小鼠横主动脉狭窄诱导左心室肥厚的技术研究

Medicine

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Summary

本议定书的目的是描述 step-by 微创的横向主动脉狭窄 (TAC) 技术的小鼠。通过消除气管插管和通气是常用的标准程序的强制性, 微创 TAC 简化了手术程序, 减少了对动物的压力。

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Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. J. Vis. Exp. (127), e56231, doi:10.3791/56231 (2017).

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Abstract

小鼠横主动脉狭窄 (TAC) 是压力超负荷所致左心室肥厚的实验研究和心力衰竭进展的最常用的外科技术之一。在大多数报告的调查中, 这一程序是用插管和通气的动物进行的, 这使得它要求和耗时, 并增加了对动物的外科负担。本协议的目的是描述一个简单的技术, 无插管和通气小鼠微创 TAC。强调了该技术的关键步骤, 以达到低死亡率和高效率的诱导肥厚。

雄性 C57BL/6 小鼠 (10 周大, 25-30 克, n=60) 被麻醉, 单腹腔注射氯胺酮和嗪的混合物。在一个自发呼吸的动物在3-4 毫米上部部份胸骨之后, 6/0 丝缝线穿线通过结扎援助的眼睛通过在主动脉弓之下和栓在一条钝的27测量针。假手术的动物进行了相同的外科准备, 但没有主动脉收缩。该程序在诱导肥厚中的疗效证实了心脏/体重比的显著增加。这个比率在 3, 7, 14 和28在手术以后获得 (n = 6-10 在每个小组和每个时间点)。运用我们的技术, 在 TAC 中观察到7天28的假动物的肥厚。手术和晚 (超过28天) 死亡率都非常低, 在1.7%。

总之, 我们的小鼠微创 cost-effective 技术具有非常低的手术和术后死亡率, 是高效的诱导肥厚。它简化了手术过程, 减少了对动物的压力。通过遵循本协议中描述的关键步骤, 可以很容易地执行该操作。

Introduction

在过去的几年中, 心力衰竭的研究已经在可行的动物模型中进行了1。与大型动物模型的心力衰竭相比, 小动物模型有许多潜在的优势。除了低成本的住房和维修, 小动物模型可以访问更多的研究人员, 由于不太复杂的设施需要2

小鼠心力衰竭模型提供了许多相同的优势, 与老鼠模型。除了减少的住房成本3, 鼠标模型受益于相关的转基因和淘汰赛 (KO) 菌株的可用性。细胞类型特异、诱导性 KO 或转基因策略的可能性使小鼠成为研究心力衰竭发病机制的宝贵工具, 并尝试识别新的治疗方案3

在目前使用的心力衰竭的小鼠模型中4中, 首次用人5描述的横主动脉收缩 (TAC) 是产生压力超负荷引起的左心室肥厚 (肥厚)1的首选模型。,3. 该模型的最大优点是能够允许左心室肥厚的分层, 尽管在不同的小鼠品系中, 对 TAC 的反应是可变的.特别是, C57BL/6 小鼠发展快速 LV 扩张后, TAC 可能不会发生其他菌株4,6,7

在2周内, 以 TAC 引起的高血压的突然发作使 LV 肿块增加约 50%, 从而可以快速检查旨在调节左心室肥厚4发育的药理或分子干预活动。急性高血压的 TAC 不完全再现左心室肥厚和重构观察在主动脉狭窄或动脉高血压的临床设置。然而, 该模型被许多研究者用来识别和修改心力衰竭的新治疗指标4

执行 TAC 在小鼠需要更大的手术经验比其他技术所需的诱导肥厚和随后心力衰竭2。大多数作者执行此过程的插管和通风的动物2,8, 这使得这个过程更苛刻和耗时, 并增加了对动物的外科负担。只有很少的调查人员在他们的研究中使用了微创的 TAC, 简要地参考了手术过程9,10,11

本议定书的目的是描述 step-by 一步简化和 user-friendly 的小鼠横主动脉狭窄的技术, 突出了程序的关键阶段。通过遵循这些关键步骤, 可以轻松地执行此项技术。

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Protocol

该协议中使用了

雄性 C57BL/6J 鼠 (10 周, 25-30g, n=60)。根据法国农业部和高等教育和研究部制定的准则, 动物接受人道护理, 所有程序都按照欧洲共同体理事会1986年11月24日的指示执行 (86/609/欧洲经济共同体) 和法国法律。该议定书得到了 #34 的批准; 动物实验 CREMEAS 和 #34 区域伦理委员会; (#2016092816207606).

1. 手术准备

  1. 在到达动物设施后一周内, 在标准的笼子里, 用12小时/12 小时的光照/黑暗周期, 用食物 (详见材料表) 和可用的水来维护小鼠。随意 .
  2. 在手术当天, 将小鼠放在单独的笼子里, 在麻醉诱导前几分钟, 以避免对动物造成任何额外的压力。手术前一天对所有手术器械进行消毒.
  3. 注射 intra-peritoneally 单剂量氯胺酮 (51.4 毫克/千克) 和嗪 (3.3 毫克/千克) 稀释盐水溶液 (0.9% NaCl).
  4. 在没有脚趾后退反射的情况下确保麻醉的深度.
  5. 用市面上可用的剃须刀剃掉动物的颈部和胸部, 用70% 酒精消毒剃须的区域.
  6. 将动物仰卧在干净的软木工作台上, 并用胶带固定爪子.

2。外科手术

  1. 无菌外科技术在整个过程中使用。在一个自发呼吸的动物, 执行纵向中线颈部切口超过10毫米与11刀片刀从上部胸骨切口到 mid-chest 为了暴露胸骨 ( 图 1 ).
  2. 通过一个4/0 单丝聚丙烯保持缝线与一个克瑞理木针持有人, 并将其贴在工作台上, 以收回甲状腺.
  3. 将 pre-tracheal 肌肉与微外科钳分开, 以发现气管.
  4. 在气管和胸骨后的闭合颚上轻轻滑动平滑倾斜的微外科钳.
  5. 通过仔细地打开和关闭光滑倾斜的弯曲显微外科钳的颌骨, 在 pre-tracheal 肌肉和胸骨后进行钝性解剖, 将胸膜移开.
  6. 抓住右锁骨上的肌肉与光滑的直微外科钳, 并轻轻拉起动物的胸部.
  7. 在胸骨下滑动骨钳的下颚, 并执行 3-4 mm 上部部分胸骨 ( 图 2 )。将胸骨的下部稍稍朝左.
  8. 通过7/0 单丝聚丙烯保持缝线从内到外通过胸骨两侧的第二个肋间空间使用微外科针持有人。靠近肋骨-胸骨角, 避免肋间和胸廓内血管或胸膜损伤.
  9. 在每一侧使用7/0 单丝聚丙烯保持缝线将胸骨边缘展开, 并用胶带将其固定在工作台上.
  10. 在低功耗放大 (2-3X) ( 图 3 ) 的条件下, 使用平滑的弯曲显微外科钳将 pre-tracheal 肌、纵隔脂肪和胸腺的部位轻轻移开, 以可视化主动脉弓。注意不要接触或损伤壁胸膜, 以防气胸的发展.
  11. 通过结扎钳 ( 图 4 A ) 将主动脉弓下的软组织露出, 轻轻地张开它的颚。在软组织中, 通过轻轻地打开和闭合颌骨, 在主动脉弓下的软组织下准备一条隧道.
  12. 通过结扎辅助的眼睛 ( 图 4 B ) 在主拱下的左侧传递6/0 丝线结扎的片段, 并通过在右手之间的绑钳进行检索。右无名和左颈共同动脉 ( 图 5 ).
  13. 将一根27口径的针切割成5毫米的长度, 然后用克瑞理针钳将其两端钝。将钝的27口径针放在主动脉弓 ( 图 6 ) 旁边, 用平滑的直微手术钳将缝合线紧贴在针和主动脉之间, 右无名和左颈共同使用两个结扎钳的动脉 ( 图 7 )。为了紧贴缝合, 执行一个初始的双结, 后跟四额外的结。确保所有节点都是平坦的.
  14. 结扎后, 快速移除针头, 以达到0.4 毫米直径缩小和可重复的横向65-70% 主动脉收缩.
  15. 检查腹主动脉弓周围软组织的止血, 胸骨边缘和 pre-tracheal 肌。在观察血液渗出的地方, 放可止血纱布。取下7/0 单丝聚丙烯保持缝合线用于胸骨边缘的传播.
  16. 通过一个简单的6/0 单丝聚丙烯缝合线与微外科针持有人从外部到左第二肋间空间, 然后从内到外的右第二肋间空间。靠近肋骨-胸骨角, 避免肋间和胸廓内血管或胸膜损伤.
  17. 将6/0 单丝聚丙烯缝合线与克瑞理木针夹合在一起, 将胸骨边缘拼接在一起.
  18. 用5/0 单丝聚丙烯纤维在一层中用克瑞理-木针夹紧皮肤.
  19. 执行与收缩操作相同的假程序, 但不在主动脉周围绑缝合.

3。术后恢复

  1. 非常密切地监视动物. #160; 将鼠标转移到单个的笼子, 并将其置于俯卧位置.
  2. 允许鼠标在变暖光下恢复, 直到完全清醒 (在诱导麻醉后不到1小时).
  3. 为术后镇痛, 注入0.1 毫克/千克丁丙诺啡腹腔. 和 #160; 重复皮下注射0.1 毫克/千克丁丙诺啡每8小时, 在前三天表明.
  4. 将操作的小鼠放在标准笼子里 (每个笼子最多3只老鼠, 每个笼子至少2只老鼠).

4。心脏收获

  1. 在分析的当天, 安乐用氯胺酮300毫克/千克和嗪20毫克/千克的溶液进行腹腔注射.
  2. 首先从下腔静脉采集血液, 然后通过同一条线在盐水中注入5毫升的2.6 毫米 EDTA 溶液.
  3. 收获心脏, 去除心房和重量心脏 (左和右心室没有心房).
  4. 将左侧与右侧 ventr 分开icle 与左心室部分残余的隔膜。称量两种组织标本, 并将其冷冻在液氮中.

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Representative Results

手术和晚期生存
手术的生存是非常高的, 98.3% (59 出 60) 为整个系列 (TAC 和假操作的动物)。唯一的手术死亡是由于一个小鼠的出血并发症, 计划为假手术。术后存活28天的观察期也很好, 98.3% (58 出 59)。唯一的晚术后死亡发生在一天 (D) 16, 可能是心脏起源的 TAC 鼠标。

技术验证
所提出的技术是非常可靠和重现性。在所有接受 TAC 的动物中, 正确的无名和左颈总动脉之间的缝合位置得到了确认。

通过测定3、7、14、28天的心脏重量/体重比值 (硬件/BW、镁/克), 验证了该技术对诱发左心室肥厚的后。硬件是左、右心室的重量, 没有心房。与术后 D7 (4.9±0.2 vs 4.1±0.05 毫克/克, p & #60; 0.01) 上的假组相比, 在条纹上的硬件/BW 比值显著增加, 并保持显著高于 D28 (5.8±0.3 vs 4.1±0.1 毫克/克, p & #60; 0.0001)后 (图 8)。观察到的增加的硬件/BW 比是完全由于左心室/体重比 (图 9a) 的上升, 因为右心室/体重比仍然是 TAC 和假操作动物在整个观察中的比较期间 (图 9B)。

此外, 我们在左心室组织中测量了心肌肥大的标志物的 mRNA 表达, 如前所述12。在 D14, 脑利钠蛋白 (BNP)、心房利钠蛋白 (ANP)、血管紧张素转换酶 (ACE)、胶原 1a1 (Col1a1) 和转化生长因子? (TGFß) 的 mRNA 表达明显高于假操作的动物 (图 10)。因此, 观察到的左心室肥厚验证了我们的 TAC 技术的效率。

用 one-way 方差分析和 Bonferroni 的事后试验对配对数据进行比较, 比较 TAC 和假组均值的平均值和标准误差。

Figure 1
图 1: 切口.
皮肤被切割超过10毫米从胸骨切口到 mid-sternum 和甲状腺被缩回与逗留缝合。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 骨钳.
该仪器允许在骨头上短而精确地切割3-4 毫米上部偏高级胸骨。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 曝光.
在胸骨边缘的缩回与7/0 中止缝合之后, 主动脉弓, 右无名和左颈总动脉与气管一起被暴露。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 结扎钳.这些钳是必要的, 以执行一个温和的和钝性解剖后, 胸骨和周围的主动脉弓。B. 结扎辅助.这是一个关键的工具, 以实现一个微妙的和创伤的通道下主动脉弓在 TAC 和假手术的小鼠。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 主动脉弓下的通道.
6/0 丝结扎的一部分是通过在主动脉弓下使用结扎援助, 并放置在右无名和左颈总动脉。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 结扎的准备.
短段2-3 毫米的钝27口径针被放置在主动脉弓上。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 横向主动脉收缩.
用结扎钳将丝线缝合在右侧无名和左颈总动脉之间的针和主动脉弓上。而不是聚丙烯缝合线是首选的主动脉结扎, 因为结将更好地举行。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 横向主动脉狭窄的验证.
与假手术 (白棒) 小鼠相比, 带状 (黑条) 的心脏重量/体重比明显增加, 通过微创的横向主动脉狭窄诱导心肌肥大。心脏肥大已经出现在 D7 术后, 并逐步增加, 随着时间的推移, 以 D28 (n=6-10 每组. ** 和 #60; 0.01, *** 和 #60; 0.001, *** 和 #60; 0.0001)。数据显示为平均± SEM (误差线)。请求se 点击这里查看更大版本的这个数字。

Figure 9
图 9: 左 (a) 和右 (B) 心室/体重比.
在观察期间, 左心室/体重比增加, 而右心室/体重比在 TAC (黑酒吧) 与假手术 (白酒吧) 动物的比例保持相似。这证实了左心室肥厚, 在右心室没有改变, 并加强了我们的技术验证 (n=6-10 每组. ** 和 #60; 0.01, *** 和 #60; 0.001, *** 和 #60; 0.0001)。数据显示为平均± SEM (误差线)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 10
图 10: BNP-mRNA 表达式.
脑钠蛋白 (BNP)、心房利钠蛋白 (ANP)、血管紧张素转换酶 (ACE)、胶原 1a1 (Col1a1) 和转化生长因子? (TGFß) 的 mRNA 表达, 主动脉带状心肌肥厚的阳性对照研究 (黑酒吧)vs 假动物 (白吧) (每组 n=6) 在 D14。表达式被计算为 2(-ΔCt) , 其中校准器是 Gapdh 参考基因的 mRNA 水平。数据显示为平均± SEM (误差线)。* p & #60; 0.05, *** 和 #60; 0.01, ***p 和 #60; 0.001 与假组比较 (t-测试)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

本议定书的目的是提出一个 step-by 的外科技术, 微侵袭横动脉狭窄小鼠。对小鼠横主动脉狭窄的详细技术描述已由其他作者2,8报告。然而, 这些研究者在动物插管和通气后进行手术。使用额外的一步插管通气增加了整个过程的复杂性和持续时间和全球压力的动物接触。因此, 微创横脉狭窄的概念得到了一定的重视。小鼠的微创横动脉狭窄用于诱发左心室肥厚及心力衰竭的进展9,10,11。这些研究的重点是在左心室肥厚和心力衰竭的成因, 而不是对手术技术的描述9,10,11

在本协议中, 我们详细报道了小鼠微创 TAC 的简化和重现技术。熟练的外科医生可以在15分钟内进行20分钟的收缩手术和假手术 (无缝合栓)。在我们最初的技术证明中, 我们发现, 引进一个关键的仪器, 结扎的援助, 使一个非常低的手术死亡率1.7%。这与人 et 报告的4% 的手术死亡率相比比较有利。al5, 3.7% 由廖 et al13和2.7% 由塔拉斯坦费尔德 et al14。此外, 观察期长达28天, 术后晚期死亡率也很低, 为1.7%。再次, 这与人 et al (10%)5、廖 et al (19%)13或塔拉斯坦费尔德 et al (2.6%)14所报告的晚期死亡率比较好。

主动脉弓下的通道是整个手术过程中最关键的一步。这一步骤的重现性没有描述的胡和同事谁使用了自制的电线与一个圈套在其年底通过主动脉下的权利无名的来源和左颈总动脉9, 也没有由 Tarnavski 谁定位在上升主动脉下内侧侧的弯曲钳, 在另一侧抓住7/0 丝缝合线, 并将其移动到主动脉2下方。在我们的技术使用的结扎援助, 使一个标准化和重复性的机动, 低风险的主动脉撕裂。

该程序的另一个决定性步骤是张力施加在27口径针的领带上, 以有效降低主动脉弓的腔内 homogenously。首先, 我们使用栓钳, 这有助于应用均匀和重现张力的缝合周围的主动脉弓。在心脏和主动脉弓的收获过程中, 对缝线的适当放置进行了验证。安徒生和工友通过评估颈动脉的多普勒信号证实了乐队的适当的安置在主动脉带的安置之前和之后11。在他们的报告中, 当多普勒流速比从右至左颈动脉的一倍11时, 接受了适当的带状。在我们的技术, 我们选择测量的效率, TAC 的程度诱导左心室肥厚与假动物相比, 为了验证的程序, 因为它不需要任何延长的程序或动物的补充麻醉。在我们的技术, 在实验结束时, 检查左心室肥厚程度和适当的带状位置。我们的技术对左心室肥厚的程度与其他研究人员在 TAC 后3周报告的结果相比, 在小鼠15。此外, 在我们的带状动物中观察到的心脏与体重比值的低变化证明了在领带上施加的张力的低波动。

总之, 通过避免在本协议中提出的插管通气, 我们的小鼠微创技术提供了一个可靠的和可重复的模型。这一模型减少了对动物的全球应变, 是时间和成本节省比 TAC 使用插管通风的动物。该方法手术和后期死亡率低, 使该技术成为一种诱导小鼠左心室肥厚的选择手段。

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Disclosures

作者没有利益冲突的披露。

Acknowledgements

这项工作得到了瑞士心血管基金会的赠款 (编号 32016) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical microscope Olympus SZX2-TR30
Razor Rowenta Nomad TN3650FO
Sutures:
Polypropylene 7/0 Ethicon BV-1X
Polypropylene 6/0 BBraun C0862061
Silk 6/0 ligature  FST 18020-60
Polypropylene 4/0 Ethicon 8683
Polypropylene 5/0 Ethicon Z303
Drugs:
Ketamin Merial Imalgène 1000, LBM154AD
Xylazine Bayer Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorphine Ceva Vetergesic, 072013
Instruments: 
Bone nippers Fine Surgical Tools 16101-10
Ligation aid Fine Surgical Tools 18062-12
Tying forceps Fine Surgical Tools 18026-10
Needle holder Crile-Wood Fine Surgical Tools 12003-15
Microsurgery forceps  Fine Surgical Tools 11003-12
Microsurgery forceps  Fine Surgical Tools 11002-12
Tissue forceps Fine Surgical Tools 11021-12
Microsurgery needle holder Fine Surgical Tools 12076-12
Microsurgery scissors Fine Surgical Tools 91501-09
Mayo scissors Fine Surgical Tools 14511-15
11-blade knife Fine Surgical Tools 10011-00
RNA extraction and qPCR:
TriReagent Euromedex TR-118-200
Rneasy Mini kit Qiagen 74704
Qubit Fluorimetric RNA assay Fisher Scientific 10034622
RNA 6000 Nano kit Agilent 5067-1511
High Capacity cDNA kit Fisher Scientific 10400745
Taqman Master Mix Fisher Scientific 10157154
Taqman BNP primers Fisher Scientific Mm01255770_g1
Taqman ANP primers Fisher Scientific Mm01255747_g1 
Taqman ACE primers Fisher Scientific Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 primers  Fisher Scientific Mm00801666_g1
Taqman TGFb primers Fisher Scientific Mm01178820_m1
Taqman Gapdh primers Fisher Scientific Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler Applied Biosystems 7000
Software:
GraphPad Prism GraphPad Prism 7
Animal food
Complete diet for adult rats/mice Safe UB220610R

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References

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