معامل امتصاص محددة؛ l هو طول مسار بصري في سم؛ ج هو التركيز في مول/ل.
    3. تركيز البروتين بتركيز 1 مم في وحدة الطرد مركزي عامل تصفية. إدخال العينة في وحدة الطرد المركزي التصفية والطرد المركزي في ز 4000 x لمدة 30 دقيقة، ومزيج الحل في وحدة التصفية بلطف مع بيبيت لتجنب ترسب البروتين في عامل التصفية. كرر الإجراء حتى يتم التوصل إلى تركيز المرجوة.
      ملاحظة: يعتمد على النظام تركيز الجمعية المثلى ويحتاج إلى أن يكون الأمثل (عادة ما بين 0.1-1 مم). إذا كان اكويمولار مختلطة المسمى عينة من البروتين المسمى مختلفة دفعتين على استعداد (مثلاً (50/50) (ش-15 N)-/(ش-13 ج)-المسمى)، خلط يجب أن تتم قبل أو بعد هذه الخطوة التركيز لضمان حق تجانس الحل المختلطة-
    4. نقل العينة في أنبوب واحتضان أنه تحت الإثارة لمدة أسبوع في درجة حرارة الغرفة-
    5. ويرافق
    6. عادة البلمرة من الوحدات الفرعية إلى خيوط الحل أن تصبح عكره. تحقق من مورفولوجيا فيبريل المجهري والتجانس على سبيل المثال بالميكروسكوب الإلكتروني (التكبير 6300 X-45000 X)، انظر الشكل 2.
    7. °
    8. الطرد المركزي العينة ح 1 في 20000 × ز و 4 جيم إزالة معظم المادة طافية، ترك فقط السائل ما يكفي لتغطية السطح لتجنب تجفيف العينة. فحص المادة طافية لمفارز غير مجمع على جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية-
    9. أغسل
    10. بعينه عن طريق إضافة ح 2 س ودقيق ريسوسبيند المحتوى مع ماصة. عدم دوامة. تدور العينة لمدة 30 دقيقة في 22000 × ز و 4 درجة مئوية. كرر الخطوة الغسيل 3 مرات. التحقق من خلال جميع الخطوات الغسيل إذا بيليه يحافظ على جانبه بعد الطرد المركزي والتحقق من المادة طافية لمفارز عدم تجميعها في جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.
    11. إضافة أزيد الصوديوم 0.02% (w/v) (نان 3) تجنب التلوث البكتيري وتخزين العينة حتى قياس 4 ° C.
  4. "سوليدستاتي الرنين المغناطيسي" الدوار ملء
    1. الطرد المركزي مرتين مدة 30 دقيقة في 22000 × g و 4 درجة مئوية. إزالة الحد الأقصى لمقدار المادة طافية؛ واتساق العينة الناتج يعتمد على الجمعية البروتين، وهو عادة جل تشبه إيداع.
    2. استخدام
    3. بيبيت شعرية لإدخال العينة في الدوار سنمر.
      ملاحظة: هنا، نقدم هذا الإجراء على دوار قطرها 4 مم. أجهزة الطرد المركزي
      1. الطرد المركزي الدوار على طاولة بلطف إدخال العينة إلى الدوار. كرر الإجراء حتى تمتلئ الدوار. الحفاظ على الحد الأدنى للمسافة لإغلاق الدوار مع الباب الدوار. إذا كانت كمية العينة غير كافية، الأخذ إدراج متاحة تجارياً لملء المساحة المتبقية لضمان تجانس توزيع العينة في الدوار.
        ملاحظة: تعتمد على اتساق مجمع بعينه، قد يكون أكثر ملاءمة لاستخدام ملعقة رقيقة، خاصة بالنسبة لعينات كثيفة جداً. دوار مع أقطار من 2.5 إلى 4 مم تستخدم ترددات ماس معتدلة.
    4. إضافة آثار حمض 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) لمعايرة درجة الحرارة والتحول الكيميائية الداخلية-
    5. إغلاق الغطاء جهاز إغلاق.
    6. الاختيار تحت عدسة مكبرة إذا كان كذلك إدراج عملية النداءات الموحدة ومغلقة تماما.

Figure 2
رقم 2: وينتج عن الممثل تنقية البروتين الوحيدات والجمعية العامة. A) 15% تريس تريسيني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة فرعية البروتين (بما في ذلك بلده 6-الوسم) في مراحل مختلفة من تنقية. لين 1-البروتين الوزن الجزيئي علامة؛ لين 2-BL21 كولاي (DE3) الخلايا التحكم أونيندوسيد؛ لين 3-BL21 كولاي (DE3) الخلايا التي يسببها مع 0.75 مم إيبتج؛ لين الهيئات إدراج لين 4-سولوبيليزيد 5-الكسور طاف خلية ليساتي؛ لين 6-كسر المنقي بعد النيكل المعطل تداولها اللوني تقارب معدنية (ايماك) فبلك والملحي. ب) الملون سلبيا ييفات البروتين بتصوير تيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. توصيف الهيكلية الأولية استناداً إلى الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي أحادي البعد (1-د)

  1. الإعداد الأولية والصليب د 1-الاستقطاب (CP)
    1. إدراج الدوار في الرنين المغناطيسي المغناطيس
    2. ابدأ إلى تدور الدوار على تردد 5 كيلو هرتز والانتظار لاستقرار ± 10 هرتز، ثم التعجيل حتى 7 كيلو هرتز. اللحن ومطابقة 1 ح و 13 ج و 15 ن القنوات. تعيين درجة الحرارة إلى 2-10 درجة مئوية (275-283 ك)؛ عينة تدفئة في 7 كيلو هرتز ماس منخفض ودرجة حرارة التكيف عادة غير مطلوب في هذا التردد ماس.
    3. سجل واحد نابض 1 د 1 ح طيف استخدام مسح 16-
      ملاحظة: مستويات السلطة يجب أن يكون سابقا تم الأمثل على مجمع مرجعية (مثل 13 ج/< سوف > 15 الحامض الأميني ن أو جليكاين)، لتوفير قيم البداية لتحسين مستويات الطاقة في التجارب على العينة المستهدفة؛ هذا الإجراء هو مهمة روتينية وذلك للخروج من نطاق هذا البروتوكول.
    4. الحفاظ على درجة الحرارة خلال كل التجارب بين 2-10 درجة مئوية، في العينات المائية ينعكس درجة الحرارة في التحول النسبي في صدى 1 ح المياه السائبة فيما يتعلق ب إشارة DSS 34. قياس درجة الحرارة عقب δ العلاقة (ح 2 س) = 7.83-T/96.9 مع دقة من 1-2 درجة مئوية 35-
    5. مجموعة يصل المطلوب ماس التردد والانتظار حتى استقرار ± 10 هرتز-
      ملاحظة: هنا ثبت لتردد كيلوهرتز 11-
    6. اللحن ومباراة 1 ح 13 ج القنوات مرة أخرى وضبط درجة الحرارة بالمساعدة من تجربة 1 ح 1 د.
    7. إعداد 1 د 1 ح-13 CP ج 36-
      ملاحظة: تبين التجارب CP الإشارات الناجمة عن المخلفات في تكيف جامدة. نبض المعايرة وفصل معلمات يمكن أن يكون مباشرة الأمثل على العينة عند الحساسية عالية بما يكفي لمراقبة الإشارات بعد أقل من 32 ~ بالأشعة. تؤخذ القيم الأولية الأمثل من التحسين القياسية على مجمع إشارة. ويتم اختيار وقت الاتصال CP ومستويات السلطة استناداً إلى شدة الإشارة القصوى. في عينات البروتين، وقت الاتصال CP الأمثل عادة بين 200 المايكروثانيه والسيدة 2 المعلمات فك الارتباط ينبغي تعديل إعادة أيضا من المعايرة على مجمع مرجعية.
      1. بعناية مراقبة إضفاء الطابع المحلي على الغزل امبليتثد في تكرار ماس معين.
    8. تسجيل مرجع د 1 ج CP 13 طيف بمثابة البصمات الطيفية د 1. معلمات النموذجية بمسح 128, 1 ms CP وقت الاتصال، 100 كيلو هرتز فصل القوة، وتأخير إعادة تدوير ق 3 و 25 مللي ثانية لاقتناء.
    9. معايرة
    10. 1 ح والتحولات الكيميائية 13 ج عقب توصيات IUPAC 37. تحديد تردد صدى الإشارة DSS ح 1 (التحول الكيميائية 0 جزء في المليون)؛ 13 يتم الرجوع إليها التحولات الكيميائية ج 1 ح التحولات (عادة ~ 0.25144، المستمدة من نسبة ال 13 ج إلى تردد صدى 1 ح 37)-
    11. تعمل عملية تجربة 1 د 1 ح-13 ج CP دون apodization
    12. (انظر الشكل 3 ألف و ب للكشف على تجميع بروتين البلوتينيوم أمر جيد). اختر ذروة معزولة لتقدير لينيويدث في العينة، يدل على الترتيب الهيكلي والتجانس. لينيويدثس نموذجي 13 ج للتجميعات البروتين البيولوجية أمر جيد تحت ماس في الحقول المغناطيسية عالية تتراوح بين 20-150 هرتز (تقاس كذات العرض الكامل في الارتفاع (فوة))-
    13. تقدير نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N) في الطيف CP.
      ملاحظة: نسبة S/N يعتمد على عوامل كثيرة، بما في ذلك أساسا كمية العينة في الدوار، درجة صلابة هيكل البروتين ووجود تكيف جزيئية واحدة. وكقاعدة عامة، ينبغي أن تكون عينة مناسبة للتحليل الطيفي سنمر الأبعاد إذا لوحظ أن إشارة في أمثل 1 د 1 ح-13 CP ج طيف المسجلة مع مسح 64-
    14. التكبير في المنطقة الطيفية للبروتين العمود الفقري الكربونيل الأصداء المترجمة (الدرجة الأولى) من بين 165-180 جزء في المليون. تقدير محتوى الهيكل الثانوي في الجمعية بموقف الأصداء الكربونيل البروتين العمود الفقري مع الأصداء من المخلفات في حلزونية α أو β-حبلا تكيف تحولت downfield أو أول، على التوالي (انظر الشكل 3B لوحدة فرعية معظمها α حلزونية) 38-
  2. التجربة 1 د إينيبت
    1. إعداد 1 د 1 ح-13 تجربة "ج كفؤ" لسبر أجزاء كثيري التنقل (sub-المايكروثانيه) الجمعية البروتين.
      ملاحظة: فصل جارب كيلوهرتز قليلة خلال اقتناء 39 يستخدم عادة، للسماح للتأخير interscan قصيرة (عادة 1 s) دون الأضرار بالتحقيق-
    2. تسجيل طائفة كفؤ مرجع الذي يخدم كبصمات الأصابع لشرائح البروتين المتنقلة؛ والمعلمات نموذجية يتم مسح 128 وشراء وقت للسيدة 25
    3. تجربة
    4. عملية 1 ح-13 "ج غير كفؤ". المبلغ والمواقف للإشارات إرشادية لكمية المخلفات المتنقلة وتكوين الأحماض الأمينية على التوالي-
      ملاحظة: أيضا تسجيل 2D 1 ح-13 تجربة "كفؤ ج" إذا كانت الإشارات موجودة في الطيف كفؤ د 1 (انظر الشكل 3 على سبيل مثال) للسماح بتعريف الأحماض الأمينية أكثر تحديداً. في حالات الإحالة غامضة، نوصي بفحص مواقف إشارة مكون المخزن المؤقت بحل الرنين المغناطيسي النووي-
    5. استخدام قاعدة بيانات بمرب 40
    6. ونشرت البيانات 38 لتعيين الأصداء إلى الأحماض الأمينية المناظرة في قرب تشكيل لفائف عشوائية؛ والطيف مكونات المحمول المخزن المؤقت فقط إذا كان لا يحتوي على المخلفات في نظام كثيري التنقل.

Figure 3
رقم 3: نتائج تمثيلية اقتناء سبكترا سنمر لتجميع بروتين جيد التنظيم. أ) 13 FID ج-الكشف عن تجربة الاستقطاب عبر 13 ج 1 ح. تجربة الاستقطاب عبر 13 ج 1 ح-ب). 1 ح-ج) 13 "ج كفؤ" تجربة جمعية البروتين جامدة؛ مكونات المخزن المؤقت فقط مرئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

3-تحليل كونفورماشونال و 3D تصميم هيكل

  1. صدى متسلسلة التعيين
    1. إعداد 2D 13 ج-13 ج تدور يحركها بروتون نشرها (PDSD) 41 تجربة للكشف عن بقايا داخل 13 ج-13 ج العلاقات المتبادلة، بما في ذلك سلاسل جانبية. الاستيلاء على القيم للخطوة الأولى 1 ح-الاستقطاب عبر 13 ج من 1 د 1 ح-13 ج CP التجربة.
      1. تعيين وقت خلط 50 مللي ثانية لشكل موحد 13 ج المسمى عينات وإلى 100 مللي ثانية بشكل انتقائي 13 عينات المسمى ج. تعيين وقت الامتلاك غير المباشرة بين 5-25 مللي ثانية، واقتناء المباشر بين 15-25 مللي ثانية تعتمد على القرار الطيفية الجوهرية التي يمكن تقديرها بواسطة إشارة مرئية في طول تسوس تعريفية مجاناً (FID) (المتمثلة في الشكل 3 ألف)-
      2. اختبار العديد من المعلمات التجهيز للبحث عن القيم المثلى فيما يتعلق بالإشارات إلى الضجيج والقرار في الطيف، وعادة معالجة كافية يمكن تحقيقه باستخدام دالة إطار قسيني مع تحول بيل جيبية (تضمين أحادي الجانب) 2.5-4-
    2. مجموعة سجل وعملية 2D 13 ج-13 ج PDSD مع تجربة مرة خلط وسيطة للكشف عن الارتباطات متسلسلة 13 ج-13 ج ربط معظمهم الأول--i±1، ولكن أيضا i±2 و i±3 المخلفات، اعتماداً على صلابة العمود الفقري البروتين وعناصر البنية الثانوية. وينبغي تعيين الوقت خلط بين 100-200 مرض التصلب العصبي المتعدد لعينات المسمى موحد. يمكن اتخاذها كافة القيم الأخرى من القصير وخلط الوقت 2D 13 ج-13 PDSD ج.
    3. إعداد، سجل وعملية 2D 15 N-13 "ج ن" أنا كاليفورنيا أنا ن أنا أول أكسيد الكربون و أنا تجربة استخدام CP 1 ح-15 ن ونقل 13 ج 15 N-CP محددة 42-تحسين نقل الاستقطاب 13 ج 15 ن-بطريقة د 1 مباشرة على العينة الفائدة، استناداً إلى الكثافة القصوى في منطقة كاليفورنيا أو الكربونيل، على التوالي. تايبيتكون القيم cal للمرة CP جهة اتصال محددة بين السيدة 2-6
    4. إعداد، سجل وعملية سلسلة في 2D 15-N (13) ج-13 ج التجارب لغرض التعيين.
      ملاحظة: يمكن اتخاذ أول 15 N-13 ج الاستقطاب نقل قيمة المعلمة من ن أنا كاليفورنيا أنا/N أنا شركة أنا والتجارب. يتم إنشاء الارتباطات البينية-بقايا من N أنا (كاليفورنيا أنا) سي بي أنا و N أنا (كاليفورنيا أنا) CO أنا، على التوالي باستخدام حلم 43 و PDSD 13 ج-13 ج نقل الاستقطاب. اتصال تسلسلي (i-1) بقايا (ط) بقايا تم الحصول عليها من N أنا (شركة i-1) كاليفورنيا i-1 ونون أنا (شركة i-1) CX i-1 التجارب، سواء باستخدام PDSD 13 ج-13 ج نقل الاستقطاب.
    5. اختر الرنين المغناطيسي النووي برنامج التحليل مثل تحليل ككبنمر 44 أو كاسب 45
    6. تحميل أطياف 2D في البرنامج (المتمثلة بالتحليل ككبنمر) وتحميل تسلسل البروتين الرئيسي-
    7. البدء بتحديد الأنواع من الأحماض الأمينية مرئية في خلط قصيرة 13 ج-13 الطيف PDSD ج. ذرات الكربون من أنظمة تدور للسماح للاتصال " بقايا من نوع " مهمة محددة؛ انظر الشكل 4 أ للتعيين من بقايا ثريونين. تحديد العديد من المخلفات قدر الإمكان؛ وهذا سيتوقف على حجم فرعية للبروتين، والاستبانة الطيفية والتشتت.
    8. تراكب
    9. القصيرة الخلط بخلط متوسطة الطيف PDSD ج 13 13 ج--
      ملاحظة: على قمم التكميلية مرئية في PDSD المتوسط خلط تنشأ معظمها من متسلسلة (بقايا الأول-بقايا i±1) جهات الاتصال. ويتضح مثال لتعيين اثنين-بقايا متسلسلة في الشكل 4B. وضع علامة على قمم الرنين نظام تدور
      1. والبحث عن الارتباطات في PDSD المتوسط خلط مع ترددات الرنين من أنظمة أخرى تدور. في البروتينات الصغيرة أو الببتيدات، يمكن أن يكون من الممكن تحقيق الإحالة الرنين متسلسلة كاملة استناداً إلى تجارب PDSD 13 ج في 2D 13 ج--
        ملاحظة: في بقايا زخارف الهيكل الثانوي حبلا β i-i±2 بقايا 13 ج-13 ج جهات الاتصال قد تظهر إشارات أكثر كثافة من اتصالات متتالية بسبب قربها في الفضاء؛ في بقايا زخارف الهيكل الثانوي α-حلزونية i-i±3 بقايا 13 ج-13 ج الاتصالات يمكن أن يؤدي أيضا إلى إشارات مكثفة.
    10. إذا خلط المتوسطة PDSD تجارب على 13 بشكل انتقائي المسمى ج عينات متوفرة، تراكب لهم على الطيف خلط قصيرة (إذا كان متوفراً 13 بشكل انتقائي المسمى ج عينة) وتعيين في تكميلية قمم، آخذا في الاعتبار العلامات انتقائية 13 ج نمط (1، 3-13 ج و 2-13 ج والغليسيرول 32 ، 33 أو 1-13 ج والجلوكوز 13 ج 2 29 ، 30 ، 31.
      ملاحظة: على سبيل المثال، في 2-13 ج والغليسيرول المسمى عينة عدة أنواع من الأحماض الأمينية المسماة في موقف Cα دون الكربونات المتاخمة (Cβ، وجيم ') المسمى، ولذلك تفضل Cα-Cα نقل بين المخلفات المجاورة. في عينات مسماة بشكل انتقائي، والارتباطات البعيدة المدى 13 ج-13 ج قد بناء الفعل في خلط متوسطة 13 ج-13 ج PDSD التجارب. إذا كانت ذروة لا يمكن تفسيرها بوجود ترابط متسلسل، فإنه يمكن أن تنشأ من جهة اتصال بعيد المدى. للغاية أمر هياكل فرعية متجانسة في الجمعية الجزيئات، مجموعة واحدة فقط من الأصداء من المتوقع أن تكون مرئية في الأطياف. إذا كان الضعف (أو مواصلة ضرب) الأصداء مرئية لذرات 13 ج أو البروتين العمود الفقري وتمتد، والتشكلات اثنين (أو أكثر) للذرة أو امتداد التسلسل الرئيسي في الجمعية العامة، على التوالي، توجد.
    11. استخدام الطيف NCA 2D التي تحتوي على بقايا داخل 15 N-13 Cα الارتباطات لتحديد ترددات الرنين 15 N لكل بقايا. إذا لم يكن القرار في البعد 13 ج كافية، استخدام المعلومات التكميلية حول صدى Cβ في نكاكب 2D لتحديد تواتر الرنين 15 ن بقايا داخل-
    12. استخدام
    13. في 2D نكاكب والأطياف نكاكو التي تحتوي على بقايا داخل 15 N-13 ج-13 ج العلاقات المتبادلة (ط) تحديد تواتر 15 ن بقايا داخل و (ثانيا) لحل الغموض في 13 ج-13 ج PDSD مع مساعدة البعد الإضافي 15 N. عكس إشارة بسبب نقل الحلم يؤدي إلى مراقبة الارتباطات Cα Cβ النموذجية التي Cα إشارة إيجابية وإشارة Cβ السلبية. كذلك الجانب سلسلة 13 ج، إذا كان مرئياً في الطيف، إيجابية مرة أخرى.

Figure 4
الرقم 4: 2-الأبعاد 13 ج-13 ج سنمر PDSD تجارب على أمر جيد، شكل موحد 13 ج، 15 البروتين المسمى ن الجمعية. A) القصير خلط الوقت PDSD (50 مللي خلط). ب) الإحالة لتمتد إلى 2-بقايا Ile32-Thr33 استخدام تراكب الوقت القصير خلط PDSD مع وقت طويل خلط PDSD (200 مللي خلط). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تصميم هيكل الثانوية
    1. استخدام 13 Cα، تحول 13 Cβ الكيميائية تحول القيم لحساب هذه المادة الكيميائية الثانوية 46 ΔδCα-ΔδCβ ، يدل على هيكل الثانوية. حساب 13 Cβ (لفائف عشوائي) Cα(assigned)-13 Cα (لفائف عشوائي) و 13 Cβ(assigned)-13-
      ملاحظة: يمكن الحصول على قيم التحول الكيميائي للمخلفات في تشكيل لفائف عشوائية من 38. القيم
      1. الأرض ΔδCα-ΔδCβ، السلبية أو الإيجابية ل > تشير إلى بقايا 3 في صف β-حبلا أو تكيف α-حلزونية على التوالي؛ وبقايا جليكاين وبرولين قد تظهر قيم التحول الكيميائية غير عادية، ك أنها غالباً ما تعمل بمثابة " قواطع الهيكل الثانوي ".
    2. التنبؤ بزوايا زوجية البروتين من التحولات الكيميائية المعينة باستخدام تالوس + 47 ، 48 أو 49 ، بريديتور 50. زوايا زوجية Phi/Psi توقع تعكس هيكل الثانوية subu البروتينأحمق وهي تستخدم القيود الهيكلية، في جميع مراحل عملية النمذجة-
  2. مجموعة من القيود الهيكلية
    1. تعيين، وسجل ارتباطات 13 ج-13 ج PDSD تجربة مع وقت طويل خلط للكشف بعيد المدى 13 ج-2D 13 ج. خلط نموذجي مرات تتراوح بين 400 مللي إلى 1 س. استخدم بشكل انتقائي عينات المسمى ج 13، كما تمييع تدور يحسن إلى حد كبير نقل الاستقطاب بين الكربونات البعيدة.
    2. تراكب خلط طويلة 2D 13 ج-13 ج PDSD المسجلة على العينة مسماة بشكل انتقائي على خلط متوسطة 13 ج-13 ج PDSD، إذا أمكن تسجيلها على نفس العينة مسماة بشكل انتقائي. قمم تكميلية تنشأ عن العلاقات المتبادلة بين ذرات 13 ج أكثر بعدا. أثناء التعيين الرنين، يأخذ في الاعتبار نظام وضع العلامات الانتقائي.
    3. بعناية تقييم قرار الطيف لتعريف إطار التسامح إحالة أي تعتمد على الأصداء الاستبانة الطيفية في طائفة معينة جزءا من المليون من هذا يمكن أن يسهم الإشارة. يحسب الانحراف المعياري لدقة التعيين تلقائياً في برامج الإحالة الرنين المغناطيسي النووي مثل تحليل ككبنمر أو حيوي.
    4. إذا كان يمكن تفسير إشارة متسلسلة (بقايا الأول-بقايا i±1) أو جهة اتصال متوسطة المدى 13 ج-13 ج (بقايا-بقايا أنا ± 2 أو 3 أو 4)، الحفاظ على هذا التعيين منذ الاستقطاب relayed نقل يمكن أن تفسر الارتباط حتى ولو كانت المسافة 13 ج 13 ج-فوق النطاق الاتصال المرئي المتوقع.
    5. تصنيف التعيينات للاتصالات البعيدة المدى 13 ج-13 ج إلى تواتر إشارات غامضة ولا لبس فيها. في حالة الترددات لا لبس فيها، التعيين الرنين واحد فقط ممكن فيما يتعلق بالإطار التسامح الإحالة.
      ملاحظة: تعيينات غامضة تحتوي على كافة التعيينات صدى ممكن ضمن إطار التسامح. يمكن رفع الغموض في وقت واحد أثناء حساب الهيكل بجولات متكررة لتوضيح استناداً إلى الهياكل الأولية المحسوبة باستخدام سوى القيود التي لا لبس فيها، كما يقوم بإجراءات حسابية مثل ARIA 51 أو المسددة 52. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام البيانات الهيكلية من مختلف المصادر الفيزيائية الحيوية (مثل تحور أو اقتطاعها هيكل وحدة فرعية بواسطة الحل الرنين المغناطيسي أو الأشعة السينية علم البلورات، قياسات الكتلة الواحدة والطول، خريطة cryo-م) خفض المستوى الغموض، انظر الأمثلة 1 ، 3 ، 53 ، 54 ، ، من 55 56 ، 57 ، 58-
  3. الكشف عن قيود المسافة الجزيئات في تجميع بروتين متناظرة
    1. إعداد 2D 15 N-13 ج الألم-CP 59 تجربة على مختلطة (50/50) ش-15 N-/يو-13 ج-المسمى عينة. ينبغي أن تنشأ إشارات الكشف على الطيف CP الألم من الجزيئية بين 15 N-13 ج التقارب. استخدام الأصداء تم تعيينه مسبقاً للقيام بتعيين جهات اتصال الجزيئات.
    2. إعداد 2D 13 ج-13 ج PDSD مع وقت طويل خلط (> 600 مرض التصلب العصبي المتعدد) على (مناصفة) مختلطة (1، 3-13 ج)-/(2-13 ج)-الجلسرين أو (1-13 ج)-/(2-13 ج)-عينة الجلوكوز.
      ملاحظة: الإشارات التي اكتشفت في هذا الطيف 13 ج 13 ج-تنشأ من داخل الجزيئية والجزيئية بين 13 ج-13 ج التقارب. ومع ذلك، يتيح التكامل عالية لمخططات وضع العلامات اثنين أزواج صدى خاصة تنشأ دون لبس عن الجزيئية بين جهات الاتصال، مثل CA سيرين في (2-13 ج)-الجلوكوز المسمى مفارز ترتبط "بناء القدرات سيرين" في (1-13 ج)-الجلوكوز المسمى مفارز. عينات
      1. تراكب طيف العينة المختلطة في 2D 13 ج-13 ج الأطياف المسجلة على البلوتينيوم المسمى ((1,3-13C)-و (2-13 ج)-الجلسرين أو (1-13 ج)-و (2-13 ج)-الجلوكوز وصفت عينات). إشارات إضافية في الطيف، سجلت في العينة المختلطة ينبغي أن تنشأ من التفاعلات بين الجزيئية.
  4. بنية النمذجة من البيانات سنمر
    1. بإعداد قوائم ضبط النفس سنمر اللازمة لحساب الهيكل: تسلسل البروتين (1)؛ (2) داخل الجزيئية المسافة لا لبس فيها القيود؛ (3) قيود المسافة الغامضة داخل الجزيئي؛ (4)-تالوس على أساس زاوية زوجية القيود؛ (5) بين الجزيئية المسافة لا لبس فيها القيود؛ (6) بين الجزيئية المسافة ملتبسة القيود؛ (7) إضافية من البيانات من غيرها من التقنيات الفيزيائية الحيوية (مثل الكتلة الواحدة طول، التماثل المعلمات)-
    2. عدة ملاحظات ثاقبة النمذجة هيكل استناداً إلى البيانات سنمر وبالتزامن مع البيانات الهيكلية التكميلية 14 ، ، من 60 15 ، 19 ، ، من 61 62 علما أنه يمكن توضيح قيود المسافة الغامضة أثناء بنية الحساب فيما يتعلق بالأولى النماذج الهيكلية استناداً إلى قيود المسافة لا لبس فيها. مراقبة بعناية لضمان دقة الهيكل، إذا كان الهيكل يتقارب إلى حظيرة واحدة.

Figure 5
الرقم 5 : داخل والجزيئات جهات الاتصال في البروتين متماثل التجميعات. التمثيل التخطيطي من داخلها-مقابل الجزيئات 13 ج-13 ج الاتصالات البعيدة المدى في تجميع الجزيئات حلزونية. الوحدات الفرعية الملونة بالأبيض والأحمر لتوضيح العلامات مختلطة من الوحدات الفرعية؛ أي قبل الجمعية أجرى خليط 1:1 لاثنين من مخططات وضع العلامات مختلفة (مثل 1-13 ج الجلوكوز و 1-13 الجلوكوز ج)-A) إينتراموليكولار 13 ج-13 ج الاتصالات البعيدة المدى (سهم منقط أزرق)؛ ب) 13 من الجزيئات ج-13 ج الاتصالات البعيدة المدى (الأحمر متقطع السهام). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

سير العمل سنمر نموذجي يتضمن العديد من الخطوات الموضحة في الشكل 1. عادة مفارز البروتين هي التي تنتجها في المختبر تعبير مغايرة في كولايوتنقيته وتجميعها تحت تهتز ولكن في بعض الأحيان أيضا في ظروف ثابتة. وتليها التعبير وتنقية فرعية البروتين اللوني هلام مخزونات النشر الاستراتيجي (الشكل 2A). تشكيل جمعيات الجزيئات يمكن أن تؤكده ثم تحليل المجهر الإلكتروني (م) (انظر الشكل 2 على سبيل مثال جمعية الخيطية).

بعد مقدمة للجمعية البروتين إلى الدوار سنمر، الدوار ويتم إدراج والمطياف وينظم تكرار ماس ودرجة الحرارة وتسجل الأطياف. يمكن الحصول على رؤى الأولى بتقنيات سنمر د 1. ويبين الشكل 3 FID سنمر نموذجي الكشف على القناة 13ج على عينة متجانسة هيكلياً بروتين، 1ح13ج CP طيف، كشف الأصداء13ج موجودة في صلب جامد فرعية البروتين في الجمعية العامة، و 2D 1ح-13"ج كفؤ" طائفة، تمثل مخلفات المتنقلة. لرؤى الذري في صلب جامد هيكل الجمعية العامة، متعددة الأبعاد سنمر تجارب بحاجة إلى تسجيلها على شكل موحد وانتقائية المسمى عينات تعيين الأصداء سنمر أولاً وثم الكشف عن التقارب بعيد المدى (انظر الشكل 4 ).

تجهيز جميع الأطياف وتحليلها مع البرامج الكافية تعيين الأصداء سنمر واستخراج داخل وقيود المسافة الجزيئات (الشكل 5). لقيود المسافة سنمر تستخدم أما وحدها أو بالاقتران مع بيانات من التقنيات التكميلية، التي يمكن أن تدمج في برنامج التصميم.

لهياكل ذرية تمثيلية الجمعيات الجزيئات حلها عن طريق تقنيات سنمر يبين الشكل 6 العديد من التجميعات الخيطية من الملاحق البكتيرية وييفات اميلويد.

Figure 6
الشكل 6:هياكل الجزيئات الخيطية مصممة بأسلوب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة: خيوط البكتيرية وبروتين اميلويد ييفات- A) الهياكل 1 نوع من أوروباثوجينيك كولايPDB التعليمات البرمجية 2N7H 4؛ ب) ASC الشعيرة، PDB التعليمات البرمجية 2N1F 63؛ ج) "النوع الثالث" إفراز نظام الإبر، 2MME رموز PDB، 2LPZ و 2MEX 2،،من364؛ د) ييفات AB42 بيتا اميلويد، PDB تعليمات برمجية 2NAO، 5KK3، 2MXU 65،،من6667 وأوساكا متحولة PDB التعليمات البرمجية 2MVX 57، آيوا متحولة PDB التعليمات البرمجية 2MPZ 58؛ ) ألفا سينوكلين ييفات، 2N0A رمز PDB 68؛ و) المجال بريون HET-s، PDB تعليمات برمجية 2RNM، 2KJ3،من 6970. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) أسلوب الاختيار لوصف الجمعيات البروتين الجزيئات على مستوى الذري. واحدة من القضايا المركزية في تصميم هيكل على أساس سنمر هو نوعية الطيفية نظام التحقيق، الذي يسمح لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد الهيكلية للدقة المختلفة، وعادة ما تتراوح بين نماذج ذات الدقة المنخفضة (التي تحتوي على الثانوية تنظيم العناصر والقليل من المعلومات 3D) لهياكل ثلاثية الأبعاد الذرية الزائفة. كمية ونوعية المعلومات الهيكلية المستخرجة من تجارب سنمر متعدد الأبعاد هو المفتاح لحساب هيكل الرنين المغناطيسي عالية الدقة للجمعية.

وصف البروتوكول يعتمد على الكشف عن 13ج-13ج و 15N-13ج الهيكلية القيود التي تتطلب تسجيل عدة أطياف 2D (وفي بعض الأحيان 3D) مع إشارة عالية للضوضاء. ترددات ماس معتدلة (< 25 كيلو هرتز)، يتم إدخال العينة في دوار مع أحجام من 3، 2-4 مم مما يسمح لكميات البروتين يصل إلى ~ 50 ملغ، تعتمد على ترطيب عينة. كمية العينة داخل الدوار طرديا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء في أطياف سنمر، عاملاً حاسما للكشف عن قيود المسافة البعيدة المدى وهذه الإحالة لا لبس فيها.

القرار الطيفية معلمة حاسمة أثناء التعيين الرنين متسلسلة وجمع القيود. للحصول على أفضل النتائج، تحتاج معلمات إعداد نموذج الأمثل، لا سيما في تنقية وحدة فرعية وشروط الجمعية (درجة الحموضة، المخزن المؤقت، والهز، درجة الحرارة، إلخ). للنموذج الأمثل، من المستحسن لتحضير عينات غير مسمى وقد لوحظ لعدة شروط متميزة للجمعية، وتسجيل د 1 1ح13ج CP طيف (كما هو موضح في الخطوة 2، 1) في كل عينة استعداد. خدمة الأطياف مقارنة الاستبانة الطيفية والتشتت بين الإعداد المختلفة، استناداً إلى الظروف المثلى التي يمكن تحديد.

نوعية البيانات سنمر يعتمد بشدة على الاختيار لبارامترات الرنين المغناطيسي النووي، خاصة بالنسبة لخطوات نقل الاستقطاب. استخدام قوة الحقل المغناطيسي عالية (إيه سيكس زيرو زيرو ميجاهرتز 1ح التردد) ضروري لحساسية عالية والاستبانة الطيفية، المطلوبة عند مواجهة الأهداف المعقدة مثل التجميعات البروتين الجزيئات.

عاملاً مقيداً في كثير من الحالات هو توافر مطياف. ولذلك، ينبغي أن تسبق اختيار العينات حكيم لإعداد الدورة مطياف. في أي حال، شكل موحد 13ج، 15عينة المسمى ن شرط مسبق لإجراء التعيين الرنين متسلسلة والمتبقية داخل. للحصول على البروتينات التي تم تعيينها باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسي النووي الصلبة راجع71. يتطلب تصميم هيكل الجزيئات التجميعات ترددات ماس معتدلة بشكل انتقائي 13ج المسمى العينات؛ للكشف عن المدى 13ج-13ج و 13ج-15N الاتصالات عينات استناداً إلى 1، 3-13ج-و 2-13ج-جيلسيرول و/أو 1-13ج-و 2-13ج-الجلوكوز العلامات ويشيع استخدام، كما هو موضح أعلاه. الاختيار بين النظامين التوسيم يستند إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء الطيفية والقرار. للتمييز بين داخل والجزيئات الاتصالات البعيدة المدى، قد كشفت عن عينات المسمى والمخفف مختلطة كفاءة.

باختصار، خطوات حاسمة لدراسة هيكلية سنمر الذري: (ط) إعداد الوحدات الفرعية وحاجة الجمعية يكون الأمثل للحصول على عينة ممتازة كمية ونوعية، الحقل (ثانيا) مطياف القوة وحيازة المعلمات يجب أن تكون اختيرت بعناية؛ (ثالثا) استراتيجيات التوسيم انتقائية مطلوبة لتحديد هيكل ثلاثي الأبعاد، وكمية البيانات المطلوبة يعتمد على نوعية البيانات وتوافر البيانات التكميلية.

رغم انطباقها على طائفة واسعة من نظم supramolecular تتراوح بين بروتينات الغشاء هومومولتيميريك نانو-الكائنات، هو غالباً ما تكون محدودة سنمر بالحاجة إلى مغ-كميات المواد نظير مسماة. التطورات التكنولوجية الحديثة في سرعة فائقة سنمر ماس (إيه وان زيرو زيرو كيلو هرتز) تفتح السبيل إلى 1الرنين المغناطيسي الكشف عن ح، ودفع الحد الأقصى لكمية العينة الحد الأدنى إلى sub-مغ 72،،من7374. على الرغم من ذلك، هي عينات المسمى ج 13للدراسات الهيكلية التفصيلية ضرورية، مما يحد من تطبيق سنمر إلى عينات جمعت في المختبر أو إلى نظم المعرب عنها في الكائنات الحية التي البقاء على قيد الحياة في المتوسط الأدنى حيث في الخلية سنمر أسلوب ناشئة (للاطلاع انظر ملاحظات 75،،من7677،78).

هو عامل هام في تطبيق سنمر للحصول على هياكل ثلاثية الأبعاد ذات الدقة العالية الاستبانة الطيفية: التغاير conformational المضمنة في تجميع يمكن أن تحد من التحليل الطيفي القرار والأطياف. العلامات المحددة 13ج بقايا يمكن في بعض الحالات توفير بديل للحصول على معلومات المسافة المحددة على بقايا الاستراتيجي بغية الحصول على النماذج الهيكلية (بالنسبة الأخيرة أمثلة انظر 79،80).

سنمر لتصميم هيكل ثلاثي الأبعاد لا يزال يحتاج إلى جمع عدة مجموعات البيانات مع البيانات طويلة وكثيراً ما جمع الأوقات على أدوات متطورة، تبعاً للنهج والنظام عدة أيام إلى أسابيع 600-1000 ميغاهيرتز (تردد1ح) مطياف. ولذلك، يمكن الوصول إلى وقت مطياف عاملاً مقيداً في سنمر دراسة متعمقة.

وفي حالة الجمعيات البروتين هومومولتيميريك، مما أدى إلى البيانات سنمر من نوعية كافية لتحديد عدد كبير من القيود الهيكلية كما هو الحال في 3،57،،من6470, سنمر لا يزال يعطي لا الوصول إلى الأبعاد المجهرية. ولذلك، في تصميم هيكل سنمر حيثياته جمعية هومومولتيميريك، م أو الكتلة الواحدة طول البيانات (MPL) مثالي تكمل البيانات سنمر لاشتقاق المعلمات التماثل. وتوفر البيانات سنمر وحدها داخل الذري وواجهات الجزيئات

سنمر تكميلية عالية مع تقنيات الهيكلية مثل القياسات EM أو المكتبة ولكن يمكن أيضا تماما الجمع بين البيانات مع الهياكل الذرية التي حصل عليها علم البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي الحل على مفارز تحور أو مبتوراً. يمكن العثور على عدد متزايد من الدراسات في الأدب حيث سمح تزامن البيانات الهيكلية المختلفة لتحديد نماذج ثلاثية الأبعاد الذرية من الجزيئات الجمعيات (انظر الشكل 6 للأمثلة التمثيلية).

في ميدان "البيولوجيا الهيكلية"، سنمر يبرز كتقنية واعدة لدراسةغير قابلة للذوبان وغير البلورية التجميعات في الذرية المستوى، أي توفير هيكلية البيانات في الجدول الذري. وفي هذا الصدد، هو سنمر القلادة إلى حل الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية للتجميعات الجزيئي، بما في ذلك البروتينات الغشاء على جمعيات البيئة والبروتين الأصلي مثل مغلفات الفيروسية، وخيوط البكتيرية أو أميلويدس، فضلا عن الجيش الملكي النيبالي و الجيش الملكي النيبالي-البروتين المجمعات (انظر على سبيل المثال81). في تطبيقات متعدد الاستخدامات بدرجة في المختبر وفي سياق الخلوية، مثل تعقب التغييرات الهيكلية والثانوي والتعليم العالي ورباعي، تحديد الأسطح التفاعل مع جزيئات شريك في المقياس الذري (على سبيل المثال 82) و رسم الخرائط ديناميات الجزيئية في سياق مجمعات المجمعة، تشير إلى إمكانيات هامة سنمر في المستقبل دراسات الهيكلية على التجميعات الجزيئية البيولوجية المعقدة.

المكون M9 المتوسطة
كلوريد الصوديوم 0.5 غرام/لتر
خ2ص4 3 غرام/لتر
غ2هبو4 6.7 غرام/لتر
مجسو4 1 مم
زنكل2 10 ميكرومتر
فيكل3 1 ميكرومتر
كاكل2 100 ميكرومتر
MEM فيتامين ميكس 100 X 10 مل/لتر
13 ج-الجلوكوز 2 غرام/لتر
15 NH4Cl 1 غرام/لتر

الجدول 1: تكوين التعبير أدنى متوسط للبروتين المؤتلف الإنتاج في كولاي الخلايا BL21-

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل وتمول وكالة الاستخبارات الوطنية (13-بدك-0017-01 ووكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE09-0020-01 للجامعة العربية)، وبرنامج "الاستثمار في المستقبل" أيدكس بوردو/يزار (2016 البارزة إلى) مرجع ANR-10-معرض أيدكس-03-02 إلى، المؤسسة من أجل البحوث لوس أنجليس (ميديكال FRM-AJE20140630090 للجامعة العربية)، برنامج FP7 (FP7-الناس-2013-CIG إلى أ. ل.) ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج الاتحاد الأوروبي في (منحة ابتداء من منسق الإغاثة الطارئة إلى الجامعة العربية، اتفاق لا 639020)، ومشروع " ويكينتيراكت. "

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486, (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5, (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463, (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491, (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12, (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10, (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13, (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26, (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23, (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46, (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46, (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46, (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46, (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46, (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47, (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112, (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106, (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129, (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139, (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38, (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133, (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420, (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44, (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45, (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128, (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33, (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11, (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95, (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150, (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20, (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48, (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34, (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51, (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23, (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129, (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135, (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138, (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22, (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23, (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319, (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132, (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136, (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158, (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101, (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (26), 5956-5960 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics