التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

تم تحقيق اشتقاق قوي من الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبس) باستخدام فيروس سينداي غير متكامل (سيف) ناقلات بوساطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. تم تنفيذ صيانة الخلايا هيبس والتوسع النسيلي باستخدام ظروف زراعة خالية من الكينو و كيميائيا مع المؤتلف الإنسان لامينين 521 (لن-521) مصفوفة و E8 الأساسية (E8) المتوسطة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتعتبر الظروف الخالية من الغينو والظروف المحددة تماما معلمات أساسية للتوليد القوي والقابل للتكاثر للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان. صيانة خلايا هيبس على الخلايا المغذية أو المصفوفات غير محددة عرضة للفروق دفعة، التلوث المسببة للأمراض وخطر المناعة. استخدام المصفوفة الإنسان لامينين 521 (لن-521) المؤتلف محددة في تركيبة مع تركيبات وسائل الإعلام خالية من شينو ومحددة يقلل من التباين ويسمح للجيل ثابت من خلايا هيبس. ناقل فيروس سينداي (سيف) هو نظام غير قائم على الحمض النووي الريبي القائم على الحمض النووي الريبي، وبالتالي التحايل على المخاوف المرتبطة التأثير المحتمل التخريبية على سلامة الجينوم نواقل دمج يمكن أن يكون. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه النواقل كفاءة عالية نسبيا في إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. وبالإضافة إلى ذلك، الأنزيمية خلية واحدة تمرير الخلايا يسهل صيانة متجانسة من خلايا هيبس دون خبرة سابقة كبيرة من الجذعية سيليرة لبنانية الثقافة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم اختباره على نطاق واسع وتطويرها مع التركيز على استنساخ وسهولة الاستخدام، وتوفير وسيلة قوية وعملية لتوليد وخلايا هيبس الإنسان محددة وخالية من خلايا الخلايا الليفية.

Introduction

منذ اشتقاق الأول من خطوط الخلايا هيبس تاكاهاشي وآخرون. 1 ، 2 ، وقد وفرت خلايا هيبس أداة مفيدة لنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات وكمادة المصدر لتوليد العلاجات خلية في الطب التجديدي 3 . وقد اعتمدت ثقافة الخلايا هيبس منذ فترة طويلة على المشاركة في الثقافة مع الخلايا المغذية الليفية 4 ، 5 أو على ماتريجيل 6 ومع تركيبات وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين (فبس). وتعتبر الفروق بين الدفعة والدفعة نتيجة شائعة للطبيعة غير المعرفة لظروف الثقافة هذه، مما يؤدي إلى تغيرات لا يمكن التنبؤ بها، وهي مساهمة رئيسية في عدم موثوقية هذه البروتوكولات 7 . تطوير وسط محدد مثل الأساسية 8 (E8) 8 والمصفوفات ثقافة الخلية المعرفة على سبيل المثال لن-521 9 ، تسمحثانية لإنشاء بروتوكولات استنساخه للغاية والمساعدات في توليد قوي وصيانة خلايا هيبس متجانسة 7 ، 8 ، 9 ، 10 .

وقد كان تطوير تقنيات إعادة البرمجة الحرة للتكامل قفزة إلى الأمام. في الأصل، إعادة البرمجة تعتمد على ناقلات الفيروسات الرجعية التي تدمج عشوائيا في الجينوم مع الآثار التخريبية على سلامة الجينومية 11 . وتشمل التطورات في منهجيات إعادة البرمجة تطوير النواقل القائمة على الحمض النووي الريبي. ناقلات الحمض النووي الريبي لديها ميزة على طريقة إعادة برمجة الحمض النووي على أساس التكامل غير مقصود من خلال إعادة التركيب الجيني غير ممكن 12 . تقدم ناقلات سيف التعبير عالية وعابرة من العوامل الخارجية من خلال الحمض النووي الريبي واحد تقطعت بهم السبل دون مرحلة الحمض النووي 11 . ناقلات إعادة البرمجة التي قدمها سيفيتم تخفيفها في جميع أنحاء التوسع الخلية وتسليط الضوء في نهاية المطاف من الثقافة توفير وسيلة الطباعة القدم الحرة لإعادة البرمجة. بعد ذلك، الحفاظ على تعدد القدرات يعتمد على التعبير الداخلي للجينات تعدد القدرات 2 .

كما بدأت الرائدة هيبس الخلايا القائمة على العلاجات للانتقال إلى التجارب السريرية، والمطالب على دفعات موحدة، استنساخ، والسلامة هي القضايا الأساسية لمعالجة 13 . ولذلك، ينبغي تجنب المنتجات ذات الأصل الحيواني. على سبيل المثال، كان استخدام المنتجات زينوجينيك مرتبطا بمخاطر التلوث غير المسببة للأمراض الممرضة. أيضا، وقد ثبت الخلايا المستزرعة في وجود مكونات الحيوانات المشتقة الحيوانية لدمج الأحماض السيلياك غير البشرية في أغشية الخلايا التي تهدد لتقديم الخلايا المستمدة المناعية 14 . وبالتالي، فإن الحاجة إلى القضاء على المنتجات زينوجينيك ضروري لأي ملاحقات السريرية في المستقبل. ينطبق هذا البروتوكول زلا حرة وتعرف الثقافة في الحفاظ على خلايا هيبس تتحرك الخلايا أقرب إلى الامتثال السريرية.

يصف هذا البروتوكول متسقة، استنساخه للغاية وسهلة الاستخدام الأسلوب الذي يولد خلايا هيبس موحدة من الخلايا الليفية. كما أنه يوفر نظام ثقافة سهل الاستعمال للحفاظ على خلايا هيبس أنشئت. وقد استخدم هذا البروتوكول لاشتقاق أكثر من 300 خطوط الخلايا هيبس في منشأة إيبس الأساسية الوطنية السويدية في معهد كارولينسكا منها بعض خطوط سبق وصفها 15 ، 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جمع مواد المريض واشتقاق خلايا هيبس من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات، ستوكهولم، 28 مارس 2012، رقم التسجيل: 2012 / 208-31 / 3. وينبغي إجراء خطوات ثقافة الخلية في خزانات السلامة الأحيائية ما لم يذكر خلاف ذلك. دائما ممارسة تقنيات التعامل مع العقيمة عند العمل مع الخلايا. السماح لوسائل الإعلام، لوحات والكواشف للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 في الرطوبة العالية.

1. عزل الخلايا الليفية البشرية من خزعة الجلد

  1. الاستعدادات المتوسطة الثقافة، والإنزيمات الهضمية، طلاء الأطباق وأدوات تشريح.
    1. إعداد الليفية المتوسطة: 44.5 مل إيسكوف في تعديل دولبيكو المتوسطة (إدمم)، 5 مل مصل الأبقار الجنين (فبس) و 500 ميكرولتر البنسلين / الستربتومايسين (بيست) (انظر الجدول 1 )، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد الانزيمات الهاضمة في تركيز العمل من 1 ملغ / مل: ويغ أليكوتس من 4 ملغ من ديسباس وكولاجيناز نوع I مسحوق في أنابيب 15 مل منفصلة وتذوب في 4 مل من دمم / F12 + 1٪ الآفات. تعقيم الحل الأنزيمي عن طريق تمريرها من خلال مصفاة 0.22 ميكرون. إعداد حلول انزيم جديدة في كل مرة.
    3. معطف بئر واحدة في 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (أو 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة) في خزعة تشريح مع 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الفوسفات مخزنة المالحة (دبس). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. الأوتوكلاف مجموعة واحدة من مقص الجراحية وملقط في خزعة لتشريح.
  2. معالجة الخزعة
    ملاحظة: خزعة عملية في أسرع وقت ممكن بعد أن تؤخذ. تخزين في برنامج تلفزيوني + 1٪ الآفات لمدة تصل إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية. وينبغي أن تكون خزعة قطرها 2 - 4 مم في الحجم ووفقا لتصاريح أخلاقية.
    1. نقل الخزعة إلى طبق 35 ملم. نقل الخزعة إلى طبق جديد 35 ملم وغمر الخزعة في 2 مل من الايثانول 70٪ لمدة 30 ثانية.
    2. نقل الخزعة إلى ثلثطبق 35 ملم وغسل مع 1 مل من محلول الملح المتوازن هانك المعقم (هبس) تستكمل مع 1٪ الآفات.
    3. نقل خزعة إلى طبق الرابع 35 ملم، إضافة 1 مل من محلول ديسباس 0.1٪ الطازجة.
    4. قطع خزعة الجلد في 1-2 ملم 3 قطع في الطبق باستخدام مقص جراحي وملقط ومن ثم نقل القطع خزعة بما في ذلك حل ديسباس في أنبوب 15 مل. إضافة 2 مل إضافية من ديسباس.
    5. شطف الطبق 35 ملم مع محلول ديسباس 1 مل ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    6. احتضان خزعة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    7. إضافة 4 مل من 0.1٪ كولاجيناز I إلى أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا هضمها 300 x ج لمدة 3 دقائق، نضح طاف و ريسوسبيند الهضم في 2 مل من الألياف الليفية المتوسطة.
    9. إزالة الحل الجيلاتين من 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. نقل تعليق الخلية بما في ذلك أي قطع المتبقية إلى 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة (أو 35 مم طبق الثقافة الأنسجة) بريكواتد مع 0.1٪ الجيلاتين في دبس.
    10. تغيير المتوسطة كل يوم ثالث.
  3. توسع الخلايا الليفية البشرية
    ملاحظة: الخلايا الليفية هي على استعداد لتمريرها إلى T25 (25 سم 2 ) قارورة زراعة الأنسجة عندما 80٪ متموجة ( الشكل 2B ). الخلايا الليفية تصل عادة 80٪ كونفلنسي في غضون 7 أيام. ومع ذلك، فإن الوقت المطلوب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ولكن ينبغي أن لا تتجاوز 4 أسابيع.
    1. نضح المتوسطة وغسل مرة واحدة مع 2.5 مل من دبس.
    2. إزالة دبس وإضافة 1 مل من التربسين-إدتا (0.05٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تظهر خلايا حواف مدورة والبدء في فصل.
    3. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة، إذا لزم الأمر شطف الخلايا ضمان ديسوسوسياتيون السليم للخلايا. نقل محلول الخلية إلى أنبوب 15 مل وطرد مركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    4. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من الخلايا الليفية المتوسطة والخلايا الليفية لوحة فيعلى المغلفة الخلية زراعة الأنسجة T25 قارورة. عند توسيع الخلايا الليفية بعد هذه الخطوة، فصل كما هو موضح أعلاه والبذور 12 × 10 3 خلايا / سم 2 .
    5. مرة واحدة الخلايا متموجة جاهزة للتجميد، توسيع أو لوحة لإعادة البرمجة. تجميد أسفل جولتين من الخلايا الليفية قبل بدء أي إعادة برمجة (الرجوع إلى القسم التالي لتجميد الإجراء). كفاءة إعادة البرمجة هي عادة أعلى للالألياف الليفية مرور أقل، والخلايا في مرور 2 - 4 هو الأمثل. ومع ذلك، تمت إعادة برمجة ناجحة من الخلايا الليفية تصل إلى مرور 10 باستخدام هذا البروتوكول.
  4. تجميد والذوبان في الخلايا الليفية
    1. إعداد الخلايا الليفية الطازجة تجميد المتوسطة: 90٪ فبس + 10٪ ديميثيلسولفوكسيد (دمسو). إبقاء في 4 درجات مئوية ( الجدول 1 ). مرة واحدة متموجة، يمكن تجميدها قارورة ثقافة الأنسجة T25 في ثلاثة كريوفيالز. إعداد 500 ميكرولتر من الليفية تجميد المتوسطة في قارورة المجمدة.
    2. لتجميد الخلايا، فصل cكما هو موضح في الخطوة 1.3، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ونقل أجزاء من 3 × 10 5 خلايا إلى أنابيب 15 مل. تدور أنابيب في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف.
    3. ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميكرولتر من 4 ˚C الليفية تجميد المتوسطة ونقلها إلى كريوفيالز. وضع قارورة في حاوية تجميد واحتضان الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    4. لذوبان الجليد الخلايا، غمر الجزء السفلي من كريوفيال في 37 درجة مئوية الماء. مرة واحدة المسال، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من المتوسطة الليفية. تدور الخلايا 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    5. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من الألياف الليفية المتوسطة. نقل الخلايا إلى غير المغلفة T25 قارورة زراعة الأنسجة واحتضان في 37 درجة مئوية.

2. سيف ناقلات إعادة برمجة الخلايا الليفية

  1. إعداد أليكوتس ناقلات تنبيه: التعامل مع سيف تحت الاحتواء 2 السلامة الأحيائية. الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة والمبادئ التوجيهية المحلية 17 . عيار الفيروسات يختلف بين دفعات.
    1. قبل إعداد أليكوتس حساب كمية ناقلات اللازمة لخلايا 5 × 10 4 وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة (على سبيل المثال ، سايتوشن 2.0). عيار الفيروس يختلف عموما من 8 × 10 7 - 1.5 × 10 8 . ذوبان الجليد والجمع بين ناقلات 5: 5: 3 (كوس موي = 5، هك-ميك موي = 5 و hKlf4 = وزارة الداخلية 3). جزء المبلغ المحسوب لإعادة برمجة 5 × 10 4 خلايا في أنابيب تعقيمها 1.5 مل. تمييع فيروس قسامة مع الليفية المتوسطة إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر لإعادة البرمجة.
      ملاحظة: كل قارورة صالحة لإعادة برمجة بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع 5 × 10 4 الخلايا الليفية. تخزين أليكوتس الفيروس في -80 درجة مئوية.
  2. سيف، سهم التوجيه، ترانزدوكشيون
    1. نضح الخلية الخليةلتر وتغسل مع 1 مل من دبس. نضح دبس وإضافة 1 مل من التربسين-إدتا (0.05٪). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يتم فصل الخلايا.
    2. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية و ريسوسبيند الخلايا ونقل إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    3. نضح طاف و ريسوسبيند بيليه في 2 مل من الليفية المتوسطة.
    4. عد الخلايا الليفية باستخدام عدادة الكريات والبذور 5 × 10 4 خلايا في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    5. نضح وسط ثقافة الخلية، إضافة 250 ميكرولتر من حل سيف واحتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. تغيير المتوسطة يوميا إلى المتوسطة الليفية الطازجة. السماح الخلايا ترانسدوسد أن تنمو لمدة 7 أيام قبل أن يتم تمريرها إلى لوحات المغلفة لن-521. إعداد لوحات لن-521 في اليوم قبل مرور. راجع 2.3.1 لإجراء الطلاء.
  3. ريبلاتينغ من الخلايا الليفية ترانزدوسد
    1. إعداد LN-521 الأطباق المغلفة: تمييع لن-521 في دبس إلى تركيز النهائي من 0.63 ميكروغرام / سم 2 . ماصة 2 مل من حل لن-521 لكل 60 ملم طبق الثقافة الأنسجة. ختم 60 ملم طبق الثقافة الأنسجة باستخدام بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد أسيكتس الأساسية 8 (E8) المتوسطة لتسهيل التعامل معها: 48.5 مل من E8 المتوسطة، 1 مل من الملحق E8 و 500 ميكرولتر من الآفات ( الجدول 1 ).
    3. 7 أيام بعد تنبيغ، مرور الخلايا إلى لن-521 المغلفة 60 ملم الأنسجة طبق الثقافة. إضافة 250 ميكرولتر من التربسين-إدتا (0.05٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى فصل الخلايا. إضافة 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة وخلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
    4. نضح طاف. ريسوسبيند بيليه في 2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة وعد الخلايا في عدادة الكريات. نضح حل لن-521 من لوحة بريكوات والبذور 4 × 10 4 خلايا في 5ML المتوسطة الليفية في ل-521 بريكواتد طبق 60 ملم. إضافة رو-كيناز المانع Y-27632(روكي) إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. الأهم من ذلك، في اليوم التالي، تغيير المتوسطة إلى E8 المتوسطة. تغيير E8 المتوسطة يوميا. ستظهر المستعمرات خلية هيبس في غضون 2-3 أسابيع.

3. اختيار المستعمرات وتوسيع الخلايا هيبس

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية خارج مجلس الوزراء السلامة الأحيائية تحت المجهر ستيريو. ويوصى باستخدام أقنعة هيرنيت والأجراء. العمل بعناية لا تلوث ثقافة الخلية.

  1. إعداد لن-521 الثقافة الأنسجة المغلفة لوحات 24 جيدا في اليوم قبل التقاط. تمييع لن-521 في دبس 0.63 ميكروغرام / سم 2 . ماصة 250 ميكرولتر من حل لن-521 في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. ختم لوحات باستخدام بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: المستعمرات على استعداد ليتم اختيارها عندما تصل إلى حجم> 1 ملم في القطر. وينبغي للمستعمرات عرض حواف حادة وتنمو في مون متجانسةأولايرس ( الشكل 2D ).
  2. نضح حل لن-521 وإضافة 500 ميكرولتر من E8 في بئر واحدة من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
  3. قطع المستعمرات إلى قطع أصغر مع مشرط في شبكة مثل نمط تحت ستيريوميكروسكوب. كشط ميكانيكيا صفائح الخلية من الطبق ونقل الأوراق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر إلى جيدا أعدت ( الشكل 2D -2E ). اختيار المستعمرات في آبار منفصلة.
  4. السماح للخلايا لإرفاق دون تغيير المتوسطة لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، تغيير E8 المتوسطة يوميا.
  5. عندما وصلت المستعمرات إلى حجم> 5 ملم، خلايا مرور الأنزيمية كخلايا واحدة لبئر جديد من لوحة المغلفة لن-521.
  6. نضح وسط زراعة الخلايا من الخلايا ويغسل مع 250 ميكرولتر من دبس.
  7. نضح دبس. إضافة 250 ميكرولتر من كاشف التفكك واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. لاحظ أن الخلايا قد بدأت في الاقتراب. فصلالخلايا من لوحة عن طريق الشطف الخلايا مع كاشف التفكك عدة مرات.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من E8 المتوسطة إلى أنبوب 15 مل. نقل الخلايا في كاشف التفكك إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  10. نضح حل لن-521 من بريكواتد لن-521 جيدا وإضافة 500 ميكرولتر درجة حرارة الغرفة E8 المتوسطة.
  11. نضح طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من E8 المتوسطة.
  12. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور 2.5 × 10 4 - 5 × 10 4 خلايا في أعدت جيدا لن-521 بريكواتد جيدا (1.25 × 10 4 - 2.5 × 10 4 خلايا / سم 2 ). يمكن بسهولة تنسيق ثقافة الخلية أن تطوى لتتناسب مع الغرض المقصود.
  13. إضافة روكي إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  14. تغيير E8 المتوسطة يوميا. الخلايا عادة ما تكون جاهزة للمرور بعد 4-6 أيام. إنزيماتيكال مرور الخلايا كخلايا واحدة كما هو موضح أعلاه عندما حوالي 90٪ متموجة.
    ملاحظة: يتم تخفيف ناقلات إعادة برمجة تدريجيا خلال توسع الخلايا هيبس وغير قابل للكشف بعد مرور 12. الخلايا التي يتم برمجتها بشكل محايد تتوقف عادة تتكاثر حول مرور 6-10 أو تفقد خصائصها متعددة الخلايا الجذعية مورفولوجيا ( الشكل 3B ).
  15. تجميد وذوبان الخلايا هيبس
    1. لتجميد الخلايا، إنزيمي فصل الخلايا كخلايا واحدة كما هو موضح أعلاه، عد الخلايا في عدادة الكريات ونقل 2.5 × 10 5 خلايا إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 1 مل من E8 المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 250 ميكرولتر من 4 درجة مئوية بسك كريوميديوم ونقل إلى كريوفيال. وضع قارورة في حاوية تجميد واحتضان الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    3. لذوبان الخلايا، وإعداد بريكواتد لن-521 جيدا من الأنسجة الأنسجة 24 جيدالوحة عن طريق الشفط حل لن-521 وإضافة 250 ميكرولتر من E8 المتوسطة. غمر الجزء السفلي من كريوفيال في 37 درجة مئوية الماء حتى يبقى سوى جليد صغير.
    4. إضافة 250 ميكرولتر من E8 المتوسطة إلى كريوفيال ونقل خلية تعليق إلى أنبوب 15 مل وإضافة 1 مل من E8 المتوسطة. تدور الخلايا 300 x ج لمدة 3 دقائق.
    5. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 250 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة E8 المتوسطة. نقل تعليق الخلية إلى بئر المعدة وإضافة 1٪ خلية تكملة بقاء أو 10 ميكرومتر روكي. احتضان لوحة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من خزعة إلى خلايا هيبس

العملية برمتها من خزعة إلى خلايا هيبس أنشئت، واضحة من إعادة برمجة ناقلات وجاهزة لتوصيف، يستغرق حوالي 16 أسبوعا ( الشكل 1 ). ويرد جدول زمني أكثر تفصيلا في الشكل 2A . هناك حاجة إلى حوالي 4 أسابيع لإنشاء وتوسيع الثقافات الليفية. بدأت مستعمرات الخلايا هيبس الأولى في الظهور حوالي ثلاثة أسابيع بعد سينداي ناقلات ناقلات. تم اختيار المستعمرات ميكانيكيا للمرور الأول ثم عبث إنزيميا كخلايا واحدة.

إنشاء الثقافات الليفية البشرية

عندما نمت الثقافات الليفية البشرية إلى كونفلنسي وعرض مورفولوجيا مقبولة، تم توسيعها لأول مرة وتجميد لمدة اثنين باساجإس قبل مطلية بالتنبيغ ( الشكل 2B ).

إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية باستخدام ناقلات سيف

تم العثور على مستويات متزايدة من موت الخلايا في الأيام التالية لانتاج سيف وقد لوحظت تغييرات طفيفة في التشكل الليفي. تم الكشف عن ظهور المستعمرات هيبس الأولى من يوم 12 بعد تنبيغ ( الشكل 2A ، 2C ). كان من المتوقع المستعمرات على أن يتم انتقاؤها حوالي ثلاثة إلى 4 أسابيع بعد تنبيغ ( الشكل 2A ، 2D ). الخلايا البذر في المبالغ المحددة في هذا البروتوكول أدى إلى وفرة من المستعمرات الناشئة (<20). انتقاء انتقائي من المستعمرات عرض التشكل مواتية ويوصى. ملامح المستعمرة المفضلة شملت كتلة مدمجة الخلايا المسطحة، والنمو كما الطبقات الأحادية متجانسة، تمييز إيندي خلايا فيدوال مع حافة حادة نحو الخلايا الليفية المحيطة ( الشكل 2D ). تم قطع المستعمرات خلية هيبس في نمط تشبه الشبكة باستخدام مشرط وميكانيكيا باساجيد ( الشكل 2E ). تركت استنساخ هيبس اختار لمدة 48 ساعة على الانضمام إلى لوحة دون تغيير متوسط. كانت استنساخ الخلايا هيبس متجانسة للغاية ولكن تم التغاضي عن عدد قليل من الخلايا الليفية الناشئة من لوحة إعادة البرمجة خلال المقاطع الأولين ( الشكل 2F ). انتقاء المستعمرات مع الحدود شرسة وكبيرة غير متجانسة كتلة الخلايا غير متجانسة ينبغي تجنبها ( الشكل 2G ). الحصول على خطوط الخلايا هيبس نمت كما الطبقات الأحادية الكثيفة، مع نسبة نواة كبيرة إلى السيتوبلازم وحددت حدود الانارة. في المقابل، التمسك المستعمرات غير متجانسة التي لم تفي بهذه المعايير تم تجاهلها ( الشكل 2H ) لتجنب الثقافات من السكان الخلية مختلطة.

p "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> التحقق من صحة استنساخ الخلايا هيبس

تم إجراء توصيف متعدد الخلايا للخلايا المستمدة بعد فقدان ناقلات سيف و كان الحفاظ على الحالة المحفزة مدفوعا بالتعبير عن العوامل الذاتية. قبل الشروع في التحقق من صحة الخلية هيبس، تأكد من فقدان التعبير ناقلات سيف. بعد هذا البروتوكول، سيف الحمض النووي الريبي ناقلات لم يعد كشفها عن طريق مرور 12 وفقا لتجربتنا، وبالتالي نقطة انطلاق مناسبة لتوصيف ( الشكل 3A ). تلطيخ إمونوسيتوشيميستري للعلامات متعددة القدرات OCT4، SSEA4 و نانوغ يجب أن تسفر عن نتيجة إيجابية متجانسة ( الشكل 3B ). تم تجاهل الثقافات خلية تحتوي على خلايا برمجتها جزئيا التي لم تعبر عن عوامل تعدد القدرات ( الشكل 3C ). ويظهر التعبير مرنا من الجينات متعددة القدرات الذاتية من قبل الوقت الحقيقي بيسي R (رت-ير) في الشكل 3D .

وينبغي أن تكون الخلايا الجذعية المحفزة قادرة بسهولة على التفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث. تم تقييم الخلايا هيبس التمايز المحتملة من خلال تشكيل الهيئات إمبريويد (إب) 18 . وتظهر إبس العائمة الحرة التي تم إنشاؤها من خلايا هيبس في الشكل 3E والتعبير مرنا من علامات محددة طبقة جرثومية بعد 21 يوما من التمايز إب هو ممثل في الشكل 3F .

شكل 1
الشكل 1: مخطط تدفق من خزعة الجلد إلى خلايا هيبس.
نظرة عامة على الخطوات الرئيسية في البروتوكول. ويشمل الرسم التوضيحي جمع الخزعة، عزل الخلايا الليفية، تنبيغ سيف، اختيار المستعمرات والتوسع النسيلي للخلايا هيبس.e.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الخطوات الحاسمة في توليد خلايا هيبس.
(A)
الجدول الزمني تسليط الضوء على نقاط زمنية مهمة في البروتوكول بما في ذلك الطلاء الليفية، سيف تنبيغ، والتغيرات المتوسطة والطلاء. يتم تمييز مرور 12 من خلايا هيبس كبدء تجارب التوصيف. (B) صورة حقل مشرق من الخلايا الليفية متموجة في الثقافة مع التشكل النموذجي. (C) ظهور المستعمرات خلية هيبس من الخلايا الليفية ترانسدوسد. (D) على استعداد لاختيار مستعمرة عرض ميزات تفضيلية، بالارض كتلة الخلايا المدمجة، والخلايا الفردية مميزة مع حواف حادة نحو الخلايا الليفية المحيطة (ممر 0). (E) هيبسيتم قطع مستعمرات الخلايا في نمط تشبه الشبكة وممرات ميكانيكيا . (F) مستعمرة مستعمرة بعد بضعة أيام من النمو. وتحيط الخلايا هيبس التمسك عدد كبير على نحو غير عادي من الخلايا الليفية التي تنشأ من لوحة إعادة البرمجة. يمكن كشط الخلايا الليفية من لوحة وسوف تختفي على الأرجح مع ممرات خلايا واحدة لاحقة (مرور 1). (G) المستعمرات عرض مورفولوجيا لا تذكر الخلايا المبرمجة تماما. الحدود الشديدة، كتلة غير متجانسة كتلة غير متجانسة كبيرة. (H) صورة الحقل مشرق تجسد مرور مبكر متجانسة خط الخلية هيبس برمجتها بالكامل بالمقارنة مع خط الخلية غير متجانسة للغاية. وتشير الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 الشكل 3: توصيف الخلايا هيبس.
(A)
رت-ير من ناقلات سيف علامات محددة. هيبس الخلايا في مرور 3 تستخدم السيطرة الإيجابية ل فيكتورسكل إعادة البرمجة. في مرور 12 خلايا هي سلبية للتعبير عن علامات محددة فيروس سينداي العمود الفقري محددة (سيف B)، سينداي محددة KLF4 (KLF4 سيف)، سينداي محددة كميك (كميك سيف)، ومراقبة ير (غابد) وليس قالب (-). (ب) مثال ممثل من إعادة هيكلة تماما خط الخلية هيبس متجانسة في مرور 12. صورة حقل مشرق من خلايا هيبس تكشف الخلايا تنمو في مونولايرز ضيقة مع حواف لومينيسينغ حادة ومع نوى كبيرة وسيتوبلازم صغير. تلطيخ إمونوسيتوشيميستري من علامات تعدد القدرات OCT4، نانوغ، SSEA4، وتلطيخ النووية 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) مما يدل على التعبير الإيجابي متجانس. (C) خط الخلية عرض التعبير غير متجانسة للعلامة متعددة القدرات نانوغ. الثقافةه يحتوي على خلايا تمت إعادة برمجتها جزئيا ويجب التخلص منها. (D) رت-ير التعبير مرنا من علامات تعدد القدرات نانوغ، OCT4، التحكم ير (غابد) وليس قالب (-) مما يدل على التعبير عن علامات تعدد القدرات. (E) حرة الأجسام العائمة الطافية المتولدة من خلايا هيبس. (F) رت-ير بعد 21 يوما من التمايز الجسم الجنيني تبين أن الخلايا هيبس المستمدة قادرة على التمايز إلى الطبقات الجرثومية الثلاث. علامات إندوديرمال أف و GATA4، علامات الأديم المتوسط ​​رونكس و HAND1، علامات الأدمة نكام و نستين، التحكم ير (غابد) وليس قالب (-). وتشير الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو الجيل الناجح لعدة خطوط الخلايا هيبس المستمدة كلونالي. الأهم من ذلك، فإن طريقة لصيانة وتوسيع خلايا هيبس أنشئت هنا هو موثوق بها ويمكن أن يؤديها مع القليل من الخبرة السابقة من ثقافة الخلايا الجذعية. ومن المعروف أن الأنزيمية خلية واحدة الممرات مع روكي جنبا إلى جنب مع مصفوفة لن-521 للحفاظ على الخلايا كما طبيعية كاريوتيبتيك، متعددة القدرات وقادرة بسهولة على التفريق مع تجنب عدم التجانس التي يسببها المستعمرة باسد الممهدة يمكن أن تحفز 10 ، 19 ، 20 . خلايا هيبس مثقف على لن-521 يمكن أن يمر كخلايا واحدة دون إضافة روكي 10 ، ولكن إضافة روكي يجعل البروتوكول أسهل للمعالجات أقل خبرة ويقلل من الوقت اللازم ل هيبس اشتقاق الخلية.

كفاءة إعادة البرمجة هي غيشفويا ليست قضية مع هذا البروتوكول. ناقلات سيف لديها كفاءة برمجة عالية نسبيا> 1٪ للألياف الليفية 11 . ومن المتوقع ظهور وافر من المستعمرات (<20). فمن المستحسن لاختيار ثلاثة أضعاف عدد المستعمرات اللازمة. وقد لوحظ أن جزء من الحيوانات المستنسخة اختار فشل في الانضمام بعد قطف. ويمكن أيضا أن تكون هناك حاجة لمستعمرات إضافية للتعويض عن المستعمرات التي أعيد برمجتها جزئيا. إن المستعمرات التي تمت برمجتها جزئيا تكون في بعض الحالات قادرة على الالتزام والنمو المدعومة بالتعبير الخارجي للجينات متعددة القدرات عن طريق ناقلات سيف. كما يتم تخفيف ناقلات سيف، وهذه الخلايا تتوقف تكاثر وفصل، وعادة ما تكون واضحة حول مرور 6-8. عدم التجانس الثقافة هو أيضا علامة على إعادة برمجة جزئية وينبغي تجاهل خطوط غير متجانسة ( الشكل 2H ).

الخيار الأمثل لإعادة برمجة ناقلات وظروف الثقافة يعتمد علىالغرض من الخلايا ولدت. ومع ذلك، لتجنب الفروق دفعة إلى دفعة التأثير على النتائج، يوصى الظروف المحددة. ويقترح اختيار نظام ناقلات غير التكامل للحفاظ على سلامة الجينومية من الخلايا المعاد برمجتها. تم اختيار ناقلات سيف في هذا البروتوكول بسبب متانة، وكفاءة عالية نسبيا وانخفاض اليدين في الوقت المطلوب. يتم تخفف ناقلات سيف خلال انقسامات الخلية وغير قابلة للكشف عن مرور 12، وبالتالي ضمان أن البيانات التي تم إنشاؤها لا يتأثر التعبير الخارجي. بسبب مطالب دقيقة وضعت على الخلايا المعدة لأغراض سريرية، سيف إعادة البرمجة يمكن أن يكون عائقا أمام الترجمة السريرية منذ إثبات أن سفك كاملة من جميع المواد ناقلات أمر صعب. مرنا بوساطة إعادة البرمجة يمكن أن تكون مفيدة إذا اشتقاق الخلايا مع الاستخدام المقصود في العلاجات الخلوية 12 . غير أن هذه الأساليب أكثر كثافة في اليد العاملة وأكثر تعقيدا لاستخدامها 21 . الطريقة هنا ديمكتوبة لثقافة الخلايا الليفية هي أيضا غير مناسبة للتطبيقات السريرية. كما فبس والجيلاتين هي زينوجينيك و وندفيند، والنظر في تحويل هذه إلى تعريف منتجات خالية من شينو 22 .

ويوصى تقنيات المعالجة المعقمة واختبار العدوى الميكوبلازما العادية أثناء العمل مع أي شكل من أشكال زراعة الخلايا. الجلد البشري يحتوي على العديد من الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تزدهر في ظروف يتم زراعة الخلايا في إذا لم يتم التعامل معها بشكل صحيح. ولذلك فمن المستحسن أن تكون أكثر يقظة في التعامل مع خزعات الجلد وخلال الأيام الأولى من الثقافة بعد معالجة الخزعة. إنشاء ثقافة الخلايا الليفية من خزعات الجلد هو، في الواقع، عملية تستغرق وقتا طويلا. بعد معالجة خزعة الجلد، سيكون هناك في البداية علامات ضعيفة من الخلايا الليفية التمسك، وبالتالي الانتظار أسبوع واحد على الأقل للعثور على عدد قليل من الخلايا الليفية عرض التشكل المتوقع في الثقافة. الوقت اللازم لإنشاء الخلايا الليفيةفي الثقافات في المختبر من الخزعات تعتمد على مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك حجم الخزعة، سن المانحين وكيف تم التعامل مع الخزعة منذ أن اتخذت. ويفضل إعادة برمجة الخلايا الليفية في مرحلة مبكرة للحصول على أفضل كفاءة لإعادة البرمجة 23 .

وباختصار، نحن هنا تصف طريقة قوية وسهلة الاستخدام لتوليد خلايا هيبس متجانسة للغاية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل سف (B13-0074) و فينوفا (2016-04134) وكلاء التمويل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1, (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17, (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18, (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3, (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28, (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17, (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11, (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17, (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6, (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33, (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15, (1), 254-262 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics