마우스 폐 전 절제술 및 보철물 삽입을 통한 내시경 표면 측정을위한 표준화 된 방법

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

내부 폐 표면적 (ISA)은 폐 질환 및 부상 유발 폐포 재생에서 폐 형태 및 생리학을 평가하는 데 중요한 기준입니다. 폐 절제술 및 인공 삽입물 마우스 모델에서 ISA의 측정 편향을 최소화 할 수있는 표준화 된 방법을 설명합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

폐의 기본 기능은 혈관과 대기 사이의 산소와 이산화탄소의 교환입니다. 기관지 폐 이형성증 (BPD), 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 및 급성 호흡기 감염과 같은 폐 질환은 ISA 2 를 감소시킵니다. 폐 질환을 연구하는 연구자들은 MLI, ILV, 기체 교환 단위 수, ISA 및 폐 조직 적합성 2 , 3을 포함하여 폐의 형태 학적 변화를 평가하기위한 몇 가지 정량적 방법을 개발했습니다. Weibel 등의 선구자 연구 4 및 Duguid et al. 5는 함께 ISA가 인간의 폐에서 폐 가스 교환 용량의 직접 척도로 사용될 수 있음을 입증했으며 기종의 심각성을 판단하는 기준으로 사용할 수있다. 지난 5 년 동안 발표 된 여러 연구에서 폐 형태 학적 매개 변수 ( 예 : 6 및 부상 PNX 1 (7)로부터 복구시 쥐의 폐에 형태 학적 및 기능적 변화를 평가한다. ISA는 식 1 8 , 9를 사용하여 계산됩니다.

방정식

, ILV 내부 폐 용적이며 MLI는 말초 폐 공역 10 크기를 나타내는 매개 변수이다.

하나 이상의 폐엽의 외과 적 제거 인 PNX는 인간 11 , 마우스 1 , 개 12 , 쥐 13 및 토끼 14 , 15를 비롯한 많은 종에서 폐포 재생을 유도하는 것으로 널리보고되었습니다. 스터드PNX 후 14 일째 생쥐의 폐는 기존 폐포의 팽창과 폐포의 새로운 형성 모두 남아있는 폐 조직에서 ISA, ILV 및 폐포의 수를 회복시키는 데 기여한다고보고했다 1 . 우리와 다른 사람들은 스폰지, 왁스 또는 주문형 보철물과 같은 재료를 PNX ( , 보철물 삽입) 후 빈 흉부 공동에 삽입하면 폐포 재생을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 기계적 힘은 폐포 재생을 시작하는 가장 중요한 요인 중 하나로 작용한다고 확고하게 확립되었습니다 1 , 16 , 17 . 이러한 연구는 PNX 치료 및 인공 삽입물 폐에서 ISA 값을 사용하여 폐포 재생을 정량적으로 평가하는 기준으로 사용하는 것이 효과적이라는 것을 강조했습니다.

옵서버 바이어스는 측정 된 VA에 유의 한 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.폐 형태 학적 매개 변수 ( 예 : MIL 및 ILV)에 대한 정보. 표준화 된 프로토콜은 ISA 계산에 사용 된 두 가지 매개 변수 인 ILV와 MLI를 결정할 때이 편향을 없애기 위해 사용할 수 있습니다. 여기서는 이러한 폐 매개 변수를 측정하기위한 매우 상세한 표준화 된 프로토콜을 제공합니다. 중요하게도, ISA를 정확히 정량화하는 능력은 손상 유발 폐포 재생 모델에서 폐 기능 연구의 신뢰성과 재현성을 향상시키고 다중 폐 질환에서 기계적 발견을 촉진해야한다고 약속한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

이 프로토콜에 사용 된 모든 절차는 국립 생물 과학 연구소의 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 8 주된 CD-1 수컷 마우스를 실험이 수행 될 때까지 특정 병원균이없는 (SPF) 시설에 수용했다. 수술은 완전히 마취 된 마우스를 사용하여 수행되었습니다 ( , 발가락 핀치 반응없이). 수술 후 쥐는 충분한 음식과 담수가있는 따뜻하고 습기가 많은 방에 보관했다. 복강 내 주사에 의해 전달 된 과량의 마취제를 사용하여 마우스를 희생시켰다.

1. 마우스 PNX 수술

  1. 복막 내 (IP) 주사를 통해 sodium phenobarbital (120 mg / kg body weight)과 buprenorphine (0.1 mg / kg body weight)으로 마우스를 완전히 마취하십시오. 쥐가 더 이상 발가락에 눌려지지 않을 때 수술을하십시오.
  2. 화학 요원으로 마우스의 왼쪽 흉부에있는 머리카락을 제거하십시오.흉내 치료 (~ 3 x 3 cm 2 영역).
  3. 복부 측면이 조작자를 향하게하여 삽관 플랫폼에 각 마우스를 고정시킵니다 ( 그림 1A ).
  4. 마우스 혀를 당기고 유도 카테터 18 ( 그림 1A )에 대한 노치가 들어있는 작은 동물 후두경으로 성대를 밝히십시오.
  5. 호흡 중 성대의 움직임을 관찰하여 성대를 구분하십시오. 20G의 정맥 내 삽관 캐뉼라를 전방 각으로 기관에 부드럽게 삽입하십시오 19 .
  6. 우측 가로 누운 위치에 마우스를 위치시키고 기계적 인공 호흡기에 연결 캐 뉼러 (예를 들어, 제어 된 압력은, 재료의 도표 참조). 마우스 가슴 ( 그림 1B )의 호흡 움직임을 관찰하여 기관에 캐뉼라의 삽입을 확인합니다.
  7. 흡기 압력을 설정하십시오.f 인공 호흡기를 12cm H 2 O에 놓고 호흡 속도를 분당 120 회 호흡으로 설정합니다 ( 그림 1B ).
  8. 베타 딘과 70 % 에탄올로 수술 부위의 피부를 오염 제거하십시오.
  9. Noyes Spring Scissors (절삭 날 14 mm, 팁 직경 0.275 mm)로 피부와 근육을 절단하여 5 번째 늑간 간격의 공간에서 2 - 3 cm 외측 개흉술 절개를합니다 ( 그림 2B , C ). thoracotomy 절차에 사용되는 수술 악기는 사용하기 전에 소독됩니다.
  10. 5 번째 늑간에서 1.5 cm 절개하여 왼쪽 폐를 노출시킵니다 ( 그림 2D , E ). 수술 중 고열 소작 기계를 사용하여 출혈을 중지하십시오.
  11. 무뚝뚝한 팁 겸자 ( 그림 2F )와 가슴에서 왼쪽 폐엽의 3 분의 1을 들어 올린 다음 면봉을 사용하여 왼쪽 전체를 꺼내십시오폐 ( 그림 2G ).
  12. 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 확인하십시오 ( 그림 2G ).
  13. hilum에서 기관지와 혈관을 실크 수술 봉합사로 단단히 묶고 결찰 후 3 - 4 mm 지점에서 왼쪽 폐엽을 잘라냅니다 ( 그림 2H , I ).
    참고 : 기흉을 일으킬 수있는 왼쪽 고관절의 봉합 매듭을 자르지 않도록주의하십시오 ( , 흉부의 공동에 공기 또는 가스가 발생할 수 있음) .
  14. 1 봉합으로 가슴 벽을 닫은 다음 5 ~ 6 개의 중단 봉합을 사용하여 근육 층과 피부 층을 순차적으로 꿰맬 수 있습니다. 각 봉합사 사이에 3 - 4 mm 간격을 두십시오 ( 그림 2M , 2N ).
    참고 : 외과 봉합 바늘을 심장에서 멀리 떨어지십시오. 부주의 한 심장 천자로 인해 즉시 사망 할 수 있습니다.
  15. 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독합니다.
  16. 애프터외과 수술에서 마우스를 38 ° 열 패드에 놓고 마우스를 인공 호흡 운동이 시작될 때까지 인공 호흡기에 연결하십시오 ( 그림 2O ).

2. 보형물 삽입

  1. PNX 절차의 1.1-1.13 단계를 수행하십시오 (즉, 마우스의 왼쪽 폐엽이 제거 될 때까지).
  2. 무딘 집게 ( 그림 2J )를 사용하여 실리콘 보철의 중심을 고정하십시오 (길이 12 mm, 두께 3 mm, 너비 7 mm, 0.2 g, 타원체 모양). 실리콘 삽입물을 삽입하기 전에 소독하십시오.
  3. 한 손으로 집게로 늑골을 잡고 흉강을 노출시킨 다음 다른 손으로 왼쪽 빈 가슴 흉강에 인공 삽입물을 삽입하십시오.
    참고 : 삽입 각도는 보철의 정면과 흉부 표면 사이에서 약 45도입니다 ( 그림 2K ,L). 인공 삽입물 삽입시 매우 부드럽게하십시오. 과도한 힘은 흉막 파열로 이어질 것입니다.
  4. 보철물이 왼쪽 빈 흉강을 차지하도록 무딘 집게로 보철물의 방향을 조정하십시오.
  5. 마우스 PNX 절차의 1.14-1.16 단계를 수행하십시오.

3. ILV 측정

  1. 일회용 혈청 피펫 (10 mL)에서 꺼낸 플런저, 바늘 어댑터가 달린 40 cm 길이의가요 관, 유속 조절 밸브 및 18 G 바늘로 구성된 맞춤 장치 ( "팽창 튜브")를 준비하십시오. 조립 후 테이프로 보드에 피펫을 고정시킵니다 ( 그림 3A ). 피펫 상단과 실험대 사이의 거리는 최소 30cm 이상이어야합니다.
  2. 55 ° C의 수 욕조에서 500 mL의 예비 가열 된 1x 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 20 g의 PFA를 용해시켜 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정 용액을 수동으로 흔들어서 준비하십시오용액이 깨끗해질 때까지 매 10 분마다. 실온으로 냉각시킨 후, 용액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한다.
    주의 : PFA를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
  3. 과량의 마취제 (0.8 % 페노바르비탈 나트륨, 1,000 U / mL 헤파린)로 마우스를 희생시킵니다.
  4. 폴리스티렌 해부 플레이트에 각 마우스를 고정하고 70 % 알콜로 뿌리십시오.
  5. 조심스럽게 마우스 가슴을 열고 가위를 사용하여 흉골을 잘라내어 폐엽을 철저히 노출시킵니다.
  6. 기관을 가위로 가위로 과도한 조직을 제거하십시오. 기관과 식도를 분리하십시오.
  7. 복부 대동맥을 잘라 심장의 오른쪽 심실에 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 이 삽입 전에 바늘을 20 mL 주사기에 연결하십시오. 폐가 흰색으로 변할 때까지 천천히 1x PBS를 심장에 밀어 넣어 혈액 세포를 제거하십시오. 일반적으로 폐 혈관을 치우기 위해 5 - 10 mL PBS가 필요합니다.
  8. 채우기e 4 % 신선한 PFA로 인플레이션 튜브를 주문 제작하고 인플레이션 튜브에서 모든 거품을 제거하십시오.
  9. 팽창 튜브의 18 게이지 바늘을 기관에 삽입하고 유체 누출을 피하기 위해 혈관 클립으로 기관을 클립하십시오.
  10. 25cm의 일정한 압력 경폐 / H 2 O 2 (20)에 4 % PFA와 폐 팽창. 완전히 확장 된 폐를 달성하기 위해 2 시간 동안 실온에서 폐를 품어. 이 "예비 고정"단계는 폐 형태를 보존하는 데 중요합니다.
    1. 팽창 튜브를 모니터링하여 초기 4 % PFA 볼륨의 값을 기록하고 최종 볼륨을 기록하십시오. 내부 폐 부피는 초기 4 % PFA 체적에서 최종 4 % PFA 체적을 뺀 값과 같습니다.
  11. 기관지를 가리고 가위로 가볍게 주변의 결합 조직에서 폐를 해부합니다 (폐를 손상시키지 않음). 폐를 손상시키지 않도록 매우 조심하십시오.
  12. 인큐4 ℃에서 12 시간 동안 4 % PFA로 채워진 50-mL 원추형 튜브에서 폐를 흔들어 쉐이커 (50 rpm)에서 부드럽게 흔들어줍니다. 조직 처리 및 염색으로 진행하십시오 (4 절 참조).

4. 조직 Embedding, 단면 및 Hematoxylin & Eosin (H & E) 염색

  1. 고정 후 Noyes Spring Scissors를 사용하여 폐에서 심장 및 과도한 결합 조직을 잘라냅니다. 폐 엽을 기관과 연결하는 기관지를 잘라내어 각 폐엽을 부드럽게 분리하십시오.
  2. 궤도 진탕 기 (50 rpm)에서 50 mL 1x PBS (30 분 / 세척)로 폐 엽을 3 ~ 4 회 씻어냅니다.
  3. 최종 세척 후, 조직이 50 ML 원추형 튜브 (약 12 H)의 바닥에 싱크 때까지 4 ° C에서 30 % 자당 솔루션 (1x PBS)에 그들을 immersing하여 폐엽을 cryoprotect.
  4. 조직을 임베딩하고 cryosectioning하기 전에 포셉과 튜브에서 폐엽 샘플을 제거하고, 액세스를 유지(sory lobes)을 이용하여 부엽 시료의 표면에서 남아있는 자당 용액을 추출한 다음 최적 절단 온도 (OCT) 화합물이 들어있는 페트리 접시에 시료를 약 30 분 동안 담그십시오.
  5. Cryomolds를 사용하여 액체 질소로 OCT 임베디드 액세서리 엽 샘플을 고정합니다. 로브의 가장 큰 표면적을 몰드 바닥에 평행하게 위치시킵니다.
  6. 조직학 분석을위한 cryosectioning 동안 각 샘플에 대한 총 세 μm의 두께 섹션을 준비합니다. 처음 1 mm 조직을 버리고 10 μm 두께의 부분을 하나씩 수집하고 0.5 mm 조직을 버리고 다른 부분을 수집 한 다음 0.5 mm 조직을 버리고 세 번째 (최종) 부분을 수집합니다.
  7. H & E 염색을하기 전에 1 시간 동안 공기 건조하십시오.
  8. H & E 얼룩 수행
    1. 수돗물을 3 ~ 4 차례 변경 한 다음 신선한 hematoxylin에서 2 분 동안 얼룩을 지우십시오; 흐르는 수돗물 아래의 섹션을 헹구십시오; 과량의 헤 마톡 실린을 제거하기 위해 1 % HCl-70 % 에탄올 용액에 2 번 섹션을 담그십시오.
    2. 3 분 동안 신선한 에오 신의 섹션 얼룩; 95 % 에탄올에서 2 번 연속으로 30 번 세척하고 100 % 에탄올로 2 번 30 번 세척하여 절편을 탈수시킵니다. 30 초 동안 크실렌의 단면을 깨끗이하고, 신선한 크실렌에서 1 회 제거 단계를 반복한다; 유리 coverslips를 사용하여 마운트 매체와 슬라이드를 탑재하십시오.

5. MLI의 정량화

  1. 명 시야 현미경을 사용하여 H & E로 염색 한 액세서리 로브 섹션 (20X 배율)의 디지털 이미지를 수집하십시오.
  2. MLI를 정량화하려면 3 개의 섹션으로 구성된 적절한 영역 (동맥 및 정맥, 주요기도 및 폐포 덕트 없음)에서 총 15 개의 중첩되지 않는 뷰 (1,000 μm x 1,000 μm)를 무작위로 선택하십시오.
  3. 10 개의 고르게 분포 된 수직선과 정의 된 len의 균등하게 분포 된 10 개의 수평선이있는 격자 배치눈금자 도구를 사용하여 선택한 영역에서 gth (1,000 μm); 따라서 각 라인은 100 μm 떨어져 있습니다 ( 그림 4B ).
  4. 하나의 절편 값을 인접한 두 개의 폐포 상피 사이의 직선 길이로 정의하십시오. 1,000 μm 길이 선을 따라 모든 절편 값을 측정하십시오.
  5. 각 그리드에 대해 가로 10 개, 세로 1,000 개, 세로 10 개 사이의 모든 절편 값을 계량화하십시오.
    참고 : MLI는 각각의 액세서리 로브에 대해 준비된 3 개의 섹션 중에서 분석 된 총 15 개의 그리드로부터 절편 길이의 평균값입니다.

6. ISA의 계산

  1. 등식 1을 사용하여 ISA를 계산하십시오 ( 소개 참조). ILV의 측정에 대해서는 3 장을 참조하고 MLI의 정량화에 대해서는 5 장을 참조하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

우리는 여기서 PNX 치료군과 인공 삽입물 (인공 삽입물)을 사용한 실험을 수행했습니다. 이러한 그룹은 이전에 발표 된 연구 그룹의 연구에서 사용한 그룹과 동일합니다 14 .

마우스 PNX 및 보철물 삽입 절차는 그림 2에 나와 있습니다. 8 주 된 CD-1 수컷 마우스가 수술과 정량화에 사용됩니다. PNX로 치료 한 군과 인공 삽입물을 삽입 한 군에서 좌측 폐엽을 모두 절제 하였다 ( 그림 2A - 2I ). 인공 삽입물 군에서는 좌측 폐 엽을 제거한 후 좌측 폐 엽의 크기와 모양을 모방 한 인공 삽입물을 가슴에 삽입했습니다 ( 그림 2J - 2L ).

수술 후 14 일째 남은 오른쪽 폐의 ILV를 결정하기 위해 주문 제작 된 팽창 튜브를 사용했다 ( 그림 3A ). 나머지 오른쪽의 평균 ILV 5 PNX 처리 마우스의 폐가 약 1.4 mL로 5 개의 보철물이 삽입 된 마우스의 오른쪽 폐의 1.05 mL ILV 값보다 유의하게 높았다 ( 그림 3B , 표 1 ).

MLI 측정을 위해 각 마우스에서 준비된 3 개의 섹션 중에서 총 15 개의 뷰를 분석했습니다. 그림 4A 는 액세서리 로브 섹션에서 병합 된 이미지와 MLI의 부량에 사용되는 선택된 영역 ( 예 : 뷰 1 - 3) 또는 선택되지 않은 영역 ( 예 : 뷰 4 - 5)에 대한 형태 학적 표준을 보여줍니다. 여기에서 PNX로 치료 한 그룹의 부속 폐 폐엽 단면으로부터의 3 번을MLI의 측정 ( 그림 4B ). 또한, 뷰 (3)의 확대 된 화상은 설명을 위해 디스플레이된다 ( 도 5a ). 라인 3은 예로서 제시된다 : 양두형 화살표 라인에 의해 표시된 차단 된 폐포 공기 공간의 길이. 우리의 분석에 따르면 PNX로 처리 한 마우스의 나머지 오른쪽 폐의 MLI 값은 보형물이 삽입 된 마우스의 나머지 오른쪽 폐의 MLI 값보다 훨씬 컸습니다 ( 그림 5B , 표 1 ). 모든 데이터는 평균 ± SEM ( 도 5B ).

ISA는 식 1을 사용하여 계산되었습니다. 표 1 은 모든 폐의 ILV 값, MLI 값 및 ISA를 보여줍니다. 보형물 주입 마우스의 ISA는 PNX 처리 마우스의 ISA보다 유의하게 작았으며, 삽입 마우스보철물의 n은 PNX 유도 재생을 손상시켰다.

그림 1
그림 1 : 마우스 Endotracheal 삽관 법 및 기계 환기. ( A ) 후두 경간 경유 20 G 정맥 삽관 캐뉼라로 기관 내 삽관. ( B ) 수술 전에 완전 마취 된 마우스를 압력 조절 식 인공 호흡기에 연결하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 마우스 폐렴 절제술 (PNX) 및 보철물 삽입. ( A - C ) 피부와 근육층을 자릅니다. B 중지외과 수술 중 고온 소작술로 출혈. ( D - E ) 5 번째 늑간 공간에서 1.5 cm 절개합니다. ( F - H ) 무뚝뚝한 집게로 왼쪽 폐엽을 당기고 폐동맥과 기관지를 확인하고, 고관절에 결찰하십시오. 화살촉은 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 나타냅니다. ( I ) 왼쪽 폐엽을 결찰 후 3-4 mm 지점에서 절제 하였다. ( J - L ) 왼쪽 흉강에 보철물을 삽입하십시오. ( M, N ) 가슴, 근육층 및 피부층을 봉합합니다. ( O ) 자발적인 호흡 운동이 시작될 때까지 마우스를 모니터하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 3 : 남아있는 폐의 내부 폐활량 (ILV) 측정. ( A ) 내부 폐 부피를 측정하기위한 맞춤 장치 ( "팽창 튜브"). ( B ) PNX 치료군과 인공 삽입물 군의 나머지 오른쪽 폐의 ILVs (평균 ± SEM)는 PNX 후 14 일째에 측정되었다. **, p <0.01, 학생 t- 검사 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 남은 오른쪽 폐에서 액세서리 로브의 평균 선형 차단 (MLI)의 부량. ( A ) 병합 된 메신저액세서리 로브 섹션의 나이가 표시됩니다. MLI 수치화에 사용되는 선택 영역 ( 예 : 보기 1 - 3) 및 선택되지 않은 영역 ( 예 : 보기 4 - 5)의 ( B ) 10 개의 일정한 간격의 수직선과 10 개의 일정한 간격의 수평선 (1,000 μm)이 선택된 영역에 배치되었습니다. 눈금 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : PNX 치료 폐 및 보형물 이식 폐에서 MLI의 정량화. ( A ) 도 4B 의 확대 3이 도시된다. 이중 화살촉이있는 붉은 색 선은 하나의 선형 절편의 길이를 나타냅니다. ( B ) MLI 값 (mean ± SEPNX 처리 마우스 및 보형물 삽입 마우스의 부엽 (葉)의 수는 PNX 후 14 일째에 측정되었다. *, p <0.05, 학생 t- 검사 . 스케일 바 : 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

수술 후 14 일 내부 폐 용적 (ml) 평균 선형 절편 (mm) 폐 내부 표면적 = 4ILV / MLI (cm 2)
PNX 처리 1.5 57.8 1038.06
1.35 49.6 1088.71
1.42 48.5 1171.13
1.4 51.5 1087.38
1.4 54.6 1025.64
보철 삽입 1.1 49.6 887.10
1 50.5 792.08
1.1 47.3 930.23
1.15 44.8 1026.79
0.86 46.3 742.98

표 1 : PNX 처리 및 보철 주입 마우스의 ISA 값 계산 PNX 후 14 일째 부속 낭의 ILV, MLI 및 ISA 값

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜에서는 마우스 왼쪽 폐 PNX 및 보철물 삽입 후 폐 매개 변수 측정에 대한 자세한 설명을 제공합니다. ISA는 현재 많은 폐 질환 및 부상 유발 폐포 재생에서 호흡 기능 평가의 주요 척도로 간주됩니다. 그러나 폐 연구 공동체가 ISA의 유용성에 관해서는 유용한 척도로 동의하고 있지만 현재까지는 ISA를 계산하는 데 사용 된 두 가지 매개 변수 인 ILV 및 MLI 측정의 표준화에 대해서는 거의 고려되지 않았습니다. 모든 측정과 마찬가지로 분명히 편향된 데이터를 얻는 것이 중요합니다. 현재 연구 노력의 핵심 목표는 쥐 폐 연구 공동체가 사용하기위한 표준화 된 프로토콜을 확립하는 것이다.

우리는이 프로토콜을 개발할 때 여러 가지 방법으로 측정 바이어스의 출처를 줄이려고했습니다. 우리는 ILV 측정에서의 변화가 적색기관에 삽입 된 바늘의 크기가 차원 적으로 일치하는지 확인하여 유체 누출을 방지함으로써 예방할 수 있습니다 (18 게이지 바늘은 마우스 기관과 매우 유사합니다). 우리는 또한 PFA 팽창 이전에 마우스 흉부 벽을 철저히 제거해야한다는 것을 발견했다. 이는 ILV 측정에서 가슴 벽의 잠재적 인 영향을 최소화하기 때문이다. MLI 값은 폐포 형태학에 크게 의존합니다. 따라서 연령 일치 및 성 대조 마우스 사용의 중요성 외에도 폐 고정 과정에서 폐포 형태의 적절한 유지 관리가 매우 중요합니다. 우리는 여기에 널리 채택 고정 방법을 사용 : 우리가 완전히 폐 조직을 팽창하기 위해 새로 제조 된 4 % PFA와 25cm의 H 2 O의 경폐 압력으로 폐를 팽창. 우리의 경험에서 압박감이 낮 으면 조직 수축, 비정상적인 폐포 형태로 이어져 궁극적으로 MLI 값이 낮아질 수 있습니다.

에 관측우리의 이전 연구는 PNX 재생 후, 나머지 폐의 부엽이 다른 폐의 3 엽과 비교하여 최대 체적 팽창을 나타냄을 나타 냈습니다. 남아있는 폐의 부엽도 형태 학적 매개 변수 ( 예 : MLI) 21 , 22 , 23 , 24 의 값에서 최대 증가를 보입니다. 그러므로 우리는 단지 다른 폐엽의 편차를 피하기 위해 부엽의 절편만을 분석했습니다. MLI의 정량화에 사용 된 다양한 섹션 간의 편차를 줄이기 위해 삽입하는 동안 로브의 방향을 제어했습니다. 우리는 로브의 가장 큰 표면을 저온 냉각 장치의 바닥과 평행하게 배치했습니다. 우리는 또한 절편시 샘플 조각의 두께, 절편 샘플링 순서 및 절단 위치를주의 깊게 조절했습니다. 샘플 처리 외에도 다른 importan표준화의 측면은 모든 동맥과 정맥, 흉막, 주요기도 및 폐포 덕트가 MLI 정량화 과정에서 평가되는 조직 영역에서 제외되어야한다는 것입니다. 동맥, 정맥 및 폐포 덕트는 모두 폐포보다 크기가 커서 (4 ~ 10 배), 이러한 큰 구조물을 제외하면 신뢰할 수있는 절편 측정을 얻는 데 중요합니다. 각 그룹에 대해 5 마리의 마우스가 정량화에 적합합니다. 각 마우스에 대해 부엽의 3 개 섹션 중 적절한 영역 (동맥 및 정맥, 주요기도 및 폐포 덕트 없음)에서 무작위로 총 15 개의 중첩되지 않는 뷰 (1,000 μm x 1,000 μm)를 선택했습니다. 샘플 삽입 방법 및 MLI 측정은 파라핀 처리 된 폐 조직에도 적용될 수 있습니다.

다른 것들은 MLI를 전체 라인 길이를 교차 된 치조 벽 25를 가진 인터셉터의 수로 나눈 값으로 정의 하였지만, 여기서는 선형 길이를 선형 길이로 사용했습니다MLI 계산에서 두 개의 인접한 폐포 상피 벽 사이에, MLI 데이터로부터 간엽의 두께를 무시한 것. 따라서, 우리는 ILV를 사용하여 ISA를 계산하였으나 총 폐량은 계산하지 않았다.

PNX 및 보철물 삽입 절차의 경우 PNX를받는 생쥐의 생존율은 85 %에서 90 %까지 다양했습니다. 보철물 이식을받는 생쥐의 생존율은 ~ 80 % 정도였습니다. 모든 수술 중에 생쥐 생존율을 높이기 위해 여러 단계를 거쳐야합니다. 1)기도에 카테터를 올바르게 삽입하는 것이 성공적인 PNX 수술을위한 전제 조건입니다. 후두경의 안내에 따라 안전하고 효과적인 기관 내 삽관을 용이하게하기 위해 마우스의 기관을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 2) 수술 중에 폐나 심장을 뚫지 마십시오. 다섯 번째 왼쪽 늑간 공간의 흉부가 넓게 열려 있는지, 그리고 좌측 엽의 hilum이 lobectomy 이전에 명확하게 확인되었는지 확인하십시오. 왼쪽 폐엽을 다시 수행 할 때섹션에서 폐 출혈 및 / 또는 폐엽의 파열을 피하기 위해 무딘 집게를 사용하여 왼쪽 엽이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 상처 봉합 중에 수술 바늘의 끝을 심장과 폐에서 멀리 떨어지십시오. 3) 과도한 힘이 흉막의 파열을 일으킬 수 있으므로 빈 가슴 틈에 보철물을 삽입 할 때 조심하십시오. 4) 수술 후 저체온이 마우스 이환율을 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 마우스를 38 ° 열 패드 위에 놓고 감각이 회복 될 때까지 모니터해야합니다.

좌측 폐엽을 제거한 후, 폐 호흡기와 내부 폐가 스 영역 모두가 현저히 감소되었다. 수술 후 14 일째 남아있는 폐 조직의 ILV, MLI, ISA는 PNX로 치료 한 군에서 인공 삽입물 군에 비해 유의하게 더 컸다. 이는 인공 삽입물이 삽입 된 PNX 유도 폐포 재건. 따라서, PNX 및 보철 - 주입 마우스 모드ls는 기계적 힘 유도 재 폐구 (re-alveolarization) 도중에 발생하는 세포 및 분자 현상을 조사하기위한 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 또한 AT2 널 폐 ISA 값은 우리의 프로토콜은 또한 유전자 변이 생쥐의 손상 회복을 검출하기에 적합한 것을 나타내는 PNX 후 14 일 (1)에서 제어 폐보다 크게 적었다. 이 연구에서 제시된 엄격하고 표준화 된 정량적 방법은 발달 연구 및 만성 폐색 성 폐 질환의 폐기종, 폐 손상 후 폐포 재생 및 폐 발달과 같은 여러 질병의 유전자 변형 동물 모델을 사용하여 폐 매개 변수와 ISA를 측정하는 데 적용 할 수 있습니다 결함.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 북경 생물 과학 연구소 (Beijing Institute of Biological Sciences)에 도움을 청한다. 이 연구는 베이징 시립 자연 과학 재단 (No. Z17110200040000)의 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16, (7), 1810-1819 (2016).
  2. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22, (6), 483-496 (1967).
  3. Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108, (2), 412-421 (2010).
  4. Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
  5. Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
  6. Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351, (6274), 707-710 (2016).
  7. Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, (3), 539-553 (2011).
  8. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, (4), 320-328 (1962).
  9. Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137, (3530), 577-585 (1962).
  10. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95, (5), 765-773 (1967).
  11. Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, (16), 244-247 (2012).
  12. Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94, (1), 405-412 (1994).
  13. Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120, (5), 1125-1136 (1979).
  14. Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5, (2), 92-95 (1988).
  15. Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115, (1), 7-13 (1977).
  16. Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75, (2), 195-205 (1939).
  17. Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281, (5), L1279-L1287 (2001).
  18. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  19. Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
  20. Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158, (4), 1230-1234 (1998).
  21. Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107, (5), 1569-1578 (2009).
  22. Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24, (4), 524-532 (2004).
  23. Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
  24. Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2, (1), (2012).
  25. Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics