Preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D

Chemistry

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Summary

Qui descriviamo una facile preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano usando immina dinamica chimica. Metodi per regolare la resistenza meccanica di idrogel e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D sono presentati.

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Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L. Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (127), e56253, doi:10.3791/56253 (2017).

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Abstract

Il protocollo presenta un metodo facile, efficiente e versatile per preparare idrogel a base di chitosano usando immina dinamica chimica. L'idrogel è preparata mescolando soluzioni di glicole chitosano con un gelator di polimeri sintetizzati benzaldeide terminato e idrogeli sono ottenuti in modo efficiente in diversi minuti a temperatura ambiente. Dai vari rapporti tra glicole chitosano, gelator di polimero e contenuto di acqua, idrogel versatile con tempi di gelificazione differenti e rigidità sono ottenuti. Quando danneggiato, l'idrogel può ritrovare apparenze e modulo elastico, dovuto la reversibilità delle obbligazioni immina dinamico come crosslinkages. Questa proprietà auto-sanabile consente l'idrogel di essere iniettabili, poiché esso può essere auto-guarito da pezzi spremuti da un idrogel di massa integrale dopo il processo di iniezione. L'idrogel è anche multi-sensible a reagire a molti stimoli di bio-attivi a causa di Stati di equilibrazione differenti delle obbligazioni immina dinamico. Questo idrogel è stata confermata come bio-compatibili e cellule di fibroblasti di topo L929 erano incorporate seguenti procedure standard e la proliferazione delle cellule è stata valutata facilmente tramite un processo di coltivazione di cella 3D. L'idrogelo in grado di offrire una piattaforma regolabile per diverse ricerche dove è profittato di un mimo fisiologico di un ambiente 3D per le cellule. Insieme alle sue proprietà multi-reattivo, self-sanabile e iniettabili, nel caso degli idrogeli potenzialmente può essere applicato come elementi portanti multipli per farmaci e cellule in future applicazioni bio-medicali.

Introduction

Idrogeli sono materiali polimerici reticolati con grandi quantità di acqua e morbido proprietà meccaniche, e sono stati utilizzati in molte applicazioni bio-medicali1,2. Idrogeli possono offrire un ambiente morbido e bagnato, che è molto simile all'ambiente fisiologico per cellule in vivo. Di conseguenza, idrogeli sono diventati uno dei più popolari impalcature per cella 3D cultura3,4. Rispetto alla coltura delle cellule 2D di Petri, coltura cellulare 3D ha avanzato velocemente per offrire che una matrice extracellulare (ECM) ha imitato il microambiente per celle da contattare e montare per proliferazione e differenziazione di scopi5. Inoltre, idrogeli contenenti polimeri naturali potrebbero offrire ambienti bio-compatibili e promozione per le cellule di proliferare e differenziare3. Idrogeli derivati da polimeri sintetici sono preferibili per i loro componenti semplici e chiare, che escludono le influenze complesse come proteine di origine animale o virus. Tra tutti i candidati di idrogel per colture cellulari 3D, idrogeli che facilmente sono preparati e hanno una proprietà coerente sono sempre preferiti. La possibilità di regolare le proprietà di idrogel per soddisfare i requisiti di ricerca differenti è importante come ben6.

Qui vi presentiamo una facile preparazione di un idrogel a base di chitosano glicole usando immina dinamica chimica, che diventa una piattaforma versatile idrogel per cella 3D cultura7. In questo metodo, noto bio-compatibili glicole chitosano vengono utilizzati per stabilire cornici delle reti di idrogel. Suoi gruppi amminici sono ha reagiti con un glicole di polietilene benzaldeide terminato come il gelator di polimeri per formare legami immina dinamico come crosslinkages di idrogeli8. Immina dinamico obbligazioni possono formare e si decompongono reversibilmente e responsabilmente ai dintorni, dotando l'idrogel con reticolati regolabile meccanicamente reti9,10,11. A causa del suo contenuto di acqua alta, materiali bio-compatibili e resistenze meccaniche regolabili, l'idrogel è applicato con successo come impalcatura per celle L929 in cella 3D cultura12,13. Il protocollo qui i dettagli delle procedure, tra cui la sintesi del polimero gelator, idrogel preparazione, l'incorporamento delle cellule e coltura delle cellule 3D.

L'idrogel Mostra anche diverse altre caratteristiche grazie alla sua dinamica immina crosslinkages, tra cui il multi-sensible a reagire ai vari bio-stimoli (acido/pH, piradossale derivato di vitamina B6, papaina proteine, ecc.), che indica che potrebbe essere l'idrogel indotto a decomporsi sotto condizioni fisiologiche8. L'idrogel è anche self-sanabile e iniettabili, che significa l'idrogel potrebbe essere amministrato per mezzo di un metodo di iniezione invasiva minimale e ottenere un vantaggio in droga e cella consegne14,15. Con l'aggiunta di additivi funzionali o gelators polimero specifico predefiniti, l'idrogel è compatibile per ottenere proprietà specifiche come magnetico, temperatura, pH sensibile, ecc.16,17, che potrebbe compiere un vasta gamma di esigenze di ricerca. Tali proprietà rivelano la capacità potenziale di idrogel per essere un iniettabile più vettori per farmaci e cellule sia in vitro che in vivo ricerca bio-medica e applicazioni.

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Protocol

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare pratiche adeguate di sicurezza durante gli esperimenti di chimica, compreso l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (occhiali protettivi, guanti protettivi, camice da laboratorio, ecc.). Il protocollo richiede cella standard gestione tecniche (sterilizzazione, recupero delle cellule, cellule passaggio, congelamento delle cellule, macchiatura delle cellule, ecc.).

1. preparazione di idrogeli

  1. sintesi della benzaldeide terminato funzionalizzati di polietilene glicole (spina DF)
    1. pre-essiccazione di PEG polimero
      1. pesare 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), trasferirla in un pallone a fondo tondo (250 mL) e aggiungere toluene (100 mL).
        Nota: Altre pioli con diversi pesi molecolari può lavorare per la formazione di idrogel ma porterà a diversa rigidezza.
      2. Riscaldare la soluzione da una pistola di calore (o un piatto caldo intorno ai 40 ° C) leggermente per aiutare a sciogliere tutti i polimeri. Dopo tutti i polimeri si dissolvono, è possibile utilizzare un evaporatore per rimuovere tutti i solventi. Ripetere questo processo secco e sciogliere due volte per rendere il PEG secche polimeri.
        Attenzione: Questa operazione deve essere eseguita in una cappa con estrema cura. Il toluene è infiammabile.
    2. Reazione di terminazione di benzaldeide di PEG
      1. aggiungere un agitatore magnetico e tetraidrofurano (THF, 100 mL) al pallone e sciogliere PEG con un agitatore. Aggiungere 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0,07 g, 0,6 mmol) in sequenza per le soluzioni di sciogliere tutti i solidi completamente.
      2. Aggiungi N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) alla soluzione e aggiungere un tubo di essiccazione che viene riempito con anidro CaCl 2 al pallone. Mantenere la reazione sotto agitazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) per circa 12 h.
    3. Processo di post-reazione
      1. filtrare i solidi bianchi generati nella soluzione di vuoto dopo la reazione è completa. Versare la soluzione nel freddo etere dietilico (500 mL) sotto agitazione per precipitare i solidi bianchi. Raccogliere tutti i solidi bianchi dal filtro e la sostanza secca in una cappa aspirante.
      2. Dissolversi ancora i solidi bianchi in THF, filtrare qualsiasi solidi bianchi insolubili, versare la soluzione nel fresco freddo etere etilico per precipitare i solidi bianchi e asciugarlo. Ripetere questo processo due o tre volte e quindi posizionare i solidi bianchi in un forno di essiccazione sotto vuoto (20 ° C, 0,1 mbar) per asciugarle completamente. Raccogliere la polvere bianca come il prodotto finale: benzaldeide terminato DF PEG.
  2. Preparazione di idrogeli
    1. pesare quantità diverse di DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) in un tubo (10 mL), aggiungere acqua deionizzata (5,0 mL) e utilizzare un vortice o agitatore magnetico per aiutare sciogliere il polimero.
    2. Sciogliere glicole chitosano (0,495 g, 6,18 x 10 -3 mmol) in acqua deionizzata (15,0 mL) in un tubo (50 mL) e utilizzare un vortice per pochi minuti per omogeneizzare la soluzione di chitosano (3% in peso).
    3. Aggiungere la soluzione di chitosano di glicole (0,2 mL, 3% in peso) e soluzioni di PEG DF (0,2 mL) in sequenza in un tubo (2,0 mL). Utilizzare un vortice per mescolare le soluzioni in modo omogeneo a forma idrogel in alcuni minuti. Seguire i rapporti nella tabella 1 per rendere idrogeli di resistenze meccaniche differenti.
      Nota: Utilizzare il metodo invertente tubo per determinare se l'idrogel è già formato.
  3. Analisi di reologia
    1. effettuare analisi di reologia su un reometro rotazionale con una piastra di acciaio parallela (diametro: 20 mm). Per la prova di gelificazione, pubblicizza chitosano glicolata (0,2 mL, 3% in peso) su una piastra inferiore. Aggiungere soluzioni acquose DF PEG (0,2 mL, 2% in peso) uniformemente goccia a goccia sulla superficie della soluzione del chitosano, quindi mescolare rapidamente con una pipetta. Più basso giù la piastra superiore e cominciano a test.
    2. Per idrogel ' prova di rigidezza s, tagliare un idrogel in un cerchio (diametro: 20 mm) e misurare il modulo elastico (G ') valori contro analisi di frequenza al 1% di deformazione. Tipico G ' valori a 6,3 rad s − 1 sono elencati nella tabella 1.
      Nota: Effettuare le analisi di reologia di idrogel 0,5 h dopo la formazione di idrogel per garantire la stabilizzazione dinamica legame dell'idrogel.
    3. Per l'idrogel ' s self-sanabile proprietà testare, tagliare un idrogel a pezzi e raccogliere i pezzi insieme a Self-Heal a un pezzo integrale. Quindi tagliare il pezzo di idrogel per fare un cerchio (diametro: 20 mm) e metterlo sul reometro per eseguire l'analisi di reologia.

2. colture cellulari 3D in idrogel

  1. preparazione delle soluzioni di gelificazione di idrogel
    1. pesare DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) in una provetta sterile (4,0 mL), aggiungere in terreni di coltura delle cellule (RPMI-1640, 2.0 mL) e utilizzare un vortice o agitatore per aiutare a sciogliere il polimero per ottenere la soluzione di polimero (20% in peso). Caricare la soluzione in una siringa (10,0 mL) e poi sterilizzarlo facendolo passare attraverso un filtro batteri ritentiva micron (0,22 µm).
    2. Pesare il chitosano di glicole (0,165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) in una provetta sterile (15,0 mL), aggiungere in terreni di coltura delle cellule (RPMI-1640, 4,0 mL) e vortex per aiutare a sciogliere il polimero per ottenere la soluzione di glicole chitosano (4,0% in peso). Caricare la soluzione in una siringa (10,0 mL) e filtrare con un filtro di batteri a rimanenza da 0,22 µm.
  2. Colture cellulari in idrogel
    Attenzione: eseguire tutto cella procedure correlate in una cappa di coltura del tessuto. Conoscenza di base della tecnica sterile è previsto.
    1. Preparazione della sospensione di cellule
      1. cultura L929 cellule in RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 5% penicillina (10 mL) in un Petri dish (diametro 10 cm) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Modificare il mezzo ogni giorno prima dell'uso.
      2. Raccogliere le celle L929 con PBS contenente tripsina (0,025% w/v) ed EDTA (0,01% w/v), poi centrifugare (5 min a 70 x g) e risospendere le cellule nel medium RPMI-1640 (1,0 mL). Eseguire la conta cellulare utilizzando standard di funzionamento del Consiglio di sangue-conteggio. Risospendere le cellule per regolare la concentrazione cellulare di ~ 3,75 × 10 6 cellule/mL.
    2. Incapsulamento di cellule in idrogel
      1. mescolare le sospensioni di cellula L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 6 cellule mL -1) con chitosano glicolata (0,4 mL) in un tubo (4,0 mL) Vortex. Dispensare la soluzione di chitosano L929/glicole (0,8 mL) in al centro di un piatto di Petri confocale (diametro 2,0 cm). Pipettare le soluzioni DF PEG (0,2 mL) nello stesso piatto e pipettare delicatamente per mescolare la soluzione e inducono la formazione di idrogel.
        Nota: Valutare la formazione di idrogel inclinando il piatto petri.
      2. Per la coltura cellulare diretto, aggiungere ulteriori quantità di terreni di coltura RPMI-1640 (1,0 mL) in cima l'idrogel. Mettere l'idrogel di cella incorporato (1,0 mL, 1.5 wt % glicole chitosano, 4,0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 cellule mL -1) in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) e cambiare il mezzo ogni giorno. Preparare per l'imaging delle cellule il giorno 1, 3, 5 e 7 dopo incapsulamento cella.
    3. Della cultura post-cella 3D in idrogel dopo l'iniezione, preparare cella caricata idrogel (1,0 mL, vedi punto 2.2.2) in una siringa (10,0 mL, ago 48 G). Dopo le forme di idrogel, iniettare lentamente l'idrogel in una capsula Petri per imaging confocale. Aggiungere un importo supplementare di terreni di coltura (1,0 mL) in cima l'idrogel e cambiare ogni giorno. Mettere la capsula di Petri in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) e preparare per l'imaging in seguito.
      Attenzione: Si prega di controllare e seguire il protocollo di funzionamento di sicurezza di una siringa.
  3. Analisi di attuabilità delle cellule
    1. confocale osservazione
      1. Sciacquare l'idrogel con PBS (1,0 mL) per due volte. Macchia nel caso degli idrogeli con diacetato di fluoresceina (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) e soluzioni di propidio ioduro (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) per 15 min. Dopo la colorazione, rimuovere tutti i solventi.
      2. Osservare nel caso degli idrogeli utilizzando un microscopio confocale in lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 543 nm di visualizzare dal vivo e morto cellule, rispettivamente. Prendere z-stack attraverso ogni profondità di 2 µm di idrogeli per convalidare una distribuzione uniforme delle cellule in tutto.
        Nota: FDA macchie cellule vive mentre le cellule morte di macchie PI.
    2. Degradare l'idrogel (1,0 mL) con acido acetico (HAc, 3% v, 1,0 mL) per 5 min e pipettare in una provetta (4,0 mL). Raccogliere le cellule di centrifuga (70 x g, 5 min) e risospendere le cellule in terreno di coltura cellulare di RPMI-1640 (1,0 mL). Eseguire la conta cellulare utilizzando un sangue conteggio pensione.

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Representative Results

Una presentazione schematica di questo protocollo su idrogel preparazione e il suo uso come coltura cellulare 3D è offerto nella Figura 1. Informazioni di idrogel Sommario e rapporti preparati con diversi punti di forza meccaniche sono riassunta nella tabella 1. L'idrogel di self-sanabile e proprietà di reologia presenta rigidità di idrogel di modulo elastico contro frequenza test nella Figura 2. Le immagini confocal cellulare e numeri di cellulare con giorni di cultura in idrogel sono presentati nella Figura 3, confermando l'attuabilità delle cellule e la proliferazione delle cellule via coltura cellulare 3D. Figura 4 presenta microscopia confocale immagini e analisi dei tassi di proliferazione delle cellule per cellule incorporate in idrogel che ha sofferto di iniezione e post-cultura. Alta attuabilità e proliferazione delle cellule indicano che le cellule incorporate nell'idrogel non sofferto nessun danno distruttivo e potrebbero recuperare dalla post-cultura, che indica iniettabilità di idrogel.

Figure 1
Figura 1 : Preparazione dell'idrogel e il suo uso come coltura cellulare 3D. (A) preparazione di idrogel; (B) cella preparazione della sospensione; (C) cultura cellulare 3D in idrogel con o senza iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Idrogel rigidità. Modulo elastico G' contro frequenza di (A) originale e (B) self-guariti idrogeli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Coltura cellulare 3D nell'idrogel. (A) 3D immagini confocal di celle L929 incorporato in idrogel resistenza rigida (verde: vivere le cellule; Rosso: le cellule morte); (B) cella conteggio risultati di celle L929 incorporato nell'idrogel dopo l'incapsulamento delle cellule al tempo indicato con. Barra della scala = 300 µm. dati presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : 3D cellulare post-cultura in idrogel dopo iniezione. (A), A immagine schematica dell'iniezione e post-cultura di un idrogel cella-caricato. Inserto: Immagini di microscopia delle cellule incorporato in idrogel prima iniezione (a sinistra) e dopo post-coltura cellulare per 7 giorni (centro e destra). Barra della scala = 100 µm; (B) immagini Confocal di celle L929 incorporato in un idrogel di resistenza rigida e post-coltivate dopo l'iniezione (verde: vivere le cellule; Rosso: le cellule morte), barra della scala = 300 µm; (C), A confronto del tasso di proliferazione delle cellule coltivate in idrogel con o senza iniezione dopo incapsulamento. Dati presentati come media ± SD. (adattato da riferimento12; Copyright © 2017 Elsevier). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rigidità di idrogel Morbido Medio Stiff
Chitosano glicole (mg) 6.6 6.6 6.6
DF PEG (mg) 4.4 8.8 17,6
Contenuto di polimero gelator (wt %) 1 2 4
Acqua deionizzata (mL) 0.4 0.4 0.4
Gelaion tempo (min) 7.5 5 3.5
G' (Pa)* 900 2100 4700
* testato sotto frequenza 6,3 rad s-1, ceppo 1% utilizzando una piastra parallela (diametro 20 mm) su un reometro rotazionale.

Tabella 1: Informazioni di idrogeli preparati con diversi punti di forza meccaniche.

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Discussion

L'idrogel presentato in questo protocollo (Figura 1) ha due componenti principali: il chitosano di glicole di polimero naturale e un sintetico benzaldeide terminato gelator polimero DF PEG, che sono entrambi materiali biocompatibili. Sintesi di DF PEG sono presentata utilizzando una reazione di modificazione di uno stadio. PEG del peso molecolare 4.000 fu scelto nel presente protocollo per preoccupazioni di solubilità, efficienza di modificazione, come pure la rigidità di idrogel. Una serie di idrogel con resistenze meccaniche differenti sono stati preparati utilizzando diversi contenuti di solidi e i rapporti di glicole chitosano e DF PEG. Idrogeli omogenei rapidamente sono stati formati in minuti mescolando soluzioni di gelificazione sotto temperatura ambiente, anche se la velocità di gelificazione potrebbe anche rallentare di soluzioni diluite. Prova di reologia è stata impiegata per valutare i punti di forza meccaniche di idrogeli differenti. I moduli di deposito (G') di tali idrogeli sono stati trovati circa differiscano da 900 Pa (morbido), 2.100 Pa (medio) a 4.700 Pa (rigido) (tabella 1 e Figura 2A). Questo è un contributo per l'alta densità di reticolazione aggiungendo ulteriori gelators polimero nella rete idrogel, con conseguente più elevato modulo elastico (rigidezza). La proprietà auto-sanabile è confermata anche dal recupero del modulo di idrogel (Figura 2B). È noto che rigidità ECM differisce per vari tessuti, così l'idrogel potrebbe offrono spunti meccanici regolabile e soddisfare le esigenze di ricerca diversi dai vari rapporti tra glicole chitosano e DF PEG polimero gelators18.

L929 cellule, una cellula del fibroblasto mouse tipico con in vivo rigidità dei tessuti ambiente di ~ 5.600 pa19, è stato utilizzato come un modello di cellulare per essere incorporati nell'idrogel. Dopo l'incapsulamento di cellule in idrogel, si può facilmente osservare che le cellule nel caso degli idrogeli hanno mostrato estremamente alta attuabilità (> 99%) durante tutto il processo di cultura, confermando l'eccellente biocompatibilità dell'idrogel a base di chitosano. Un aumento notevole di densità delle cellule nell'idrogel implicita che questo idrogel potrebbe sostenere la proliferazione delle cellule L929 anche senza extra-aggiunta di fattori di crescita (Figura 3A). Dopo 7 giorni nella cultura nell'idrogel, aumentato il numero di cellulare 300% (Figura 3B). È stato riferito che le cellule coltivate in Ponteggi ha potuto differenziare seguendo spunti meccanico20,21, che potrebbe implicare ulteriori ricerche utilizzando questo metodo di coltura di idrogel 3D.

L'impianto di cellule con idrogeli iniettabili ha acquisito vantaggi incomparabili per migliorare notevolmente l'efficienza di consegna e la vitalità delle cellule impiantate14. All'interno di una rete di reticolati immina dinamico, l'idrogel potrebbe Self-Heal dopo l'iniezione. La proprietà auto-sanabile consente l'idrogel di essere iniettabili, che implica applicazioni potenziali per l'idrogel come iniettabili più vettori. Per valutare ulteriormente questo idrogel come elemento portante di cella iniettabili, è stato effettuato un esperimento che imita iniezione e post-coltura. L'idrogel di cella incorporato è stato caricato in una siringa e spremuto fuori attraverso un ago di 48 G in una capsula Petri, seguita da un 7 giorni di post-coltura processo con tasso di vitalità e proliferazione delle cellule studiata.

Come mostrato in Figura 4A, i pezzi di idrogel troppo angusto potrebbero Self-Heal per riformare un idrogel integrato circa 1 h dopo l'iniezione, che è utile nella consegna delle cellule. Per le celle nell'idrogel, se confrontato con l'immagine ha preso subito dopo incapsulamento (Figura 4A, inserto sinistro), la densità delle cellule è aumentata drammaticamente dopo 7 giorni (Figura 4A, inserto centrale). Nella visione allargata, una più dettagliata delle cellule-Profissional processo in cui alcune cellule sono trovati per essere diviso in due (Figura 4A, giusto inserto), confermata direttamente dalla proliferazione cellulare 3D nell'idrogel. Figura 4B Mostra le immagini confocale dei saggi vive-morte cellulare dopo l'iniezione e post-cultura esperimento. La densità delle cellule iniettate ovviamente aumentata con un alta attuabilità (> 99%), dimostrando la proliferazione delle cellule successo nell'idrogel 3D dopo l'iniezione. Per imparare che se l'iniezione influenzato il tasso di proliferazione delle cellule, un confronto tra analisi statistiche quantitative per i tassi di proliferazione delle cellule in idrogel con o senza iniezione è stata eseguita (Figura 4). Il tasso di proliferazione delle cellule dopo l'iniezione, anche se leggermente diminuita, rimase in un livello elevato (~ 75%) e il numero di cellulare aumentato 145% relativamente dopo 7 giorni nella cultura in idrogel, che indica che la forza di taglio durante l'iniezione ha un'osservabile limitata influenza negativa sulla proliferazione delle cellule.

Abbiamo descritto una procedura tipica di questa applicazione di idrogel, ma i ricercatori possono modificare il protocollo per soddisfare i requisiti specifici di ricerca. Gelators polimero hanno influenze significative sull'idrogel e sono facilmente modificabili. Ad esempio, la rigidità di questo idrogel potrebbe essere facilmente manipolata da differenti rapporti di glicole chitosano e DF PEG gelator. Nel frattempo, l'uso DF PEG di altri pesi molecolari potrebbe compiere anche questa destinazione. Abbiamo usato PEG 4K in questo protocollo, ma PEG 2 a 10K potrebbe anche funzionare. Quando si utilizzano altre pioli, è importante monitorare il tempo di gelificazione e rigidità in particolare. Altri gelators polimero funzionale potrebbe funzionare anche se i ricercatori hanno capacità di sintesi per predisporre specifici polimeri funzionali con terminazione benzaldeide17.

Questo protocollo ha diversi limiti. In primo luogo, a causa della struttura dinamica, la rigidità di questo idrogel è limitata rispetto a un legame covalente reticolato idrogel. Uno potrebbe verificarsi errori di preparare gli idrogel con troppo alto di un design del modulo. In secondo luogo, questo idrogel è bio-degradabile, limitando così la coltura cellulare a lungo termine entro l'idrogel. In terzo luogo, l'idrogel offre un ambiente di coltivazione di reticolato 3D che ha preoccupazioni di diffusione. Ad oggi, la maggior parte delle bio-analisi si basano sulla cultura 2D. La struttura 3D potrebbe ostacolare l'ulteriore cella relativo studi in vivo.

Quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi passaggi critici da seguire. In primo luogo, durante la sintesi del gelator polimero DF PEG, la disidratazione è molto importante. In secondo luogo, quando si eseguono procedure relative alle celle, sterile operazione è fondamentale. In terzo luogo, il tempo di colorazione dovrebbe essere ben controllato in idrogel per ottenere belle immagini confocal.

In sintesi, il protocollo introdotto una facile preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano, che si applicano come una piattaforma per la coltura cellulare 3D e potrebbero offrire spunti meccanici regolabile per varie ricerche. È già stato applicato in aree riguardanti la somministrazione di farmaci, terapia cellulare e chemioterapia del tumore, che non solo è un testamento alla sua performance, ma aumenta anche il suo potenziale per biomedica applicazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta dal National Science Foundation cinese (21474057 e 21604076).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycol chitosan Wako Pure Chemical Industries 39280-86-9 90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 619-66-9 99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 538-75-0 99%
Calcium chloride anhydrous Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 10043-52-4 96%
4-dimethylamiopryidine Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 1122-58 99%
Polyethyleneglycol Sino-pharm Chemical Reagent 5254-43-7 99%
Tetrahydrofuran Sino-pharm Chemical Reagent 109-99-9 99%
Toluene Sino-pharm Chemical Reagent 108-88-3 99%
Ethyl ether Sino-pharm Chemical Reagent 60-29-7 99%
Acetic acid Sino-pharm Chemical Reagent 64-19-7 99%
Anhydrous CaCl2 Sino-pharm Chemical Reagent 10043-52-4 99%
Fluorescein diacetate Sigma 596-09-8 99%
Propidium iodide  Sigma 25535-16-4 94%
RPMI-1640 culture media Gibco
Fetal bovine serum Gibco
Trypsin-EDTA Gibco 0.25%
PBS Solarbio 0.01 M
Penicillin streptomycin solution Hyclone 10,000 U/mL
Rheometer TA Instrument AR-G2
Confocal microscope Zeiss 710-3channel
L929 Cells ATCC NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator EYELA N-1100
48 guage needle ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD 48-guage
Microscope Leica DM3000 B
Microscope software Imaris
Heat gun Confu KF-5843 
Petri dish NEST

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References

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