제자리에서 Shewanella oneidensis MR1 Biofilms SALVI 및 ToF 심즈의 특성

Chemistry

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Summary

이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.

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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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Abstract

박테리아 biofilms는 그는 광대 하 게 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 및 환경 미생물학에서 그들의 역할을 이해 하는 표면에 관련 된 지역 사회. 이 연구는 분석 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에 대 한 시스템에 biofilm 첨부 파일을 육성하 고 생활 biofilm의 화학 매핑 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈)에 의해 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 외부와 우리의 전문 설치 SALVI 채널 내의 박테리아의 경작을 통해 뿐만 아니라 biofilm 존재 및 ToF 심즈 분석 전에 두께 감지 하는 광학 이미징 기술을 통해 이루어집니다. 조각 같은 biofilm에서 크게 다른 탈수의 지역화 된 물 클러스터 환경으로 EPS에 강조 우리의 결과, 자연 수 화 상태에서 Shewanella biofilm의 특성 피크를 보여 상태입니다. 이러한 결과 진공 기반 화학 이미징 장비 biofilm 이미징 제자리에 있도록 SALVI의 획기적인 기능을 보여 줍니다.

Introduction

박테리아 biofilms는 점에서 셀 연결 하 고 많은 가능한 환경에서 살아남을 수 있다 불리 한 물리적 및 기계적 자극, 다양 한 생존을 위해 박테리아에 대 한 방어로 시간이 지남에 진화 표면 관련 커뮤니티. 1 , 2 Biofilms는 광대 하 게 조사 하 고 의학, 공학, 농업, 그리고 산업 연구 및 개발 등 많은 분야에 응용 프로그램을. 1 , 2 정확 하 필수적 이다 이러한 복잡 한 미생물 지역 사회, 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS)와 그들의 현지 물-클러스터 환경 등의 화학 매핑을 이해 하 고 상세한 그들의 생물 학적 활동 묘사 2

Biofilms는 존재 하 고 높은 수 화 상태에서 성장. 이 진공에서 휘발성 액체를 공부에 어려움으로 인해 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈) 같은 진공 기반 표면 분석 기법을 사용 하 여 큰 도전을 선물 한다. 그 결과, 진공 기반 표면 분석 기법만 말린된 상태에서 biofilm 샘플을 공부 하 고 거의 독점적으로 제한 되었습니다. 그러나, 그것의 진정한 생물 microenvironment의 정확한 조사 억제 말린된 상태에서 biofilm을 공부. 그것은 종종 EPS 무결성 및 biofilm 형태, 건조 biofilm 제자리에 액체 연구 질량 스펙트럼 결과 비교한 후 입증 되었습니다 어떤 과감 한 변경 발생 합니다. 3 , 4 이 문서에서는 분석에는 액체 진공 인터페이스 (SALVI),5,6 미세 반응 기에 대 한 우리의 시스템의 사용을 채용 하 여 자연 수 화 상태에서 biofilms 공부에 대 한 솔루션 제공을 따라서 여전히 진공 내에서 액체 매트릭스의 구조적 무결성을 유지 하면서 보조 이온 조사 빔에 대 한 직접 액세스를 제공 하는 아닌입니다 (PMDS)의 만든에서 그것의 얇은 실리콘 나이트 라 이드 (죄) 막에서 액체를 포함 약 실입니다. 7 , 8

S. oneidensis 씨-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하기 위해 돌연변이이 biofilm 절차 그림 변화 다양성 및 기반 환경 및 응용 미생물학에 있는 일반적인 사용에 대 한 모델 생물으로 선정 되었다 금속 감소와 세포 외 전자 전송에 대 한 그것의 독특한 기능에 무 겁 게. 9 , 10 , 11 또한, GFP의 존재를 허용 쉽게 연속 biofilm-두께 형광 현미경 검사 법을 통해 모니터링, fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터를 사용 하 여. 우리의 이전 연구 죄 창 최대 1 백 마이크로미터의 두께에 biofilm 성장을 위한 형광 이미징에 operando를 사용 하 여 첨부 파일을 선호 하는이 박테리아의 증거가 나타났습니다. 4 , 12 이 종이 형광 현미경 검사 법을 통해 biofilm의 존재의 확인을 토론할 것 이다, 하는 동안는 SALVI는 슈퍼 해상도 같은 다른 광학 이미징 방법에 호환 형광 이미징 (즉, 구조화 된 조명 현미경 (SIM)9) 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM)4이미징). 광학 이미징 biofilm 두께 측정을 제공 하 고 표시, 두께 신 창에 첨부 파일을 확인 하는 biofilm의 모양의 3D 이미지를 얻을 수 있습니다. 9 동안 GFP 심즈 분석에 사용 되었다, oneidensis S. GFP 없이 성장 곡선에 대 한 광학 밀도의이 유일한 필요한 측정으로 사용 되었다 어떤 형광 이미징 요구 하지 않았다. 일반적으로, 차이 GFP 태그 및 태그 종 성장 곡선에 중요 하지 않습니다. 또한,이 프로토콜 절차를 설명 하는 모델 생물으로 S. oneidensis 씨 1 GFP를 사용,이 절차는를 위한 SALVI 내 재배에 필요한 수 있습니다 어떤 세균성 긴장. 비록 주어진 필요한 세균성 긴장의 지식, 시간, 온도, 산소 환경 등 일부 성장 조건 사용 될 박테리아의 변형에 맞게 수정 해야 합니다. 성장 매체에 대 한이 절차는 경작에 대 한 포도 당, 포도 당 없이 tryptic 간장 agar (TSA) 없이 "나노 와이어" 중간, tryptic 간장 국물 (TSB)를 사용합니다. 성장에 대 한 고 막의 확장 모니터링에 대 한 "나노 와이어" 매체의 구성 특별히 공식화 되었습니다. 그리고 S. oneidensis 작은 전선과 중간 구성의 모양을 나타나는 periplasm 되었습니다. 이전 연구에서 설립. 13 , 14

현장에서 우리의 이전 프로토콜 액체 ToF-심즈 SALVI 단백질 immobilization와 죄, ToF 심즈 분석 및 데이터 감소에 상세한 프로토콜을 첨부 파일에 대 한 제공 하는 혜택을 설명 했습니다. 12 데이터 감소 단계를 되풀이, 보다는 오히려이 종이 될 것입니다 대신 설정 하 고 biofilm 존재와 사전 두께 감지 하는 이미징 단계 뿐 아니라 우리의 SALVI 아닌 내 biofilms 육성의 독특한 접근 방식에 초점을 ToF 심즈 분석 하. Biofilms 이전만 건조 챔버 내에 진공 기반 표면 분석 기법의 샘플을 제한 되어, 하는 동안 라이브 biofilms의 상세한 EPS 및 biofilm 화학 매핑 지금 얻을 수 있습니다 현장에서 이 새로운 기능 때문에.

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Protocol

1. 재료의 준비

  1. 준비의 중간 튜브
    1. (biofilm 문화와 성장 곡선 당 필요한 3 당 필요 1) 혈 청 병
      참고: 어떤 성장 든 지 소개에서 설명 했 듯이 이 절차에 대 한 관심의 박테리아의 변형에 필요한 영양분을 제공 하는 적합 한 매체를 이용 될 수 있다 이 경우에, " 나노 와이어 " 미디어와 포도 당 매체 없이 TSB S. oneidensis 씨 1 GFP의 성장을 위해 사용 되었다. 13
      1. 보증금 20 mL로 한 70 mL 혈 청 병, 성장 매체의 마 개 모자 그리고 병을 방해. 살 균 깨끗 한 알루미늄 호 일의 조각으로 상단 커버.
      2. 압력솥 121에서 30 분 동안 액체 주기 병 ° C. Afterward, 저장 실내 온도에서 살 균된 혈 청 병.
    2. 혐 기성 문화 관
      1. 공기 headspace와 혐 기성 문화 관으로 성장 매체의 5 mL을 입금 마 개에 넣고 병을 방해. 살 균 호 상단 커버.
  2. 거품 트랩 튜브 준비
    1. 신중 하 게 혈 청 병 고무 마 개를 통해 구멍을 펀치 22 게이지 바늘을 사용 하 여.
    2. 잘라 20 1/32 " 소계 (PTFE) 같은 면도기와 튜브 튜브의 세그먼트의 그 한쪽 끝은 뾰족한.
    3. PTFE 튜브 고무 마 개 윗부분에 구멍을 통해 스레드 뾰족한 끝을 사용 하 여. 때까지 약 2 cm 마 개를 통해 평면 끝에 면도칼으로 PTFE 튜브의 뾰족한 끝을 잘라 튜브를 겨.
    4. 5 mL 주사기의 플런저를 제거 하 고 주사기의 오픈 엔드에 1.2.3 단계에서 고무 마 개를 맞는. PTFE 튜브의 2 cm 끝은 주사기의 배럴 있습니다. 이것은 거품 트랩.
    5. 거품 트랩 (PTFE 튜빙, 고무 마 개, 및 주사기)에 알루미늄 호 일로 1.2.4 단계 및 고압 테이프와 보호 포장. 고압 튜브는 중력으로 소독 호 일 패키지 30 분을 위한 121 ° C에서 주기 단계 2.4에서에서 사용 하기 위해 준비까지 실내 온도에 밀폐 호 일 패키지 저장.
  3. 세균성 성장 곡선
    참고:이 프로토콜 사용 하 여 S. oneidensis 씨 1 GFP 모델 생물으로 SALVI에 biofilm을 성장. 그러나,이 절차는 다른 박테리아 성장 aerobically 또는 anaerobically에 맞게 적용할 수 있습니다. 어떤 변형 사용에 따라 성장 시간과 환경 적절 하 게 조정 해야 할 수 있습니다.
    참고:-80 ° C 세균 냉장고 주식 없이 포도 당 및 글리세롤 TSB의 1:1 혼합물의 구성 되어 있습니다. 성장 곡선의 예에서는 그림 1 B로 각각 0.2 mL 수량에 세 번 20 mL와 70 mL 혈 청 병 없이 포도 당으로 TSB의 스타터 문화를 사용 하 여 준비 되었다 " 나노 와이어 " TSB의 흔적을 제거 하는 매체. 그러나,이 프로토콜 하나만 성장 매체 사용 됩니다, 그리고 S. oneidensis에 대 한 이러한 특정 중간 솔루션으로 이루어졌다 그 후속 전송 되지 실시 됩니다,이 가정 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하지, 하지만이 같은 추가 전송은 것이 좋습니다 처음 풍부한 TSB에 박테리아를 입금으로 고정 된 세포 복구; 그리고 3 명의 후속 전송 " 나노 와이어 " 모든 TSB는 사라 하 고 발생 하는 전형적인 성장 역학.
    1. 스타터 문화
      1. 접종-80 ° C 냉동 고에서 세균 글리세롤 재고를 제거 하 고 가능한 한 빨리 녹여 gloved 손 가진 주식을 따뜻한. 생물 안전 캐비닛 (BSC)이 냉장고 주식 이동.
      2. BSC 내에서 단계 1.1.2에서에서 준비 없이 포도 당으로 성장 매체의 5 mL를 포함 하는 출장 및 방해 혐 기성 문화 관에 냉장고 주식의 0.1 mL를 전송에 연결 된 22 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 합니다. 적절 한 생물학적 폐기물 컨테이너에 다시 동결로 나머지 냉장고의 dispose 셀 충격 수.
      3. 는 스타터 문화 분 (rpm) 당 150 회전에서 30 ° C에서 쉐이 커/인큐베이터에서 알을 품고 고 600 nm (OD 600) 읽을 때 사용에서 광학 밀도 받아 주십시오. 기록의 성장 및 OD 600 시간 같은 모든 후속 사용에 대 한 그 같은 시간에 행 해질 수 있다 결과 재현 되도록. 예를 들어,이 스타터 문화 15 h에 대 한 성장을 허용 되었고 사용 약 1.0의 OD 600.
    2. 접종 성장 매체
      1. 1.1.1.2, 그리고 초보 문화 1.3.1.3, 준비 단계에서 준비 하는 3 개의 혈 청 병 하 고 BSC를 모두가지고.
      2. 내는 BSC, 각각 22 G 바늘, 혈 청 병의 각 선발 문화에서 전송 솔루션의 0.1 mL와 멸 균 1 mL 주사기를 사용 하 여.
      3. Sterilize 70% 혈 청 병의 상단 에탄올과 소독된 알루미늄 호 일, 커버 라벨을 적절 하 게, 그리고 인큐베이터 내에서 궤도 셰이 커에 전송. 150 rpm 궤도 셰이 커를 설정 하 고 30 인큐베이터를 설정 단계 1.3.3 내 ° C. 품 첫 번째 OD 600 데이터 전 까지는 촬영.
    3. 취득 세 600 데이터 포인트
      1. 빈 필터 살 균 증류수 이온된 (DI)의 입금 100 µ L에 의해 물으로 준비 살 균 베트. 물이 오염 되지 것입니다 있도록 플라스틱 파라핀 영화는 베트의 상단 주위를 바꿈. 실내 온도에 상점. 사용 하 여 UV/Vis 분 광 광도 계는 베트를 삽입 하 여 눌러 성장 곡선에 대 한 모든 데이터 포인트를 복용 하기 전에이 빈 " 빈 ".
        참고: 모든 48 h 새로운 빈 준비 되어야 한다 잘못 된 독서 피하기 위해 정기적으로 빈을 교체 하는 것이 좋습니다로.
      2. 각 세 600 데이터 요소에 대 한 준비 단계 1.3.2.3 인큐베이터 및 전송에서 소독된 BSC에서에서 혈 청 병을 제거. 0.1 mL 접종된 매체의 각 혈 청 병 및 살 균 큐 벳을 별도로 표시 3 입금 받아.
      3. 블랭킹, 후 멧 자외선 보이는 (UV/Vis) 분 광 광도 계에는 문화를 포함 하 고 한 번에 하나의 OD 600를 읽고 넣고 그 시간 지점에 대 한 모든 세 가지 수치를 기록.
        참고: S. oneidensis 씨-1에 대 한 데이터 요소 찍은 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81, 및 105 h에서 접종 후. 성장은 박테리아 죽음 단계 완료 되 면 완료 됩니다. 이러한 포인트는 특정 성장 시간과이 프로토콜에 사용 되는 박테리아의 추세에 지식의 부족 경우 적절 하 게 조정 되어야 한다. 성장 추세에 대 한 불확실성이 있는 경우에, 포인트 해야 하는 데이터 수집 더 자주, 예를 들어, 첫 번째 12 h, 후속 36 h, 다음 100 h, 12 h 간격 및 최종 124 헤에 대 한 24 시간 간격에 대 한 모든 6 h에 대 한 모든 3 h
      4. OD 600을 사용 하 여 y 축으로 데이터 요소 및 시간을 x 축으로 그래프 그래프 소프트웨어를 사용 하 여 각 시간 점에 대 한 표준 편차 오차 막대와 함께 찍은 3 점의 평균 곡선. S. oneidensis 씨-1 성장 곡선 그림 1 B 대표적인 결과 섹션에에서 표시 됩니다.
      5. 성장 곡선의 로그 단계 섹션의 기간 식별 단계 1.3.3.4에서 준비 하는 그래프를 사용 하 여. Shewanella, 이것이 성장의; 12와 33 h 사이 따라서 그것은 추정 될 수 있다 성장의 24 h, Shewanella 된다는 것의 성장, 그 로그-단계 내에서 박테리아 성장 곡선에 사용 된 사용 하기 전에 치료와 같은 미디어를 사용 하 여 양식 것 이다 가정.

2. 박테리아 배양

  1. 첫날: 천 배지 접종
    참고:이 섹션의 절차는 agarose pla와 함께 사용 되었다로그-단계, 성장 곡선에 사용 하는 액체 시 동기 문화 대신에 하나의 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 테. 이 TSA 포도 당 없이 사용 되었고 그 후로 사실 때문에 동일한 성장 조건 재현으로 간주 될 수 있는 " 나노 와이어 " 매체 성장 곡선 절차, 그리고 TSA에 TSB를 구성 하는 동일한 성분이 있다.
    1. 얼음 양동이에 S. oneidensis 씨-1 GFPbacteria 주식-80 ° C 냉동 고 및 장소에서 제거, 소독된 BSC 내부이 양동이.
    2. BSC, 내를 사용 하 여 살 균 1 µ L 접종 루프 냉동된 박테리아의 표면을 긁어 T-행진 agarose 격판덮개의 표면에 루프를 사용 하 여.
    3. 플라스틱 파라핀 영화와 접시의 측면 씰링 후 접시를 반전 하 고 개별 식민지 나타날 때까지 24 시간에 30 ° C 인큐베이터에 저장.
  2. 2 일째: 혈 청 병을 접종
    1. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 BSC 내에서.
    2. BSC, 내 디 물에 70% 에탄올과 1.1.1 단계에서 준비 된 혈 청 병에 고무 스 토퍼의 표면을 청소.
    3. 개별 CFU 천 배지에서 선택한, 멸 균 주사기를 사용 하 여 연결 된 22 바늘 게이지, 어떤 이웃 식민지를 건드리지 않고 접시에서 식민지를 꺼내 려 충분 한 성장 매체를 입금 및 식민지의 제보와 매체 혼합 바늘.
      : 참고 단독으로 식민지를 선택 해야 합니다 충분히 멀리 다른 박테리아는 접시에 있는 그런 매체는 다른 식민지를 건드리지 않고 그것에 입금 하실 수 있습니다.
    4. 접시의 표면에서 액체 추출 같은 주사기를 사용 하 여.
    5. 거품 주사기 내에 밖으로 두드리는, 후 혈 청 병에 액체를 주입 하 고 30 ° C 24 h. 위해 150 rpm에서 설정 내에서 궤도 셰이 커에 장소
      주: 혈 청 병, 더 많은 산소를 소개 실험 조건을 변경 하 고 박테리아에 대 한 성장 시간 사이의 일관성 줄일 수 병에 더 많은 산소를 소개를 피하기 위하여 중요 하다 주사기에서 거품을 도청.
  3. 2 일째: SALVI 아닌 살 균
    참고: 무 균 튜브 시스템의 홍보, BSC 내에서 새로운 주사기와 튜브 및 교체에서 주사기를 분리 해야 하는 단계를 완료. 이렇게 하려면 단순히 금속 주사기 홀더를 빼서 주사기 펌프에서 주사기를 분리 하 고 배관 살 균 BSC에 부착 된 주사기를가지고. 연결할 때 튜브 시스템에서에서 언급 한 절차, 액체 저수지, PTFE 튜빙, 피팅 슬쩍 인젝터는 물방울 챔버에 연결 polyetheretherketon (PEEK) 인젝터와 연결할 들어 있는 주사기를 의미 합니다 SALVI 입구 SALVI 콘센트 배관 밀봉 콘센트 컨테이너 뿐만 아니라 배관.
    1. 새 SALVI 장치를 사용 하 고 슬쩍 피팅 및 인젝터 PTFE 튜빙의 한쪽 끝을 연결.
      참고: SALVI 장치는 이전 연구 및 특허에 대 한 자세한 장치 제조 각 실험 다음 신선한 준비. 5 , 6 , 8 , 15
    2. 주사기에 70% 에탄올의 2 개 mL를가지고 고는 SALVI에 PEEK 피팅 연결. 주사기 펌프에 주사기를 연결 하 고 폐 병에는 SALVI의 콘센트를 연결, 후 수 분 20 µ L/1.5 헤 대 한 SALVI 통해 실행 에탄올 디 물 솔루션
    3. 소독된 디의 걸릴 4 mL 주사기로 물이 고 동일한 SALVI의 입구에 연결. 주사기 펌프에 주사기를 연결한 후 적어도 3 h. 위해 20 μ/분 SALVI 통해 실행 물을 수 있도록
    4. 는 BSC 내에서 단계 1.2.5에서에서 준비 호 일 패킷 열고 살 균 픽 사출의 5 mL 주사기와 멸 균 PEEK 피팅 TFE 튜브의 끝에 끝을 연결 합니다. 받아 ~ 3 mL 주사기로 메 마른 매체의 TFE 튜브를 연결. 5 mL 물방울 챔버를 반전 하 고, 멸 균 주사기를 사용 하 여 주입 성장 매체 물방울 챔버 1 mL의 총 볼륨에 도달할 때까지.
    5. 는 SALVI의 입구에 5 mL 주사기 물방울 챔버의 끝을 연결.
    6. 멸 균 주사기에 성장 매체의 10 mL 고 똑 튜브의 입구에 연결. 주사기 펌프에 주사기를 연결한 후 12 h 20 µ L/분 SALVI 통해 실행 (또는 밤새 껏) 매체를 수 있습니다. 접착 테이프를 사용 하 여 이러한 부품을 확보 하 여. 커버 호 일 또는 먼지 입자 및 미생물 오염 매체에 포함 된의 확률을 최소화 하기 위해 플라스틱 파라핀 영화 콘센트 병. 이 모양을의 상세한 묘사는 그림 1 A에서 찾을 수 있습니다.
      1. 허용 똑 튜브 수 세로, 그 주사기 펌프 두어야 한다 높은 표면에 물방울 튜브와 테이프, 그리고 평평한 표면 아래에 SALVI 보안 의미를.
      2. 에탄올의 모든 흔적 제거 되도록 12 h SALVI 통해 매체를 실행 아닌 박테리아와 접종 전에 SALVI의 튜브에서.
      3. 추가 보호를 위해 입구와 출구 배관에 맞게 잘라 양쪽으로 멸 균된 페 트리 접시 내 SALVI 아닌 상공을 계속. 또한, 항상 죄 막 이미징 분석 전에 채널을 보호 하기 위해 창에 테이프를 유지.
  4. 하루에 세: SALVI 아닌의 접종
    1. 주사기 펌프에서 전체 배관 시스템 (주사기 SALVI 폐기물 병에 연결에 연결 하는 챔버를 물방울에 연결)를 제거 하 고 그것을는 멸 균된 BSC입니다. 또한, 단계의 2.2.5 인큐베이터에서 혈 청 병을 제거 하 고 BSC 가져.
    2. 어떤 오염을 방지 하기 위해 70% 에탄올과 혈 청 병 스 토퍼의 표면을 청소 하 고를 사용 하 여 무 균 주사기 22 G 연결 된 메 마른 바늘 박테리아의 4 mL 병에서 추출.
    3. 는 SALVI 똑 튜브의 5 mL 상공에서 분리 하 고 주사기는 SALVI의 입구에 직접 접종된 매체와 연결. 똑 배관 살 균 알루미늄 호 일 패킷 또는 BSC 내 두고.
    4. SALVI에 포함 된 액체의 여러 볼륨 변경에 대 한 있도록 SALVI, 채널을 접종을 3 h 20 µ L/분에 실행 되도록 주사기 펌프에 연결할 SALVI과 콘센트 병 주사기.
    5. 접종, 후 SALVI과 주사기 주사기 펌프에서 분리 하 고 BSC를 가져올. 단계의 2.4.3 5 mL 물방울 챔버에 다시는 SALVI의 입구를 연결 후 20 mL 성장 매체의 무 균 주사기로 고 똑 튜브의 입구에 연결.
    6. 는 주사기 펌프에 BSC에서는 SALVI에 연결 된 튜브를가지고 고 6 ~ 10 일, 또는 형광 이미징 (3 단계에서 설명)에 대 한 호의 베푸는 표시 biofilm 성장을 보여줍니다 때까지 2 µ L/min의 속도로 튜브를 통해 전달 하는 매체 ToF 심즈 분석입니다. 성장 매체의 10 mL와 함께 새로운 멸 균 주사기를 작성 한 후 이전 성장 매체 밖으로 실행 하고있다는 SALVI에 연결 하 여 BSC 내에서 밖으로 실행으로 신선한 매체를 리필.
      참고: 2 µ L/min에 접종을 시작, 후 유량 증가 한다 결코 또는 감소, 흐름 속도 변경 것 채널 내의 전단 응력을 만들는 biofilm를 분리. 그것은 중요 한 것이 유량 변경 되어서는 안; 심즈 전에이, ~ 24 h에 대 한 준비, 관찰 밀접 하 게 되도록 그렇게 거기에 더 많은 매체를 밀어 필요가 없는 거품은 튜브 에 튜브를 통해 더 빠른 속도입니다. 그들은 채널에서 biofilm을 밀어 수 있습니다
      1. 피하는 아닌에 거품. 그것은 거품 SALVI 튜브에 연결 5 mL 똑 튜브의 하단에 내에서 주의 해야 합니다. 신선한 매체는 SALVI에 공기를 강제 것입니다 보장 하기 위해 픽 인젝터의 끝에 의해 투입 될 수 있는.

3. 광학 SALVI 아닌 내 Biofilm의 이미징

    형광 현미경 이미징

  1. 참고: Shewanella이 프로토콜 내에서 모델 생물으로 사용 GFP를 표현 하기 위해 돌연변이; 따라서, 그것은 필요 하지 않습니다 얼룩. 박테리아 얼룩, 요구 하는 경우이 항상 행해져야 한다 (예를 들어, 2 µ L/min) biofilm 분리를 피하기 위해 같은 flowrate에. 또한, 셀 양분 가용성 없이 서, 그들은 분리 것입니다. 따라서, 어떤 추가 착 색 하는 것이 필요한 경우 얼룩 한다 주입 성장 매체 보다는 물 얼룩 세포를 공급 하기 전에.
    1. SALVI 똑 BSC 내부 배관에서 분리 하 고 손가락 졸라 픽 연합 PEEK 피팅을 속이 고는 SALVI 닫습니다.
    2. 테이프 유리 슬라이드에 안전 하 게 SALVI 아닌 챔버의 튜브는 창이 완전히 평평 하 고 직면 상승. 창에서 보호용 테이프를 제거 합니다. 플랫폼에 무대 클램프 사이의 유리 슬라이드를 배치 하 여 현미경의 스테이지를 슬라이드 클램프.
    3. 낮은 현미경의 스테이지는 SALVI의 상단 배치 되도록 충분히 가까이 초점의 렌즈는 창을 터치를 일으키지 것입니다 10 X 목표의 끝.
    4. 스위치 백라이트 찾기 초점을 조정 하 여 현미경 목표 x 10을 사용 하 여 채널에. 이 시간에는 SALVI의 죄 창에 세균성 부착의 존재 없이 접종 박테리아의 창에 비해 명백한 있는지 확인 합니다. 셀의 가까이 이미징, 20 x 목표 전환 합니다. 창에 연결 하는 박테리아의 존재는 강한 녹색 형광 있어야 빈 SALVI 채널에 비해,.
    5. 는 백라이트를 해제 하 고 현미경은 소스를 켭니다. 2-3 분을 기다릴 고 FITC 필터 창에 연결 된 biofilm의 보기 및 캡처 이미지를 현미경에 설정으로 전환. 준비, 참조 그림 1 C 처럼 성숙된 biofilm 보일 무슨의 예를 들어.
    6. 차례 수은 소스와 슬라이드에서 SALVI 분리. 필요한 경우, 다시 한 번 다시, 이미징 하기 전에 더 많은 성장을 위한 수 있도록 2 µ L/min 중간 흐름에 연결 하거나 보조 포함 ToF 심즈 분석을 위해 사용 하는 SALVI 전송. 이것 biofilm 두께 만큼, 두께가 되지 결론 및 ToF 심즈 분석 전에 성장 위한 더 많은 시간이 필요한 경우 필요 합니다. 연결할 중간 흐름을 다시 한 번, 단계 2.3.6 참조.
      참고: 아래에 넣어 다시 중간 흐름, 형광 이미징 해야 다시 전에 수행 ToF 심즈 분석. ToF 심즈 분석을 수행할 수 있습니다 때까지 그것을 피드
      1. 주고는 biofilm 성장 매체. 권장 하지, 필요한 경우, 하는 동안 닫힌된 SALVI 하룻밤, 4 ° C에서 저장 될 수 있다 하지만 ToF 심즈의 진공 챔버에 삽입 하기 전에 실내 온도에 온난 하 허용 되어야 한다. 그러나, biofilm biofilm 분리를 줄이기 위해 중간 흐름에서 분리 후에 즉시 분석.

4. ToF 심즈 데이터 수집

참고:이 섹션 개요, 역할 및 흡착된 단백질 분자 액체 심즈 분석을 설명 하는 우리의 이전 프로토콜 내에서 더 자세히 토론 된다. 12

  1. ToF 심즈 초과 챔버에 설치 SALVI
    참고: 항상 때 SALVI 장치를 처리 하 고 ToF 심즈에 설치 단계 동안을 피하기 위해 잠재적인 오염 표면에 글러브를 착용 한다 분석입니다.
    1. 마운트 SALVI 무대에 여러 나사와 그것을 해결. 신 창 조정 나사 압박감과 삽입 실리콘 웨이퍼에 의해 평면 조각 PDMS 아닌 챔버의 하단에는 다는 것을 확인 하십시오. 창에서 보호용 테이프를 제거 후 ToF 심즈 초과 챔버로 무대를 로드.
    2. 는 ToF 심즈 초과, 개최 및 로딩 플랫폼에 가로로 무대 설정 열고 초과 문을 닫습니다. 진공 펌프를 시작 하 고 그 적합 한 진공에 도달 되도록 기다립니다.
    3. 진공 1 x 10 -7 mbar 안정 면 메인 챔버는 SALVI 이동.
  2. 깊이 프로 파일링 및 수집 데이터 요소
    1. ToF 심즈에 광학 현미경을 사용 하 여 미세 채널 찾기.
    2. 는 데이터 수집 전에 양수 또는 음수 모드를 선택합니다. 25 사용 하 여 케빈 Bi 3 + 모든 측정에서 기본 이온 빔으로 광속 및 전자 홍수 총을 사용 하 여 모든 측정 하는 동안 충전 표면 중화.
    3. 검색 150 ns 펄스 Bi 3 + 빔 폭 64 x 64 픽셀 해상도와 ~ 2 µ m의 직경을 가진 원형 지역에. 100 nm 죄 창을 통해 펀치 후 다른 150에 대 한 검색을 계속 고 강도 이미징에 대 한 데이터를 수집 하는 s. 펀치-통해, 후 카운트는 지역 프로 파일링 깊이 내에서 크게 증가할 것 이다. 안정화, 후이 수 라고도 강도 높은 지역.
    4. 감소 펄스 폭 50 ns 더 대량 해상도 스펙트럼을 얻으려고 데이터 컬렉션에 대 한. 계속 또 다른 200에 대 한이 인수에 대 한 s.
    5. 적어도 3 양수와 3 부정적인 데이터 포인트를 수집 하기 위해이 단계를 반복.
      참고: 신 창이 깨뜨리지 않을 것 이다 고 누출에서 진공의 챔버로 창 무결성 손상 되도록 펀치를 통해 지역 공간 반드시.

5. ToF 심즈 데이터 분석

    질량 교정 IonToF 소프트웨어를 사용 하 여
    1. ToF-심즈 (측정 탐색기)의 분석 소프트웨어를 열고 클릭는 " 프로 파일 ", " 스펙트럼 "와 " 이미지 " 버튼, 프로세스 깊이 프로필, m/z 스펙트럼, 및 이미지 데이터를 각각,.
    2. ToF 심즈 데이터 수집을 통해 얻은 데이터 파일 오픈.
    3. 깊이 관심의 데이터 프로 파일링을 선택 하 고 깊이 프로필 임시 시리즈에 따라 스펙트럼 재구성.
    4. 보도 " F3 " 여은 " 교정 질량 " 창. 특정 샘플에 존재 하는 것으로 예상 된다 화학 화합물에 따라 교정에 대 한 봉우리를 선택 하십시오.
  1. 봉우리의 관심 선택
    1. 있는 경우 피크 선택은 샘플 분석을 위해 필요한, 문학 또는 다른 이전 연구 결과 따라이 샘플의 특성 피크를 결정. M/z 스펙트럼에 대 한 관심의 강도 비교 합니다. 필요한 경우 새로운 봉우리를 추가 하거나 간섭 피크 피크 목록에서 삭제.
    2. 클릭 한 피크에 왼쪽된 하단 창에 붉은 줄을 찾아. 모든 피크를 묶는 데 빨간 줄 이동.
    3. 피크 주요 스펙트럼 창에서 화학 수식을 일치 선택 다음을 클릭 하는 " 피크 추가 " 창 위의 버튼. < /리 >
  2. 질량 보정 데이터 내보내기
    1. 피크 목록에서 내보낼는 " 피크 목록 " 메뉴, 선택 " 저장 … " 피크 목록에는 " itmil " 형식.
    2. 에서 깊이 프로 파일을 내보낼는 " 프로필 " 창에 클릭은 " 파일 " 메뉴, 다음 선택 " 수출 ", 선택한 후 "으로 저장 "는 ".txt " 파일.
    3. 에서 m/z 스펙트럼 파일로 내보낼는 " 스펙트럼 " 창에 클릭은 " 파일 " 메뉴, 다음 선택 " 수출 ", 선택한 후 "으로 저장 "는 ".txt " 파일.
    4. 에서 이미지 파일을 수출 하는 " 이미지 " 창 인쇄 화면 및 이미지 파일로 저장.

6. ToF 심즈 데이터 플로팅 및 프레 젠 테이 션

  1. 그래픽 도구를 사용 하 여 데이터를 가져올.
  2. 재건된 스펙트럼을 표시 하는 y 축으로 x 축과 피크 강도로 m/z를 사용 하 여 플롯을 확인 합니다. 예를 들어 그림 2 A에 주어진 다.
  3. 결합 다른 m/z와 양식 중 긍정적 이거나 부정적인 이온 매핑을 표시 하는 행렬의 2 차원 (2D) 이미지 재건. 예를 들어 그림 2 B에 주어 집니다.

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Representative Results

이러한 대표적인 결과 ToF 심즈를 통해 연결 된 biofilm의 화학 프로필 수 식별 및 해석 하는 방법을 보여을 제공 합니다. ToF 심즈 데이터 수집, 절차 섹션에서 짧게 강조에서 질량 스펙트럼을 플로팅 후 피크 식별 각 각각 m/z 값에는 id를 지정 하려면 실시 한다. 이것은 박테리아와 공부, 등 다양 한 물 클러스터, 지방산, 단백질 조각 박테리아 내에서 있을 것으로 예상 되는 특정 화학 조각에 질량 분석에 광범위 한 문학 검토를 통해 행 해질 수 있다. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 이 대표적인 결과 표시 부정적인 질량 스펙트럼으로 S. oneidensis 씨-1 biofilm와 디 물 샘플 합니다. 긍정적인 스펙트럼의 해석 비슷한 절차를 따릅니다.

그림 1 A SALVI 아닌에서 biofilm을 재배 하는 경우이 프로토콜에 따라 도식 설치를 보여줍니다. 왼쪽 상단에 주사기는 일정 한 속도로 PFTE 튜빙 시스템 전체와 아닌 내부 중간 흐르는 계속 주사기 펌프에 첨부 됩니다. 주사기 펌프는 거꾸로 수영 최대 스트림에서 메구미 생물을 방지 하기 위해 중간 저수지에 오염 방지 물방울 챔버 위에 배치 됩니다. 매체의 봉인된 콘센트 병 및 아울렛 튜브는 아닌 통해 전달 SALVI PFTE 튜브에 직접 물방울 챔버 저수지에서 흐른다. 점선은 성숙된 미 oneidensis 의 이미지 죄 창에서 가리키도록 미스터 1 GFP 세포 형광 현미경 검사 법, 단계 3.1에 의해 점령. 그림 1 B 는이 프로토콜, S. oneidensis 씨-1 모델 유기 체를 사용 하 여 성장 곡선의 한 예를 보여 줍니다. 이 그래프에서 성장 단계에서 성장 단계 로그가 특정 재배 조건에서 15-32 h 사이 발생 종결 될 수 있다. 이 그래프에서 추가 정보 표시 0-15 h 성장의 래그 단계 이며 33-105 h 성장의 고정 단계를 나타냅니다. 그림 1 C 성숙된 biofilm의 예를 보여주는 형광 현미경으로 얻은 이미지입니다.

그림 2 A 표시 수산화 S. oneidensis 의 부정적인 질량 스펙트럼으로 제자리에서 액체 ToF 심즈에 의해 미세 채널 내에서 MR-1 biofilm. 이 그래프는 선택 된 대량 범위 (m/z 100-350) 비교 S.oneidensis 미스터-1과 디 물, biofilm의 예를 보여 줍니다 후자 얻은 시스템 제어로. 그림 2 B 씨 1 biofilm 및 ToF 심즈 여 디 물에 관심의 봉우리의 2D 이미지의 비교를 표시 합니다. 일단 m/z 값을 재미 있는 공부는 질량 스펙트럼에서 확인 될 수 있다, m/z 값의 잠재적인 피크 식별은 IonToF 심즈 소프트웨어 도서관 및 문학 조사에서 지 원하는 제대로 화학 조각에 할당 됩니다. 그림 2A 의 봉우리 포함 물 클러스터 (즉, m/z 107 (H2O)5-, 125 (H2O)6-, 143 (H2O)7-, 161 (H2 O)8-, 179 (H2O)9-, 197 (H2O)10-, 215 (H2O)11-, 233 (H2O)12-, 251 (H2O) 13-, 269 (H2O)14-, 287 (H2O)15-, 323 (H2O)17-, 341 (H2O)19-))9로 화합물의 생체 관련 쿼럼 감지 각 봉우리 위에 빨간색 선으로 표시 됩니다 (즉, m/z 175 C10H9없음2-), EPS 부산물 (m/z 123 C2H44-, 159 P 2 O8H-, 216 크롬2O7-, 285 octadecanoethiols, 325 극 지 화합물, C12 극 지 화합물)15,,1618, 그리고 지방산 체인 조각 (즉, m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, 255 C16:0 지방산, 279 linoleic 산, C18H31O2-, 325 C21H40O2 -, 341 표면 지질, 18-MEA thioester 연계, 스 테아 르 산 C18H35O2-, 팔 미트 산 C19H17O6 의 monoacylglyceryls의 이온 바인딩 -). 16 , 19

이후는 biofilm 수산화 biofilm 샘플에서 본 일부 봉우리는 디 물에서 찾아낸 그들과 유사한 놀라운 일이 아니다. 이러한 물 클러스터 봉우리 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, 하 고 341 (H2O)5- 해당 그림 2A, m/z를 포함 하 여 각 피크 위에 빨간색 선으로 표시 됩니다. (H2O) 6- (H2O)7- (H2O)8- (H2O)9- (H2O)10- (H2 O)11- (H2O)12- (H2O)13- (H2O)14- (H2O)15- (H2O)17- (H2O)19-, 각각. 9 이 질량 스펙트럼의 많은 특성 물 클러스터의 보급으로이 결과 수산화 biofilm에 있는 화학 물 클러스터 환경의 강력한 증거를 제공 합니다. 또한, 비 물 클러스터 관련 있으 나 봉우리 두 스펙트럼에서 관찰 된 PDMS, 미세 채널의 구성 요소에서 일반적으로 간섭 봉우리로 일반적으로 표시 될 수 있습니다. 예를 들어 PDMS에서 하나의 일반적인 알려진된 간섭 피크 부정적인 이온 모드에서 m/z 137 이다.

그림 2A와 같이 디 물의 스펙트럼을 대량 biofilm 심즈를 비교, 어떤 봉우리 디 물에 존재 하지 않습니다 아직는 biofilm에 나타나는. 예를 들어 m/z 255에서 피크 ([채널3(채널2)14COO]-, 팔 미트 산) 고 강도에 biofilm 샘플에 하지만 전혀 디 물 샘플에 존재. 이 제안 신호 c일본은 biofilm, 대부분 biofilm 또는 자체 생성 된 EPS는 도쿄에서 많은 재미 있는 봉우리는 그림 2A에서 확인 되었다. 예를 들어, EPS 봉우리는 m/z 123-, C2H44-, 159 (P2O8H-), 216 발견 관련 (Cr2O7-), 285 (octadecanoethiols), 및 325 (극 지 화합물, C 12 극 지 화합물)입니다. 17 , 18 , 20 지방산과 관련 된 봉우리 127 된다는 것을 발견 했다 ([C2H3(CH2)3COO]-), 255 ([채널3(채널2)14COO]-, 팔 미 틴 산), 279 ([CH3 (채널2)15COO]-, 리 놀 레 산), 317 (C21H33O2-), 325 (C21H40O2-), 및 (표면 지질, 18-MEA를 통해 바인딩된 341 thioester 연계, 스 테아 르 산 C18H35O2-, 팔 미트 산 C19H17O6-monoacylglyceryls의 이온). 16 , 19 마지막으로, quinolone 신호 쿼럼 감지 신호 관련 피크의 C10H9없음2- m/z 175에서 관찰 되었다.

그림 2 B 씨-1 oneidensis S. biofilm (위쪽 행)와 디 물 (아래쪽 행) 사이 4 개의 다른 재미 있는 이온의 분포의 2D 이미지를 표시합니다. M/z 값 107 ((H2O)5-)는 m/z 값 175 샘플 내에서 상당한 강도의 물 클러스터 (C10H9없음2-) 감지 관련된 신호, m/z 255 쿼럼 묘사 지방산은 ([채널3(채널2)14COO]-, 팔 미 틴 산), 및 m/z 341 (C21H41O2-) 지질 조각 모두를 나타내는 수 있습니다 클러스터 1 amu 질량 정확도 때문에 물. 9 2D 그림의 밝은 지역 이미지에 분자 이온의 높은 수를 나타냅니다. 예상 했던 대로, 신호는 품질 평가 점수에 대 한 화합물, 그리고 지질 biofilm 샘플 내에서 수량에 훨씬 더 큰 했다. 물 클러스터 (m/z 107)에 대 한 신호 biofilm 샘플을 통해 강한 동안, 또한 이었다 디 물 샘플에 예상 대로. 마지막으로, m/z 341에서 신호 biofilm 샘플 내에서 균질 하지만 아주 약하게 디 물 샘플에서 발견 되었다. M/z 341 물 클러스터 피크 동안, 그것은 또한 여러 다른 지방산 및 표면 지질의 대표. 16 biofilm 샘플 데이터의 정규화 지질 파편의 존재까지 물 클러스터의 존재를 능가 하는 제안 후 이내 그것의 강한 존재.

Figure 1
그림 1 : 실험 회로도. (A) 표시로 biofilm 설치의 실험 회로도 실험실 내에서 나타납니다. 주사기 (1)에서 중간 흐름을 왼쪽, 상단에서 시작를 통해 어느 액체 움직임에 속도 제어 주사기 펌프 (2)에 첨부 됩니다. 화살표는 시스템을 통해 흐름 방향을 나타냅니다. (1) 주사기 TFE 튜브 (4) (3) 피팅 슬쩍 인젝터를 통해 연결 된다. 매체 흐르는 물방울 챔버 (5) 오염 방지 하 고 결국 봉인된 콘센트 컨테이너 (7) SALVI (6)을 통해 이동 합니다. 주사기 펌프는 물방울 챔버 (5) (6) SALVI에 따라 배치 됩니다 (8) 평평한 표면에 수직인 수 높은 표면 (9)에 배치 됩니다. (B) 성장 곡선 Shewanella oneidensis 미스터-1 "나노 와이어" 매체에 대 한. 시간 0-15 h 나타냅니다 지연 위상, 시간 15-33 h 로그 단계를 나타냅니다, 그리고 시간 33-105 h 또는 고정 위상 및 시간 105 h를 나타냅니다 더 이상 죽음의 단계를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 형광 현미경 검사 법 획득 성숙된 biofilm의 (C) 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : ToF 심즈의 비교는 수산화의 스펙트럼 부정적인 Shewanella oneidensis biofilm, 미스터-1 중간 SALVI 아닌에. (A) m/z 심즈 미스터-1 매체와 디 물 Shewanella oneidensis biofilm의 질량 스펙트럼. 후자는 컨트롤으로 사용 되었다. 레드 라인 특성 물 클러스터 봉우리의 위치를 나타냅니다. (B) biofilm 디 물 사이 관심의 봉우리의 2D 이미지 비교. 왼쪽에서 오른쪽, 이미지 표시 (m/z 107 (H2O)5-), 물 클러스터 쿼럼 센 싱/호르몬 신호 (m/z 175, C10H9없음2-), 지방산 (m/z 255, [채널3(CH 2)14COO]-, 팔 미 틴 산), 표면 지질/EPS 조각 (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2-). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

로그 단계에서 접종 후 수 일 및 온도를 그것은 건강 하 고 이미징, 충분히 두꺼운 3.1 단계에서 설명한 대로 전에 biofilm 성장 해야 테스트 중요 하다. 이 절차는 특히 S. oneidensis MR1 biofilm; 실 온에서 배양 커버 그러나 다른 방 온도 성장의 속도 좌우할 수 있다. 따라서, 그것은를 사용 하 여 광학 이미징는 biofilm ToF 심즈 분석을 진행 하기 전에 준비 인지 이해 중요 합니다. 마찬가지로, 박테리아의 다른 변종 다른 성장 조건 및 분석에 대 한 바람직한 두께 달성 하는 길이 필요 합니다. 그림 1b에서 성장 곡선 묘사 될 12-32 h, 박테리아의 로그 단계 200 하 고이 절차를 통해 24 시간에 사용 되었다, 그러나 그것은이 시간으로 사용할 수 없습니다 로그 단계 박테리아의 다른 변종에 대 한 성장 곡선을 설정 하지 않고 독립적으로. 로그 단계 S. oneidensis에 대 한 성장의 12와 33 h 사이 동안, 24 h 사실은 그것이 산소 로그 단계의 끝으로 생물의 성장 율을 제한 하기 시작 했다 성장 부분에 선정 되었다. 이 시간 셀 했다 실험 나노 와이어, 낮은 산소 환경에서 살아남을 수 있는 양식 성공 biofilms에 따라서 액을 생산 하기 시작 했다. 3 , 13 따라서, 박테리아를 사용 하 여 로그 단계를 선택 하는 시간 한다 의해 영향을 받을 연구 경험과 지식을 공부 되는 박테리아의 실험 연구에 문학에서 얻은. 또한, 별도 성장 곡선 biofilm 성장의이 접근 방식을 사용 하는 데 사용 됩니다 박테리아의 모든 다른 변종에 대 한 로그 단계를 이해 하 설립 해야 합니다. 2 µ L/min의 성장 속도 S. oneidensis의 최대 성장 속도 초과할 수 없습니다 MR-1, 그리고 총 시간 자란 하지는 성숙한 biofilm를 선정 되었다 그래서 계산 하 고 분리 하는 경향이 했다. 이 요금에 따라 조정 될 수 있다이 설치와 함께 사용 될 다른 박테리아의 지식.

몇 가지 제한이 SALVI biofilm 성장에 대 한 사용 하 여 채널의 평면 벽에 연결 하는 박테리아의 확률으로 서는 채널 내에서 미생물 파울 링 포함 됩니다. 권장 2 µ L/min이이 프로토콜 내에서 일정 한 비율로 성장에도 불구 하 고 미생물 파울 링 아직도 너무 오랫동안 성장 하는 biofilm 허용 되는 경우 발생할 수 있습니다. 이러한 경우, 경고 없이 biofilm 수 창에서 분리 하 고 콘센트 견제는 SALVI 종료. 미생물 파울 링도 기계적인 힘을 추가 하 여 발생할 수 있습니다 (, 이동) SALVI는 피할 수 없습니다. 그러나,이 가벼운 현미경 ToF 심즈 분석 전에 죄 창 하는 biofilm의 첨부 파일을 확인 하 여 검사에 보관할 수 있습니다. 다른 한 가지 한계 PDMS 아닌 일부 박테리아 부착에 어렵게 만들 수 있는 부드러움을 포함 되어 있습니다. 그러나,이 박테리아의 부착 문제 라면 늑 골된 가장자리는 채널을 생성 하 여 수용 하는 SALVI의 디자인에서 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 셀 카운트 성장 곡선 결정 위한 OD600 독서 대신 할 수 있습니다. 예를 들어 연구 OD600 판독을 셀의 직접적이 고 일관 된 상관 관계를 나타났습니다. 21 그러므로 OD600 간주 됩니다 biofilm 성장을 평가 하는 데 충분 한.

이 기술의 한계는 몇, SALVI는 기본적으로 anaerobically 장갑 상자 또는 어떤 온도-제어 환경 챔버 내에서 같은 많은 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 많은 다양성을가지고 문화 접시 역할. 몇 가지 사소한 제한이 여전히 각 특정 박테리아의 최적의 성장 조건에 대 한, 수용 될 수 있는 상대 습도, 온도, 햇빛, 근처 배치 통제 실 조건 포함. 또한, 이러한 기술적 과제의 일부 온도 또는 biofilm 설치에 RH 중재 기능 인큐베이터로 극복할 수 있습니다.

SALVI 진공-호환 미세 인터페이스입니다. 이 작품에서는, 200 x 300 µ L 미세 채널 biofilms 이미징 광학 및 액체 심즈 뒤 문화 사용 되었다. 액체 진공 기반된 기술을 사용 하 여 공부 때문에 휘발성과 진공에 액체 단계에서 유지 하기 어려운 기술 도전 제시. 따라서 ToF 심즈 같은 진공 기술만 건조 하 고 극저온 샘플으로 전통적으로 제한 되었습니다. 22 또한 SALVI 사용할 수 있습니다 다양 한 이미징 및 분광학 현미경과 분 광 기술의 다양 한 사용에 대 한. 4 , 9 우리 그룹 지속적으로 액체와 고체-액체 인터페이스의 제자리에 분석에 다양 한 SALVI 응용 프로그램을 확장 해 왔다. 15 , 23 , 24 우리의 가장 최근의 노력 효과적으로 나타났습니다 박테리아 죄 막에 부착. 9 초기 부착 후 시간이 지남에 매체의 지속적인 흐름이 보였다는 SALVI의 죄 창에 직접 biofilm를 성공적으로 육성. ToF-심즈, 동안 기본 이온 빔 2 µ m 직경에서의 구멍을도 배 하는 데 사용 됩니다. 이 치수는 자연스럽 게 수 화 microenvironment에 biofilm의 화학 프로필 제공 죄 창에 연결 된 biofilm의 셀 길이 비슷합니다. 말린 샘플 수 화 상태에서 biofilms 비교할 때 biofilm의 화학 정체성의 차이, EPS, 및 물 클러스터 환경을 매우 중요 하다. 9 SALVI의 사용 없이 ToF 심즈 수만에 실시 건조 하 고 극저온 샘플 제공 하는 자연 수 화 상태에서 샘플의 화학 프로필을 잡으려고 실패 화학 매핑.

그림 1A같이 그것은 SALVI 아닌에 수직이 되도록 똑 튜브에 대 한 수 있도록 똑 튜브 위에 주사기 펌프를 유지 하는 것이 중요. (콘센트 병) 이내 콘센트 PFTE 튜브 (물방울 챔버에 연결 된) 입구 배관 보다 작으면 또한, 거품 장치, 튜브 안에 갇혀 될 가능성이 됩니다. SALVI 성장 위한 박테리아를 양성의 또 다른 중요 한 단계는 1.3 단계에서 설명한 대로 먼저 사용 됩니다 특정 박테리아 스트레인의 성장 곡선을 얻을 것입니다. 이 광학 밀도 측정 성장 곡선을 획득 하 여 수행할 수 있습니다. 성장 곡선 그림 1B와 같이는 박테리아 것의 성장, 로그 상 내 박테리아는 건강 하 고 추측 될 수 있다 때 기간을 이해 하는 데 중요 합니다. 성장이 단계 내에서 박테리아를 활용 하 여 건강 한 biofilm microenvironment의 창조를 용이 하 게 하 고는 biofilm의 예상 속도로 성장할 것입니다. 압력가 마로 소독 살 균 ToF 심즈와 함께 사용 하 여 이전에 대 한 수 수 없습니다 SALVI 아닌 70% 에탄올과 디 물, 실내 온도에 멸 균은. 압력가 마로 소독 수는 SALVI의 창 피해와 수증기로 소개는 사실 때문입니다. 성장의 몇 일 후에 아닌 세균성 첨부 파일을 확인 하기 위해 형광 현미경으로 검사 되어야 한다. 예를 들어 그림 1C에서 찾을 수 있습니다, 그리고이 이미지를 보여 성숙된 biofilm 찍은. 매체의 흐름 경로 때문 박테리아 더 호의적으로 부착 하 고이 위치는 흐름과 전단 세력 있는 lowes 아닌의 가장자리를 따라 성장t입니다.

요약 하면, SALVI 제공 하는 진공 기반 이미징 질량 분 서 계에 자연 수 화 상태에서 살아있는 biofilm 수 문화와 연구 biofilms 화학 매핑을 제자리에서 사용 하는 훌륭한 방법입니다. 이 독특한 접근 방식에 biofilm의 물 클러스터 microenvironment, 또한 그것의 EPS 부산물의 더 깊은 이해로 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 이 정보는 biofilm의 생물 학적 활동을 이해 하는 데 사용할 수 및 의학, 공학, 농업, 그리고 산업 연구 및 개발에서와 같은 다양 한 응용에 이용 될 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL) 지구 및 생물 과학 (EBD) 임무 씨앗 실험실 감독 연구 및 개발 (LDRD) 기금 지원에 대 한 감사. 경 음악 액세스 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL) 일반 사용자 제안을 통해 제공 되었다. EMSL은 사무실의 생물학과 환경 연구 (BER) PNNL에 주최 국가 과학적인 사용자 시설입니다. 저자는 원고를 읽고 유용한 피드백을 제공 하는 증거에 대 한 박사 Yuanzhao 딩 감사 합니다. PNNL는 Battelle 계약 드 AC05 76RL01830 아래 DOE에 대 한에 운영 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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References

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