Spids

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I denne undersøgelse er metoden præsenteret for, hvordan man udfører elektrofeksiologiske optagelser med injektion på flere steder fra den hyperdirekte vej under urethananæstesi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haumesser, J. K., Kühn, J., Güttler, C., Nguyen, D. H., Beck, M. H., Kühn, A. A., van Riesen, C. Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp. (124), e55940, doi:10.3791/55940 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Konvergerende beviser viser, at mange neuropsykiatriske sygdomme skal forstås som lidelser i storskala neuronale netværk. For bedre at forstå det patofysiologiske grundlag for disse sygdomme er det nødvendigt at præcis karakterisere på hvilken måde forarbejdning af information forstyrres mellem de forskellige neuronale dele af kredsløbet. Ved hjælp af ekstracellulære in vivo elektrofysiologiske optagelser er det muligt at præcis afgrænse neuronal aktivitet inden for et neuronalt netværk. Anvendelsen af ​​denne metode har flere fordele i forhold til alternative teknikker, fx funktionel magnetisk resonansbilleddannelse og calciumbilleddannelse, da det tillader en unik tidsmæssig og rumlig opløsning og ikke er afhængig af genetisk manipulerede organismer. Imidlertid er brugen af ​​ekstracellulære in vivo optagelser begrænset, da det er en invasiv teknik, der ikke kan anvendes universelt. I denne artikel er en enkel og nem at bruge metode præsenteret wHvor det er muligt at optage ekstracellulære potentialer samtidigt som lokale feltpotentialer og multiunit-aktivitet på flere steder i et netværk. Det er detaljeret, hvordan en præcis målretning af subkortiske kerner kan opnås ved hjælp af en kombination af stereotaktisk kirurgi og online analyse af multi-enhed optagelser. Det er således påvist, hvordan et komplet netværk, såsom den hyperdirektive cortico-basale ganglia-løkke, kan undersøges i bedøvede dyr in vivo .

Introduction

Nylige kumulative beviser for forskellige neuropsykiatriske lidelser som Parkinsons sygdom (PD) og skizofreni tyder stærkt på, at deres patofysiologi er baseret på en kritisk dysfunktion af forlængede neuronalkredsløb, der ofte involverer kortikale og subkortiske strukturer 1 , 2 , 3 . Ifølge denne teori opstår de kliniske manifestationer af sygdommene som følge af en forringet informationsbehandlingsevne af et netværk af celler i stedet for enkelte celler eller specifikke neuronale elementer 1 , 2 , 3 . For at øge forståelsen af ​​denne komplekse gruppe af neuropsykiatriske sygdomme og finde nye behandlingsmuligheder er det obligatorisk at karakterisere neuronal dynamikken hos disse uordnede netværk i menneskelige patienter og i dyremodeller i detaljer. En fremragendeEnt metode til at studere store netværk i levende fag er multi-site elektrofysiologiske optagelser af ekstracellulære potentialer 4 . Ved hjælp af denne metode er det muligt samtidig at vurdere lokale feltpotentialer (LFP'er), der primært repræsenterer den tidsmæssige summation af excitatoriske og hæmmende postsynaptiske strømme og multi-unit aktivitet (MUA), der genereres af presynaptiske potentialer 5 . Optagelsen af ​​ekstracellulære potentialer har flere fordele i forhold til alternative metoder til at studere netværk, fx funktionel magnetisk resonansbilleddannelse og calciumbilleddannelse, fordi den giver en højere tidsmæssig og rumlig opløsning, og fordi den ikke er afhængig af genetisk manipulerede organismer 5 . Imidlertid er brugen af ​​ekstracellulære in vivo optagelser begrænset, da det er en invasiv teknik, der ikke kan anvendes universelt.

In vivo elektrofysiologisk recOrdninger kan udføres i vågen såvel som i bedøvede dyr 6 . Begge metoder ledsages af specifikke fordele og ulemper. Undersøgelser i vågen dyr tillader optagelse af hjerne signaler under udførelsen af ​​definerede adfærdsmæssige opgaver, men er tilbøjelige til bevægelsesrelaterede og andre artefakter 7 , 8 . Optagelser i bedøvede dyr på den anden side giver mulighed for at vurdere LFP'er og MUA med et minimum af artefakter ved højt definerede kortikale synkroniseringsstilstande, men resultaterne adskiller sig i nogen grad fra det, der findes i vågen emner 9 , 10 , 11 .

I de senere år er det blevet påvist, at prøveudtagningen af ​​LFP'er er særlig nyttig til at afgrænse patologiske ændringer af netværksaktivitet. Et fremtrædende eksempel på dette er forskning om patofysiologi af PD hos menneskerS og dyremodeller af sygdommen, hvor det kunne påvises, at forøget beta-oscillationer i den cortico-basale ganglia-sløjfe er forbundet med parkinsoniske motoriske symptomer 12 , 13 . Som en konsekvens af denne forskningslinie undersøges det for øjeblikket, om beta-oscillationer kan bruges som en online feedback biomarkør til lukket-hjuls dyb hjerne stimulering 14 , 15 .

I den foreliggende undersøgelse tilvejebringes der en detaljeret beskrivelse af akutte in-vivo elektrofysiologiske optagelser af LFP'er og MUA i rotter, der er bedøvet med urethan. Det påvises, hvordan et komplet netværk, såsom den hyperdirektive cortico-basale ganglia-bane, kan karakteriseres elektrofysiologisk ved hjælp af standard og tilpassede elektroder og hvordan disse elektroder kan bygges. Det understreges især, hvordan en præcis målretning af basale ganglia-kerner kan opnås ved coMbining stereotaktisk kirurgi sammen med online registrering af MUA'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslov (senest revideret i 2014) og europæiske bestemmelser (2010/63 / EU). Eksperimenter blev godkendt af den lokale dyrevelfærdsmyndighed (LaGeSo, Berlin) og overholdt lokale afdelinger og internationale retningslinjer.

BEMÆRK: I den præsenterede metode bruges to elektrodemodeller til at optage fra den hyperdirektiske cortico-basale ganglia-vej, der forbinder primærmotorcortexen (M1) med subthalaminkernen (STN) og substantia nigra pars reticulate (SNr). Til epidural elektrocorticogram (ECoG) anvendes optagelser fra M1 specialfremstillede lavimpedans Ag / AgCl elektroder. Optagelserne fra STN og SNr udføres med kommercielt tilgængelige højimpedans wolframelektroder.

1. Konstruktion af Epidural Ag / AgCl Epidurale Elektroder

  1. Tag en ca. 5 cm lang stribe af 99,99% ren sølvtråd med en diametreR på 200 μm og fjern eventuelt belægning.
  2. Hold spidsen med spidsen nedad i en flamme af en lighter eller et lys, indtil spidsen begynder at smelte. Vent, indtil spidsen er kugleformet og har en diameter på ca. 1 mm. Afskær den præformede elektrode til en samlet længde på 15 mm fra begyndelsen af ​​den kugleformede spids til trådenden.
  3. Lodde en præcisionstik til trådenden, som passer til det anvendte elektrofysiologiske registreringssystem. Dæk lödpunktet fra ledningens ende til stikket med ledende sølvfarv. Dette hjælper ledningsevne og resulterer i en bedre signalkvalitet.
  4. Efter at den ledende lak er tørret, dække loddet med et 3 mm til 1 mm varmekrympeslange. Brug forsigtigt en urmagerens hammer til at flade den kugleformede spids til halv tykkelsen.
  5. Anbring undersøgelseshandsker og tag en linsfri rengøringsduge med 100% ethanol for at fjerne snavs og fedt.
  6. Sæt elektroderne iEt 15 ml centrifugerør eller cellekulturrør og fyld det op med husholdningschlorblegemiddel (FORSIGTIG, indeholdende 2,8 g natriumhypochlorid pr. 100 g opløsningsmiddel), indtil den kugleformede spids er helt dækket.
    FORSIGTIG: Klorblegemiddel er ætsende; Følg altid producentens sikkerhedsanvisninger.
  7. Tag elektroderne ud efter 23 min og skyl dem generøst med destilleret vand. Den vellykkede anvendelse af et sølvchloridlag fremgår som en homogen lilla farveændring.
  8. Tør i luften. Efter helt tørret, tag elektroderne med fine pincet. Med en fin pensel bør du anvende flydende elektrisk isolering. Start på ledningen direkte bag elektrodespidsen og dækk alt op til varmekrympeslangen. Lad isoleringen tørre i mindst 2 timer.
  9. For kvalitetskontrol udfør en kontrol af elektrisk ledningsevne med et multimeter. Hvis det er muligt, udfør impedans test ved 1 kHz ved hjælp af en passende impedansmåler, mens elektroden og testenSonden er samlet i en 0,9% NaCl indeholdende H20 opløsning uden at berøre hinanden. Impedansværdierne ved 1 kHz skal være ca. 8 kΩ.

2. Fastgør elektroderne til en stereotaksisk holder

BEMÆRK: Brug samtidig wolfram-mikroelektroder med en impedans på 1,5 MΩ for at optage MUA og LFP'er samtidig. Hvis optagelsens fokus er på optagelser af høj kvalitet af enkelt enheder, skal du vælge mikrovågelektroder med højere impedans (> 5 MΩ). Hvis formålet med undersøgelsen udelukkende er rettet mod LFP'er, kan elektroder med lavere impedanser være acceptable. For små strukturer, for hvilke dorsoventrale stereotaxiske justeringer ofte er nødvendige, skal man bruge elektroder med en passende dorsoventral spidsadskillelse (i dette tilfælde 250 μm). Desuden giver dette en fordel ved en mere lokal referenceelektrode, hvis det er nødvendigt. De stereotaksiske koordinater måles altid fra den nederste elektrode og aRe beregnet i reference til bregma.

  1. Tag en standard stereotaxisk elektrodeholder med en akrylblok og klemme og læg det sikkert på en flad overflade i synsfeltet på et kirurgisk mikroskop.
  2. Løs det første par elektroder løst fast i akrylblokken af ​​holderen med stykker tape (3 mm x 8 mm) ved brug af fine pincet. Elektroderne skal udstikke akrylblokken ca. 12 mm.
  3. Ret forsigtigt den anden bipolære elektrode ved siden af ​​den første elektrode. For at målrette strukturen i den hyperdirekte vej skal afstanden være 2 mm ( figur 1 ). For de fleste standard stereotaxiske elektrodeholdere er dette den tilstødende reces. Brug en tykkelsesmåler til at verificere. Forskellige netværk kan nås på samme måde. Til dette kan akrylblokken vendes i en vis grad.
  4. Juster det andet par elektroder ved at glide det forsigtigt til en position, hvor den mest ventrale spids er ca. 200Μm forsænket i forhold til den første elektrode ( figur 1 ). Gør dette under mikroskopisk vision. Til dette skal du bruge en 30 G kanyle (ydre diameter 300 μm) for bedre at beregne afstanden.
  5. Tryk på klæbebåndet, og fastgør derefter med holderens metalklap.

3. Kirurgi

  1. Ved elektrofysiologiske optagelser skal du bruge urethan (FORSIGTIG) for anæstesi.
    Forsigtig: Urethan er giftig og kræftfremkaldende, så overholder altid sikkerhedsforskrifterne og databladet fra stoffets fabrikant.
  2. Forbered en opløsning af 200 mg / ml urethan i 0,9% NaCl medicinsk saltopløsning.
  3. Administrer i alt 1,3 g / kg kropsvægt urethan intraperitonealt (IP). Afhængigt af rottestammen kan det være rimeligt at opdele dosen i to doser med et interval på 15 minutter mellem injektionerne for at forbedre narkosens sikkerhed.
  4. Kontroller dybden af ​​anæstesi ved at bruge pEdal-tilbagetrækning refleks og andre egnede reflekser. Hvis bedøvelsen ikke er dyb nok til at udføre operation, injicer du 0,15 g / kg legemsvægt af urethan-IP og venter yderligere 15 minutter.
  5. Påfør et øjensalve for at forhindre hornhindeudtørring.
  6. Kontinuerlig overvågning respirationsfrekvens og pedal tilbagetrækningsrefleks under anæstesi. Brug en lille dyre opvarmning pad med temperatur kontrol for at sikre, at en fysiologisk kropstemperatur opretholdes gennem kirurgi. Inden starten skal elektrofysiologiske optagelser skifte til et ikke-elektrisk alternativ ( f.eks. Natriumacetatpude).
  7. Barber pelsen sammen med den dorsale side af hovedet for at opnå et rent kirurgisk felt. Desinficer omkring snitstedet med passende kirurgisk desinfektionsmiddel. Fix dyret i den stereotaktiske ramme.
  8. Udfør en 2 cm lang snit i hovedbunden i sagittal retning med en skalpel. Brug en skalpel til lidt skrabe af kraniet aponeurosis og desinficere kraniet. Brug coTton knopper gennemblødt i 3% H202 for at fjerne eventuelt resterende væv.
  9. Brug en elektrocauter eller termocauter til at kontrollere blødning, hvis det er nødvendigt. Stop blødninger fra kraniet knogle og hypoderm, hvis blødningen ikke stopper spontant efter 1-2 min og forhindrer synet på kraniet.
  10. Juster skærebjælken, indtil hovedet er placeret i fladskallet position, hvilket betyder at bregma og lambda som stereotaxiske referencepunkter er i samme plan. Dette er vigtigst for at opnå høj kirurgisk præcision. Brug et standard stereotaxisk rotationsjusteringsværktøj, kalibrér det udpegede tip til bregma under mikroskopisk vision og juster fordybningsbjælken, indtil de udpegede punkter for bregma og lambda på værktøjet rører på kraniet på samme tid.
    BEMÆRK: En visning fra den ene side med fokuseret lys fra den anden kan bidrage til at bestemme denne tilstand. Alternativt kan du tage en stereotaxisk holder med en fin kanyle og måle de dorsoventrale koordinater for Bregma aNd lambda under mikroskopisk vision. Juster skærebjælken, indtil de dorsoventrale koordinater for Bregma og lambda er de samme.
  11. Brug en stereotaxisk holder med kanyle, kalibrere til bregma og derefter beregne placeringen af ​​alle borehuller på kraniet. Brug den stereotaxiske holder til at markere positionerne for de huller, der skal bores, enten ved omhyggeligt at ridse kraniet eller ved at bruge en kirurgisk farvemarkør. Koordinaterne for dette afhænger af målene, koordinater med reference til bregmaen er givet til hyperdirektvejen i tabel 1 , herunder de foreslåede koordinater for cerebellære referenceelektroder.
  12. Ved hjælp af en microdrill bores alle huller omhyggeligt. For STN og SNr bor et fælles hul (ca. 2 mm x 3 mm i størrelse). Alle andre borehuller skal have en diameter på ca. 1 mm.
  13. Tag to fine kanyler (mindst 27 G) og bøj deres spidser for at danne en hooked form ved hjælp af en hård overflade eller pincet. Brug disse til at fjerne enhver debriS fra borehullerne, og skær forsigtigt og fjern dura materen i det fælles STN / SNr hul.
  14. Skyl borehullerne med fysiologisk saltvand. Påfør en dråbe fysiologisk saltvand hver 15. minut til borehullerne for at forhindre hjernen og dura fra udtørring.
  15. Tag en mikrodrill og matchende rustfrit stålmikroskrue ( f.eks. En M 1.2 mm x 2 mm skrue), bor et hul og skru en mikroskrue imellem hullerne i de reference epiduralelektroder over cerebellum, gør det samme for M1 epidural elektroder.
  16. Skub de selvbyggede Ag / AgCl epidurale elektroder ind i borehullerne for referenceelektroderne og M1-elektroderne. Styr elektrodespidsen med fine pincet og skub det direkte under kraniet benet ind i borehullet.
  17. Fix alle epidural elektroder med to-komponent dental akryl. Sørg for ikke at dække bregma-punktet eller påvirke det fælles STN / SNr-hul.
  18. Indsæt den forberedte holder med wolframmikrofilelektrodenEs i den stereotaxiske ramme.
  19. Kalibrere den mest ventrale elektrode, som er beregnet til at målrette mod STN, til bregma. Juster til den beregnede position over det fælles STN / SNr hul og sænk elektroderne ned til hjernen under mikroskopisk vision. Sørg for, at wolframmikrofilelektroderne går glat ind i hjernen.

4. Elektrofysiologisk kortlægning og optagelser

BEMÆRK: For dette trin er et Faraday bur og et flerkanals elektrofysiologisk optagelsessystem med optagelsessoftware i stand til online-filtrering og online spikesortering nødvendig. Brug fortrinsvis et system, der virker med en forforstærker placeret nær dyrets hoved for at holde elektrisk støj og artefakter til et absolut minimum. Udover wolframmikrofilelektroderne er mindst en epidural og en referenceelektrode nødvendig for at udføre optagelser af hyperdirektvejen. Det anbefales at indsætte epidural og referencE elektroder parvis uden at røre ved hinanden, hjælper det i tilfælde af funktionsfejl og giver mulighed for forskellige typer referencer i dataanalyse.

  1. Sæt en mobil Faraday bur over den stereotaxiske ramme. Hvis kun et stationært Faraday-bur er til rådighed, skal du forsigtigt flytte den stereotaxiske ramme ind i Faraday-buret, mens du sørger for, at dybe hjerneelektroder ikke sænkes ned i hjernen, indtil den stereotaxiske ramme er i sin endelige position.
  2. Tilslut elektroderne til hovedet i den elektrofysiologiske opsætning. Sørg for, at referenceelektroderne er forbundet til passende referencekanaler.
  3. Indstil optagelsessoftware: Bandpass-filter (0,05-8,000 Hz) og forstærk (få 1.500-2.000x) det rå datasignal. Brug et online LFP- og spikesfilter med passende indstillinger (båndpasfilter 0,05-250 Hz for LFP'er, bandpassfilter 300-8000 Hz for MUA). For alle filtre skal du bruge et butterworth-type filter.
  4. Indstil en spike tærskel, hvis det er relevant, for onlineE spike sortering. De fleste optagelsessoftware muliggør opsætning af en spidsgrænse, som er en amplitudeværdi over hvilken et signal er markeret som en spids af softwaren. Denne tærskel kan enten bestemmes matematisk som en faktor eller standardafvigelse af middel-amplitude af det filtrerede spikesignal eller kan fortrinsvis bestemmes ved visuel inspektion af datasegmenter <500 ms og opstilles som en linje over signalstøj i en grafisk brugergrænseflade.
    BEMÆRK: Formålet med at oprette en spike tærskel er at tælle pigge og sortere enheder for at give information om, hvor mange neuroner der for tiden er registreret, og hvordan deres pigge er formet.
  5. Sænk langsomt wolframmikrofilelektroderne til 1 mm dorsal af målet, hvilket er STN for hyperdirect pathway. Vent til signalet stabiliseres, hvis det er nødvendigt.
  6. For elektrofysiologisk kortlægning fremskyndes elektroderne ventralt i trin på 100 μm. Ved hvert trin skal du vurdere brændemønsteret, skyde rSpiste og formede pigge. Sammenlign dem med de typiske eksempler, der er givet i figur 2 . Almindeligvis viser tætte kerne hurtig og kontinuerlig spiking over flere dorsoventrale trin, medens fiberrige strukturer viser lave brændhastigheder og mindre homogen spidsaktivitet i efterfølgende ventrale trin.
  7. For den hyperdirekte vej skal du sørge for, at den mest ventrale elektrode er inde i STN.
    BEMÆRK: STN nås, når en betydelig stigning i MUA detekteres ventral af Zona incerta. Ventral til STN, spiking stopper næsten helt fordi elektroden har nået den indre kapsel. Når den mest ventrale elektrode er i STN, sikrer konfigurationen af ​​wolframmikroelektroderne den bageste, den anden elektrode er i SNr. Dorsoventral finjustering i små trin kan være nødvendigt for at registrere typisk MUA i STN og SNr på samme tid. Bemærk, at frekvensen af ​​MUA afhænger af antallet af neuroner, der faktisk er optaget og på niveauhjernenaktivering.
  8. Når elektroderne er i de ønskede strukturer, skal du oprette online filtrering og spikesortering (se figur 4 ), og derefter starte optagelsen af ​​dataene. Typiske eksempler på de forskellige cortical synkroniseringstilstande, som kan identificeres i LFP-optagelserne, er vist i figur 3 .

5. Eksperimentets slutning

  1. Når optagelserne er færdige, hæves elektroderne langsomt ud af hjernen og spules dem øjeblikkeligt med fysiologisk saltvand. Elektroderne kan genbruges efter grundig skylning og visuel inspektion. Udladningsbøjelektroder.
  2. Euthanize dyrene ved en IP-indsprøjtning af en overdosis urethan (2,5 g / kg legemsvægt).
    BEMÆRK: Uretan bør kun anvendes til afsluttende procedurer.
  3. Hvis der kræves histologisk kontrol af elektrodepositionen eller andre histologiske farvningsprocedurer, skal du fjerne hjernen fra kraniet og behandle denVæv hensigtsmæssigt.
    BEMÆRK: Afhængigt af de påtænkte farvningsmetoder kan transcardiel perfusion være nødvendig. Til post mortem-verifikation af elektrodpositionen er en standard Nissl-farvning tilstrækkelig i de fleste tilfælde til at visualisere elektrodbanen i f.eks. Koronale hjerneafsnit. Yderligere fremgangsmåder til at lette histologisk målverifikation indbefatter brugen af ​​elektrisk inducerede læsioner i hjernevævet ved at påføre elektrisk strøm via optageelektroderne eller påføring af biokompatibelt farvestof forud for elektrodeindsættelse 16 , 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med de heri anvendte optageelektroder er det muligt at prøve LFP'er fra primærmotorisk cortex, subthalamukernen og substantia nigra pars reticulata og MUA fra STN og SNr. Indledningsvis optages LFP'er og multi-enhed-aktivitet sammen i et bredbåndssignal. Derefter adskilles LFP'er og MUA'er med båndpasfiltre (0,05-250 Hz for LFP'er og 300-4000 Hz for MUA).

For den korrekte målretning af subkortiske kerner, især af små strukturer som STN, er det fordelagtigt at justere de planlagte stereotaksiske koordinater med online-registreret MUA-signal. Til elektrodebane målretningen kan STN karakteristisk MUA mønster optages ( Figur 2 ) 9 , 20 .

For senere trin i analysen er detOfte obligatorisk at definere enkelte enheder fra multi-enhed aktivitet ved principiel komponentanalyse ( figur 4 ).

I LFP-optagelserne fra M1 kan to spontant vekslende kortikale synkroniseringsstilstande identificeres: Aktiveret tilstand (AS) og tilstanden Slow Wave Activity (SWA) ( Figur 3 ) 18 , 19 . Mens SWA-tilstanden domineres af langsomt oscillationer med høj amplitude på omkring 1 Hz, er AS karakteriseret ved hurtigere oscillationer med en lavere amplitude ( Figur 3 ).

figur 1
Figur 1: Opsætning af Deep Brain Microwire Electrodes i en Standard Stereotaxisk Holder. Bemærk spidsadskillelsen mellem A, elektrodeparet forSTN og B, elektrodeparet for SNr i dorsoventral retning på ca. 200 μm og anterioposterior retning ca. 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Karakteristisk Multi-enhed Aktivitet fra en Dorsoventral Elektrode Trajectory Målretning af STN. ( A ) Multi-enhed optagelser af den ventrale posteromediale thalaminkernen (VPM), zona incerta (ZI), subthalamukernen (STN) og substantia nigra pars reticularis (SNr). VPM'en udviser sparsomme og uregelmæssige afstandsstykker med høj amplitude. Dette mønster af pigge ophører, når de nærmer sig ZI. Når elektroden kommer ind i STN et typisk højfrekvent fyringsmønster med korte udbrud med medium forstærketUde kan observeres. SNr kan identificeres ved dets høje amplitude og regelmæssige skyde mønster. ( B) STN-baner overlejret på billeder fra en rotte-stereotaktisk atlas 21 . Øvre del: koronalplan. Nederste del: sagittalplan. Bemærk, at elektrodespidsen passerer gennem VPM og ZI. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3. Kortikale synkroniseringsstater i LFP-optagelser fra primær motorcortex under uretananæstesi. ( A ) Repræsentativ 600 s LFP-registrering af primærmotorkortexen. Tidsperioder med højfrekvens, lav amplitudeaktivitet svarende til aktiveret tilstand (i) og tidsperioder med en langsommere rytme og høj Er amplitude svarende til tilstanden Slow Wave Activity (ii) kan differentieres. ( B ) Tilsvarende tidsfrekvensplan over et interval på 600 s, der viser 0-20 Hz relativ effekt af de LFP'er, der er vist i (A). Varmere farvninger angiver højere relativ effekt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Sortering af enkelte enheder fra STN Multi-unit Activity. ( A ) Tredimensionel visning af enhedsklynger i funktionsrum efter hovedkomponentanalyse. Hver klynge repræsenterer en formodet enhedsenhed. ( B ) Spike bølgeformer og spike bølgeform gennemsnit svarende til klyngerne i (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Koordinater fra Bregma STN Snr M1 Reference 1 Reference 2
anterior-posterior -3,6 -4,8 3,0 -10,0 -10,0
medial-lateral 2,5 2,5 3,0 3,0 -3,0
dorsal-ventral -8,0 na na na na

Tabel 1: Stereotaksekoordinater til optagelse af Hyperdirect CoRtico-basal ganglia vej. Alle punkter måles fra bregma referencepunktet på kraniet i mm; Ikke relevant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse er metoden demonstreret, hvordan man optager ekstracellulære elektrofysiologiske signaler samtidigt fra flere steder i et givet netværk ved hjælp af eksemplet på den hyperdirecte cortico-basale ganglia-vej, der forbinder M1 med STN og SNr i gnavere.

Et kritisk trin i optagelsen af ​​små subkortiske strukturer, såsom STN, er den præcist styrede indsættelse af optageelektroderne i målet. I den præsenterede metode sikrer man at to vigtige trin sikrer en høj nøjagtighed af målretningen. Når dyret forberedes i det stereotaktiske apparat, inden elektroderne indføres i hjernen, er det absolut obligatorisk at sikre, at kraniet bringes i positionen "flade kraniet" 22 . For at opnå den flade skalleposition ændres positionen af ​​snitlinjen for den stereotaktiske ramme indtil højderne af bregma- og lambda-referencepunkterne oN kraniet er ved samme dorsoventrale plan 21 . Kun ved at sikre denne position kan koordinater fundet i stereotaktiske atlas anvendes med høj præcision til det enkelte laboratoriedyr, da atlaserne er baseret på den flade kraniet stilling 21 . Eksperimentelle beviser beviser også, at målretningsnøjagtigheden ved hjælp af en individualiseret fladskalleposition er overlegen til en fast indstilling af skærebjælken 23 . Placeringen af ​​optageelektroderne i dorsoventralplanet bør finjusteres ved konstant registrering af multi-enhed aktivitet. De forskellige kerne- og hvide stofstrukturer langs elektrodebanen viser karakteristiske brandmønstre ( figur 2 ), som kan anvendes til at justere positionen af ​​elektroden 9 , 20 .

Et andet vigtigt skridt i den præsenterede metode er placeringen af ​​rEference elektrode. I den præsenterede protokol blev en position over cerebellar cortex valgt, fordi referenceelektroden på dette tidspunkt ikke detekterer den cortico-basale gangliaaktivitet, som var det centrale punkt for undersøgelsen. I undersøgelser med interesse for analysemetoder, der er modtagelige for volumeledning, bør en mere lokal reference være favoriseret 5 .

Urethane er et almindeligt anvendt anæstetikum til optagelse af neuronale ekstracellulære potentialer i dyreforskning 11 , 18 , 24 , 25 , 26 . Årsagen til dette er, at en enkeltdosis urethan kan producere en stabil og langvarig narkose i 8-12 timer med kun en begrænset depression af centralnervesystemets aktivitet sammenlignet med andre anæstetika 27 . Men urethan anæstesiA aktiverer også det sympatiske nervesystem, som kan resultere i uønskede bivirkninger som f.eks. Hyperglykæmi 27 . På grund af dets langvarige virkning og manglen på et stærkt lægemiddel til at modvirke dets anæstetiske virkning, bør urethan ikke anvendes til gentagne forsøg, som adskilles af timer eller dage. Hvis det er planlagt at lave flere optagelsessessioner på samme dyr, eller hvis der er en teknisk grund til ikke at anvende urethan, kan gasanæstesi med isofluran og injektioner af lægemidler som ketamin og xylazin være rimelige alternativer til elektrofysiologiske in vivo eksperimenter 28 , 29 . Ulempen ved disse narkose regimer er, at de kræver hyppigere overvågning og justeringer end brugen af ​​urethan på grund af deres korte halveringstid og ophobningen af ​​stofferne over tid. Derudover er der tegn på, at urethan kan forstyrre mindre med fysiologisk b Regnaktivitet end andre anæstetika 30 .

Alle de heri detaljerede registreringsbetingelser bestemmer kritisk, hvordan de opnåede data kan behandles yderligere og analyseres offline, derfor er det obligatorisk at justere alle indstillinger til kravene i de planlagte analysetrin. Da der er mange muligheder for analyse af multikanals ekstracellulære optagelser, kan brugen af ​​tilgængelige open source værktøjskasser være fordelagtig 31 .

Optagelsen af ​​ekstracellulære potentialer in vivo er en metode, der giver en unik tidsmæssig og rumlig opløsning af hjerne signaler, der er bedre end alternative metoder, såsom funktionel magnetisk resonans billeddannelse og calciumbilleddannelse 5 . Den fremlagte metode kan ikke kun anvendes til optagelse af hyperdirect pathway, men kan let tilpasses til en række andre eksperimentelle modeller og forskningsspørgsmålF "> 24 , 32 , 33. Da det imidlertid involverer stereotaktisk kirurgi, er der mange forskningsindstillinger, hvor den ikke kan anvendes, og hvor en ikke-invasiv metode skal vælges.

I fremtiden skal en kombination af den præsenterede ekstracellulære multi-site optagelsesteknik med optogenetiske værktøjer realiseres for yderligere at forbedre vores forståelse af netværksdysfunktionen underliggende neuropsykiatriske sygdomme for at finde nye behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, til finansiering af vores studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl custom epidural electrodes Goodfellow GmbH
D-61213 Bad Nauheim, Germany
info@goodfellow.com
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes
Stereotaxic holder with acrylic block David Kopf Instruments,
7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders
Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance Microprobes.com
18247-D Flower Hill Way  Gaithersburg, Maryland, 20879 USA
Product-ID WE3ST31.5A5-250um The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible.
Rat alignment tool David Kopf Instruments,
7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula
Two-component dental acrylic Associated Dental Products Ltd.
Kemdent Works, Purton, Swindon
Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based)
Faraday cage Self-construction A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh
Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities OmniPlex® Neural Data Acquisition System
Plexon Inc
6500 Greenville Avenue, Suite 700
Dallas, Texas 75206
USA
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77, (3), 406-424 (2013).
  2. Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72, (8), 840-844 (2015).
  3. Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75, (6), 963-980 (2012).
  4. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, (5), 446-451 (2004).
  5. Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13, (6), 407-420 (2012).
  6. Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
  7. Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221, (2), 307-319 (2010).
  8. Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113, (3), 925-936 (2015).
  9. Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
  10. Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20, (2), 820-833 (2000).
  11. Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26, (23), 6318-6329 (2006).
  12. Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17, (6), 656-664 (2007).
  13. Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
  14. Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
  15. Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. 77-86 (2013).
  16. Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150, (2), 185-191 (2006).
  17. Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
  18. Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28, (18), 4795-4806 (2008).
  19. Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101, (2), 243-276 (2000).
  20. Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100, (4), 679-687 (2004).
  21. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (1998).
  22. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. (2008).
  23. Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200, (1), 29-35 (2011).
  24. Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
  25. Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217, (2), 269-281 (2009).
  26. Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13, (8), 3252-3265 (1993).
  27. Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42, (2), 109-114 (1986).
  28. Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23, (31), 10058-10063 (2003).
  29. Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69, (1), 41-51 (2015).
  30. Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26, (3), 518-531 (2016).
  31. Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
  32. Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
  33. Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics