Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

Bioengineering

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Summary

El objetivo de este protocolo es generar un modelo de fractura de compresión vertebral relacionada con la osteoporosis rata desnudo que puede ser evaluados longitudinalmente en vivo usando un microcomputed semiautomatizado basado en tomografía cuantitativa análisis estructural.

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Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

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Abstract

Las fracturas de compresión vertebrales relacionadas con la osteoporosis (OVCFs) son una necesidad común y clínicamente no satisfecha con el aumento de prevalencia como las edades de la población de mundo. Modelos OVCF animales son esenciales para el desarrollo preclínico de estrategias de ingeniería de tejido traslacional. Mientras que en la actualidad existe un número de modelos, este protocolo describe un método optimizado para la inducción de defectos vertebrales altamente reproducibles múltiples en una sola rata desnuda. Una tomografía de la novela microcomputed semiautomatizado longitudinal (µCT)-basado en análisis estructural cuantitativa de los defectos vertebrales también se detallan. Brevemente, las ratas fueron reflejadas en múltiples puntos de tiempo post operatorio. La exploración de día 1 fue reorientada a la posición estándar y se define un volumen de interés. Exploraciones posteriores µCT de cada rata fueron registradas automáticamente para la exploración del día 1 por lo que el mismo volumen de interés entonces se analizaron para evaluar para la nueva formación del hueso. Este enfoque versátil adaptable a una variedad de otros modelos donde análisis longitudinal basado en la proyección de imagen podrían beneficiarse de una alineación exacta 3D. semiautomatizada. Tomados en conjunto, este protocolo describe un sistema fácilmente cuantificable y fácilmente reproducible para la investigación de la osteoporosis y del hueso. El protocolo sugerido toma 4 meses para inducir osteoporosis en ratas ovariectomizadas desnudas y entre 2,7 y 4 h para generar, de la imagen y analizar dos defectos vertebrales, dependiendo del tamaño del tejido y el equipo.

Introduction

Más de 200 millones de personas en todo el mundo sufren de osteoporosis1. Patológico subyacente disminución de la densidad mineral ósea (DMO) y microarquitectura ósea alterada aumentar la fragilidad del hueso y, consecuentemente, el riesgo relativo de fractura2. La osteoporosis es tan frecuente y nocivo para la salud que la OMS ha definido una preocupación de salud pública importante. Además, como la población mundial se espera que a la edad, osteoporosis se espera llegar a ser aún más común.

Las fracturas de compresión vertebrales osteoporóticas son las fracturas más comunes de fragilidad, estimadas en más de 750.000 al año en los Estados Unidos. Se asocian con morbilidad significativa y tanto como una mortalidad mayor de nueve veces la tarifa3. En los ensayos clínicos, actualmente disponibles intervenciones quirúrgicas, como la vertebroplastia y cifoplastia, fueron encontradas para no ser más eficaz que un impostor tratamiento4,5, dejando sólo el tratamiento del dolor disponible para estos pacientes. Puesto que los tratamientos actuales de OVCF son limitados, es imprescindible para el desarrollo de un modelo animal que puede replicar el desorden6,7,8. Tales modelos animales podrían facilitar la investigación de los métodos actuales de tratamiento y el desarrollo de nuevas terapias que se traducirá en la práctica clínica. La osteoporosis ha sido inducida y sostenido en animales modelo mediante la administración de una dieta baja en calcio (LCD) en conjunto con ovariectomía1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. para modelar aún más la pérdida de hueso asociada con OVCFs, defectos óseos vertebrales se establecieron en las ratas inmunocompetentes 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. En este trabajo se presenta un modelo de defecto vertebral de immunocompromised ratas con osteoporosis modelada. Este nuevo modelo puede utilizarse para evaluar terapias celulares con células de diferentes fuentes y especies para la reparación de fracturas difíciles, tales como OVCFs.

La proyección de imagen del hueso es una parte crucial de la evaluación de fracturas y enfermedades óseas. Métodos de proyección de imagen avanzados fueron desarrollados para la evaluación precisa de cambios óseos estructurales y de estrategias de regeneración25. Entre ellos, la proyección de imagen µCT ha surgido como un método no invasivo, de fácil de usar y de bajo costo que ofrece imágenes 3D de alta resolución. La proyección de imagen µCT tiene varias ventajas sobre otras modalidades en la evaluación de pacientes de osteoporosis, ya que ofrece alta resolución 3D osea microarquitectura26 que luego pueden ser analizadas cuantitativamente. Este último puede entonces utilizarse para comparar los efectos terapéuticos de tratamientos propuestos. De hecho, en vivo µCT la proyección de imagen es un estándar de oro para la regeneración de defectos vertebrales monitoreo1,16,27. Sin embargo, algunas publicaciones28,29,30,31 han empleado herramientas de registro automatizado para minimizar la dependencia del usuario, sesgo de interpolación y error de precisión de µCT Análisis basado en la proyección de imagen. Recientemente, fuimos los primeros en utilizar un procedimiento de registro para mejorar el análisis de la regeneración ósea en un hueso estandarizado vacío, como se explica en este protocolo32 .

El método aquí descrito se puede utilizar para estudiar el efecto de terapias celulares nuevos para OVCFs, unhindered por host respuestas de células T que pueden rechazar las células alogénicas o xenogeneicos. La osteoporosis es inducida en ratas jóvenes a través de la ovariectomía (OVX) y 4 meses de un LCD. La edad de las ratas OVX, combinado con la pantalla LCD, nos permitió alcanzar una masa ósea pico baja, imitando la osteoporosis postmenopáusica conduciendo a la pérdida ósea irreversible. Esto puede explicarse en parte por el hecho de que, en la pantalla LCD y alrededor de 3 meses de edad, la transición de las ratas del hueso modelado para remodelación de la fase en la vértebras lumbares33, aumentando así la probabilidad de mantener la osteoporosis tiempo. Utilizando animales jóvenes hace que este modelo más rentable, como cuestan menos. Sin embargo, está limitada por intrínsecamente no son responsables de los cambios biológicos en el animal de envejecimiento.

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Protocol

todos los experimentos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de Cedars-Sinai Medical Center (protocolo # 3609). Se administró anestesia para todos los procedimientos quirúrgicos e imágenes. Todos los animales fueron alojados según los protocolos aprobados de IACUC.

Nota: el diseño experimental de este protocolo se muestra en la figura 1. Compra de ratas de 6 semanas de edad con sus ovarios quirúrgicamente removido y darles de comer un LCD compuesto por fosfato de calcio y 0.77% 0.01%. Después de un período de 4 meses de un LCD, perfore un defecto vertebral de tamaño crítico en el cuarto y quinto cuerpos vertebrales lumbares (L4-L5). Después de la cirugía, imagen de las ratas en el día 1 y las semanas 2, 4, 8 y 12 después del establecimiento del defecto. Localizar defectos de márgenes en la exploración del día 1, reorientar a una posición estándar y definir un volumen cilíndrico de interés (VOI). Registrar automáticamente las exploraciones posteriores µCT (es decir, para la semanas 2, 4, 8 y 12) de cada rata a la posición estándar definida para la correspondiente exploración del día 1. Aplicar el día 1 predefinidos VOI a los análisis registrados. Evaluar la densidad de volumen óseo y la densidad aparente de las VOIs.

1. inducción de Osteoporosis

  1. poner ratas de seis semanas de edad athymic ovariectomizada en 4 meses de un LCD compuesto por fosfato de calcio y 0.77% 0.01%.
  2. Interruptor de nuevo a una dieta normal.
    Nota: Estas ratas se hará referencia a como " las ratas " en adelante.

2. Modelo de defecto vertebral

Nota: la sincronización es 40-50 minutos por animal.

  1. Herramientas de autoclave todo quirúrgico previo a la cirugía.
  2. En el caso de múltiples cirugías, esterilizar instrumentos quirúrgicos todos.
    1. Lavar las herramientas y colocarlos en un baño sonicador para 5 minutos en un conjunto de esterilizador de grano caliente a 250 ° C para permitir s. 20 las herramientas se enfríe durante 5 min.
  3. Inducir anestesia.
    1. Lugar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectado a una máquina de anestesia con un sistema de barrido central. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100% y mantener a través del cono de nariz en 2-3% de isoflurano. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
    2. Aplicar un estímulo del pellizco del dedo del pie para asegurar el adecuado plano de anestesia. Si se observa no hay respuesta, iniciar el procedimiento de.
  4. La rata anestesia en recumbency dorsal sobre una almohada (37 ° C) y estirar las extremidades mediante un sistema de retracción de fijador magnético ( figura 2A).
    Nota: La temperatura de la almohada es importante para la prevención de la hipotermia, ya que una rata anestesiado es incapaz de regular su temperatura corporal.
  5. Afeitar la zona abdominal con una afeitadora eléctrica. Esponja con base de yodo antiséptico y clorhexidina gluconato 0.5% seguida de etanol al 70%.
  6. Inyectar la rata con carprofeno (5 mg/kg peso corporal (BW), subcutánea (SQ)) antes de comenzar el procedimiento quirúrgico.
  7. Utilizar un bisturí estéril para cortar la piel. Comenzar la incisión de 1 cm por debajo del proceso xifoides y corte a través de la línea media (~ 5-8 cm) ( figura 2B).
  8. Utilizar tijeras quirúrgicas para realizar una incisión de la aponeurosis a través de la linea alba para acceder a la cavidad abdominal ( figura 2).
  9. Exponer la cavidad abdominal utilizando retractores ( Figura 2D).
  10. Desviar los intestinos hacia la derecha de la rata para exponer la aorta abdominal y el riñón izquierdo ( Figura 2E). Palpe la zona lumbar antes de proceder a exponerlo. Para evitar la deshidratación, uso estériles gasas empapadas con solución salina estéril para envolver los órganos internos.
  11. Thermocautery uso para exponer en capas el aspecto anterior de cuerpos vertebrales lumbares L4-5 y aíslan el tejido conectivo y los músculos circundantes ( figura 2F -G).
    Nota: Thermocautery debe utilizarse para controlar el sangrado durante la disección.
  12. Utilizar un hisopo de algodón estéril impregnado de solución salina estéril para remover el tejido de sangre y residual de la vértebra L4. Utilice una broca de taladro trépano estéril (~ 2 mm de diámetro) para perforar un defecto de 5 mm de profundidad del hueso en el centro del aspecto anterior expuesto del cuerpo vertebral (Figura 2 H-I).
    Nota: Aplique una mínima presión para perforar a través de solo la corteza ventral y hueso trabecular subyacente; evitar la perforación a través de la corteza dorsal. Tenga en cuenta que las vértebras de las ratas son muy frágiles. Use un hisopo de algodón para limpiar el defecto y aplicar presión para detener el sangrado, si está presente.
  13. Repetir paso 2.11 en la vértebra L5 para crear un total de 2 defectos por rata ( figura 2J).
  14. Devolver el intestino a la cavidad abdominal.
  15. Utilizar una vicryl sutura quirúrgica absorbible sintético (vicryl 3-0 sin teñir 27 " SH taper) en un patrón continuo para suturar la aponeurosis ( figura 2 K).
  16. Cerca de la piel mediante una sutura no absorbible 4-0 monofilamento nylon en un patrón interrumpido simple ( figura 2 L).
  17. Aplicar 100 μl del pegamento de la piel de uso tópico sobre las suturas de la piel y entre ellos para asegurar el cierre completo de la piel.
  18. Inyectar la rata con ringer entibiada caliente (37 ° C) ' solución de s (1CC/100 g BW, SQ) para prevenir la hipotermia y la deshidratación.
  19. Inyectar la rata con buprenorfina (0, 5 mg/kg BW, SQ) antes de la cirugía y cada 8-12 h para aliviar el dolor después de la operación según sea necesario.
  20. No descuide el animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Además, no devolver un animal que ha experimentado la cirugía a la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.
  21. Después de que el animal se ha recuperado en la almohada, devolverlo a su jaula.
    Nota: Las ratas de la casa individualmente (es decir, en jaulas separadas) para prevenir la mutilación de rata a rata de las suturas y heridas.
  22. Chow remojado en agua en un plato de Petri en el piso de la jaula para unos días después de la operación ayudar a las ratas a alcanzar la comida de lugar.
  23. Administrar carprofen (5 mg/kg BW, SQ) después de la cirugía 24 h para el alivio del dolor cada 24 h según sea necesario.
  24. Retire las suturas de la piel mientras el animal está bajo 2% isoflurano anestesia 10-14 días después de la operación.

3. MicroCT exploración

Nota: la sincronización es 30-40 minutos por animal.

  1. Al día siguiente de la intervención quirúrgica, colocar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectada a una máquina de anestesia con un sistema de barrido central. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100% y mantener a través del cono de nariz en 2-3% isoflurano.
  2. Analizar la rata usando un escáner en vivo µCT. Repetir la exploración para el análisis longitudinal de la regeneración ósea.
    Nota: Asegúrese de que todos los animales se analizan con la misma configuración (es decir, energía de rayos x, análisis medio, intensidad, tamaño del voxel y resolución de la imagen) y en un similaorientación de la r. Por ejemplo: energía de rayos x, 55 kVP; corriente, 145 μA; tamaño de voxel, 35 μm; incrementos, 115 μm; y tiempo de integración, 200 ms; con las muestras en PBS. Consulte a Bouxtein et al. 34 para más explicaciones y consideraciones implicados en roedores µCT análisis para una evaluación de la microestructura ósea. Idealmente, se utilizaría la máxima resolución de escaneo disponible para todos los escaneos; sin embargo, exploraciones de alta resolución requieren tiempos más largos de la adquisición, generan conjuntos de datos grandes y exponen a los animales a más radiación ionizante. Este último puede introducir efectos no deseados, incluyendo la disminución de fracturas. Por lo tanto, el equilibrio entre datos adicionales y tiempo de la exploración se debe cuidadosamente considerar.

4. Separación vertebral

Nota: el tiempo es 20-30 min por ejemplo.

  1. Contorno de la vértebra de interés, como se muestra en la Figura 3A-I. Asegúrese de incluir todas las partes de la vértebra y excluyendo las partes que pertenecen a las vértebras adyacentes.
    1. Clic en " programa de evaluación de µCT " y seleccionar la muestra en el menú de.
    2. Contorno de cada rebanada con el mouse.
    3. Uso el " Z " bar para ir a la rebanada siguiente.
  2. Guardar la vértebra contorneada como un archivo independiente ( figura 3J -K) haciendo clic en " archivo " → " GOBJ guardar " cada par de rebanadas.

5. definición del VOI para evaluación cuantitativa Longitudinal

Nota: los pasos siguientes dependen de si el análisis es desde el día 1 después de la cirugía (vértebra de referencia) o desde el momento posterior puntos ( blanco las vértebras).

  1. Vértebra referencia.
    Nota: El momento es de 20-30 minutos por muestra.
    1. Z-rotación, medir el ángulo de los márgenes con un segmento XY desde el centro del defecto ( Figura 4A -B).
      1. En el plano Z, ir a la zona de la vértebra donde el defecto es más claro y la pantalla captura la vértebra.
      2. En un software de presentación, preparar un objeto con forma de rectángulo que cabe en el defecto.
      3. Girar la imagen de la vértebra que el defecto esté orientada hacia arriba y los márgenes del defecto son paralelos a los lados del rectángulo.
      4. Medir el ángulo de rotación (haga clic en la imagen → " formato de imagen " → " tamaño ").
      5. Utilice el ángulo medido para rotar la vértebra ( figura 4).
        1. Abrirá una nueva ventana de DECterm (" Session manager " → " aplicaciones " → " DECterm ").
        2. Run " ipl ":
        3. Ipl > turn3d
        4. -entrada [en] >
        5. -salida [out] >
        6. -turnaxis_angles [0.000 90,000 90.000] > 90 90 0
        7. -turnangle [0.000] > ángulo medido
        8. -img_interpol_option [1] >
    2. Para rotación, medir el ángulo de los márgenes con una YZ-slice desde el centro del defecto ( figura 4 -E). Use el ángulo medido para girar la vértebra ( figura 4F).
      1. Clic en " YZ " en " programa de evaluación de producto " y repita los pasos 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > isq
      3. -aim_name [en] >
      4. -isq_filename [default_file_name] > Introduzca el directorio de archivo ISQ (p. ej., " DK0: [MICROCT. DATOS. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -dim [-1 -1-1] >
    3. tapa la vértebra rotada al cambiar el plano XY al plano ZX.
      1. Abrirá una nueva ventana de DECterm (" Session manager " → " aplicaciones " → " DECterm ").
      2. Run " ipl ":
      3. Ipl > flip
      4. -entrada [en] > hacia fuera
      5. -entrada [fuera] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. Definir el VOI. Contorno de
      1. dibujar una circular del defecto utilizando un segmento desde el centro del defecto seleccionando el icono de contorno circular en " programa de evaluación de producto " ( figura 6A). Copia que contorno y pegar en todos los sectores en el defecto ( Figura 6B).
        Nota: Puesto que todos los defectos fueron creados usando el mismo procedimiento, analizar el mismo número de rodajas y, posteriormente, el volumen total (TV) para todas las muestras de.
  2. Vértebra objetivo.
    Nota: El momento es de 10-20 minutos por muestra. Archivos de
    1. carga el DICOM de la blanco y las vértebras de la referencia a la ventana principal del software de análisis de imagen.
      Nota: Evitar los cambios de valor de escala de grises, definir el mismo tipo de salida datos como los archivos originales de DICOM en el menú de carga.
    2. Registro de la referencia de la vértebra.
      1. Lanzamiento el " registro Voxel 3D " módulo y la vértebra de referencia como el " volumen Base " y la vértebra de destino como la " partido volumen. " haga clic en " registro " para registrar las vértebras ( Figura 5).
    3. Salvar el fichero registrado utilizando los mismos datos tipo e importación a un entorno de µCT.
    4. Aplicar el VOI.
      1. Aplicar el VOI definido para la vértebra de la referencia a la vértebra destino registrado haciendo clic en " programa de evaluación del producto " → " archivo " → " GOBJ de carga " y seleccionando la GOBJ previamente creado. Compruebe que la VOI y defecto son concéntricos.

6. Análisis MicroCT

Nota: la sincronización es 10-20 minutos por muestra.

  1. Enviar el VOI para la evaluación del uso de un programa de evaluación de µCT ( figura 6).
    Nota: Asegúrese de utilizar los mismos parámetros al analizar los VOIs. Asegúrese de que el umbral es suficientemente alto como para omitir el ruido de fondo con pérdida mínima de hueso. Si se utiliza un biomaterial radiopaco, podría utilizarse una serie de estrategias para analizar la formación de hueso. Si hay una diferencia en densidad entre el biomaterial y el hueso el tejido, el biomaterial podría segmentarse a 35 , 36. De lo contrario, los investigadores podrían evaluar cualitativamente las diferencias en la formación ósea entre los grupos experimentales.

7. Eutanasia

  1. lugar la rata osteoporótica en la cámara de inducción conectado a una máquina de anestesia. Inducir la anestesia con isoflurano de 5% en oxígeno al 100%.
  2. Mantener la anestesia mediante el cono de la nariz y realizar la eutanasia mediante la incisión de la cavidad torácica para producir un neumotórax bilateral 37.

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Representative Results

Mediante este protocolo, una imagen y cuantificar la regeneración de n = 8 defectos vertebrales osteoporóticas modeladas a través de diferentes puntos temporales. La coincidencia anatómica obtenida por el procedimiento de registro permite el análisis del misma VOI todos los puntos de tiempo. Esto resulta en un análisis histomorfométrico 3D longitudinal altamente preciso, incluso cuando ya no son reconocibles los márgenes del defecto original. Utilizamos cinco puntos de tiempo (día 1, semana 2, semana 4, semana 8 y la semana 12) como un ejemplo para la evaluación longitudinal de la regeneración ósea (figura 7). Regeneración puede evaluarse tanto por la evaluación cualitativa de los cortes transversales 2D e imágenes en 3D (como se ilustra en la Figura 7A) y por la comparación cuantitativa de la cantidad de hueso (BVD) y calidad (AD) (figura 7B). Pueden determinarse los siguientes índices morfométricos para hueso recién formado: (i) televisión, incluyendo volúmenes de hueso y tejidos blandos (TV, mm3); (ii) volumen de tejido mineralizado (BV, mm3); (iii) hueso densidad de volumen (BV/TV); y (iv) hueso densidad mineral (DMO, hidroxiapatita mg por cm3). Específicamente, la formación del hueso mínimo (aumento del 5% en la densidad de volumen de hueso) se observó 2 semanas después del establecimiento del defecto. Después de dos semanas, no hubo diferencias significativas en la formación ósea se observaron en comparación con momentos posteriores. En general, aunque hubo algún grado de formación ósea, que alcanzó su punto máximo en aproximadamente un 10% en la semana 8, fue mínima para mantener el hueso vacío en el tiempo.

Figure 1
Figura 1: diseño del protocolo. Se describen los pasos claves en el protocolo. Ratas desnudas primeras, ovariectomizadas sometidas a cuatro meses de una dieta de calcio baja (LCD) fueron intervenidas a crear defectos de tamaño crítico estándar en dos cuerpos vertebrales lumbares. Las ratas fueron fotografiadas el día 1 y después de la operación semanas 2, 4, 8 y 12. La exploración de día 1 fue reorientada a una posición estándar, y una VOI cilíndrica fue definido usando los márgenes del defecto. Exploraciones posteriores µCT de cada rata se registraron automáticamente a la posición estándar definida para la correspondiente exploración del día 1. El día 1 predefinidos VOI entonces fue aplicado a los análisis registrados. La densidad de volumen óseo y densidad aparente del VOI fueron utilizados para evaluar la nueva formación del hueso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: defecto Vertebral cirugía. Se ilustran los pasos clave en la generación quirúrgica de defectos vertebrales. En primer lugar, las ratas se colocaron en una almohadilla de calefacción (A). Se hizo una incisión de línea media a través de la piel (B) y luego la linea alba (C) para exponer la cavidad abdominal (D). Los intestinos se reflejaron para exponer la pared abdominal posterior (E), y la columna lumbar se expone utilizando thermocautery (flecha, F-G). Defectos se perforaron en el cuarto (H, flecha para el taladro; Yo, flecha señalando el defecto) y quinto (J, flechas apuntando a los defectos) cuerpos vertebrales lumbares. Finalmente, se suturan la aponeurosis (K) y piel (L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: vértebra separación. Se muestran los pasos claves en el contorno de una vértebra de interés. (A-I) Se muestran representante rebanadas 2D contorno (línea verde) en el eje de la longitud de una vértebra. Una representación 3D de la columna completa (J) puede ser comparada con la vértebra separada (K). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: vértebra posicionamiento de referencia. Representante de rebanadas en dos planos se muestran de una vértebra antes y después de la rotación a una posición estándar. En primer lugar, utilizando a un representante XY-rebanada (A), el ángulo (B, verde) es necesario girar el defecto (B, Plaza Roja) a ser paralela al eje y (B, amarillo) determina y utiliza para crear la imagen rotada (C ). Luego, mediante un representante YZ-slice (D), el ángulo (E, verde) es necesario girar el defecto (E, cuadrado rojo) a ser paralela al eje z (E, amarillo) determina y utiliza para crear la imagen rotada (F ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: destino vértebra inscripción. Representante de rebanadas en tres planos de la vértebra blanco (marcado en verde) y referencia vértebra (marcado en rojo) antes de (A-C) y después (D-E) registro aparecen. Nota el color amarillo, que indican superposición entre vértebras de destino y referencia y las flechas blancas que señalan al hueso verde después de la regeneración, lo que indica la formación de hueso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis de la VOI. Representante de rebanadas en dos planos con el volumen curvo de interés se muestran. Un contorno circular se coloca en el centro del defecto en un representante ZX-rebanada (A). Después de contornear todos los ZX-sectores, el volumen del defecto completo puede verse en el plano XY (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: análisis Longitudinal de la regeneración de defectos vertebrales. Se muestran los resultados del análisis cualitativo y cuantitativo representativo hueso regeneración. (A) A defecto vertebral representativo en varios puntos de tiempo se representa en cada panel una imagen 3D frontal (panel superior) con la formación de hueso en el vacío indicado en rojo, una imagen 2D sagital (panel central), como una imagen 2D axial (panel inferior). Se realizó el análisis cuantitativo de la formación del hueso en los huecos. Volumen de hueso densidad (B) y densidad aparente (C) se calcularon y compararon mediante repetido medidas ANOVA de dos vías con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Las barras de error representan SEM. ***-p < 0.0001. Por favor le haga clic ene para ver una versión más grande de esta figura.

Pasos Problema Razón posible Solución
2.3 Animal jadeando bajo anestesia Entrega de isoflurano exceso Reducir la concentración de isoflurano entregada al animal.
Animal responde a pizca Entrega insuficiente de isoflurano Aumentar la concentración de isoflurano.
2.7-2.12 Sangrado abundante Daño vascular Utilice un hisopo de algodón estéril para aplicar presión o cauterio para detener el sangrado.
El animal tiene dificultad para respirar Se pincha el diafragma Eutanasia del animal para prevenir la sofocación.
Fuga de contenido intestinal El tracto gastrointestinal fue perforado Eutanasia del animal para prevenir otras complicaciones. Evitar que al levantar la aponeurosis de los intestinos subyacentes antes de cortar.
Sangre emerge desde el sitio de perforación Se pincha un vaso sanguíneo Aplicar una torunda de algodón estéril hasta que se detiene la sangría.
Animal sacude repentinamente durante la perforación El taladro fue demasiado profundo y daña la médula espinal Eutanasia del animal para prevenir otras complicaciones.
El defecto óseo se ve incompleto El taladro no ir lo suficientemente profundo Vuelva a colocar la cabeza del taladro en el defecto y profundizar
2.15 2.24 Se rompe la sutura La sutura fue tirada demasiado Vuelva a colocar la sutura toda. Si la ruptura ocurre a menudo, utilice una sutura más gruesa de tamaño.
Animal es lento para recuperarse de la anestesia El animal es hipotermia Aumentar la temperatura de la almohada o aplicar una fuente adicional de calefacción (e.g. lámpara).
Las suturas están abiertas Las suturas se colocan libremente, o el animal hizo actividad vigorosa Reaplicar las suturas y Dermabond se aplican directamente a las suturas y entre ellos.
3 Imagen escaneada aparece con baja resolución, ruidoso o disperso Parámetros de digitalización deben ajustarse Ajustar los parámetros del Protocolo de análisis. Consulte a Bouxsein et para más directrices para el análisis.
Imagen escaneada aparece borrosa El animal se movió durante el proceso de digitalización Vuelva a examinar al animal. Si el movimiento continúa, aumentar la concentración de isoflurano.
5 El registro de la vértebra objetivo no tuvo éxito Separación vertebral no fue hecho correctamente Contornear la vértebra: Asegúrese de que todas las partes de la vértebra se incluyen y excluyen cualquier estructuras adyacentes.
Gran diferencia en el posicionamiento de las vértebras Vuelva a colocar la vértebra de destino en la misma orientación que la vértebra de referencia mediante rotaciones y flip (paso 29A).
Analizar no puede reconocer correctamente las estructuras óseas Aplicar un umbral en el módulo de registro para eliminar el ruido de fondo de las muestras del hueso.
Las vértebras registradas son diferentes Crear imágenes en 3d de sus muestras y combinar las vértebras correcta a través de los diferentes puntos temporales.
6 El volumen total (TV) es diferente entre las muestras Se utilizó un número diferente de rebanadas o un contorno diferente Asegúrese de utilizar siempre el mismo tamaño de contorno y el mismo número de rebanadas.
Valor de la densidad mineral (DMO) del hueso es anormal Calibración inadecuada de microCT Calibrar la microCT normas correctas de hidroxiapatita

Tabla 1: solución de problemas. Posibles problemas y soluciones se presentan diferentes pasos en el protocolo.

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Discussion

La osteoporosis es la causa más frecuente de las fracturas de compresión vertebral causada por una carga mayor sobre la columna vertebral y que resultan en el colapso del cuerpo vertebral. Sin embargo, es prácticamente imposible generar una lesión en un roedor que auténticamente Replica similar colapso vertebral. En cambio, los investigadores crean un vacío cilíndrico en el centro del cuerpo vertebral para imitar OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. puesto que hay no hay consistencia en la literatura en cuanto al tamaño del defecto, un defecto de tamaño crítico fue definido como uno que espontáneamente sana plenamente sin una intervención dentro de 3 meses post-op16,17.

Aunque el método de combinar la ovariectomía con una pantalla LCD para inducir rápidamente osteoporosis fue previamente publicado1,13, fueron los primeros en mostrar que la aplicación de este enfoque athymic resultados de ratas en un eficiente, rápido, y disminución irreversible en el hueso trabecular vertebral volumen y mineral de densidad40. Se trata de un modelo reproducible del pequeño animal que es unhindered por el sistema inmune roedor y que no han necesidad de inmunosupresión, como por otros24.

Nuestro protocolo quirúrgico genera múltiples idénticos defectos vertebrales lumbar crítica40. Esto resulta en defectos muy consistentes y fácilmente comparables y cuantificables a través de animales. Creemos que defectos producidos usando este acercamiento son superiores al defecto vertebral modelos generados en vértebras caudales1,19,41 porque la cola de rata es sometida a fuerzas biomecánicas que están significativamente diferentes de los relacionados con la columna lumbar de la rata.

Pasos críticos en este protocolo incluyen evitar hipotermia intraoperatoria y tomar precaución al taladrar las frágiles vértebras de ratas ovariectomizadas de desnudo después de un LCD. Después de generar el defecto vertebral, se monitorea a través de una secuencia temporal de análisis de en vivo µCT en puntos de tiempo para la evaluación longitudinal de la reparación ósea. Es fundamental mantener la misma configuración de escaneo. Las vértebras son contorneadas y separadas del resto de la exploración. Contorno un idéntico volumen total para todos los escaneos de una vértebra y evitando cambios de valor de escala de grises son críticos. Comercialmente disponibles múltiples algoritmo de registro de imagen facilita la extracción de la línea de base anatómica correspondiente VOIs a todos los puntos de tiempo posteriores. Por último, se analizan estas VOIs volumen del hueso, densidad aparente, etcetera. Es fundamental analizar todos VOIs utilizando los mismos parámetros. Esta técnica proporciona un análisis µCT 3D longitudinal altamente precisa y sencilla que no es dependiente de usuario.

Este método podría aplicarse a cualquier análisis de la regeneración de defecto longitudinal del hueso. El modelo de defecto vertebral utilizado aquí es un modelo conveniente para esta aplicación, ya que su estructura ósea es único y puede ser fácilmente registrado en la misma posición anatómica. Sin embargo, cualquier regeneración ósea podría analizarse bajo las mismas condiciones separando adecuadamente el hueso mismo de interés a través de los análisis longitudinales. Es imprescindible incluir muestras de huesos separados con las mismas características anatómicas. Este problema potencial y otros se describen en la tabla 1, junto con posibles causas y soluciones sugeridas. La coincidencia anatómica obtenida por el procedimiento de registro sólo puede ocurrir si las muestras son las mismas características anatómicas. El registro permite al usuario aplicar el VOI predefinido exacto de la primera exploración a todos los puntos de tiempo restante, dando por resultado un análisis histomorfométrico 3D altamente precisas en el tiempo. Volumen la densidad ósea y la densidad aparente del VOI pueden utilizarse para evaluar la nueva formación del hueso.

Aunque potencialmente ampliamente aplicables, el modelo presentado aquí no es sin limitaciones. El uso de ratas desnudo athymic podría considerarse una limitación, potencialmente podría enmascarar algunos procesos inmune-mediado que pueden ser de importancia para la regeneración. En segundo lugar, modelado de osteoporosis mediante la combinación de la ovariectomía y una pantalla LCD en ratas jóvenes, previamente publicados1,13, está limitado en su capacidad para imitar la biología de la población de pacientes ancianos. En tercer lugar, OVCFs fueron modelados por un procedimiento quirúrgico, como los otros animales que las fracturas relacionadas con osteoporosis son primates42. Finalmente, mientras que la rata de columna lumbar es el mejor modelo disponible para la columna lumbar humana, donde se desarrollan la mayoría de las fracturas vertebral, la falta de carga axial en la columna de roedor también es una limitación.

Este protocolo es modular y por lo tanto podría ser fácilmente modificado a las necesidades del investigador. Por ejemplo, las ratas ovariectomizada athymic podrían utilizarse para estudiar otras fracturas relacionadas con osteoporosis. Debe un investigador decide usar nuestro enfoque al análisis de la regeneración de hueso semiautomatizado, se podría aplicar a cualquier modelo de fractura usando estructural longitudinal de imágenes, no necesariamente micro-computarizada la tomografía. Además, información adicional podría recopilarse simultáneamente utilizando modalidades de imágenes adicionales como imágenes por resonancia magnética.

El modelo OVCF presentado en este protocolo podría utilizarse para el estudio de nuevos enfoques terapéuticos para este clínico insatisfechas. Además, nuestro enfoque de análisis semiautomatizado puede utilizarse con éxito para realizar un análisis similar que es menos dependiente del usuario y ofrece mayor precisión que otros métodos16. Particularmente digno de mención es el hecho de que hemos utilizado software de visualización y análisis disponible comercialmente que puede ser utilizado por cualquier investigador — software que admite modalidades de imágenes adicionales, tales como proyección de imagen de resonancia magnética y proyección de imagen nuclear. Por lo tanto, creemos que este método es altamente generalizable y sólo está limitado por la disponibilidad de en vivo capacidades de proyección de imagen y software de registro.

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Disclosures

Esta investigación fue apoyada por una beca del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).

Acknowledgments

La investigación fue apoyada por una beca del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

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