펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biochemistry
 

Summary

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

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Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

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Abstract

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 biotic 및 abiotic 목표의 인식에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술입니다. 펩 티 드 선호도 시 약 등 감지 치료제, 항 체와 비슷한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 하지만 더 강력 하 고 더 극단적인 환경에서 수행할 수 있습니다. 관심의 대상 단백질에 펩 티 드 캡처 에이전트의 특정 농축 바인딩 개선 단계를 세척 하 고 따라서 거짓 긍정적인 바인더의 발생을 감소 반자동된 정렬 방법을 사용 하 여 향상 된입니다. 반자동된 정렬 방법은 상용 자동된 활성화 자기 셀 임의의 15-메 르 펩 티 드를 표현 하는 라이브러리를 정렬 무제한 세균성 디스플레이 장치를 정렬 여기 사용에 대 한 설명 이다. 약간의 수정이 메서드는 다른 연장 자동 장치, 다른 정렬 라이브러리 및 다른 유기 체. 이 작품의 주요 목표는 포괄적인 방법론을 제공 하 여 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명입니다. 이 기술을 형광 활성화 된 세포 (FACS), 정렬를 사용 하 여 정렬 하는 동안 및 개별 후보자, 비교에 친 화력과 특이성을 평가 하는 셀에 바인딩 분석 등 펩 티 드의 분석 시퀀스 동향을 파악 하 고 이해 하 고 잠재적으로 선호도 관심의 대상에 대 한 특이성을 개선 합의 시퀀스.

Introduction

Biopanning은 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술, 박테리아와 펩 티 드 선호도 시 약 1,2,3,,45에 대 한 편리한 소스 라이브러리 표시 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24. 마찬가지로 페이지 표시 25,26 효 모 표시 27,28는 펩 티 드 셀 표면에 노출 되는 biotic 및 abiotic 목표, 이러한 상호 작용을 바인딩할 수 있습니다. 펩 티 드 등뼈와 아미노산 사이드 체인 29의 독특한 특성에 의해 구동. 파지 디스플레이, 달리 박테리아 스스로 자기 복제 되며 바인딩된 페이지의 차입 및 세포의 감염 없이 디스플레이에 필요한 모든 유전 물질을 포함. 효 모 디스플레이, 달리 세균 디스플레이 급속 한 (약 20 분 30) 대장균의 시간을 두 배로 때문에 빠릅니다. 결과 펩 티 드 선호도 시 약을 생산 수 있습니다 감지 플랫폼 16,,1726 의 다양 한에서 사용 하기 위한 셀 오프 있고 사용을 위한 잠재력으로 생활 재료 표시에 셀 2 , 31 , 32. 특정 대상의 인식에 대 한 단일 클론 항 체에 비해 펩 티 드 훨씬 작고 더 유연 하 고, 그리고 펩 티 드 디스플레이 라이브러리 시스테인 33 등 특정 아미노산을 피하려고 DNA 수준에서 쉽게 조작할 수 있습니다 . 펩 티 드 치료제 34,,3536 및 항 체 발견, 재현할 수 합성 (오프-셀의 그들의 용이성으로 인해 활용 될 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 악용 하는 점점 더 )의 생산 그리고 우수한 정비 기능 시 약을 제공 하는 높은 온도 또는 냉각 37,38없이 장기 저장에 노출 후에 극한 환경에서 성능. 극한 환경에서 작동 해야 하는 국방부, 예를 들어, 특정 관심의 시 약의 저장을 위해 콜드 체인을 극복 하는 능력이입니다. 열 안정성은 그러므로 선호도 시 약이이 원고에 예제로 주어진 선택한 대상 인식에 대 한 바람직한 기능.

최근, 훨씬 더 간단 하 고 반자동된 마그네틱 활성화 셀 맥 (MCS) 방법 9,,1439정렬 사용 하 여 신뢰할 수 있는 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 되고있다. 이러한 방법 자기 활성화 셀 (autoMACS 또는 autoMCS) 악기 분류 자동 정렬 다른 점으로, 상업적으로 사용할 수를 포함 하 여 플랫폼 여러 유사한를 사용 하 여 생물 학적 대상에 대 한 입증 되어 있다 (표 참조 재료) 1,,1415 와는 일회용 카트리지 7,9 또는 칩 39, 귀중 한 사양에 대 한 샘플을 포함 하는 보다 전문적인된 장치 사용 유기 체 또는 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 또는 더 높은7독 소. 이러한 반 자동화 방법 경우는 자료 자석 또는 코팅 자성 구슬에 고 (와 같은 혐 기성 박테리아) 다른 유기 체와 함께 사용할 경우 능력 abiotic 재료에 바인딩할 수 펩 티 드에 대 한 정렬 확장 될 수 있는 정렬 그리고 성장 조건이 변경 될 수 있습니다. 세균성 디스플레이 라이브러리 정렬, 뿐만 아니라 여기 사용 상업 autoMCS 악기도 사용 하 고 일부 효 모, 더 절연 뒤의 화면에 표시 된 인간 단일 체인 항 체 파편의 발견의 초기 단계에 대 한 사용 하는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 40. 반 자동화에 주요 이점은 정렬 시간 및 노력, 그리고 더 강력 하 고 재현할 수 제거 자석 구슬에서 언바운드 셀의 세척 단계, 감소 가양성을 선도, 더 적은 필요한 정렬 라운드, 갈수록 감소 복잡 한 다운 스트림 분석 9,14. 상업적인 autoMCS 악기의 경우는 여러 사전 로드 된 프로그램을 다른 응용 프로그램, 음수 전 (고갈), 정렬 등 순수성을 우선 순위, 최종 샘플 볼륨을 최소화 하 고 증가 적합 있을 수 있습니다 또는 드문 셀 41의 격리에 대 한 감도 감소.

이 작품의 초점은 상용 autoMCS 악기를 사용 하 여 세균성 디스플레이 라이브러리 biopanning에 대 한 방법론을 설명 하 고 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명 다른 응용 프로그램에 대 한 확장을 용이 하 게 하는 순서입니다. 여기에 사용 하는 디스플레이 라이브러리 (재료의 표 참조) 12,13 포함 약 109-1011 독특한 15-메 르 펩 티 드 세균 외부 막 단백질 OmpX의 수정된 된 버전을 통해 전시에 종합적으로 생산 하는 경우 솔루션에서 무료 펩 티 드의 대표 될 것으로 예상 된다 세포 표면에 무제한 자연. 이 단백질 비 계에는 C-YPet 모나에 바인딩을 통해 식 모니터링에 대 한 긍정적인 제어 P2X 펩 티 드를 또한 포함 되어 있습니다. 그러나, 적당 한 다양성 및 원하는 특정 응용 프로그램에 필요한 다른 특성 구입 또는 새로운 라이브러리를 함께 작동 합니다 마찬가지로 biopanning 절차, 비록 몇 가지 사소한 변경 내용이 필요할 수 있습니다. 이 biopanning 프로토콜의 회로도 그림 1에서 그림입니다. 또한, 프로토콜에 적응 시킬 수 있는 다른 자동화 된 자기 정렬 플랫폼 및 다른 정렬 전략. 벤치탑 자석으로 수동 자기 정렬 성공적으로 입증 되었습니다, 더 복잡 하 고 시간이 걸리는 다운스트림 분석으로 인해 필요한 증가 가양성 14, 이기는 하지만 고 그럼에도 불구 하 고 다른 옵션을 제공 합니다 autoMCS 단계 없는 자동화 된 마그네틱 셀 장치를 정렬 하는 경우 이용하실 수 있습니다.

Protocol

1. Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 사용 하 여 autoMCS

참고:이 autoMCS 기반 정렬 프로토콜 앞에서 설명한 14, 되었으며는 더 철저 한 확장 프로토콜에 대 한 새로운 "사용자"는 가능성에 대 한 설명을 포함 하 여 더 세부 사항을 위해이 원고에 대 한 보충 자료에서 사용할 수 수정입니다. AutoMCS 장치를 정렬에 사용할 수 없는 경우 14일 Sarkes 외. 2015 이후 정렬 프로토콜 설명서에 설명도에서 추가 프로토콜을 참조 하십시오. AutoMCS 프로토콜 제공 여기 추가 되었습니다 포함 향상 된 특이성 1,15추가 부정적인 정렬 단계에 적응. 이 biopanning 프로토콜의 회로도 그림 1에서 그림입니다.

  1. 네거티브 바인더 자석 구슬을 가진 Cross-React를 제거 하려면 정렬
    1. 적절 한 항생제 약 1 x 10과 다양 한 박테리아의11셀 표시 정렬 라이브러리 Luria 국물 밀러 (파운드) 포함의 500 mL를 접종 (재료의 표 참조).
      참고: 디스플레이 세균성 펩타이드 라이브러리 사용 여기 약 10 포함 (재료의 표 참조)9-1011독특한 멤버 8,12 파운드 25 µ g/mL 페니 (파운드 Cm25)를 포함 하는 재배 하는 고. 이 프로토콜의 나머지는이 라이브러리를 사용 한다고 가정 합니다.
    2. 문화에는 OD600 0.5의 도달할 때까지 225 RPM에서 떨고와 37 ° C에서 품 어-0.55. 4% 재고 1: 100, 225 RPM에서 37 ° c.에 45 분 동안 흔들어 diluting 하 여 0.04 %w / v L-arabinose 펩 티 드 식 유도
    3. 장소는 얼음에 문화를 유도 한다. 약 4 ° c.에 20 분 동안 6000 x g 2 x 1011 세포를 원심 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 의해 셀 1.5 mL PBS에에서 resuspend.
      참고: 1.0의 OD600대장균에 대 한 1 x 109 셀/mL 약 같습니다.
      참고: 셀; lyse 수 있습니다이 소용돌이 하지 않습니다 resuspend 손으로 또는 짧게 ≤에 떨고 225 RPM, 4 ° c.
    4. Microcentrifuge tube(s) 및 스핀 RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 셀을 전송 상쾌한을 제거 합니다. 1 mL 버퍼링 인산 염 (PBS) 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 포함 된에 셀 펠 릿 resuspend PBS-B).
    5. 1 mL PBS-B에 ≥5에서 5 분, 000 x g (RT)에 대 한 원심 분리기 streptavidin 입히는 구슬 (약 3 x 109 구슬 재료의 표 참조)의 300 µ L를 씻어. 벤치 탑 마그네틱 입자 구분에 튜브를 배치 합니다. 상쾌한, 펠 릿을 피하고 조심 스럽게 제거.
    6. 셀 플러스 PBS B 혼합물 위에 준비에 구슬 resuspend 회전 플랫폼에 대 일 분 장소 샘플 얼음에 4 ° C에서 품 어.
    7. AutoMCS 악기 시스템 초기화를 설정. 프라임 라인 "세척 하세요" "분리" 메뉴에 화면 하단에 선택 하 여 제조업체의 실행 및 워시 버퍼 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 다음 "린스" 하 고 "실행".
    8. 프라임 PBS-b, 다음 단계에서 워시 버퍼 및 실행 버퍼 PBS-B를 사용 하 여 시스템. 위쪽 탐색 모음에서 "분리" 메뉴를 선택 하 고 "세척 지금" 선택 합니다. "린스" 및 "실행" 신선한 PBS-b 시스템을 선택
    9. 부 화 단계에서 15 mL 원뿔 튜브 셀 및 비드 혼합물을 전송. 샘플 슬롯에이 튜브를 놓고 미리 냉장된 (4 ° C) 랙의 긍정적이 고 부정적인 선택 슬롯에 15 mL 원뿔 튜브 빈 (재료의 표 참조). 랙 악기 플랫폼에 배치 합니다.
    10. 선반에 각 샘플에 대 한 분리 프로그램 할당 (5 샘플 최대 하나의 실행에 정렬할 수 있습니다). 각 샘플의 중간 그리고 마지막 샘플 후 "린스" 단계를 추가 합니다. 셀 분리 시작 "실행"을 선택 합니다. 충분 한 버퍼를 사용할 수 있는지 확인 하려면 "확인"을 선택 합니다.
      참고: "Posselds" 분리 프로그램 잘 작동 부정적인 정렬 및 정렬 1 라운드 및 "Posseld" 라운드 2-4, 정렬에 대 한 선호 하지만이 프로그램의 둘 다 성공적으로 사용 된 긍정적인 모든 부정 및 긍정적인 정렬 라운드 14 ,15 와 다른 프로그램 특정 응용 프로그램에 대 한 더 증명할 수 있습니다 (자세히 설명 토론에서).
    11. 프로그램이 완료 되 면 랙 제거 하 고 적절 한 분수를 유지. 여기, 부정적인 정렬에 대 한 부정적인 분수 (구슬 없이 셀 포함)를 유지 합니다. 얼음에 놓습니다.
    12. 전체에서 부정 정렬 분수를 사용 하 여 0.2 %w / v D-포도 당 파운드 Cm25 의 1 L를 접종. 하룻밤 225 RPM에서 떨고 37 ° C에서 성장.
    13. AutoMCS 악기를 해제 하기 전에 실행 하 고 세척 버퍼 제조업체의 실행 및 워시 버퍼 (재료의 표 참조)으로 변경 합니다. 선택 "지금 워시", 다음 "린스"와 "실행". 완료 되 면, 거기 오염 라인 70% 에탄올에 다음 화면의 오른쪽 상단 모서리에서 "전원 아이콘"을 눌러 고 "예"를 선택 합니다.
    14. 시스템 종료가 완료 되 면 (병 보라색 됩니다), 기계를 해제.
    15. 다음 날 15% 글리세롤과 냉장고 주식 약 1 x 10 병 당11셀 파운드에 게 하룻밤 culture를 사용 합니다. 또한, 또는 양자 택일로,이 문화를 사용 하 여 다음 단계에서: 추가 부정적인 정렬 (섹션 1.2) 또는 긍정적인 정렬 (섹션 1.3)의 첫 번째 라운드.
  2. 부정적인 관심의 다른 대상으로 Cross-React 것 바인더를 제거 하려면 정렬
    참고: 섹션 1.2 필요는 더 이상 부정적인 정렬 하거나 원하는 경우 생략 될 수 있습니다. 이 경우, 1.3 섹션을 진행 합니다. 모든 원하지 않는 대상에 잔여 바인딩 섹션 2에서 FACS에 의해 평가 될 수 있다: 정렬 라운드 FACS 분석.
    1. 또한 검색 된 펩 티 드 1,15에 바인딩 가능성이 비슷한 단백질 등 특정 단백질 대상에 대 한 부정적인 정렬 반복 성장 및 유도 단계 1.1.1-1.1.3, 고정 재고의 시작 1.1.15 단계 또는 단계 1.1.12 (견적 및 1 x 1011 세포 접종 OD600 를 사용)에서 하룻밤 문화에서 streptavidin 고갈 라이브러리.
    2. Microcentrifuge tube(s) 및 스핀 RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 셀을 전송 상쾌한을 제거 합니다. 1 ml PBS 포함 600 nM biotinylated cross-reactive 단백질 대상 셀 펠 릿을 resuspend. 회전 하는 플랫폼에 45 분 동안 4 ° C에서 품 어.
      참고: 600 nM는 건의 한 시작 농도 고, 지적된 혜택 관찰 되는 경우 변경 될 수 있습니다. Biotinylation 단백질 목표의 달성 될 수 있다 고는 시 약을 사용 하 여 정량 자료의 테이블에.
    3. 한편, 씻고 100 µ L 1 ml PBS-B streptavidin 입히는 구슬 (약 1 x 109 구슬)의 5 분 동안 원심 분리기 (RT)에 ≥ 5000 x g에서. 벤치 탑 마그네틱 입자 구분 및 신중 하 게 제거 상쾌한, 피하 펠 릿에 튜브를 배치 합니다.
    4. 6000 x g 5 분 (실시간 또는 4 ° C)에서 대상 바인딩된 셀 원심, 상쾌한를 제거 하 고 1 ml PBS-b. 셀 펠 릿 resuspend Cross-reactive 단백질 대상에 바인딩된 씻어 셀의 전체 볼륨에 구슬 resuspend. 30 분 동안 회전 플랫폼에 4 ° C에서 품 어.
    5. 얼음에 완전 한 단계-1.1.7 1.1.15 부정적인 정렬, 적절 한 냉장고 주식을 만들기에 대 한 샘플을 놓습니다. 1.3 긍정적인 정렬에 대 한 모든 원하는 부정적인 정렬 달성 된, 경우 또는 다른 잠재적인 cross-reactive 단백질에 대 한 부정적인 종류 섹션 1.2를 반복을 계속 합니다.
  3. 라운드 1 긍정적인 정렬
    참고: 특정 단백질에 대 한 긍정적인 정렬 1 라운드 대상 비슷합니다 특정 정렬 대상에 대해 부정적인 정렬 포함 하는 구슬, 긍정적인 부분을 유지 하는 것을 제외 (1.2 참조).
    1. LB Cm25 다양 한 박테리아의 약 1 x 1011셀 표시 정렬 라이브러리는 streptavidin 고갈 되 고 성장 (단계 1.1.12)에서 하룻밤 또는 (1.1.15 단계)에서 냉동과 해 동, 얼음에 또는 그의 500 mL를 접종 추가를 원하는 대로 (1.2.5 단계)에서 다른 cross-reactive 단백질 대상 바인더의 고갈.
    2. 문화에는 OD600 0.5의 도달할 때까지 225 RPM에서 떨고와 37 ° C에서 품 어-0.55. 4% 재고 1: 100, 225 RPM에서 37 ° c.에 45 분 동안 흔들어 diluting 하 여 0.04 %w / v L-arabinose 펩 티 드 식 유도
    3. 장소는 얼음에 문화를 유도 한다. 약 4 ° c.에 20 분 동안 6000 x g 2 x 1011 세포를 원심 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 (손으로 또는 짧게 ≤에 떨고 225 RPM, 4 ° C)에 의해 셀 1.5 mL PBS에에서 resuspend.
    4. Microcentrifuge tube(s) 및 스핀 RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 셀을 전송 상쾌한을 제거 합니다.
    5. 1 ml PBS 포함 하는 관심의 600 nM biotinylated 단백질 대상 셀 펠 릿을 resuspend. 회전 하는 플랫폼에 45 분 동안 4 ° C에서 품 어.
      참고: 600 nM는 건의 한 시작 농도 고, 지적된 혜택 관찰 되는 경우 변경 될 수 있습니다. Biotinylation 단백질 목표의 달성 될 수 있다 고는 시 약을 사용 하 여 정량 자료의 테이블에.
    6. 한편, 씻고 100 µ L 1 ml PBS-B streptavidin 입히는 구슬 (약 1 x 109 구슬)의 5 분 동안 원심 분리기 (RT)에 ≥ 5000 x g에서. 벤치 탑 마그네틱 입자 구분에 튜브를 놓고 펠 릿을 피하고 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다.
    7. 대상으로 부 화 완료 되 면 대상 바인딩된 셀 RT (4 ° C) 어떤 언바운드 대상 단백질을 제거 하 5 분에 대 한 6000 x g에서 원심. 상쾌한을 제거 하 고 1 ml PBS-b. 셀 펠 릿 resuspend 씻어 세포 단백질 대상에 바인딩된의 전체 볼륨에 구슬 resuspend. 30 분 얼음에 회전 하는 플랫폼에 4 ° C에서 품 어.
    8. AutoMCS 악기 시스템 초기화를 설정. 프라임 라인 분리 메뉴에 화면 하단에 "세척 지금"를 선택 하 여 제조업체의 실행 및 워시 버퍼 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 다음 "린스" 하 고 "실행".
    9. 프라임 PBS-b, 다음 단계에서 워시 버퍼 및 실행 버퍼 PBS-B를 사용 하 여 시스템. 위쪽 탐색 모음에서 분리 메뉴를 선택 하 고 세척 지금 선택 합니다. 린스 및 실행 신선한 PBS-b 시스템을 선택
    10. 위의 인큐베이션 단계에서 15 mL 원뿔 튜브, PBS-B의 추가 500 µ l로 튜브를 헹 구 고 세척 샘플 풀링 셀 및 비드 혼합물을 전송. 샘플 슬롯에이 튜브를 놓고 미리 냉장된 (4 ° C) 랙의 긍정적이 고 부정적인 선택 슬롯에 15 mL 원뿔 튜브 빈 (재료의 표 참조). 랙 악기 플랫폼에 배치 합니다.
    11. 선반에 각 샘플에 대 한 분리 프로그램 할당 (5 샘플 최대 하나의 실행에 정렬할 수 있습니다). 각 샘플의 중간 그리고 마지막 샘플 후 "린스" 단계를 추가 합니다. 셀 분리 시작 "실행"을 선택 합니다. "확인" 또는 "계속" 충분 한 버퍼를 사용할 수 있는지 확인 하려면 선택 합니다.
      참고: "Posselds" 분리 프로그램 부정 정렬에 잘 작동 하 고 긍정적인 라운드 1 "Posseld"를 정렬 하는 것이 좋습니다 정렬 라운드 2-4, 하지만이 프로그램의 둘 다 성공적으로 사용 되었습니다 모든 부정 및 긍정적인 정렬 라운드 14 , 15 와 다른 프로그램은 특정 응용 프로그램에 대 한 더 증명할 수 있습니다 (자세히 설명 토론에서).
    12. 프로그램이 완료 되 면 랙 제거 하 고 적절 한 분수를 유지. 여기에, 긍정적인 정렬에 대 한 긍정적인 분수 (셀 및 비즈 포함)를 유지 합니다. 얼음에 놓습니다.
    13. AutoMCS 악기를 해제 하기 전에 실행 하 고 세척 버퍼 제조업체의 실행 및 워시 버퍼 (재료의 표 참조)으로 변경 합니다. 선택 "지금 워시", 다음 "린스"와 "실행". 완료 되 면, 거기 오염 라인 70% 에탄올에 다음 화면의 오른쪽 상단 모서리에서 "전원 아이콘"을 눌러 고 "예"를 선택 합니다.
    14. 시스템 종료가 완료 되 면 (병 보라색 됩니다), 기계를 해제.
    15. 전체에 긍정적인 정렬 분수를 사용 하 여 0.2 %w / v D-포도 당 파운드 Cm25 의 1 L를 접종. 하룻밤 225 RPM에서 떨고 37 ° C에서 성장.
    16. 다음 날, 숙박 문화를 사용 하 여 냉장고 주식 15% 글리세롤를 포함 하는 파운드에 게 및/또는 긍정적인 정렬 섹션 1.4에서에서 2 라운드를 계속.
  4. 이후 긍정적인 정렬 라운드
    참고: 일반적으로, 4 개의 정렬 라운드는 권장, 3 정렬 라운드는 일반적으로 충분 한 14,15. 정렬 중지 도움으로 정렬 라운드 FACS 분석 2에서 설명 합니다. 각 후속 긍정적인 정렬 라운드 대상과 자기 비드 볼륨의 농도 감소.
    1. 5 mL 파운드 Cm25 100 µ l 세포 접종 이전 정렬 라운드 (또는 그 라운드에서 냉동된 셀 주식), 숙박 문화를 사용 하 여 (1시 50분 희석). 문화에는 OD600 0.5의 도달할 때까지 225 RPM에서 떨고와 37 ° C에서 품 어-0.55.
    2. 0.04 %w / v L-arabinose, 225 RPM에서 37 ° c.에 45 분 동안 흔들어 펩 티 드 식 유도 장소는 얼음에 셀을 유도 한다.
      참고:이 유도 문화 또한 제 2 아래에 설명 된 대로 바인딩 선호도에서 유래 분류 라운드에 대 한 특이성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
    3. RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 1 x 108 세포를 원심 상쾌한을 제거 하 고 포함 하는 정렬의 이전 라운드에 대 한 사용의 biotinylated 단백질 대상의 절반 농도 50 µ L PBS에 셀 펠 릿 resuspend (따라서 300 nM 라운드 2, 150 라운드 3, 및 75 nM nM에 대 한 우리의 제안에서 4 라운드 시작 지점)입니다. 얼음에 (4 ° C 회전 하는 플랫폼에서) 45 분 동안 품 어.
    4. 한편, 세척 streptavidin 입히는 구슬 (3, 및 4 µ L에 대 한 4 라운드 8 µ L에 대 한 라운드 2 라운드에 대 한 15 µ L,) 1 mL PBS-B ≥ 5000 x g (RT)에 5 분 동안 원심 분리기에서. 벤치 탑 마그네틱 입자 구분 및 신중 하 게 제거 상쾌한, 피하 펠 릿에 튜브를 배치 합니다. 50 µ L에 구슬 resuspend PBS.
    5. 1.4.3, 단계에서 목표를 가진 45 분 외피 RT 5 분 또는 4 ° C 6000 x g에서 셀 원심, 후 상쾌한, 제거 하 고 씻어 1.4.4 구슬 50 µ L에서 세포를 resuspend. 얼음에 완전 한 단계 1.3.7-1.3.13 긍정적인 정렬에 대 한 샘플을 계속.
    6. 0.2 %w / v D-포도 당 정렬에서 전체 긍정적인, 구슬 포함 된 분수와 함께 보충 파운드 Cm25 의 5 mL 문화 접종
    7. 다음 날, 하룻밤 문화 냉장고 주식 15% 글리세롤을 포함 하는 파운드 및 또는 라운드 다음 긍정적인 정렬 계속을 사용 하 여, 1.4.1 단계로 반환.
      참고: 바인딩 친 화력과 특이성을 평가 하기 위해 1.4.2에서 유도 문화를 사용 하 여 제 2 아래에 설명 된 대로 확인할 수 있습니다 정렬 중지 하. 경우 한 행에 두 개의 정렬 라운드 표시 비슷한 바인딩 선호도, 또는 최신 라운드 관심의 대상에 대 한 바인딩 선호도 감소,이 바람직한 장소 정렬 중지 합니다. 마지막 라운드 후 단계로 1.4.1 반환 하지만 1.4.2 중지.

2. FACS 라운드 정렬의 분석

  1. 각 정렬 라운드, 또는 동일한 문화에 대 한 단계의 1.4.2 유발된 세포를 사용 하 여 5 µ L 유도 셀을 추가 다음의 각각의 25 µ L 바인딩 평가 대 한 솔루션을 준비 (재료의 표 참조): PBS 혼자; PBS 150 nM YPet 모나 (YPet 12,13, 표현에 대 한 긍정적인 제어), 경우; 900 nM 단백질 대상 방출/493 nm⁄518 nm (대상-488); 여기 아민 반응성 염료와 같은 형광 염료를 활용 900 nM cross-reactive 단백질 별로 부정적인 정렬 같은 형광 염료 (Cross-Reactive 단백질-488);와 표시에 사용 되 그리고 900 nM streptavidin-R-phycoerythrin (SAPE). 45 분 동안 얼음에 품 어.
    참고: 직접 단계 1.4.2, 항상이 단계 것에서에서 계속 행 해질 경우 그 라운드에 대 한 biopanning 다운 선택한 라이브러리 밤새 자란 이후 완료 된 후 하루 subcultured 그리고 다음 날 유도 합니다. 문화가 성장 하 고 마찬가지로 냉동된 정렬 라운드 주식에서 유도 사용할 수 있습니다; 이 경우, 모든 라운드 테스트 하 고 단일 실험에서 비교 될 수 있습니다.
  2. RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 원심 분리기 세포 상쾌한을 제거 하 고 얼음에 샘플을 저장 합니다.
    참고: 셀 펠 릿 모든 샘플 분석에 대 한 준비가 될 때까지 얼음에 저장할 수 있습니다.
  3. 오픈 소프트웨어, 시작, 시스템 및 악기 제조 업체의 지침 43,44다음 보정, FACS 악기를 켭니다.
  4. FACS 소프트웨어 "관리자"를 클릭 하 고 원하는 폴더를 클릭 만들거나 "새로운 폴더." "새로운 실험" 클릭 화면 왼쪽 상단에 아이콘. 마우스 오른쪽 클릭 아이콘을 "이름 바꾸기" 실험을 합니다. 그 실험에서 "글로벌 워크시트"를 클릭 하십시오.
  5. "점 플롯" 아이콘 클릭이 scatterplot 만들려고 글로벌 워크시트 스프레드시트에서 합니다. 점 그래프 자체에 클릭 한 다음 선택 "속성" 아이콘 상단에 스크린의 왼쪽 및 biexponential 디스플레이에 축 열기 창에서 "Y 축"과 "X 축" 옆의 상자를 선택 하 여 조정. X를 클릭 하 여 biexponential 디스플레이 창을 닫습니다.
  6. 만들기 상단에 있는 아이콘을 클릭 하 여 "새로운 튜브" 스크린의 왼쪽 및 오른쪽은 "글로벌 워크시트" 아래 견본 아이콘을 클릭 하 고 "이름 바꾸기"를 선택 하 여 적절 한 정보를 가진 견본을 이름을 바꿉니다. (+)를 클릭 하 여 표본 확장 기호, 다음 튜브 아이콘에 더블 클릭 마우스 오른쪽 클릭, 그리고 다시 선택 "이름 바꾸기" 샘플을 설명 하.
  7. 이 점 그래프를 사용 하 여 기본 SSC-A vs FSC-A 두 배 그 튜브에 선택 하 여 옆에 있는 화살표 혼자 PBS에 부정적인 제어 샘플을 실행 하려면. 그냥이 예제를 실행 하기 전에 resuspend 500 µ L 얼음 차가운 FACS는 FACS를 버퍼와 전송 샘플 실행에 셀 펠 렛 튜브 (재료의 표 참조), pipetting 및 튜브를 터치 하 여 잘 혼합. 악기의 샘플 주입 튜브 (앉아)에 resuspended 세포를 놓습니다. 언론 "취득 데이터"에 30000-50000 "디스플레이를 이벤트"와 "이벤트를 기록" 10000에 낮은 유량 (시작; 증가 필요한 경우), 앉아서 "플러시" 선택.
    참고: 적절 한 속도 (낮음, 보통 또는 높음)를 이벤트/s의 수는 약 200 년과 2000 년 사이 속도가입니다.  이 범위를 사용 하 여 모든 단계에 대 한.
  8. 인수, 동안에 "임계값" 탭 클릭을 선택 하 여 필요한 경우 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 임계값을 조정 하 고 "가치"를 변경 합니다. 혼자 PBS에 부정적인 제어 세포가 약간 센터는 앞으로 및 측면 분산형 (FSC 그리고 SSC)에 대 한 전압을 조정 합니다.
    참고: "추가" 아이콘을 사용 하 여 "임계값" 탭에는 추가 매개 변수 (예: SSC)을 추가할 수 있습니다. 일반적으로 PMT 전압 1000V SSC를 금감위에 약 700 V의 대장균에 대 한 잘 작동합니다.
  9. 샘플을 제대로 읽고, "레코드 데이터"을 표시 하는 200-2000 이벤트/s 흐름 속도 조정 합니다. 완료 되 면 기록, 앉아에서 튜브를 제거 하 고 얼음에.  "다각형 게이트" 아이콘을 선택 하 고 마우스는 scatterplot에 셀 인구의 주위 게이트를 사용 하 여. 도트 그림을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "인구 계층 보기"를 선택 합니다.
  10. 부모로 서이 "P1" 게이트를 사용 하 여 인구 계층 구조에서 "P1"을 클릭 하 여. 다음 단계 2.5 새로운 점 음모를 만듭니다. 마우스 오른쪽 단추로 각 축 하 고 금감위 A FITC a y 축과 x 축 변경 게이트 부정적인 제어 (PBS 혼자) "다각형 게이트" 아이콘을 사용 하 여 모집단의 위쪽 및 왼쪽 측면 주위 최대한 꽉 게이트.
    참고: 두 번 P1 게이트 P2 게이트의 부모가 되도록 인구 계층을 확인 하십시오. 그렇지 않으면 그것은 P1 게이트 라인 나타나고 "모든 이벤트"; 부모를 될 것입니다. 게이트를 삭제 하 고 다시 다음 단계 2.10을 만듭니다.
  11. 인구 계층 구조에서 "P2"를 선택 하 고 마우스 오른쪽 클릭, "반전 게이트" 선택. P2 게이트 점 음모를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "보기 인구"를 선택 합니다. 디스플레이 대 한 "P2" 및 "하지 P2" 인구를 선택 (인구의 1% 미만 해야 벗어나는 게이트).
  12. P2 게이트 점 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 "통계 보기 만들기"를 선택 합니다. 통계 뷰 창을 마우스 오른쪽 클릭 하 고 "편집 통계 보기"를 선택 합니다. "인구" 탭을 클릭 하 고 추가 또는 인구, 원하는 대로 P1 부모 인구를 포함 하 여 제거 (P2 및 P2 하지 한다 이미 표시). "통계" 탭에서 클릭 하 고 "FITC-A 중간"와 관심의 다른 통계를 추가. 확인을 눌러 창을 닫습니다.
  13. PE-A vs 금감위에 대 한 비슷한 점 그래프를 만들기-A와 PBS 혼자 샘플을 사용 하 여 게이트 (이전 플롯 중복 고 수 변경). 이 스프레드시트를 사용 하 여 이러한 방식으로, 각각에 대 한 약 10000 이벤트 기록 (를 포함 하 여 부정적인 제어 셀 각 fluorophore 표시 대상 인 큐베이 팅) 모든 샘플을 실행 하려면.
    참고:는 당신부터 셀 대상-488 단백질, 제어 등은 그 단백질, 바인더 및 바인딩된 %로 "하지 PX" (여기서 X는 해당 그래프에 대 한 문이 인구 수)에서 값을 기록 한다 긍정적인 YPet 가진 외피 후 게이트 밖에 서가. SAPE 부정적인 제어를 사용 하면 PE A vs FSC-A 플롯을 사용 합니다. P 1의 중간 형광 강도 (MFI)이 상대적인 관점에서 바인딩의 범위를 표시 하려면 % 바인딩 정보를 제공 하 고 더 outliers 45의 강력한에 기록 합니다. 메디아 형광 강도 수 정규화 (nMFI)는 비 계만 부정적인 컨트롤 (아무 N 맨끝 펩 티 드), 또는 관심의 대상에 바인딩되지 않는 펩 티 드 순서를 포함 하는 복제의 MFI에 의해 각 펩타이드의 MFI를 분할 하 여 부 화 후 와 같은 대상 같은 fluorophore 14에 활용. 이러한 부정적인 제어 셀을 사용할 수 없는 경우 uninduced 셀 동일한 대상 인 큐베이 팅과 같은 fluorophore 표시는 정규화에 대 한 또한 사용할 수 있습니다.

3. 시퀀스 분석 잠재적인 후보자 및 바인딩 선호도 평가

  1. 펩 티 드 순서 결정
    1. 선택 하 고 수십 또는 수백 biopanning의 최종 원에서 세균성 식민지의 순서 (일반적으로 3 또는 4 라운드는 충분 한 14).
    2. 시퀀스 분석 특히에 매크로 파일을 개발 했습니다 (코드, "하위 eCPX_Sequencing"에 대 한 지원 정보를 참조)를 사용 하 여 데이터 분석 biopanning의 테이블에 나열 된 15mer 세균 디스플레이 라이브러리에서 생성 하는 시퀀스 재료입니다. 재료 또는 기본 설정된 다른 호환 하는 소프트웨어의 테이블에 나열 된 스프레드시트 소프트웨어를 사용 합니다.
      참고: 다양 한 도구가 있습니다 온라인 그 또한 DNA 순서 분석 47에 도움이 될 수 있습니다. 선호 하는, 다른 설립된 메서드를 사용 하 여 시퀀스 분석 하 고 3.1.3 단계로 건너뜁니다.
      1. 시퀀스 파일 (.seq 파일, 텍스트 문서도 일)의 집합을 다운로드 하 고 새 폴더로 그들을 추출. 필요한 경우 이동 또는 폴더 향상 된 속도 (반대로 네트워크 폴더) 컴퓨터의 하드 드라이브를 복사 합니다.
      2. 새 스프레드시트 창을 엽니다. 메시지 팝업 하는 경우 매크로 사용 하 고 모든 기능을 사용 하려면 있는지 확인 합니다.
        참고: 단계 3-6 아래 매크로 사용 하는 처음으로 완료만 해야한다. 대 한 후속 분석, 단순히 "실행 하는 매크로" 7 단계부터 시작 합니다.
      3. "하위 eCPX_Sequencing" 파일에 매크로의 전체 내용을 복사 합니다.
        참고: 현재 버전 측면 15-메 르 도서관 자료의 테이블에 나열 된에 대 한 시퀀스 설정 하 고 그들 사이 아미노산을 번역할 것 이다. 5' 측면에 서는 열 A와 3 개의 ' 측면에 서는 매크로 실행 하기 전에 각 10 시퀀스까지 스프레드시트의 B 열에 시퀀스에서 시퀀스를 복사 하 여 추가 시퀀스를 입력 될 수 있습니다.
      4. 빈 스프레드시트 파일에서 "보기" 탭을 선택한 다음 "매크로"를 두 번 클릭 Personal.xlb 폴더를 선택 합니다. 이 사용할 수 없는 경우, 먼저이 나타나게 하려면 매크로 기록 합니다.
      5. 클릭 "만들기" 또는 "단계 에"에 따라 강조 될 수 있다. 전체 매크로 모듈에 붙여넣습니다.
      6. 클릭 저장 아이콘 또는 파일, 이동 저장. 모듈을 종료 합니다. 창이 팝업, 확인을 누릅니다.
      7. 매크로 실행: desired.seq 파일 있는 폴더에가 서. 상단에 폴더 위치를 보려면 폴더의 아이콘 옆에 있는 막대를 클릭 하십시오. 그것을 복사 합니다.
      8. 새 스프레드시트 창으로 이동 합니다. 보기 탭을 선택한 다음 매크로를 두 번 클릭 합니다. 목록에서 "eCPX_Sequencing"를 선택 하 고 클릭 "실행 합니다."
      9. 팝업, 파일 위치에 복사 붙여넣기 상자에서 7 단계와 히트 enter. 매크로 시퀀스를 통과 하 고 다양 한 시트에 테이블에 그들을 조직 시작 해야 한다.
      10. "요약 테이블" 시트를 사용 하 여 추적 파일 오류를 확인 하 고 수동으로 (경우 시퀀스 또는 "X" 포함 번역 될 수 있는) 수정 하는 데 필요한 됩니다 경우 확인 하려면.
        참고: "요약 테이블" 표시 번역 된 펩 티 드 시퀀스, 시퀀스 오류 번역을 방해 하지 않는 한 (A에서 Z까지), 아미노산 서 열에 의해 정렬 됩니다. "X" 확인할 수 없습니다 개별 아미노산을 나타냅니다.
    3. 시퀀스 변환, 조직, 및 시퀀싱 오류 수정, 일단 어떤 반복 시퀀스 "요약 테이블" 시트에서 정렬 된 펩 티 드 순서 목록을 확인 하십시오.
    4. (를 포함 하 여 반복 및/또는 최소한 눈에 띄는 트렌드와 펩 티 드) 225 RPM에서 떨고 37 ° C에서 5 mL 파운드 Cm25 시퀀스 된 식민지를 위한 숙박 문화를 성장 하 고 구한다 냉장고 주식 다음 단계에서 15% 글리세롤을 포함 하는 파운드에 1.4.7. 테스트 바인딩 선호도 대 한 시퀀스를 반복 펩 티 드 그리고 특이성에서 설명한 FACS 메서드를 사용 하 여 섹션 3.3 FASTA 형식의 시퀀스 목록 (전체 목록과 반복)을 사용 하 여 기본 맞춤을 사용 하 여 시퀀스를 정렬 하 고 분석 프로그램, 섹션 3.2에서.
  2. Clustal 오메가, Kalign, 및 유사한 프로그램을 사용 하 여 순서 정렬
    1. 매크로, FASTA 스프레드시트에서 FASTA 형식의 시퀀스를 복사 또는 그렇지 않으면 (예: 단계 3.1.3에서에서) 정렬 시퀀스에서 FASTA 파일의 목록을 만듭니다.
      참고: A 열 포함 숫자 순서로 FASTA 파일 "Seq #" 열 B "요약 테이블" 시트에서 "AA 순서"로 정렬 표시 하는 동안. 펩 티 드 순서 아미노산 순서 정렬의 목록 상단에, (로 "# 빈") 빈 벡터와 그 시퀀스는 둘 다 5' 또는 3' 검색 조건 ("# Value")로 발견 된 시퀀스를 사용할 수 없게 표시 됩니다. 이 기능은 쉽게 업데이트 또는 분석에서 그 시퀀스의 제거 수 있습니다.
    2. Clustal 오메가48 또는 Kalign49 소프트웨어 웹사이트 50,51, 이동 하 여 열거나 다른 선호 하는 소프트웨어를 사용 하 여 순서 정렬에 대 한. 복사 하 고 붙여 FASTA 시퀀스 목록 "어떤 지원 되는 형식에서 시퀀스" 아래 상자에 입력. "더 많은 옵션"에서 Kalign (불가능 Clustal 오메가), 30 "간격 오픈 처벌"을 변경 하지만 그렇지 않으면 "제출"을 클릭 하기 전에 기본 설정을 유지.
    3. 시퀀스 정렬 맞춤 위에 "결과 요약" 탭을 선택 하 고 다음 "Jalview" 아이콘을 클릭 하 여 Clustal 오메가 Kalign 온라인 소프트웨어 내에서 직접 Jalview, 5253 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
      참고:, 선호 하는 경우 또는 다른 프로그램에서 생성 된 시퀀스 정렬의 분석을 위해, 54 소프트웨어를 별도로 다운로드 및 복사 하는 "파일", "입력 정렬"를 클릭 하 여 열 분석 창에 맞춤을 붙여 및 " 텍스트 상자에 ". 이 쉽게 합의 시퀀스 입력된 시퀀스 정렬에 인지 확인 하는 수단을 제공 합니다.
  3. 바인딩 친 화력과 특이성 FACS를 사용 하 여 비교
    1. 5 mL 파운드 Cm25 0.2 %w / v D-포도 당 관심의 각 개별 분리로 (단계 3.1.4 또는 식민지의 더 순서 분석에서 섹션 3.2, )에서 적절 한 부정적인 제어 (디스플레이와 보충 접종 비 계만 또는 단계 2.13에 대 한 참고에 설명 된 대로 대상, 바인딩되지 않는 펩 티 드). 하룻밤 225 RPM에서 떨고 37 ° C에서 성장.
    2. 숙박 문화를 사용 하 여 3 mL 파운드 Cm25 60 µ l 세포 접종 (1시 50분 희석). 문화에는 OD600 0.5의 도달할 때까지 225 RPM에서 떨고와 37 ° C에서 품 어-0.55. 0.04 %w / v L-arabinose 펩 티 드 식 유도 2 m m EDTA (펩 티 드 디스플레이 42의 촉진), 37 ° c.에 45 분 225 RPM에서 떨고 플러스
    3. 장소는 얼음에 문화를 유도 한다. 각 분리에 대 한 5 µ L에 셀을 추가 25 µ L PBS 혼자 또는 PBS 포함: 150 nM YPet 12,13 (긍정적인 통제 식), 경우; 250 nM 대상-488; 250 nM Cross-Reactive Protein(s)-488; 그리고 250 nM SAPE (2.1에 대 한 자세한 내용은 참조). 45 분 동안 얼음에 품 어.
    4. RT 5 분 또는 4 ° c.에 대 한 6000 x g에서 원심 분리기 세포 펠 릿의 반대 측에서 액체를 그려서 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 모든 샘플 및 분석에 대 한 준비는까지 얼음에 셀 펠 릿을 저장 합니다.
    5. 500 µ L 얼음 차가운 FACS 버퍼, 실행 pipetting 및 교류 cytometer를 사용 하 여 읽기 전에 그냥 튜브를 flicking 하 여 잘 혼합에서 각 셀 펠 릿 resuspend (재료의 표 참조).
      참고: 참조 단계 2.13 바인딩 친 화력과 특이성 비교 게이팅의 추가 설명 및 nMFI의 계산에 대 한 메모. 비-바인더 또는 일반적인 바인더 지금 추가 분석에서 제거할 수 있습니다 및 높은 선호도 바인더를 다시 열 정렬 섹션 3.2 추가 시퀀스 초기에 놓친 수 있습니다 동향에 대 한 보고를 다음에 의해 평가 되어야 합니다. 인구입니다. 섹션 3.2 및 3.3 새로운 트렌드로 필요에 따라 반복 될 수 있습니다와 합의 시퀀스는. 이 분석 동향 볼 수 없습니다 하는 경우 더 많은 임의의 시퀀스를 포함할 수 있습니다.

Representative Results

자동화 된 자기 활성화 셀 (autoMCS) 보다는 수동 마그네틱 셀 정렬 정렬 사용 하 여 false 네거티브 후보 크게 세균성 디스플레이 라이브러리 9,14biopanning 동안 감소 된다. 부정적인 정렬 단계 수 추가할 수 있습니다 관심의 대상으로 일반적인 바인더를 줄이기 위해 필요 하 고 그것은 자석에 대 한 부정적인 정렬 추가를 비즈 자신 앞 최소한 제안 했다. 그림 2, 고 추가 부정적인 선택 하기 전에 같이 biopanning 선택한 세균의 4 라운드 보호 항 (PA) 바인더에 대 한 라이브러리를 표시 하기 전에 스스로 자성 구슬에 대 한 부정적인 선택이 완료 된 rivax 및 abrax, 그림 3에서 보듯이 대 한 긍정적인 선택의 4 라운드에 대 한 그래서 의도 하지 않은 절연 streptavidin 자체를 바인딩 하는 펩 티 드의 관심사 이며와 FACS를 사용 하 여 모니터링은 여기에서 사용 하는 구슬 streptavidin biotinylated 단백질의 캡처에 활용 된 Phycoerythrin (그림 3 streptavidin 활용 된 , SAPE). 바인딩 대상 단백질을 평가할 때 최소한 streptavidin 바인딩은 어떤 유망한 개별 후보자에 대 한 테스트 해야 합니다. 백분율 바인딩 및 nMFI SAPE에 대 한 모든 정렬 라운드에서 낮은 값 이어야 한다. 바인딩 streptavidin의 수준 인구 반복적으로 각 정렬 라운드 후 streptavidin 입히는 자성 구슬에 노출 때문에 그림 3에서 발생 각 정렬 라운드 다소 증가할 수 있다. 배경 streptavidin 바인딩 레벨이 다운스트림 분석에 문제가 있는 경우, 추가 자석 구슬에 대 한 부정적인 정렬 수행할 수 긍정적인 정렬 라운드는 streptavidin 바인딩 인구 증가 따라 가양성의 다운스트림 심사를 줄이기 위해 순서입니다. 단백질 또는 자료를 사용할 수 있는 경우는 특별히 특정 응용 프로그램에 대 한 펩 티 드의 다운스트림 사용을 방해할 수 또는 있는 구조 때문에 대상 및 시퀀스 유사성, 선호도 시 약으로 cross-react 것으로 예상 된다 추가 정렬 부정적인 그에 대 한 단백질 또는 물자 것이 좋습니다. 예는 abrax 바인딩 펩 티 드의, 구조적 유사성 및이 두 가지 단백질 1,15의 순서 상 동 격리 하기 전에 rivax에 대 한 부정적인 정렬입니다. 다시, cross-reactive 부정 사용 하는 단백질 바인딩 단계 정렬 모니터링할 수 있습니다 라운드 FACS (그림 3Rivax-488)를 사용 하 여 정렬의 분석 중. 최고의 케이스 시나리오에서 백분율 바인딩 및 nMFI은이 같이 낮다.

가능한 경우, 고정된 긍정적인 제어 펩 티 드에 C-여기, 대표 결과에 사용 하는 세균성 디스플레이 라이브러리를 제작한 디스플레이 발판의 P2X 펩 티 드 등 FACS 분석 결과에서 선호도 바인딩의 부족 인지 확인 하는 데 도움이 디스플레이의 표현의 부족 보다는 대상에 대 한 선호도 peptide(s)의의 부족 자체을 발판. 그림 2 에서 그림 3, YPet 모나가이 P2X에 바인딩 펩 티 드 모니터링 및 정렬의 초기 라운드는 비 계를 제대로 표현 하는 방법을 보여 줍니다. 이 주로 자체 발판 만들어진 하지 즉 임의의 라이브러리에서 N 맨끝 펩 티 드에 정지 codons의 높은 주파수로 인해 높습니다. 다른 효과 대장균에 예상치 못한 독성 효과 펩 티 드의 존재와 같은 또한 기여할 수 있습니다 또는 다른 이유 (예: 세균성 게놈에서 돌연변이)에 대 한 성장 또는 펩 티 드 디스플레이 속도 감소. 유도 하는 동안 EDTA의 추가 42, 정렬의 이러한 초기 라운드 동안 식 향상 시킬 수 있습니다 하지만 아직 테스트 되지 않았습니다. 각 biopanning에 YPet 모나에 바인딩 인구 3 라운드에 의해 크게 향상 됩니다. 그림 2 그림3 비교, 그것은 또한 분명 그 식 수준 향상 시킬 수 있습니다 ( 그림 2YPet 모나)에서 90 분을 유도 시간 ( 그림 3YPet 모나)에서 45 분 보다 증가 하지만 45 분은 일반적으로 충분 합니다. Note 1.0 근처 값 식 수준 경우 일반적인 되므로 YPet 모나에 대 한 nMFI 부정적인 제어 셀의 YPet 모나 바인딩 수준으로 정규화 됩니다. 동일한 샘플에서 YPet 모나 MFI PBS 혼자 MFI를 정상화 상대 식 수준을 비교 하는 유효한 방법 이기도 하지만 훨씬 더 높은 값을 준다 ( 그림 2 를 비교 하 여 그림 3 Sarkes 에서에서 결과 외. 2015 15).

펩 티 드의 특정 대상에 바인딩 라이브러리의 농축은 일반적으로 3 긍정적인 정렬 라운드 이내 달성 하지만 정렬의 네 번째 라운드를 계속 도움이 될 수 있는, 그림 2 와 같이 그리고 그림 3 . 여기, % 셀 고 nMFI 계속 해 서 증가 모두 예 목표, PA와 abrax, 그림 2 에서 빨간색 박스는 4 라운드 라운드 3에서 그림 3, 각각. 높은 선호도 펩 티 드 순서 라운드 3에 이미 있을 수 있습니다 하지만 4 라운드 뿐만 아니라, 잠재적인 후보 14다운 선택에서 에이즈에 더 풍부 하 게 높습니다. 4 라운드에서 시퀀스의 분석 반복 시퀀스를 표시 하는 경향이 그리고 이러한 시퀀스를 반복 친 화력과 특이성 분석 및 합의 순서 결정에 대 한 훌륭한 출발점. 그림 4와 같이이 원고에 보충으로 제공 하는 eCPX_Sequencing 매크로이 초기 분석을 간소화 수 있습니다. .Seq 또는 텍스트 파일, 선택한 5'과 3' 시퀀스 사이 DNA 시퀀스의 폴더와 시작 번역, 아미노산 서 열, 주최 이며 각 펩 티 드에서 개별 아미노산 잔류물의 수에 대 한 분석. 격리 된 펩 티 드 순서의 정렬된 목록 요약 테이블 시트 화면 그림 4에표시 된 것 처럼 쉽게 반복 하 고 어떤 주파수에는 시퀀스를 결정 하 사용할 수 있습니다. 반복 시퀀스를 포함 하는이 스프레드시트에 셀 쉽게 분석에 대 한 다른 색상에 설명 되어 있습니다. 합의 시퀀스 및 기타 동향에 대 한 이러한 반복 시퀀스를 확인 하는 것이 좋습니다. 이것은 Kalign 등 Clustal 오메가, 순서 정렬 소프트웨어에 의해와 (를 포함 하 여 그들이 주파수에서 반복 및 비 반복 시퀀스) 전체 시퀀스 출력 및 다운 선택 목록 중에 분석을 수행할 수 있습니다. 반복 시퀀스 (또는 그들의 상대 주파수 없이). 그림 5A 에 PA와 주파수, 계정에 복용 하지 않고 시퀀스를 반복 하는 abrax에 대 한 대표적인 결과 표시 됩니다 5B, 각각. Note는 그림 5A에서 스스로 개별 반복 시퀀스의 몇 가지 PA 대상 포함 합의 시퀀스 WFCFTC (또는 유사한 순서), 대 한 밑줄이 그어진 빨간색으로 Kalign에 Jalview 소프트웨어 분석을 적용 하 여 결정 했다 반복 시퀀스의 시퀀스 정렬입니다. 이 합의로 WXCFTC, 이전을 결정 했다 정렬 방법 9에 신뢰 하는 PA 바인딩 합의 것. 그림 5B, 어디 abrax 대상에 대 한 반복 시퀀스 같은 방식으로 분석 되었다, 결과 다르다. 첫째, 5 시퀀스 abrax 바인더 (비록 44% 더 많은 식민지도 PA에 대 한 시퀀싱 했다) PA 바인더에 대 한 biopanning의 4 라운드에서 격리 15 반복 시퀀스에 반대에 대 한 biopanning의 4 라운드에서 반복 했다. 둘째, 5 반복 시퀀스 중 가장 유망한 "합의" 시퀀스 (FWAWF, 보라색에서 밑줄)을 포함, 후보 도끼-A15 포함 되어 있지만 최고의 시퀀스 일치 (FWDTWF). 추가 분석 바인딩 친 화력과 특이성 결정, 아래의 설명 대로 FWDTWF abrax 바인딩에 그림 5C에 대 한 상위 5 명의 후보에서 결정의 일치를 제공 하는 데 도움이.

각 반복 시퀀스에서 대표적인 식민지에 세포 친 화력 및 특이성 FACS, abrax 바인딩 펩 티 드에 대 한 biopanning에서 반복 시퀀스에 대 한 그림 6A 와 같이 사용 하 여 추가로 분석할 수 있습니다. 여기 그것은 모든 5 개의 반복 시퀀스 rivax, 부정적인 정렬 또는 streptavidin, 자석 구슬 사용으로 인해 정렬 동안에 사용 되는 구조적으로 유사한 단백질 보다 abrax, 의도 된 대상에 대 한 높은 선호도 분명 biopanning입니다. 이것은 이미 유망한 결과 선호도 대 한 일치 및 표시 된 그림 3, 그것은 분명 그 농축 바인딩 대상, abrax에 대 한 정렬 라운드의 특이성은 각 라운드 동안 biopanning의와 증가 하 고 있다 유사한 단백질, rivax에 대 한 선호도 없습니다. 그러나 혼자 4 라운드에서 시퀀스를 반복 사용 하 여 abrax 정렬에 대 한 만족 스러운 합의 순서 하지 결정 했다, (그림 5B 토론 이상). 그러나 4 라운드에서 100 시퀀스 된 식민지에 반환,, 그것은 지적 했다 눈으로 도끼-A15 분리에 가장 일치 하는 하나의 추가 후보, 도끼-A12, 포함 지적 했다 FWDTWF 시퀀스 예측된 합의 대 한 유사 시퀀스에 대 한 검색 하는 경우 그리고 또 다른 후보, 도끼-A14, 비슷한 포함 순서, DWNTWF. 이들과 다른 시퀀스 반복 시퀀스에 포함 된, 다른 비 반복 시퀀스에 시연 또는 무작위로 선택 되었다 바인딩 친 화력 및 특이성에 대 한 FACS에 의해 분석 되었다. 그 테스트는 Sarkes 외. 2016 1 순위가 결정 됩니다 고이 분석에서 상위 5 바인더 FWDTWF, 그림 5C에서처럼 결정 합의 순서 그림 6B에 표시 됩니다.

PA 대상 인식 하는 펩 티 드에 대 한 biopanning의 4 라운드에서 펩 티 드 시퀀스를 반복에 대 한 선호도 바인딩 비슷한 분석 공개 최고의 바인더, PA-488 nMFI:SAPE nMFI의 비율에 의해 선정 하는으로 포함 된 WXCFTC 일치 또는 유사한 시퀀스 (표 1)입니다. 이 비율을 사용 하 여 시퀀스 자체 구성 합의 포함 하는 및을 하지 않았다. 최고 후보자, 모든 포함 시퀀스 관련 합의 분석 되었다 마찬가지로 그림 6, abrax에 대 한 위에서 설명한 방법에 Sarkes 그 외 여러분 2015 14에 제시 된으로. 이러한 결과 일부 대상에 대 한 시퀀스를 반복 펩 티 드의 분석 수 있습니다 합의 순서를 결정 하 고 중요 한 선호도와 선택된 대상에 대 한 특이성 바인더를 적절 한 수 있습니다 그 입증 될, 그 자체로, 충분 한 대 한 바인딩입니다. 그러나 참고,, 반복의 수는 반드시 관심 (표 1)의 대상에 대 한 상대적 바인딩 선호도 반영 하지 않는다. 시퀀스 분석 및 후보자의 수영장을 좁혀 높은 선호도와 그 후보자 중 동향 재검토를 바인딩 분석 사이 대체 도움이 됩니다 분석 시퀀스 혼자 반복의 패턴을 확인 하기에 충분 하지 않을 경우, . 혼자 반복 시퀀스 분석에서 추세를 관찰 하는 경우에 동일한 동향 또는 다른 동향, 추가 조사 시 추가 비 반복 시퀀스 수 있습니다 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1: 세균성 디스플레이 라이브러리에 대 한 biopanning 프로토콜의 도식. 같이, biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 순환 과정 이다. 세균성 디스플레이 라이브러리에서 각 셀 (재료의 표 참조) 세포는 플라스 미드 (이 경우 choloramphenicol) 저항 유전자를 포함 하는 항생제의 성장으로 유지 되는 플라스 미드 DNA를 포함 되어 있습니다. 각 플라스 미드는 또한 임의의 펩 티 드 셀의 외부에 노출 시키는 디스플레이 비 계 단백질을 인코딩합니다. 때문에 각 셀 단일 플라스 미드 DNA 시퀀스를 포함, 각 셀 세포 막에 걸쳐 여러 위치에서 단일 펩 티 드를만 표시 되어야 합니다. Biopanning의 시작 정렬 각 라운드 후에 라이브러리 다양성의 수준에 따라 DNA 시퀀스 수 있습니다 또는 수 없습니다 고유 셀을. Biopanning는 성장과 그들의 외부 막에 개별 펩 티 드를 표시 하도록 셀 라이브러리의 유도로 시작 합니다. 이 펩 티이 드는 다음을 대상 단백질 (biotinylated 또는 그렇지 않으면 캡처에 대 한 태그) 작용할 수 있습니다. 마그네틱 활성화 셀 정렬 (MCS), 언바운드 단백질 제거 되 고 셀 캡처 단백질 (biotin과 강한 상호 작용은이 예에서 streptavidin)로 코팅 된 자석 구슬 알을 품는. 전체 문화 다음 언바운드 셀에서 바인딩된 세포를 분리 하는 자석에 노출 됩니다. 자동화 된 자기 정렬 장치를 사용 하 여 가양성을 줄이기 위해 셀 분리에 대 한 선호 이다. 여기 그림은 긍정적인, 셀에 바인딩된와 공동 자석 구슬 elute 유지 됩니다. 우리가 일반적으로 앞 수행, 부정적인 정렬에 대 한 프로세스는 동일 셀 자석 구슬의 세척을 대신 유지 됩니다. 관심, 구속 (긍정적인 정렬) 또는 언바운드 (부정적인 종류) 도서관 일부 하룻밤 성장 및 정렬의 다음 라운드에서 사용. 긍정적인 biopanning의 각 후속 라운드 엄중 개선 대상 농도 및 비드 볼륨 감소를 요구 한다. 각 라운드 후 biopanning, 선호도 및 단백질 대상에 대 한 펩 티 드의 특이성 평가 됩니다 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 biopanning를 중지 하 고 개별 후보자 조사 시작 시기를 결정 하는 데 도움이. 필요에 따라 DNA 연속 그리고 펩 티 드 순서 분석 수행 됩니다. 분석 단계는 순환 과정, 특히 biopanning의 최종 라운드 후 개별 격리 동향 공개 자체에 있을 수 있습니다. 이 시점에서, 펩 티 드 순서 동향 및 합의 바인딩 친 화력 및 특이성와 상관 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: FACS 라운드 정렬의 분석에 대 한 예제 데이터: PA 대상. 바인딩 선호도 FACS에 의해 결정 되는 biopanning (긍정적인 정렬) 선택한 박테리아 표시 대상, 보호 항 (PA)에 바인딩 하는 펩 티 드에 대 한 라이브러리의 4 라운드 후 표시 됩니다. 이 첫 번째 수행 streptavidin 입히는 자성 구슬에 대 한 부정적인 정렬 후 수행 되었다. 바인딩 평가 대 한 셀은 0.4% 유도 했다 L-arabinose 보육 대상 및 제어 솔루션 및 FACS를 분석 하기 전에 90 분. 빨간색에서 박스는 의도 된 대상에 대 한 선호도 분석을 바인딩. 여기 A FITC vs FSC의 점도 표시-A와 백분율 셀 (PBS 혼자와 incubated 문이 부정적인 컨트롤)에 비교 하 여 바인딩된 값 및 중간 형광 강도 (nMFI, 펩 티 드 없는 네거티브 제어와 인 큐베이 팅에 비해 정규화 동일한 fluorophore 표시 된 단백질)로 45 분 동안 incubated 했다 유도 세포의: PBS 버퍼 혼자, 150 nM YPet 모나 (펩 티 드 식에 대 한 긍정적인 통제), 또는 250 nM PA-488 (표시 대상). Biopanning의 각 라운드 후 관심의 대상에 대 한 선호도 바인딩 증가 농축 note 그림 3, 달리 모든 autoMCS 셀 분판 프로그램 Posselds를 사용 하 여 완료 되었습니다. 이 데이터의 일부 또한 A FITC vs FSC-A 플롯 그림과 비교 Sarkes 외. 2015 14 FITC H 대 FSC-H의 점도에 구상 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: FACS 라운드 정렬의 분석에 대 한 예제 데이터: abrax 대상. 유사 하 게 그림 2, FACS에 의해 결정 된 대로 완전 한 biopanning 실험에 대 한 비교 바인딩 선호도 여기는 표시. 세균성 디스플레이 라이브러리는 streptavidin 입히는 자석 구슬, 그림 2에 대 한 부정적인 정렬 대상이 되었다 하지만 다음 비슷한 구조와 동종 단백질에 대 한 부정적인 정렬 추가 라운드에 복종 되었다 고 기능, 대상, abrax에 바인딩 하는 펩 티 드에 대 한 긍정적인 biopanning의 4 라운드를 수행 하기 전에 rivax. 바인딩 평가 대 한 셀은 0.4% 유도 했다 L-arabinose 대상, 긍정적인 통제, 및 부정적인 컨트롤에 바인딩 및 FACS에 읽기 전에 45 분. 빨간색에서 박스는 의도 된 대상에 대 한 선호도 바인딩. 여기는 A FITC vs의 점도 표시 FSC-A (또는 PE-A vs SAPE 경우 FSC-A) 백분율 셀에 대 한 값 (PBS 혼자와 incubated 문이 부정적인 컨트롤)에 비교 하 여 바운드와 nMFI의 유도로 45 분 동안 incubated 했다 셀 : PBS 버퍼 혼자, 150 nM YPet 모나 (펩 티 드 식에 대 한 긍정적인 통제), 250 nM Abrax-488 (레이블이 단백질 대상), 250 nM Rivax-488 (레이블이 잠재적인 cross-reactive 단백질 대상), 또는 250 nM SAPE (부정적인 컨트롤을 직접 바인딩 streptavidin 입히는 자석 구슬). 관심, abrax, biopanning의 각 라운드의 대상에 대 한 바인딩 선호도와 구조적으로 유사한 단백질, rivax에 대 한 최소한의 바인딩 선호도 증가 농축 note 그림 2, 반면 긍정적인 1 라운드 biopanning 사용 하 여 수행 했다 autoMCS Posselds 프로그램 후속 라운드를 정렬 하는 동안 완료 되었습니다 biopanning이이 원고에 대 한 제안 프로그램 Posseld를 사용 하 여. 이 데이터 또한 A FITC vs FSC-A 플롯 그림과 비교 Sarkes 외. 2016 15 FITC H 대 FSC-H의 점도에 구상 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: "eCPX_Sequencing" 매크로 사용 하 여 출력 하는 예제 시퀀스 분석. 표시 된 화면이입니다 biopanning의 4 라운드에서 48 시퀀스 된 식민지의 선택한 세균성 디스플레이 라이브러리 Posselds 메서드를 사용 하 여 PA 바인더에 대 한. "요약 테이블" 시트는 여기에 표시 됩니다. Note 식민지 했다 시퀀싱 프로세스 동안 그들의 지정 된 파일 이름의 알파벳 순서로 번호가 지정 하 고 한 번 이상 반복 하는 시퀀스를 둘러싼 상자 쉽게 데이터 분석을 위한 다양 한 색상에 설명 되어 있습니다. ECPX_Sequencing 매크로 보조 코드 파일로 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 두 가지 단백질 목표에 대 한 정렬 및 합의 결정 순서. 여기 표시 된 모든 이미지는 Kalign 온라인 분석 소프트웨어 51를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 후 착 색 Clustal_X과 Jalview 소프트웨어를 사용 하 여 생성 했다. A) PA biopanning에서 시퀀스 라운드 4 반복의 맞춤 ( 표 1에 해당). B) abrax biopanning에서 시퀀스 라운드 4 반복의 맞춤 ( 그림 6A에 해당). C) abrax biopanning에서 상위 5 후보자의 맞춤 라운드 4, FACS 개별 후보자의 분석에 따라 ( 그림 6B에 해당). 빨간색 선은 밑줄에 A와 C, B에 보라색 라인 밑줄 바인딩 때만, 반복 시퀀스를 검사 하는 abrax에 대 한 결정 합의 시퀀스에 전조 가능성을 강조 하는 동안 바인딩 선호도 테스트 해야 합의 순서 FACS를 사용 하 여 전에 합의 경우에 따라 결정 될 수 있다. 다양 한 분석 소프트웨어를 사용 하 여 생성 하는 유사한 정렬 Sarkes 외. 2015 14 및 Sarkes 외. 2016 1에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 예 바인딩 선호도 및 FACS를 사용 하 여 분석 하는 개별 후보자에 대 한 특이성. 여기에 표시 된 A) 반복 시퀀스 및 biopanning의 4 라운드에서 abrax, 대상에 대 한 비교 바인딩 선호도 의해 결정으로 B)는 최고 5 후보자 FACS를 사용 하 여 결정 정규화 된 중간 형광 강도 (nMFI)입니다. 데이터 평균 (바) 및 3 개의 독립적인 복제 실험의 표준 편차 (오차 막대)을 나타냅니다. 표시 된 모든 후보는 구조적으로 유사한 단백질, rivax (Rivax-488, 빨간 막대)와 streptavidin 부정적인 제어 (SAPE, 검정색) abrax (abrax-488, 녹색 바)에 대 한 매우 구체적인 note. 반복 시퀀스에는 (도끼-07 도끼-15)의 두 b에서 상위 5 후보자 중도 했지만, 비교 결과 A와 B 보여줍니다 반복 분석 혼자 시퀀스의 않을 수 있습니다 충분히 높은 선호도 펩 티 드를 분리. 여기에 표시 된 데이터는 Sarkes 그 외 여러분 2016 1에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 1
표 1: 개별 반복 후보자에 대 한 일반적인 바인딩 특정 바인딩의 비율. 이 예제에서 반복 시퀀스 번호와 SAPE (부정적인 제어) nMFI에 PA (대상) nMFI의 비율 4 라운드 PA biopanning에서 반복 후보 시퀀스에 대 한 표시 됩니다. 이 데이터는 상대적 PA nMFI:SAPE nMFI 비율으로 정렬 하 고 알려진된 WXCFTC 합의 또는 유사한 시퀀스, 굵은 글꼴로 표시 하 고 밑줄의 존재에 대 한 분석 했다. 시퀀스를 자기는 합의와 그 후보자 높은 PA nMFI:SAPE nMFI 비율, 따라서 대상와 좀 더 구체적으로 상호 작용 구성 확인 합니다. 표시 결과 단일 FACS 실험에서 있습니다. 대상에 대 한 낮은 선호도와 펩 티 드 추가 복제 및 Sarkes 외. 2015 14에 출판 분석에서 제외 했다.

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Discussion

펩 티 드 인식에 대 한 항 체에 대 한 유용한 대안을 제공 하는 특정 조건이 극한 환경에서 안정성 필요할 때 그리고 Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 선호도 시 약의 고립에 성공적인 접근 되었습니다. 이러한 라이브러리의 Biopanning 간소화 되었습니다 여기에, 설명 하는 autoMCS 메서드를 사용 하 여 그리고 상용 autoMCS 플랫폼 훨씬 넓은 청중에 게이 기술을 확장. 전통적인 번갈아 MCS/FACS에 비해 박테리아에 대 한 정렬 방법 라이브러리 표시, 정렬 및 바인딩된 셀을 분리 수 있는 더 비싼 FACS 악기를에서 투자 필요 하지 않습니다 때문에 autoMCS 방법 보다 적게 비싸다 여기에 사용 되는 교류 cytometer 유형의 보다 분석 14수만입니다. AutoMCS에 의해 성공적인 biopanning에 대 한 중요 한 단계는 분리 프로그램 선택, 부정적인 FACS를 사용 하 여 biopanning, 중지 시기를 결정 하는 라이브러리 농축 모니터링 가양성을 줄이기 위해 잠재적 크로스-반응에 대 한 정렬 및 후보자의 수백의 성가신 검열을 피하기 위해 후보 풀의 스마트 분석.

여기에 설명 된 예제 비록 약간 다른 분석 전략의 각 풀에 대 한 펩 티 드 순서에 차이 두 개의 별도 대상, PA 및 abrax, 선택한 세균성 디스플레이 라이브러리의 성공적인 biopanning 설명 biopanning의 4 라운드 후 후보자입니다. PA 순서 분석 펩 티 드 순서 144 식민지에서 한 번 이상 반복에서 분명 트렌드를 보여주는 더 똑 바른 예 이었다. 이 혼자 합의 포함 하는 충분 한 PA 대상에 대 한 합의 순서를 결정 하 고 그 식민지 또는 유사한 시퀀스 streptavidin 부정적인 컨트롤에 바인딩 대 PA에 바인딩의 비율 면에서 최고의 후보자를 했다. 그러나,이 항상 되지 않습니다 경우. Abrax 대상에 대 한 시퀀싱 100 식민지 5 반복 시퀀스 아니라 이러한 시퀀스에서 동향은 향기로운 아미노산 잔류물 및 aspartic 산 또는 아스파라긴을 포함 하는 경향이 다른 불분명. 반복 시퀀스에서 예측된 "합의"만 수 생산 되었고 abrax, 선호도 대 한 검사를 하지만 그 정확한 일치 시퀀스를 포함 하는 아무 부모 시퀀스, 이후 우리 시퀀스 된 식민지의 목록에 반환 관찰 다른 후보가 서로 공통점이 더 많은 동향 했다. 사실, 두 식민지 반복 혼자, (FWAWF 대신 FWDTWF), 트립토판, 페닐알라닌, aspartic 산 성 잔류물의 하지만 다른 간격으로 동일한 추세를 했다에서 "일치"에 유사한 시퀀스 포함. 이러한 펩 티이 드 중 하나는 반복 시퀀스, 하나 아니었다. 유사한 변종 포함 된 세 번째 시퀀스와 함께 이러한 두 시퀀스 상위 5 바인더 abrax에 대 한 선호도 측면에서 테스트 중 이었다. 전반적인 최고 바인더 도끼-A05도 비슷한 추세를 표시 됩니다. Abrax에 대 한 결과 여러 번 시퀀스 분석 및 친 화력과 특이성 분석 사이의 교체는 접근 때로는 선택한 대상에 따라 필요한 것을 보여 줍니다. Abrax 대상에 대 한 결과 또한 매우 비슷한 단백질 (rivax 1,15)를 통해 얻을 수 있는 특이성의 수준을 보여 줍니다.

우리의 연구에 대 한 선정 autoMCS 프로그램 Posselds 및 Posseld, 낮은 주파수, 초기 인구의 5% 미만으로 레이블이 대상 셀의 긍정적인 선택에 대 한 둘 다 있었다. 두 경우 모두, 세포는 두 개의 자석 열 통과. 그러나 Posselds 프로그램의 경우, 셀 통과 더 느리게 증가 노출 시간 41을 첫 번째 열. 상업적인 autoMCS 장치의 제조 업체에 의해 주어진 프로그램 설명 뿐만 아니라 (참조 자료 테이블) 41이 프로그램은 여러 잠재적인 프로그램의 초기 비교 후 선정 됐다. 각 프로그램의 능력 꺼내 부정적인 제어 셀, 균질 문화에서 가양성 방지 하 고 성공적으로 부정적인 통제 세포는 감소와 함께 아군을 포함 하는 혼합된 문화에서 관심의 대상으로 알려진된 바인더를 분리 알려진된 바인더의 비율 비교 되었다. 여기에 설명 된 응용 프로그램에서 크게 벗어난, 비슷한 비교 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로그램 선택에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 PA는 biopanning의 모든 4 라운드에 대 한 이러한 프로그램 중 하나를 사용 하 여 절연과 비슷한 펩 티 드의 지도 보여에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약의 분리 (Posseld 및 Posselds)이 두 프로그램을 비교 하는 결과 게시 선호도 및 PA에 대 한 특이성 WXCFTC 합의의 결정. 주요 차이점은 그 Posseld, 그것의 빠른 흐름 속도, 보다 신속 하 게 정렬 및 바인딩 대상에 대 한 선호도 높았다 따라서 biopanning, 두 라운드 동안 biopanning 의 4 라운드 후 더 많은 독특한 시퀀스를 led Posselds를 사용 하 여 14.이 학습 전략 약간 변경 되었습니다 때 모두 혜택을 통합 abrax 바인딩 펩 티 드에 대 한 biopanning: 1 라운드 어디 다양성은 높은, 하지만 다음이 중요 한 단계 더 많은 노출 시간을 허용 하도록 사용 되었다 Posselds는 프로그램 Posseld 라운드 2-4 1,15중 가장 높은 선호도 바인더의 빠른 격리에 대 한 전환 했다. 이 때문에 특히 nMFI 및 백분율 바인딩 둘다 abrax 라운드 4 프로그램 중 하나를 정렬 하는 PA에 비해 4 라운드를 정렬에 대 한 더 높은 abrax, 이상적 될 것으로 보인다 (그림 2 그림 3 과 Sarkes 그 외 여러분 2015 14), 하지만 같은 목표와 함께 다른에 대 한 전략을 사용 하 여 직접 비교는 더 결정적인 비교에 필요한 것입니다. 어떤 프로그램은 특정 응용 프로그램에 대 한 최고의 개별 대상, 사용, 정렬 라이브러리 및 여기에 설명 된 조건에 어떤 변화를 달성 하는 펩 티 드 식의 수준에 달려 있습니다.

설명 하지 여기 abiotic 재료로 biopanning에서 잠재적인 결과입니다 하지만 우리는 또한 대량 알루미늄 2에 대 한 biopanning에 대 한 동일한 세균 디스플레이 라이브러리를 사용. 이 연구는 autoMCS를 사용 하 여 수행 되지 않은 하지만 비슷한 연구 자료에서 사용할 수 또는 수에 코팅 또는에, 마그네틱 비드 활용 된 경우 autoMCS를 사용 하 여 달성 될 수 있었다. 대량 알루미늄 연구에서 개별 아미노산 분석 및 이차 구조 모델링 아무 합의 순서 결정된 2이후 어떤 고립 된 펩 티 드의 바인딩 선호도 운전에 유용 했다. 생물 학적 목표와도이 개별 잔류물 주파수 분석 탭을 포함 하는 스프레드시트 "eCPX_Sequencing" 매크로에서 생성 하는 이유는 일부 대상에 대 한 바인딩 선호도 운전 하는 무슨을 이해 하는 데 필요한 수 있습니다. 그러나 없는 반복 시퀀스는 합의의 부족 뿐만 아니라 볼 수 있습니다 잔류물 주파수 패턴을 표시 하는 경우에,, 다른 유형의 분석 해야 합니다. 또한, 추가 라운드를 정렬 원하는 대상에 충분 한 선호도 다운 선택에 대 한 후보자의 훨씬 더 큰 수를 차단 하지 않도록 필요할 수 있습니다.

다음 세대 시퀀싱의 증가 가용성, 선호도 테스트 하기 전에 가장 유망한 후보자를 결정 하 고 biopanning의 각 라운드 후 농축의 정도 결정 하는 더 철저 한 연구를 수행 수 있습니다. 그러나, 쉽게 수십 또는 수백 개의 식민지의 일상적인 식민지 시퀀싱을 충분히 높은 주파수의 없는 경우 복제를 통해 다시 만들어야 시퀀스 바인딩 분석 단계로 이동 할 수 있습니다. 이 기술 발전, 저렴 하 고 더 일상적인 되 고 특히 식민지 격리에 대 한 옵션, 그것은 것입니다 가능성이 있을 biopanning 데이터를 분석 하는 가장 좋은 방법은. 그것은, 진화 방법 개별 시퀀스 및 전체 라이브러리의 이어질 수 있습니다. 또한, 정렬 라이브러리에서 박테리아 빠른 성장 속도와 게놈 단백질에 대 한 디스플레이 비 펩 티 드 식 없이 자료를 바인딩할 수 overexpress 박테리아 세포 쪽으로 정렬 바이어스 수 시간이 지남에 변경할 수 있습니다. 인스턴스입니다. 그 이유로, 유망한 후보자 등장, 일단 그것은 플라스 미드 DNA를 분리, 신선한 대장균, retransforming FACS 통해 펩 티 드 바인딩을 확인 합니다. 셀 무료 형태로 펩 티 드를 사용 하 여 계획 하는 경우 선호도 무료 펩 티 드에 대 한 평가 또한 한다. 예를 들어 대상 셉에 대 한 세균 디스플레이 통해 발견 된 펩 티 드 선호도 시 약 종합적 제작-셀 및 효소 연결 된 immunosorbant 분석 결과 (ELISA), 및 (FACS)를 통해 셀에 셀 오프 같은 더 전통적인 방법으로 분석 된 (ELISA)을 통해 선호도 두 방법 7에 의해 결정 하는 Kds를 사용 하 여 비교 했다.

Biotin streptavidin 상호 작용의 강도 단백질 대상과 바운드 펩 티 드의 캡처에 대 한 이상적인 전략은, 비록 다른 캡처 전략에 대 한이 절차를 수정할 수 있습니다. 에폭시 및 carboxylic 산 구슬 같은 자석 구슬, 단백질의 직접 결합 성공 했다 하 고 바인딩 단계를 제거 합니다. 그러나, 직접 첨부 파일 첨부 파일 전략에 따라 특정 또는 일반적인 방식으로, 잠재적인 바인딩 사이트를 방해 수 있습니다. 추가 streptavidin 비즈를 사용 하 여 장점은 안정적인 단백질 덜 대상 갓 30 분에 biotinylated 일 수 있다 또는 저장 동안 스스로 구슬 cross-linking에 대 한 단백질으로 더 이상 화를 요구 하는 경향이 있으며, 필요한 경우, 냉동 일반적으로 2-8 ° c.에 저장 Biotinylated 단백질의 제안된 시작 농도 대상 여기, 600 nM, 여러 대상에 대 한 성공 했다 하지만이 농도 감소 하는 경우 증가 선호도와 펩 티 드 캡처 시 약을 수 있습니다. 또한,이 메서드를 확장 하 고 다른 세균성 디스플레이 라이브러리와 다른 유기 체에 대 한 수정 될 수 있습니다. 예를 들어 사용할 anaerobes, 산소의 부재에서 또는 독특한 특성을 가진 펩 티 드를 분리 하는 extremophiles와 함께 사용 하기 위해 다른 환경에서 이러한 단계를 수행할 수 있습니다. 펩 티 드 또는 합의 결정에 대 한 관심의 특정 대상 수 있습니다 잠재적으로 사용 셀에 셀에서 생활 소재, 또는 합성으로 생산. 종합적으로 생산된 펩 티 드를 더 성숙 하 더 높은 선호도 및 센서에서 사용 하기 위해 또는 항 체 바인딩을 사용할 수 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 더 강력한 단백질 촉매 캡처 (PCC) 에이전트의 개발에 대 한 수 또는 인식 38,55. 분자 모델링 그림 5C 1에 나열 된 abrax 바인딩 펩 티 드 및 합의 대 한 최근 수행 되었다 목표와 펩 티 드의 위치 바인딩 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 전반적으로, 펩 티 드 선호도 시 약에 대 한 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 인식에 대 한 항 체의 생산, 단백질 목표의 탐지 및이 반자동된 biopanning, 간단, 신속 하 고 강력한 대안 접근 까지 도달 하는 응용 프로그램을 신뢰할 수 있는 결과 생산 하고있다.

Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

저자는 미국 육군 연구 실험실 (ARL) 박사 화목 프로그램, 박사 저스틴 P. Jahnke의 약속을 통해, ARL와 오크 릿지 연관 된 대학 계약을 통해 관리의 지원을 인정 하 고 싶습니다. 자금 남은 센서와 전자 장치 스파이 ARL에 의해 제공 되었다. 저자 또한 감사 Daugherty 실험실 UCSB에서 세균성 디스플레이 라이브러리와 YPet 모나 시 약, 닥터 브린 아담스 지원에 ARL, 그의 초기 작품에 대 한 박사 조슈아 Kogot에서 YPet 모나 시 복제에 대 한 복제에 대 한 정보를 공유 하 고 싶습니다, 엣지 우드 화학 고 표현 하 고 abrax를 정화 하는 데 사용 하는 플라스 미드를 공유 하기 위한 생물학 센터의 Alena 진정 세균 디스플레이 라이브러리 및 rivax 단백질의 biopanning PA 바인딩 펩 티 드, Qin Guo의 격리에 대 한 기술 지원에 대 한 브랜디 Dorsey에 훈련 abrax 바인딩 펩 티 드의 격리에 대 한 예비 실험과 박사 제시카 테 럴이이 원고에 관한 유용한 토론에 대 한 기술 지원에 대 한.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

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References

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