Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

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Summary

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

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Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

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Abstract

El objetivo de este protocolo presenta un procedimiento optimizado para la purificación y cultivo de pBECs y establecer en vitro barrera blood - brain (BBB) basados en pBECs en mono-cultura (MC), MC con medio acondicionado astrositos (ACM), y co-cultivo (NCC) con astrocitos de porcino sin contacto o rata origen. pBECs fueron aisladas y cultivadas de los fragmentos de los capilares de las cortezas cerebrales de 5-6 meses de edad los cerdos domésticos. Estos fragmentos fueron purificados por el retiro cuidadoso de meninges, de aislamiento y de homogeneización de la materia gris, la digestión enzimática, filtración y centrifugación. Para eliminar las células contaminantes, los fragmentos capilares fueron cultivados con puromicina medio. Cuando confluentes de 60-95%, pBECs de los fragmentos capilares fueron pasados a filtro de membrana permeable inserta y establecido en los modelos. Para aumentar la tensión de barrera y fenotipo característico BBB de pBECs, las células fueron tratadas con los siguientes factores de diferenciación: membrana florescente 8-CPT-cAMP (campo abreviado aquí), hidrocortisona y un inhibidor de la fosfodiesterasa, RO 20-1724 (RO). El procedimiento se llevó a cabo durante un período de 9-11 días, y cuando se establece el modelo de la NCC, los astrocitos se cultivaron 2-8 semanas de antelación. Cumplimiento de los procedimientos descritos en el protocolo ha permitido el establecimiento de las capas endoteliales con permeabilidad paracelular altamente restringida, con la CNC modelo mostrando una resistencia eléctrica (TEER) de promedio transendothelial de 1249 ± 80 Ω cm 2y la permeabilidad paracelular (Papp) para Lucifer amarillo de 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm seg-1 (media ± SEM, n = 55). La evaluación adicional de este fenotipo de pBEC demostró buena expresión de la proteínas de Unión estrecha claudin 5, ZO-1, occludin y adherens Unión proteína catenina p120. El modelo presentado puede utilizarse para una variedad de estudios de la BBB en salud y enfermedad, y con la permeabilidad paracelular altamente restrictiva, este modelo es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular.

Introduction

Estructura celular y función de la Barrera Blood - Brain

En la interfaz del sistema nervioso central y circulatorio (CNS), el BBB actúa como un sitio regulador clave para homoeostatic control del microambiente del CNS, que es esencial para el correcto funcionamiento y protección del sistema nervioso. El sitio de la BBB es las células endoteliales que recubren el lumen del vaso sanguíneo. En los capilares del cerebro, las células endoteliales forman a uniones estrechas intercelulares complejas y patrones de expresión fuertemente polarizada de los transportadores de influjo y eflujo particular garantizar transporte molecular altamente específico entre la sangre y el cerebro 1. Los componentes estructurales de los complejos de Unión estrecha incluyen proteínas de la familia occludin y claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin y asociados a las moléculas de la adherencia junctional (mermeladas). Claudin 5 es particularmente importante en la restricción de junctional paracelular. Inducción y mantenimiento de este característico fenotipo endotelial BBB implican interacciones dinámicas con las células circundantes, como pericitos, astrocitos, neuronas y las membranas del sótano, que junto con cerebro endothelial las células forma el neurovascular unidad (NVU)2,3. Los mecanismos implicados en estas interacciones no se entienden todavía completamente, pero incluyen intercambio de señales químicas entre las células, que permite la modulación de la permeabilidad BBB en el corto plazo e induce a largo plazo BBB características4. Astrocitos especialmente son conocidos por contribuir al fenotipo de célula endotelial cerebral y son una fuente de factores reguladores como neurotrófico glial-derivado (afecta el cAMP intracelular) de factor5, de factor de crecimiento básico del fibroblasto6, hidrocortisona7y transformación del factor de crecimiento β (TGF-β)8. El efecto de TGF-β, sin embargo, ha sido debatido9.

De In Vivo que In Vitro BBB

In vivo estudios siguen proporcionan valiosa información sobre la biología BBB. Sin embargo, los modelos de cultura de célula pueden proporcionar perspectivas adicionales y constituyen herramientas útiles para la comprensión detallados aspectos moleculares y funcionales de la BBB en salud y enfermedad. Aunque las complejas interacciones entre los tipos de células y componentes de la BBB son difíciles de lograr totalmente en modelos en vitro , se ha producido, desde la primera purificación de las células endoteliales cerebrales y aplicación de estos en monocultivos 10 , 11 , 12, amplio desarrollo de los procedimientos de purificación y condiciones de crecimiento de la BBB modelos cultura, resultando en una mayor semejanza a la barrera en vivo de la célula. Los modelos utilizados en vitro BBB se basan en células primarias de origen bovino, porcino y roedor y en líneas celulares inmortalizadas. Cada modelo tiene diferentes ventajas y desventajas. Para la comparación y el modelo de opción, los marcadores de validación como expresión de BBB enzimas, transportadores, receptores y proteínas estructurales se utilizan para crear descripciones de los actuales modelos establecidos1.

Objetivo del Protocolo de

Una característica importante de la BBB es barrera tirantez y TEER alta, sin embargo, un gran número de los modelos disponibles no reflejan bien los niveles en vivo . Incorporar el desarrollo y optimización de las contribuciones de varios laboratorios, el objetivo de este protocolo es presentar un método para establecer un alto TEER en vitro BBB modelo basado en la pBECs primaria en MC con o sin ACM o en NCC con primaria astrocitos de rata o de origen porcino. Los procedimientos aplicados y el establecimiento del modelo incluyen esfuerzos para eliminar las células contaminantes y mejorar la diferenciación de pBECs en un fenotipo BBB. Este trabajo ha dado como resultado el establecimiento de modelos TEER fiables y de alta permeabilidad paracelular baja y buena expresión funcional de las proteínas clave de Unión estrecha, transportadores y receptores. Sin embargo, como los astrocitos son un factor que contribuye al fenotipo de células endoteliales cerebrales, las tres condiciones diferentes de la cultura representan tres diferentes fenotipos de las células endoteliales del cerebro. El modelo de la NCC es especialmente útil para estudios de ciertos mecanismos especializados involucrados en el descubrimiento de medicamentos, estudios de transporte y tráfico intracelular, así como para la investigación de las interacciones célula-célula donde es la máxima expresión de características BBB ventajoso.

Origen e historia del Protocolo

El modelo de pBEC descrito aquí se basa en el modelo porcino desarrollado en los laboratorios Eisai (Londres) por el Dr. Louise Morgan y sus colegas, whichis basada en un exitoso anterior cerebro bovino células endoteliales modelo13. El método original de preparación de la célula fue una filtración de dos etapas utilizando nylon mallas para atrapar los microvessels, seguidos por un paso subculturing para mejorar la pureza. En el anterior desarrollo del método, tirantez óptima de fenotipo y barrera BBB fueron alcanzados por el crecimiento en medio suplementado, incluyendo ACM. R. Skinner hicieron otras modificaciones al método en el laboratorio del Prof. N. Rothwell en Manchester UK14,15. El método fue adoptado por el laboratorio Abbott, KCL Londres, donde Patabendige hecho significativamente más sencillo de preparar, evitando el uso de los astrocitos o ACM y eliminando las células contaminantes tales como del pericitos con puromicina. Los primeros papeles confirmó que el modelo de MC conserva varias características importantes de la en vivo BBB, como uniones estrechas eficaces, sistemas de transporte de la membrana mediada por receptor transcitosis16,17 , 18 , 19 , 20. más tarde S. Yusof otra vez probado co-cultivo astrositos y mejoró significativamente TEERAN, así que esta es la variante preferida actualmente utilizada en el laboratorio Abbott del21. El modelo ha sido exitosamente transferido a la Nielsen M. laboratorio en Aarhus, donde otras modificaciones han sido introducidos (este protocolo), incluyendo la simplificación gris materia extracción, usando la malla solamente un paso de filtración y un paso de la capa de filtro único la combinación de colágeno y fibronectina. El procedimiento aplicado para el aislamiento de astrocitos porcinos (este protocolo) se basó en los protocolos desarrollados por el laboratorio T. Moos en Aalborg, descrito por Thomsen et al22. El TEER y otras propiedades del modelo generado en Londres y Aarhus son similares, lo que da confianza a la idea de que el modelo se transfiere fácilmente entre laboratorios y responde bien a la observación cuidadosa y la racionalización de los pasos del método. De hecho, Yusof S. ha establecido el modelo de MC en un país tropical (Malasia)23, que otro ajuste para las condiciones locales y las fuentes de tejido.

Ventajas sobre métodos alternativos y actualmente establecieron modelos

En comparación con las células endoteliales de cerebro de origen bovino y roedor, pBECs proporcionan la ventaja de tener una menor tasa de pérdida del fenotipo BBB en vivo después de aislamiento24. Además, son capaces de formar barreras endoteliales relativamente estrecha, aun cuando crecido en MC (Ω 800 cm2)16 en comparación con los niveles comúnmente divulgados de monocapas de líneas celulares bEND.5 y bEND.3 (Ω 50 cm2) pBECs 25 , 26 , 27,29,de28,30de cfin (300-800 Ω cm2) y cerebEND (Ω 500 cm2)29,31,32y primario del cerebro células endoteliales del ratón (100-300 Ω cm2)SS = "xref" > 33,34,35,36 y rata (100-300 Ω cm2)37,38. Sin embargo, el TEER ha demostrado dependencia sobre los procedimientos de purificación y de la cultura. En la mayoría de los casos, la adición de ACM o cocultivo con astrocitos muestra efectos diferenciales sobre las células endoteliales y un aumento en tensión de las capas endoteliales1. Sin embargo, con los esfuerzos para optimizar las condiciones de cultivo, sólo los modelos basados en bovinos han demostrado valores TEER comparable a los modelos basados en porcino (promedios de 800 Ω cm2 en MC, hasta 2500 Ω cm2 en co-cultivo astrositos)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Como los modelos basados en cerebro bovino primario células endoteliales han demostrado grandes variaciones, tanto entre como dentro de laboratorios14,45,46,47,48, reproducibilidad podría ser un problema. En el modelo de pBEC divulgado aquí, los laboratorios que han logrado TEER muy similar y los valores de permeabilidad paracelular con baja variabilidad, tanto en como entre laboratorios. Por lo tanto, debería ser posible para otros laboratorios establecer un modelo robusto con baja variabilidad utilizando el método presentado aquí. Además formando capas endoteliales apretadas, modelos con pBECs previamente han sido validados por expresión de proteínas de Unión estrecha, funcionales transportadores BBB, receptores y enzimas y demostrada idoneidad para una amplia gama de estudios15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. por otra parte, datos inéditos del transcriptoma en co-cultivos de pBECs muestran un perfil esperado de BBB transportadores y receptores (resultados no publicados, Nielsen et al.).

El modelo BBB de porcino tiene otra ventaja como el genoma, la anatomía, la fisiología, y progresión de la enfermedad del cerdo reflejan la biología humana a un grado más alto que otros modelos establecidos cuenta con60, que son favorables para la industria farmacéutica. Como cerebros porcinos son un subproducto común de la industria cárnica, constituyen una fuente fácilmente accesible de cerebro las células endoteliales, minimizando la cantidad de animales necesarios para los experimentos así proporcionando un rendimiento de alta purificación de un cerebro porcino. Aunque la purificación y cultivo de células primarias es algo lentos y requiere de conocimientos de normalización en la creación del modelo, células primarias generan los modelos más confiables de BBB. Líneas celulares inmortalizadas no pueden ser un sustituto, como características importantes tales como tirantez barrera, perfiles de expresión del transportador y microambiente regulación no reflejan los resultados experimentales en vivo61, 62. in vitro modelos proporcionan la ventaja de células vivas imágenes con mayor resolución, posibilitando la visualización de procesos intracelulares permitiendo un enfoque de cercanía a las células muestreados u observados, con objetivos con la ampliación más alta y mejor calidad óptica63. No es el caso para el uso de la microscopía de dos fotones en animales vivos. Además, en vitro modelos ofrecen la posibilidad de transfectar las células, permitiendo la visualización de proteínas etiquetadas e investigación de su tráfico.

Aplicaciones del modelo

La función de la BBB no es fijo y puede ser modulada dinámicamente en fisiología y patología. En muchas enfermedades neurológicas, incluyendo neurodegenerativas, enfermedades inflamatorias e infecciosas, desorganización y aumento de la permeabilidad de la BBB se observa64,65,66,67 . Con el fin de reducir y prevenir la progresión de la enfermedad y el daño subsiguiente, identificación y caracterización de los mecanismos moleculares subyacentes a la modulación de la BBB son de gran importancia. En este contexto, confiable en vitro modelos están en alta demanda por la industria farmacéutica y además desempeñan un papel importante en la predicción de la permeabilidad BBB de fármacos al SNC. Cualquier modelo en vitro que sirve como pantalla de permeabilidad debe mostrar una vía paracelular restrictiva, una arquitectura celular fisiológico realista y expresión funcional del transportador mecanismos68. Demostrado en anteriores estudios16,17,57y por la permeabilidad paracelular y expresión de proteínas TJ y AJ aquí, el modelo presentado cumple todos estos criterios y es conveniente para una gama de BBB estudios en ambos fisiología normal y patología. Las fortalezas del método de purificación y cultivo presentado incluyen una combinación de simplicidad y reproducibilidad y la habilidad de incluir astrocytic influencia con un robusto y confiable alta TEER en vitro BBB modelo resultante. Para este propósito, los astrocitos de porcino y rata origen han demostrado aumentar el fenotipo BBB de pBECs en un de manera similar22.

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Protocol

cerebro porcino fueron obtenido como subproductos de la industria de alimentos danesa. Los mataderos daneses están bajo estricta supervisión y observación por el Ministerio danés de medio ambiente y alimentos.

utilizado para el aislamiento de astrocitos de rata fueron criado y grupo ubicado en el centro local de animal a una temperatura ambiente de 22 ° C - 23 ° C y un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h bajo inspección del veterinario y de acuerdo a danés regulaciones para animales de laboratorio. Las ratas fueron sacrificadas antes de que fueron sacrificados con arreglo a las directrices internacionales sobre el uso ético de animales (Directiva del Consejo de comunidades europeas de 24 de noviembre de 1986; 86/609/CEE) y las directrices danés. No experimentos en vivo con animales o material humano fueron utilizados en estos experimentos.

Nota: lo que sigue es un protocolo principal de pBEC describir purificación (paso 1), cultivo (paso 2) y (paso 3) TEER medidas. Para la configuración de una NCC con astrocitos, se presenta una alternativa también (paso 4) describiendo la purificación y cultivo de rata y cerdos astrocitos.

1. purificación de los capilares de cerebro porcino

  1. recoger cerebros de 8-10 5-6 meses de edad los cerdos domésticos (por ejemplo, de un matadero cercano) y transporte en hielo al laboratorio. Le recomendamos comenzar el siguiente procedimiento de purificación dentro de 2-3 h de la terminación de los animales.
  2. Colocar los cerebros en un banco del flujo estéril y lave suavemente con PBS 1 L en un vaso de precipitados colocada en hielo.
  3. Con cuidado extraer meninges de un cerebro en un momento con unas pinzas de punta fina y transferir el cerebro libre de meninges otro vaso de precipitados de 1 L con PBS a hielo. Extender el tiempo puede complicar la eliminación. El tiempo utilizado para cada cerebro debe ser 10-15 minutos
  4. Con un bisturí, raspar la materia gris de un cerebro en un momento y transferir el material aislado a cajas Petri (8,8 cm 2) que contiene 20 mL de DMEM nutriente mezcla F-12 (DMEM/F-12) colocado en hielo. Aislar como materia gris tanto como sea posible sin retirar el material de la materia blanca. De fragmentación inicial, atraviesan el material de la materia gris de una jeringa de 50 mL sin aguja. Seguir todos los cerebros y el material de recogida de la materia gris de la piscina. Extender el tiempo puede complicar la eliminación. El tiempo utilizado para cada cerebro debe ser 10-15 minutos
  5. Transferir el material aislado de materia gris en el tubo de molino de un homogeneizador de tejidos mano en una proporción de 50/50 con medio DMEM/F-12. Homogeneizar el material haciendo 8 arriba y abajo de movimientos con un mortero suelto, seguido por 8 arriba y abajo de movimientos con una mano apretada. Continuar hasta que todos aislados ha sido homogeneizado el material, luego transferir el homogeneizado a una botella de 500 mL y diluir con DMEM/F-12 a aproximadamente 450 mL de volumen total.
  6. Filtrar el homogeneizado con una botella de 500 mL tapa azul con porta filtro y 140 μm filtro de malla y aislar los capilares mediante la ejecución de los tejidos a través del filtro. Utilizar un filtro por cada 50 mL de homogenado y lavar cada filtro con DMEM/F-12 luego.
  7. Lugar el tubo capilar que contiene filtros en placas de Petri con una solución de la digestión de tripsina/EDTA (2.5% tripsina 0.1 nM EDTA en PBS), colagenasa CLS2 (2.000 U/mL) y DNasa 1 (3.400 U/mL) en DMEM/F-12. Use 1 placa de Petri (8,8 cm 2, solución 20 mL) por 3 mallas de filtro.
  8. Colocar las cajas Petri a 37 ° C por 1 h en un agitador orbital a 180 rpm o les Revuelva suavemente cada 10 minutos. Después de 1 h, salen de los capilares de los filtros con la suspensión de la caja Petri con una pipeta de 1 mL.
  9. Dividir la suspensión de los 3 platos en 2 tubos de 50 mL y detener la digestión agregando 10 mL DMEM/F-12 en cada tubo de 50 mL.
  10. Centrífuga las suspensiones celulares x 250 g, 4 ° C por 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 10 mL de DMEM/F-12. Agregar una más 20 mL de DMEM/F12 a cada tubo. Repetir la operación de la centrífuga con dos veces.
  11. Deja los tubos enfríen en hielo por 5 min y transferir las soluciones a 2 nuevos tubos de 50 mL.
  12. Centrifugar las suspensiones celulares x 250 g, 4 º C durante 5 minutos y resuspender cada pellet en 8-10 mL (aproximadamente 1 mL, cerebro utilizado) de la solución congelada que consiste en 10% de DMSO en FBS.
  13. Transferir la suspensión de células a crioviales, utilizar 1 mL por cryovial. En promedio, una purificación resulta en 1 frasco por cerebro utilizada, en promedio que las células endoteliales para insertos de 12-16. Coloque los frascos en una caja de congelación a-80 ° C durante al menos 4 h hasta la noche. A continuación, guarde los crioviales en cryotank con nitrógeno líquido.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido tiene temperaturas extremadamente bajas. Por favor, use protección adecuada.

2. Cultivo de pBECs primaria (8-10 días)

  1. Cultura inicial (3-5 días)
    1 día
    1. para optimizar las condiciones para la fijación de pBECs, realizar recubrimiento de un frasco de T75 mediante la adición de una solución final las concentraciones de colágeno IV (150 μg/mL) y fibronectina (50 μg/mL) en el ddH 2 O el matraz, asegurándose de que la solución cubre toda la superficie. Use 10 mL por cada frasco de T75. Incubar a 37 ° C durante 2 h.
      Nota: La capa puede ser realizada justo antes de utilizarlo o hasta una semana antes y almacenada con PBS a 4 ° C. El revestimiento no debe secarse, o ya no se formará una superficie adecuada fijación y crecimiento.
    2. Preparar 16 mL de pBEC crecimiento medio consisten en DMEM/F-12 suplementado con 10% suero de derivados del plasma (PDS), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y heparina (15 U/mL). Suplementar el medio con puromicina (4 μg/mL) para seleccionar las células endoteliales. Ten en cuenta que el tratamiento de puromicina puede utilizarse para un máximo de 5 días.
    3. Alícuota el medio preparado en 6 mL y 10 mL volúmenes en dos tubos de 15 mL.
    4. Traer un frasco con capilares de nitrógeno líquido (paso 1.13) y descongelar los capilares por el uso de un baño de agua de 37 ° C o añadiendo 750 μl del medio preparado de la alícuota de 6 mL. Si descongelar añadiendo medio, Pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo para descongelar y homogeneizar la suspensión. Cuando se haya descongelado, transferir la suspensión de células al medio 6 mL alícuota.
    5. Para eliminar el medio de congelación, girar los capilares abajo a 250 x g, 4 ° C por 7 min.
    6. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 1-2 mL de la alícuota de 10mL. Cuando vuelva a suspender, transferir la solución al medio 10mL alícuota.
    7. Transferir la suspensión capilar al matraz cubierto T75 y suavemente incline el frasco para asegurar una distribución igual sobre la superficie. Coloque el matraz T75 a 37 ° C, 5% CO 2.
      Día 2
    8. Después de la incubación durante la noche, preparar medio de cultivo 10 mL pBEC complementado con puromicina (4 μg/mL) para un matraz T75 y realizar un cambio de medio. Ten en cuenta que todas las soluciones medio aplicadas a las células deben ser precalentadas a 37 ° C antes de su uso.
      Nota: Como alternativa, un cambio medio puede realizarse 4-6 h post chapado cuando los tubos capilares deben atado a la superficie. Incube las células hasta alcanza 60-95% de confluencia, generalmente 3-5 días de deshielo. Hacer no allolas células w para llegar a 100% de confluencia para evitar inhibición de contacto que puede detener más crecimiento de la célula.
      Día 4-6
    9. Cuando se alcanza la confluencia deseada, paso de las células endoteliales a insertos de membrana permeable (ver sección 2.2). Si la confluencia deseada no se logra en el día 4, se realiza cambio de medio. A más tardar el día 6, las células deben ser pasadas a los insertos de membrana permeable. Si no se logra la necesaria confluencia de día 6, las células no son adecuadas para uso experimental.
      Nota: preparación de astrocitos de NCC: cuando se configura el modelo de la cultura, 2 - 8 semanas de edad astrocitos en cultivo (ver sección 4) deberían estar preparados para el modelo de la cultura mediante la realización de un cambio medio en la víspera de pases de las células endoteliales para insertos. Para cada astrositos, preparar 1500 μl de medio de crecimiento de astrositos consisten en DMEM baja glucosa suplementada con 10% FBS, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) y llevar a cabo el cambio de medio.
  2. Crecimiento de pBECs en Permeable la membrana inserta (5 días)
    día 4-6
    1. membrana permeable preparar rellenos (placa de 12 pozos con insertos de 1,12 cm 2 de superficie, 0,4 μm poros) para siembra de pBEC por recubrimiento con colágeno IV (500 μg/mL) y fibronectina (100 μg/mL) en el ddH 2 O. uso aproximadamente 300 μL de cada uno Inserte y asegúrese de que la solución cubre toda la superficie cada vez mayor. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 para un mínimo de 2 h.
    2. Preparar 30 mL de medio de crecimiento de pBEC (para la composición de los medios de comunicación, consulte Sección 2.1.2) sin puromicina.
    3. Aspirar el medio de la cultura de pBEC en el matraz T75 y suavemente Lave dos veces con 5 mL PBS estéril a temperatura ambiente.
    4. Trypsinize las células añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA (2.5% tripsina 0.1 nM EDTA en PBS) a T75 y coloque el frasco a 37 ° C, 5% CO 2 para 5-7 min.
    5. Para separar las células endoteliales del cerebro, golpee suavemente la parte del matraz T75 con los dedos, finalmente dejando sobreviviente y más fuerte fijación del pericitos en la superficie del frasco. Investigar visualmente la separación bajo un microscopio. Cuando se observa desprendimiento de 80%, parar la tripsinización añadiendo 5 mL de medio.
    6. Transferencia de la solución de células a un tubo de 15 mL con una pipeta de 10 mL y vuelta por las células endoteliales del cerebro por centrifugación a 250 x g, 4 º C durante 7 minutos.
    7. Con cuidado quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en medio de 1mL. Cuando suspendida, añadir 2 mL más de medio para llevar el volumen total a 3 mL
    8. cuenta el número de células manualmente por medio de un celular con cámara o un celular automático sistema de conteo. Preparar una solución de celdas de 2.2 x 10 5 medio de células/mL, resultando en una densidad de siembra final de 1.1 x 10 5 células/insertar.
    9. Retire solución de revestimiento de las inserciones de membrana permeable y transferir 500 μl de la suspensión de células a cada inserción. En uno de los insertos, añadir medio único y use esta inserto como un ' filtro solo ' control para las medidas de TEER.
    10. Establecer las células endoteliales en MC, MC con ACM, o NCC con astrocitos de la siguiente manera:
      1. de MC: añadir 1500 μl de medio de crecimiento del pBEC/ACM por pocillo de la placa de 12 pozos por debajo de los insertos de membrana permeable. Coloque los insertos de la membrana permeable a 37 ° C, 5% CO 2 e incúbelos durante 2 días.
      2. De NCC: transferencia inserta a pozos con renovado con medio de cultivo de astrositos astrositos el día antes. Coloque los insertos de la membrana permeable a 37 ° C, 5% CO 2 e incúbelos durante 2 días.
        Nota: Tenga en cuenta el uso de distintos tipos de medios en los pozos de la parte inferior de los tres modelos.
        Día 6-8
    11. En el día 2, cambiar los medios de comunicación sobre los insertos de membrana permeable con pBECs. Preparar 500 μl de medio de crecimiento de pBEC por insertar y realizar cuidadosamente el cambio para minimizar las interrupciones de la capa de células. Incube las células durante dos días. Ten en cuenta que el cambio de los medios de comunicación se lleva a cabo inserciones sólo y no de pozos fondo.
  3. Estimulación con factores de diferenciación (1-2 días)
    día 8-10
    1. para cada uno de los diferentes modelos, medios de estimulación deben estar preparados como sigue:
      1. de MC: para cada uno introducir y preparar bien, 500 μl de medio de crecimiento de pBEC que contiene campo (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17.5 μm).
        MC: Preparar además 1500 μl de medio de crecimiento de pBEC que contiene campo (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17.5 μm).
        MC con ACM: descongelar 1500 μl de ACM y complementar con campo (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17.5 μm).
      2. De NCC: para cada inserción, preparar 500 μl de medio de crecimiento de pBEC que contiene campo (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17.5 μm). Para cada bien de astrositos, preparar 1500 μl de DMEM/F-12 suplementado con penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL), heparina (15 U/mL), campaña (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17.5 μm).
    2. Para cada uno de los diferentes modelos, realizar intercambio de los medios de comunicación como sigue:
      1. de MC: cuidadosamente aspirar el medio de pozos y rellenos y añadir el medio de diferenciación en ambos compartimientos, con 500 μl de cada inserción y 1500 μl de cada pocillo. Ten en cuenta que interrupción a cada lado de la estufa puede afectar y alterar la capa celular.
      2. De NCC: cuidadosamente aspirar el medio de los pozos y añadir medio de diferenciación de 750 μl por pocillo. Cuidadosamente aspirar el medio de insertos y agregar 500 μl de medio de diferenciación por insertar. Luego añadir la restantes 750 μl de medio de diferenciación a cada astrositos bien.
    3. Para todos los modelos: Coloque las células a 37 ° C, 5% CO 2 e incube con medio de diferenciación hasta el día siguiente.
      Nota: Tenga en cuenta que para el NCC con astrocitos los astrocitos son desde este punto en medio sin suero.

3. Mediciones de TEER

  1. en el día después de estimular las células con medio de diferenciación, preparar el sistema de cámara de medición de resistencia de tejido para las mediciones de TEER enjuagando la cámara dos veces con ddH 2 O, una vez con el 70% EtOH durante 5 min. y 2 veces más con ddH 2 O.
  2. Añadir 4 mL de DMEM/F-12 a la cámara de medición de resistencia de tejido, conectar al sistema y calibrar para aproximadamente 30 min según los siguientes parámetros: R = 0, prueba R = 1000, modo = R.
  3. Realizar las mediciones de TEER colocando cuidadosamente los insertos en la cámara de medición de resistencia de tejido. Para cada insert, realizar mediciones por triplicado y calcular el promedio Ω cm 2.
    Nota: Para el modelo de la cultura, valores TEER se esperan que alcancen > 500 Ω cm 2. Si no se alcanza el nivel adecuado de TEER el primer día de medición TEER, agregar nuevos factores de diferenciación (campamento (250 μm), hidrocortisona (550 nM) y RO (17,5 μm)) y medir TEER otra vez en el día siguiente. Cuando se alcanzan los niveles adecuados, el modelo debe ser preparado para el experimento planeado. Tenga en cuenta que las células deben descansar durante al menos 3 horas antes de realizar el experimento para recuperarse después de las mediciones de TEER. Después de la estimulación, TEER valores en general permanecen aceptables durante 24-48 h después de la estimulación.
    Nota: Un método alternativo y más rápido utilizando el par de electrodos rígidos de STX - 100C también registra alta TEER en este modelo 81. La ele de STX2 flexiblectrode par da lecturas menos confiables.

4. PREPARACIÓN de los astrocitos para el COCULTIVO de contacto: Método alternativo

  1. Purificación de astrocitos
    1. para cada rata cerebro utilizado, capa 2 T75 matraces añadiendo 10 mL de poli-l-lisina (5 μg/mL) en Dec 2 O para cada uno T75 matraz. Incube los frascos a 37 º C durante 30 minutos
    2. Aislamiento de astrocytes puede realizarse como sigue:
      1. rata astrocitos:
        1. Decapito 2 1 - 2 días de edad ratas utilizando un método aprobado.
        2. Cortar la piel de cráneo comenzando desde el cuello hacia la nariz y cortar el hueso con una incisión sagital.
        3. Abrir el cráneo con el fórceps curvado, sacar el cerebro y colocarlo en un tubo de 15 mL (tubo 1) con 11 mL de glucosa baja de DMEM suplementada con 10% FBS y gentamicina Sulfato (125 μg/mL).
        4. Cuidadosamente quitar con unas pinzas de punta fina de meninges y suspender el material del cerebro usando una pipeta de 1 mL.
      2. Astrocitos porcinos:
        1. obtener 1 cerebro de un cerdo doméstico de 5-6 meses de edad.
        2. Retire cuidadosamente las meninges del cerebro utilizando pinzas de punta fina o manos.
        3. Recoger 4 g de gris materia del cerebro y coloca las piezas en glucosa baja de 1-2 mL DMEM suplementada con 10% FBS y gentamicina Sulfato (125 μg/mL) en una placa Petri. Si las piezas son grandes, picar con bisturís o pinzas.
        4. Suspender el material aislado con una pipeta de 1 mL, pasar a un tubo de 15 mL (tubo 1) y relleno con glucosa baja de DMEM suplementada con 10% FBS y gentamicina Sulfato (125 μg/mL) para un volumen total de 11 mL.
        5. Continúe homogeneizando el material aislado con una aguja larga, conectada a una jeringa de 10 mL y suspender por 3 veces. Espere hasta que las piezas grandes se han asentado en la parte inferior del tubo, luego recoger medio 7 mL de la parte superior del tubo (tubo 1).
        6. Filtrar la suspensión 7-mL a través de un filtro de nylon de 40 μm en un nuevo tubo de 50 mL (tubo 2).
        7. Medio de
        8. Agregar 7 mL al tubo 1 con el cerebro. Continuar con la homogenización y filtración de 4.1.2.2.5-6 pasos hasta que el volumen de suspensión celular filtrada en el tubo 2 es aproximadamente 35 mL.
    3. Retire la solución de recubrimiento de los matraces T75 [paso 4.1.1]. Un lavado rápido con 5 mL de PBS después de la incubación con poli-l-lisina puede utilizarse para asegurar que las células no se ven perjudicadas por los efectos tóxicos de la solución de capa.
    4. Dividir y semilla de la solución de astrositos aislado entre los frascos T75. Incube los frascos a 37 º C, 5% CO 2 para 3-5 días.
  2. Astrocitos cultivo y preparación de NCC con las células endoteliales (3 semanas)
    1. Cultura inicial
      1. después de 3-5 días de incubación, realizar un cambio medio cuidadosamente aspirando mediano y agregar 10 mL de la glucosa baja de DMEM suplementada con 10% FBS y gentamicina Sulfato (125 μg/mL).
        Nota: Después del primer cambio de medio, medio debe cambiarse cada 5 días. Durante las primeras 2 semanas, agitar los matraces y lavar las células con PBS al cambiar el medio. Esto ayuda en la eliminación de contaminante microglia.
      2. Después de 3 semanas de cultivo, trypsinize las células añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA a la parte inferior de cada matraz T75 e incúbelos a 37 ° C, 5% CO 2 para 5-7 min.
      3. Parar la tripsinización añadiendo 5 mL de medio, la solución de células a un tubo de 15 mL y centrifugar los astrocitos x 250 g, 4 ° C por 7 min.
      4. Con cuidado quite el sobrenadante y resuspender las células en solución de 10% de DMSO en equipos de congelación.
      5. Cuenta el número de células y preparar una solución de celdas de 4.0 x 10 6 células/mL. Congelar las células en crioviales añadiendo 1 mL por frasco.
    2. Crecimiento en Permeable la membrana insertar sistema fondo Wells (2-12 semanas)
      1. preparar platos para 12-bien para el crecimiento de los astrocitos mediante la adición de 1 mL de poli-l-lisina (5 μg/mL) en Dec 2 O para cada pozo. Colocar las placas a 37 ° C por 2 h.
      2. Para cada placa de 12 pozos, preparar 25 mL de medio de crecimiento de astrositos (glucosa baja en DMEM suplementado con 10% FBS y penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL)).
      3. Traer el frasco de astrocitos de nitrógeno líquido y descongelar las células añadiendo 750 μl DMEM glucosa baja de medio. Cuidadosamente pipetee hacia arriba y hacia abajo para descongelar y homogeneizar la suspensión. Cuando se haya descongelado, transfiera la suspensión de células a un tubo de 15 mL y añadir de medio a un volumen total de 7 mL.
        PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura, así que use protección personal como guantes.
      4. Para eliminar el medio de congelación, girar los capilares abajo a 250 x g, 4 ° C por 7 min.
      5. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio.
      6. Retire el recubrimiento de los pocillos de las placas bien 12 y transferir la suspensión de células a pozos utilizando 1 mL por pocillo. Incube las células a 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Actualizar el medio cada tercer día y la cultura de las células durante un mínimo de 2 semanas antes de usar las células para el cocultivo con células endoteliales. Las células se pueden utilizar para el cocultivo durante hasta 12 semanas después de descongelar, con la edad óptima es de 2 a 8 semanas.

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Representative Results

Establecimiento de los modelos In Vitro de BBB

En el método presentado, optimizado, cultivo de pBECs y el establecimiento del sistema de inserción de membrana permeable con MC o sin ACM o NCC con astrocitos (figura 1) se llevó a cabo durante un período de 9-11 días (figura 2). Para la selección de las células endoteliales, una cultura inicial de fragmentos capilares purificadas fue combinada con el tratamiento de puromicina para un máximo de 5 días, que eliminó la mayoría de las células contaminante y promovieron el crecimiento de las células endoteliales fusiformes de la fragmentos capilares (Figura 3A-C). Día 4-6, pBECs había proliferado a una confluencia de 60-95%, creciendo como no superpuestos, células alineadas longitudinalmente, inhibida por el contacto. Cuando las células alcanzaron la confluencia deseada, pBECs fueron plateadas en colágeno IV y fibronectina revestido membrana permeable insertar filtro membranas (2 de 1,12 cm superficie, 0,4 μm poros) a una densidad de 1.1 x 105 células/insertar, en el que se normalmente forman monocapas confluentes después de 4 días (días post aislamiento 8-10). Cuando co-cultivo pBECs, astrocitos de rata o de origen porcino fueron plateados en pozos inferior recubiertos de poli-l-lisina durante un mínimo de 2 semanas antes de comenzar el NCC (figura 3D). Al establecer la NCC, la experiencia ha demostrado que los astrocitos cultivados de 2 a 8 semanas proveen el mejor apoyo para la promoción del fenotipo BBB en pBECs; dentro de este tiempo, los astrocitos forman culturas confluyentes con células dispuestas en una estructura de nido de abeja-como (figura 3E-F). El día 4 en el modelo de sistema de inserción de membrana permeable (día 8-10 post de aislamiento), las células fueron estimuladas con campamento, hidrocortisona y RO para aumentar la tensión de barrera y el patrón de expresión característico de BBB de proteínas Unión apretadas, transportadores, y receptores.

Caracterización del fenotipo del pBEC y permeabilidad paracelular

Inspección visual de la célula combinada con medición de TEER rutinariamente son las maneras más confiables para evaluar la confluencia y la tirantez de la capa de células endoteliales en los insertos de membrana permeable antes de los experimentos. La figura 4 muestra los resultados de dos series de experimentos para evaluar la permeabilidad de fármacos de molécula pequeña a través de la BBB, los parámetros de control de TEER (reflejando la permeabilidad iónica) combinados con permeabilidad aparente21 (aplicaciónde P, cm s-1) de sacarosa radiactiva o tinte trazador Lucifer amarillo (LY), que refleja la permeabilidad paracelular de moléculas de droga pequeño típico (~ 200-600 Da). Un compuesto de interés con una Pla aplicación mayor que el de Pla aplicación de sacarosa o LY (dependiendo del peso molecular de la droga) podría sugerir permeabilidad transcelular o transporte a través de las células. Figura 4 muestra que en membrana permeable con pBECs cultivadas sobre astrocitos de rata, buenos lotes de pBEC (e.g. aquí establece la LY) generará tario en la gama 500-2000 Ω cm2, con algunas mayores o menores. Algunos lotes, especialmente durante las primeras etapas del aprendizaje el protocolo, pueden tener tario inferior alrededor de 100-900 Ω cm2 (por ejemplo, aquí establece la sacarosa). Medición de TEER permite la selección de filtros, por ejemplo a partir de TEER > 500 Ω cm2, y sobre la gama de TEER demostrado, Papp es relativamente independiente de TEER, indicativo de una capa de barrera lo suficientemente apretado para estos experimentos. El protocolo para la medición de permeabilidad depende del tipo de construcción de soluto. Para una descripción del procedimiento para la medición de permeabilidad de moléculas pequeñas en la NCC, se describe un protocolo Yusof, SR, et. al21. Evaluación de la expresión de las proteínas de Unión estrecha en pBECs en NCC con astrocitos de rata mostró localización de claudin 5 occludin y ZO-1 a lo largo de las ensambladuras de la célula, como se muestra por inmunofluorescencia (figura 5A-C). Asimismo, lo adherens Unión proteína p120 catenina mostró distribución bien definida a lo largo de las ensambladuras de la célula (figura 5).

Figure 1
Figura 1: representación esquemática de los modelos BBB in vitro aplicados. Representación esquemática de la membrana permeable al insertar modelos de sistema de pBECs en MC (A), MC con ACM (B)y NCC con astrocitos (C). En el MC, pBEC medio o ACM se aplicaron en los pozos de la parte inferior, mientras que en la CNC, insertos con pBECs fueron colocados en pozos con astrocitos 2-8 semanas de edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de flujo de los pasos principales en el cultivo de pBEC y el establecimiento de los modelos presentados. Para un resumen y el cronograma para el método, esta presentación esquema resume los pasos principales en el procedimiento de cultivo de pBECs y establecimiento de los modelos presentados, es decir, MC con o sin ACM y NCC con astrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: curso de representante temporal de cultivos iniciales de astrocitos de rata y pBECs. Contraste de fase microscopio imágenes de culturas del pBECs (A-C) y astrocitos (D-F) ver durante 5 días. Purificar fragmentos capilares en el primer día de la cultura inicial demostrada la presencia de capilares y células contaminantes (A, día 1), que después cambio medio día 2 y un día adicional de crecimiento, mostró la selección de pBECs, a partir de su crecimiento de los fragmentos capilares (B, día 3). Monocapas confluentes de pBECs se lograron en el día 4-6, momento en el que pBECs demostró morfología en forma de huso y fueron alineados longitudinalmente (C). Astrocitos de rata sembrados de fondo pozos normalmente proliferaron a capas confluentes plazo de 5 días (D-F)y fueron utilizados para los modelos de NCC después de 2 semanas de crecimiento. Barra de escala para todas las imágenes: 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: integridad apretada de la ensambladura de pBECs. Permeabilidad aparente (Papp) de pBECs a paracelular marcadores sacarosa (342.5 MW 14C-etiquetados, 14,8 25,9 GBq/mmol) y Lucifer amarillo (MW 521.57, 10 μg mL-1), enfrenta a TEER. pBECs se cultiva en 1,12 cm2 permeable Inserte los filtros de membrana por encima de los astrocitos de rata en la base del pozo y marcadores a la cámara apical. Después de 1 hora a 37 & #730; C, aparición del marcador en el compartimiento basal fue medido y apical al basal Papp (x 10-6 cm seg-1) calculado. Se midió TEER > 3 h antes P de laaplicación, utilizando electrodos de EVOM STX100C, corregido por el filtro de membrana permeable en blanco insertar con resistencia 150 Ω. TEER promedio para el conjunto de datos Lucifer amarillo fue de 1249 ± 80 Ω cm2 (media ± SEM, n = 55). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterización de Immunocytochemical de pBECs. Para pBECs en 1,12 cm2 membrana permeable insertar filtro inserta encima de astrocitos de rata en el pozo de base, análisis de la microscopia de la inmunofluorescencia de los componentes de la ensambladura apretada Claudin (A) (B) 5 Occludin (C) ZO-1, adherens Unión proteína (D) p120 catenina demostró localización bien definida en las ensambladuras de la célula-célula y revela capas de células endoteliales de cerebro confluente con células fusiformes, sin traslapo. Barra de escala para todas las fotos: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Purificación y proliferación de pBEC

Durante el procedimiento de purificación, pasos críticos incluyen eliminación rápida y eficaz de meninges y separación de la materia blanca y gris, que es importante para el rendimiento de la purificación y la pureza y el establecimiento adecuado del modelo. El presentado en vitro BBB modelo con pBECs, hemos mejorado y simplificado de un procedimiento de purificación basado en homogeneización mecánica de materia gris aislada, tamaño selectivo de filtración para el aislamiento de microvasos, digestión con colagenasa , ADNasa y tripsina, con una cultura inicial de fragmentos del microvessel. En general, uno de los mayores retos durante la purificación y cultivo de células primarias es la eliminación de células contaminantes. Experiencia con la purificación de las células endoteliales cerebrales primarios ha indicado que retiro cuidadoso de meninges y resultados de la materia blanca en mejora de pureza y rendimiento de los capilares, así como mayor crecimiento de la célula endotelial y expresión de BBB características. Por esta razón, cuidadosa eliminación de meninges (incluyendo dentro de surcos) en el protocolo presentado fue diseñado para asegurar el retiro de leptomeningeal células (que tienen propiedades similares a los fibroblastos), así como de las células de la musculatura lisa arterial y arteriolar, que crecen más rápidamente que las células endoteliales en cultivo. Asimismo, minimización del material de la materia blanca resultó en cultivos de células endoteliales más puros, con menos células contaminantes de los fragmentos aislados de capilares. Sin embargo, esta rápida método aplicado para el aislamiento reduce la producción de capilares aisladas y optimización del aislamiento de materia gris podría mejorar significativamente el rendimiento de cada cerebro. Un gradiente de densidad, que está incluido en un protocolo de purificación alternativo69, puede utilizarse para aislar células endoteliales libres y mejorar la pureza de la célula endotelial, pero es mucho tiempo y además puede disminuir el rendimiento. Ambos de estos métodos de purificación han sido ampliamente utilizados y caracterizado y compartir las características de generación de alta TEER pBEC modelos en MC y astrositos co-cultivo (normalmente 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

Para establecer las monocapas con carácter restrictivo alto paracelular, la experiencia ha demostrado que los pericitos deben eliminarse del endotelial culturas16. Pericitos de cerebro porcino generalmente crecen por debajo de las capas de pBEC y no hacen agujeros en las capas endoteliales, como observado en cultivos de cerebro de rata células endoteliales72,73. Pericitos en pBEC culturas hacen, sin embargo, tienden a afectar la morfología de las células endoteliales, que aparecen más amplio y con células irregulares internos16. Porque las células endoteliales del cerebro expresan niveles más altos de los transportadores de eflujo (e.g. P-glicoproteína) que otros tipos de células en los microvasos, puede reducirse el número de células contaminantes por puromicina tratamiento74. Además, el uso de derivados de plasma suero (PDS) en lugar de becerro fetal o neonatal deriva del suero favorece el crecimiento de las células endoteliales, como el PDS tiene una menor concentración de factores de crecimiento como factor de crecimiento derivado de plaquetas y de crecimiento endotelial vascular factor, que se muestran para aumentar permeabilidad BBB y estimular angiogénesis14,75,76,77. Introduciendo una cultura inicial de fragmentos aislados de capilares y combina esto con tratamiento de puromicina (4 μg/mL) y el uso de PDS, hemos logrado disminuir significativamente el número de células contaminantes restantes después de la purificación, por lo que después de eso podríamos establecer firmemente monocapas endoteliales sobre insertos de membrana permeable. Para garantizar el mejor acoplamiento de las células endoteliales en platos de la cultura y las superficies de inserción de membrana permeable, se ha observado que una mezcla de la capa de colágeno de tipo IV (de la placenta humana) y la fibronectina aumenta en gran medida la proliferación rendimientos y la mezcla combinada fue favorecido por lo tanto sobre el método tradicional usando solamente colágeno de tipo I78.

Diferenciación de las células y el establecimiento de un modelo de TEER alta In Vitro BBB

PBECs en MC generalmente retienen muchas características claves de BBB tras aislamiento, ello cocultivo con astrocitos no es esencial para inducir a ensambladuras apretadas funcionales y lograr alta TEER valores16,57. Esfuerzos para optimizar las condiciones para la diferenciación de las células endoteliales en fenotipo BBB incluyen el uso de que contiene el suero suplementado con 8-CPT-cAMP, hidrocortisona7 (aumento de intracelular campo nivel13) y RO 20-1724 (manteniendo el nivel intracelular de cAMP), que según los anteriores resultados de74,79 junto con éxito mejora la tensión de barrera aumentó TEER y también han ayudado a restablecer más en vivo como expresión génica perfil80. Sin embargo, el uso de hidrocortisona para el endurecimiento de la capa endotelial puede modificar la respuesta de las células endoteliales a determinados estímulos y con el fin de utilizar el modelo para la investigación de las respuestas a la quimioterapia y las citocinas durante la inflamación, la uso de la hidrocortisona puede necesitar ser evitado.

De estudios comparativos con MC, MC con ACM y astrositos Co culturas en tanto los laboratorios participantes y en otros lugares, se ha demostrado que aporte astrocytic es capaz de mejorar las características BBB endoteliales y aumento de la tensión de barrera 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. para alcanzar esa alta expresión del fenotipo BBB en pBECs, establecimos una NCC con astrocitos y encontró que ambos porcino y astrocitos primarios de rata fueron beneficiosos, como también se observó en otros laboratorios22. Durante el establecimiento de los astrositos NCCs, la experiencia ha demostrado que la pureza y la edad de las culturas de astrositos influyen en la tirantez de barrera endotelial resultante, wITH la edad óptima de los astrocitos es 2 a 8 semanas, que se correlaciona con un cambio observado en la morfología de astrositos con el tiempo. El día antes de la NCC, un cambio medio de los astrocitos se pretende eliminar metabolitos nocivos y permitir suficiente tiempo para que los astrocitos a la estimulación y señalización factores que influyen en el desarrollo de la barrera. Cuando co-cultivo las células endoteliales y astrocitos en el sistema de inserción de membrana permeable, es importante prestar especial atención a la manipulación del modelo de barrera. Durante el cambio de medio, tanto la aspiración y adición del medio y los movimientos de las inserciones deben hacerse con cuidado para reducir al mínimo la interrupción de la barrera endotelial.

Reproducibilidad y fiabilidad

Un gran desafío al utilizar células primarias para establecer modelos en vitro es lograr alta reproducibilidad entre culturas. Tal normalización puede cumplirse por la elección del método, uso de herramientas de alta calidad y reactivos y experiencia en microdissection. La reproducibilidad alta baja variación de lote a lote para el método presentado es por lo tanto depende en gran medida de la estricta observancia a los procedimientos descritos.

Para lograr una buena reproducibilidad entre lotes y frascos durante TEER las medidas, una cámara de medición de resistencia de tejido o voltímetros epiteliales con electrodos miniatura rígido, en lugar de electrodos del palillo flexible pueden ser utilizados, reduce el variabilidad de los valores observados de TEER. Además de lograr altos valores TEER (figura 4), se confirma la confiabilidad del modelo presentado por la permeabilidad soluto pequeños baja correspondiente (figura 4) y por la caracterización de immunocytochemical de la pBECs (figura 5 ).

Limitaciones del método aplicado y del modelo

La utilización de cerdos transgénicos y miniaturas ha aumentado durante las últimas décadas, pero la cantidad de datos en vivo es aún limitada en comparación con los datos disponibles para modelos de roedores y por lo tanto puede plantear un desafío para comparar los datos en vitro porcina con resultados en vivo . Sin embargo, como la biología del cerdo refleja más de cerca que muchos animales de laboratorio establecidos biología humana y modelos de cerdo transgénico para estudiar enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer han sido establecido84, la disponibilidad de en vivo datos se esperan llegar a ser menos problemático con el tiempo.

Una limitación de los modelos actuales del sistema inserción de membrana permeable de la BBB es la incapacidad para imitar el flujo sanguíneo en los microvasos. En vivo, tensión de esquileo se ha demostrado afectar muchos aspectos de la fisiología de la célula endotelial como la división, diferenciación, migración y apoptosis85,86y para influir en las características importantes de BBB como la expresión de proteínas de Unión y la inducción y polarización de transportadores61,85,87. Para introducir estas condiciones, se pueden considerar sistemas microfluídicos desarrollado recientemente88,89,90.

Un método útil para corregir el efecto de la capa de agua marchara (capa de límite acuosa) de datos de permeabilidad en vitro es derivar la predicha 'permeabilidad intrínseca' en vivo, usando el software basado en enfoque21. Este software puede utilizarse también para permeabilidad detallada datos análisis21.

Futuras aplicaciones y direcciones para el método

Como los componentes de la unidad neurovascular se han demostrado para desempeñar un papel importante en inducir y mantener características BBB, y ningún modelo actual de vitro aún ha sido capaz de imitar completamente el en vivo condiciones, componentes importantes y las interacciones pueden ser todavía falta. Los esfuerzos actuales en el desarrollo del modelo presentado incluyen establecer modelos triple-cultura con astrocitos y pericitos y experimentos combinando células de diferentes especies. Incorporación del pericitos hasta ahora no ha se ha observado para aumentar significativamente los niveles TEER de la barrera. Sin embargo, se han observado syngeneic porcinos modelos comparables a triple culturas utilizando células endoteliales de cerebro porcino, astrocitos de rata y rata de pericitos con respecto a la tensión de barrera y expresión de las características de las proteínas de sello del cerebro endotelio22. Para desarrollar un modelo basado en las células humanas, futuros desarrollos de in vitro modelos BBB para entrega y descubrimiento de fármacos pueden depender de la derivación de células madre humanas pluripotentes y adulto madre o progenitora células21.

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Disclosures

Los autores no divulgan ningún conflicto de interés.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen y Niels M. Kristiansen para asistencia técnica y número R155-2013-14113 de concesión de la Fundación Lundbeck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

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References

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