लक्ष्यीकरण Cysteine Thiols के लिए इन विट्रो साइट-संयोजक प्रोटीन के विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन

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Immunology and Infection

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Summary

ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण सजातीय नमूनों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है । यहां, हम साइट के लिए एक कुशल रासायनिक विधि वर्तमान संयोजक प्रोटीन के विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रियाशील Cys thiols लक्ष्यीकरण द्वारा बैक्टीरिया से शुद्ध ।

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Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

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Abstract

Stromal इंटरेक्शन अणु-१ (STIM1) एक प्रकार है-I transmembrane प्रोटीन endoplasmic जालिका (ER) और प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) पर स्थित है । एर निवासी STIM1 एक दुकान के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में पीएम Orai1 चैनलों की गतिविधि को विनियमित कैल्शियम (सीए2 +) प्रवेश जो प्रिंसिपल सीए2 + संकेतन प्रक्रिया है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ड्राइव. STIM1 के बाद दो चमकीले Asn स्थलों पर ग्लाइकोसिलेशन का बहोत ही 2 + अणु का सेंसिंग डोमेन है । हालांकि, जैव रासायनिक, भौतिक, और संरचना एनके जैविक प्रभाव-ग्लाइकोसिलेटेड STIM1 हाल ही में एक को आसानी से सजातीय N-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए अक्षमता की वजह से समझ रहे थे । यहां, हम एक इन विट्रो रासायनिक दृष्टिकोण है जो विशिष्ट प्रोटीन के अंतर्निहित प्रभाव को समझने के लिए लागू करने के लिए ग्लूकोज moieties देता है के कार्यांवयन का वर्णन एनप्रोटीन संरचना और तंत्र पर ग्लाइकोसिलेशन । समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग हम संशोधन की दोनों दक्षता के साथ ही एक नमूना के साथ ग्लूकोज लगाव के संरचनात्मक परिणामों का आकलन. इस दृष्टिकोण आसानी से प्रकृति में पाया असंख्य ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

स्टोर संचालित कैल्शियम (सीए2 +) प्रविष्टि (SOCE) प्रमुख मार्ग है जिसके द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ले2 + extracellular अंतरिक्ष से cytosol में Ca । टी लिम्फोसाइटों में प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) बाँध एंटीजन पर स्थित टी सेल रिसेप्टर्स जो प्रोटीन tyrosine kinases को सक्रिय करते हैं ( 1,2,3) में समीक्षित । एक फास्फारिलीकरण झरना phospholipase के सक्रियकरण की ओर जाता है-γ (PLCγ) जो बाद में hydrolysis और phosphatidylinositol 1, 4, 5-bisphosphate में झिल्ली diacylglycerol 4, 5-inositol (रंज2) के trisphosphate मध्यस्थता (आईपी3 ). आईपी3 एक छोटी सी diffusible दूत जो आईपी3 रिसेप्टर्स (आईपी3आर) endoplasmic जालिका (एर) पर बांधता है जिससे इस रिसेप्टर चैनल खोलने और सीए2 + की अनुमति के लिए नीचे की ओर प्रवाह से एकाग्रता ढाल एर लुमेन को cytosol ( 4में समीक्षित) । जी प्रोटीन से संकेत रिसेप्टर युग्मित और अन्य उत्तेजित और गैर उत्तेजक कोशिका प्रकार की एक किस्म में tyrosine कळेनासे रिसेप्टर्स आईपी3 और आईपी के सक्रियकरण3रुपए का एक ही उत्पादन के लिए नेतृत्व.

के कारण परिमित ca2 + ईआर की भंडारण क्षमता, आईपी3-मध्यस्थता जारी है और cytosolic Ca में परिणामी वृद्धि2 + केवल क्षणिक है; हालांकि, एर चमकदार Ca के इस घट2 + निराधार प्रभाव stromal संपर्क अणु-1 (STIM1), एक प्रकार-I transmembrane (TM) प्रोटीन ज्यादातर एर झिल्ली 5पर पाया,6,7। एक EF-हाथ जोड़ी और बाँझ α-आकृति (EFSAM) से बना STIM1 एक लुमेन उंमुख सीए2 + संवेदन डोमेन शामिल हैं । तीन cytosolic-उंमुख कुंडलित डोमेन एकल TM डोमेन द्वारा EFSAM से अलग कर रहे है ( 8में समीक्षित) । एर पर चमकीले Ca2 + कमी, EFSAM एक स्थिरीकरण-oligomerization 7युग्मित,9 जो TM और कुंडलित-कुंडल डोमेन 10के संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था का कारण बनता है । ये संरचनात्मक परिवर्तन एर-पीएम जंक्शनों 11,12,13,14 में STIM1 के एक फँसाने में महायुद्ध के साथ बातचीत के माध्यम से phosphoinositides 15, 16 व Orai1 उपइकाईयां 17,18. Orai1 प्रोटीन पीएम उपइकाई है जो सीए2 + चैनल 19,20,21,22के रूप में इकट्ठा कर रहे हैं । एर-पीएम जंक्शनों पर STIM1-Orai1 बातचीत एक खुले सीए की सुविधा2 + रिलीज़ सक्रिय ca2 + (CRAC) चैनल अनुरूपण जो के उच्च सांद्रता से cytosol में सीए2 + के आंदोलन को सक्षम बनाता है extracellular स्पेस. प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, निरंतर cytosolic ca2 + उंनयन CRAC चैनलों के माध्यम से प्रेरित सीए2 +-calmodulin/calcineurin निर्भर dephosphorylation के परमाणु कारक के सक्रिय टी कोशिकाओं जो बाद में नाभिक में प्रवेश करती है और टी सेल सक्रियकरण 1,3को बढ़ावा देने के जीन का transcriptional विनियमन शुरू होता है । STIM1 द्वारा CRAC चैनल सक्रियण की प्रक्रिया 23,24 के माध्यम से एगोनिस्ट-प्रेरित एर चमकदार ca2 + घट और परिणामस्वरूप निरंतर cytosolic ca2 + ऊंचाई सामूहिक रूप से 25SOCE है । टी कोशिकाओं में SOCE की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन अध्ययनों से स्पष्ट है कि दोनों STIM1 और Orai1 में heritable उत्परिवर्तनों गंभीर संयुक्त इम्यूनो सिंड्रोम पैदा कर सकता है 3,19,26, 27. EFSAM आरंभ करता है SOCE संवेदन के बाद एर-चमकदार सीए2 + समाप्त ca के नुकसान के माध्यम से2 + विहित EF-हाथ में समंवय, अंततः स्थिरीकरण के लिए अग्रणी-युग्मित स्वयं-संघ 7, २८,२९.

ग्लाइकोसिलेशन आबंध लगाव और oligosaccharide संरचनाओं के प्रसंस्करण, भी glycans के रूप में जाना जाता है, एर और Golgi में विभिंन प्रकार के कृत्रिम कदम के माध्यम से ( 30में समीक्षा की गई है,३२,३३) । eukaryotes में ग्लाइकोसिलेशन के दो प्रमुख प्रकार हैं: एन-लिंक्ड और -लिंक्ड, विशिष्ट अमीनो एसिड और लिंकेज को पाटने वाले एटम पर निर्भर करता है । N-ग्लाइकोसिलेशन में, glycans Asn के बीच पक्ष श्रृंखला से जुड़े रहे हैं, और ज्यादातर मामलों में, दीक्षा कदम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला लुमेन ३४में चलता है के रूप में ईआर में होता है । N-ग्लाइकोसिलेशन का पहला कदम एक चौदह चीनी कोर संरचना ग्लूकोज (Glc), mannose (आदमी), और एन-acetylglucosamine (GlcNAc) (यानी Glc3आदमी9GlcNAc2) एक एर से बना के हस्तांतरण है झिल्ली लिपिड एक oligosaccharyltransferase ३५,३६द्वारा । इसके अलावा कदम, जैसे दरार या ग्लूकोज के अवशेषों का हस्तांतरण, ईआर में विशिष्ट glycosidases और glycosyltransferases द्वारा catalyzed हैं । कुछ प्रोटीन है कि एर छोड़ और Golgi में कदम आगे ३७संसाधित किया जा सकता है । -ग्लाइकोसिलेशन glycans के अलावा करने के लिए संदर्भित करता है, आम तौर पर पक्ष श्रृंखला हाइड्रॉक्सिल समूह Ser या के अवशेषों के लिए, और इस संशोधन Golgi परिसर में पूरी तरह से होता है ३३,३४. वहां कई glycan संरचनाओं जो N-acetylglucosamine, fucose, गैलेक्टोज, और sialic एसिड प्रत्येक monosaccharide के साथ बनाया जा सकता है क्रमिक रूप से ३३जोड़ा ।

कई प्रकार के O-ग्लाइकोसिलेशन के लिए कोई विशिष्ट अनुक्रम शर्त के रूप में पहचाना गया है, जबकि N-लिंक किए गए संशोधन के साथ एक आम सहमति अनुक्रम संबद्ध किया गया है: Asn-x-Ser/Cys, जहां x किसी भी एमिनो एसिड हो सकता है सिवाय प्रो ३३। STIM1 EFSAM में इनमें से दो आम सहमत हैं N-ग्लाइकोसिलेशन साइटें: Asn131-Trp132-Thr133 और Asn171-Thr172-Thr173. दरअसल, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि EFSAM में Asn131 और Asn171 ३८,३९,४०,४१पर स्तनधारी कोशिकाओं में एन-ग्लाइकोसिलेटेड हो सकता है । हालांकि, SOCE पर N-ग्लाइकोसिलेशन के परिणामों के पिछले अध्ययनों को incongruent गया है, SOCE सक्रियण पर इस पोस्ट-शोधों संशोधन द्वारा दबा, potentiated या कोई प्रभाव नहीं सुझाया गया है ३८,= "xref" > 39,४०,४१. इस प्रकार, अंतर्निहित भौतिक, जैव रासायनिक, और EFSAM N-ग्लाइकोसिलेशन के संरचनात्मक परिणामों पर अनुसंधान इस संशोधन के विनियामक प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इन इन विट्रो प्रयोगों में सजातीय प्रोटीन के उच्च स्तर के लिए आवश्यकता के कारण, एक साइट-चुनिंदा covalently करने के लिए moieties संलग्न करने के लिए दृष्टिकोण ग्लूकोज EFSAM करने के लिए लागू किया गया था । दिलचस्प है, Asn131 और Asn171 ग्लाइकोसिलेशन संरचनात्मक परिवर्तन है कि EFSAM कोर के भीतर एकाग्र और जो STIM1-मध्यस्थता SOCE ४२को बढ़ावा देने के लिए भौतिक गुणों को बढ़ाने के कारण ।

Cys thiols करने के लिए glycosyl समूहों के रासायनिक लगाव अच्छी तरह से किया गया है एक प्राथमिक काम है जो पहली बार इस एंजाइम की उपयोगिता-मुक्त दृष्टिकोण को समझने के लिए साइट-प्रोटीन समारोह पर ग्लाइकोसिलेशन के विशिष्ट प्रभावों का प्रदर्शन द्वारा स्थापित ४३ , ४४. हाल ही में और STIM1 के संबंध में, Asn131 और Asn171 अवशेषों Cys और ग्लूकोज-5-(methanethiosulfonate) [ग्लूकोज-5-(MTS)] के लिए रूपांतरित हो गए थे covalently लिंक करने के लिए ग्लूकोज मुक्त thiols ४२करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यहां, हम इस दृष्टिकोण का वर्णन है जो न केवल संशोधन के लिए साइट विशिष्ट Cys अवशेषों को शामिल mutagenesis का उपयोग करता है, लेकिन यह भी समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी तेजी से दोनों संशोधन दक्षता और संरचनात्मक का आकलन करने के लिए लागू होता है perturbations के फलस्वरूप ग्लाइकोसिलेशन । विशेष रूप से, यह सामांय पद्धति आसानी से किसी भी recombinantly उत्पादित प्रोटीन का या तो O-या N-ग्लाइकोसिलेशन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)-एक बैक्टीरियल पालतू-28a अभिव्यक्ति वेक्टर में Cys के शामिल करने के लिए मध्यस्थता साइट-निर्देशित mutagenesis.

  1. पालतू-28a वेक्टर की एकाग्रता का निर्धारण (यानी डबल असहाय डीएनए) ०.०२० के एक पराबैंगनी (यूवी) विलुप्त गुणांक का उपयोग (& #956; जी/एमएल) सेमी -1 २६० एनएम पर ।
  2. संश्लेषित प्रत्येक Cys उत्परिवर्तन के लिए पूरक mutagenic प्राइमरों की एक जोड़ी ऐसी है कि मैं ) वहां 15 न्यूक्लियोटाइड पहले आधार बेमेल और 15 न्यूक्लियोटाइड के पूरक के लिए पहले टेंपलेट के पूरक के एक ंयूनतम रहे है के बाद टेंपलेट अंतिम आधार बेमेल, द्वितीय ) कुल प्राइमर लंबाई ४५ न्यूक्लियोटाइड से अधिक नहीं है, और iii ) एक guanine या cytosine प्रत्येक प्राइमर (तालिका 1) के प्रथम और अंतिम न्यूक्लियोटाइड स्थिति पर स्थित है । सुनिश्चित प्राइमर संश्लेषण एक ०.०२५ & #956 का उपयोग किया जाता है; मॉल स्केल और कारतूस शुद्धि ।
  3. एक उच्च निष्ठा वाला डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर, २ २० & #181; L पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण: एक आगे प्राइमर युक्त और दूसरा रिवर्स प्राइमर युक्त । प्रत्येक मिश्रण तैयार 1x & #160;P cr बफर के अंतिम सांद्रता शामिल करने के लिए १.५ mM MgCl 2 के साथ, ०.२ mM dNTPs, ०.५ & #956; M प्राइमरी, ०.४ & #956; l DMSO, १.२५ एनजी/& #956; l खाके डीएनए, ०.०२ U/& #956; l उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़.
  4. थर्मल एक तीन कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग मिश्रण चक्र: ९८ & #176; ग के लिए 30 एस (denaturing), ५३-५६ & #176; ग के लिए 30 एस (एनीलिंग), ७२ & #176; ग के लिए 30 एस kilobase (केबी) -1 (विस् तार) का टें पलेट डीएनए । 5 चक्र के लिए तापमान कार्यक्रम को दोहराने और एक अंतिम ७२ & #176 जोड़ने के लिए, ७.५ min.
  5. के लिए C विस्तार चरण
  6. अलग ट्यूबों में आगे और रिवर्स प्राइमरों के साथ प्रारंभिक पीसीआर के बाद, एक एकल ट्यूब में उत्पादों गठबंधन (यानी ४० & #956; L कुल) और एक अतिरिक्त 20 चक्र के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया जारी एक ही साइकिलिंग मानकों का उपयोग कर के रूप में १.४ कदम में वर्णित है.
  7. Electrophorese 15 & #956; पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर की एक 1% (डब्ल्यू/वी) agarose जेल का प्रयोग 0.5 x Tris, एसिटिक एसिड, ईथीलीन डायमाइन टेट्रा एसिटिक एसिड (EDTA) रनिंग बफर (ताे) पर करें । नियंत्रण के रूप में, electrophorese डीएनए जो पीसीआर द्वारा परिलक्षित नहीं किया गया है और संदर्भ डीएनए सीढ़ी जो मार्कर बैंड दोनों अधिक से अधिक और आशा की पीसीआर उत्पाद आकार से कम शामिल है की एक समकक्ष राशि है ।
  8. ४० मिनट के लिए १२० V पर ट्रो के बाद
  9. , ०.५ & #956; जी/एमएल ethidium ब्रोमाइड और 30 मिनट के लिए शेक रूम के तापमान पर से युक्त पानी में जेल जलमग्न । पूर्ण लंबाई टेम्पलेट की पुष्टि करें mutagenic प्राइमरों के सापेक्ष ethidium में वृद्धि के रूप में प्रवर्धित बैंड के ब्रोमाइड फ्लोरोसेंट तीव्रता नियंत्रण टेम्पलेट बैंड के तहत यूवी प्रकाश (३०२ एनएम) की तुलना में.
    1. यदि कोई प्रवर्धन स्पष्ट नहीं है, तो एनीलिंग तापमान को एडजस्ट करने के बाद पीसीआर को दोहराएँ ०.५ & #176; सी वेतन वृद्धि के बीच ५३-५६ & #176; c तापमान रेंज.
  10. mutagenic प्राइमरों द्वारा टेंपलेट के प्रवर्धन की पुष्टि पर, शेष ~ 25 & #956 का इलाज; DpnI प्रतिबंध एंजाइम के साथ पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर के एल मिथाइलयुक्त टेम्पलेट डीएनए को पचाने के लिए. प्रयोग DpnI at ०.५ & #181; l (10 इकाइयाँ) प्रति 25 & #956; l पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर और 1 & #215 का अंतिम एकाग्रता; DpnI प्रतिक्रिया बफर. २.५ के लिए मशीन ३७ & #176; C.
  11. निंन टेंपलेट पाचन, जोड़ें ~ 5-10 & #956; पच मिश्रण का १०० & #181; l हीट शॉक सक्षम DH5 & #945; Esherichia कोलाई कोशिकाओं में एक १.७५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब । गर्मी सेल-६० min.
  12. के लिए बर्फ पर डीएनए मिश्रण
  13. हीट शॉक सेल-डीएनए मिश्रण में microcentrifuge ट्यूब पर ४२ & #176; सी के लिए एक सूखी गर्मी ब्लॉक पर ४५ एस । 3 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण की मशीनिंग के बाद, जोड़ें ९०० & #956; कक्ष तापमान Luria के एल-Bertani शोरबा (£) कोशिकाओं को और एक बाँझ 14 मिलीलीटर दौर-नीचे ट्यूब में कुल सेल निलंबन स्थानांतरण.
  14. गर्मी ३७ पर सेल निलंबन & #176; सी के लिए ९० मिनट के साथ निरंतर मिलाते हुए १९० rpm.
  15. बाद में, एक १.७५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन वापस हस्तांतरण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  16. के बाद, निकालें ९०० & #956; l के supernatant और शेष १०० में कोमल pipetting द्वारा बैक्टीरियल कोशिकाओं को पुनर्स्थगित & #956; LB.
  17. का l
  18. एक पौंड-आगर एंटीबायोटिक जिसमें अभिव्यक्ति सदिश के लिए चयनात्मक है प्लेट पर परिणामी केंद्रित सेल निलंबन स्थानांतरण (यानी ६० & #956; g/mLKanamycin) । Aseptically पर समान रूप से फैल आगर प्लेट और मशीन के लिए ~ 16 ज पर ३७ & #176; C.
  19. अगले दिन, लगाना प्लेट से एक सिंगल कॉलोनी में 5 मिलीलीटर तरल पौंड युक्त antiobiotic चयन दबाव में (अर्थात ६० & #956; g/mL कनमीसिन) । बढ़ने पर तरल संस्कृति रात भर ३७ & #176; ग पर लगातार झटकों से ३७ & #176; c.
  20. को अलग करें और क्षारीय lysis के आधार पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके ई. कोलाई कोशिकाओं से प्रचारित प्लाज्मिड को शुद्ध करे सामा < सुप वर्ग = "xref" > 45 .
  21. ब्याज के उत्परिवर्तन की पुष्टि वर्तमान और प्लाज्मिड < सुप वर्ग के सैंज डीएनए अनुक्रमण द्वारा उचित पढ़ने के फ्रेम में = "xref" > ४६ .
< p class = "jove_title" > 2. समान 15 N-त्यसपछि प्रोटीन अभिव्यक्ति साथै BL21 & #916; E3 ई कोलाई .

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: विभिन्न संयोजक प्रोटीन अलग अभिव्यक्ति की स्थिति की आवश्यकता होती है. निंनलिखित मानव STIM1 EFSAM प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित प्रक्रिया है ।

  1. रूपांतरण सदिश Cys उत्परिवर्तनों बंदरगाह (यानी पीईटी-28a-EFSAM) में BL21 & #916; E3 codon (+) हीट शॉक सक्षम कोशिकाओं और प्लेट पर पौंड-आगर एंटीबायोटिक चयन दबाव युक्त प्लेटों के रूप में चरणों में वर्णित 1.9-1.14) के साथ निम्नलिखित संशोधन: सीधे प्लेट a १५० & #956; l aliquot out of ~ १,००० & #956; एल कुल सेल पर पौंड-आगर प्लेट पर एक microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने के लिए की आवश्यकता के बिना निलंबन ।
  2. अगले दिन, aseptically २०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में एक एकल कॉलोनी का हस्तांतरण करते हैं जिनमें 20 मिलीलीटर की पूरक उपयुक्त एंटीबायोटिक (यानी ६० & #956; g/mL कनमीसिन फॉर पीईटी-28a-EFSAM) शामिल है । बढ़ती इस तरल स्टार्टर संस्कृति रात भर (यानी ~ 16 ज) ३७ & #176 पर लगातार मिलाते हुए ~ १९० rpm के साथ सी ।
  3. चरण २.२ के रूप में एक ही दिन पर, 15 N के लिए M9 माध्यम तैयार करें-autoclaving बफर साल्ट के 1 L M9 द्वारा लेबल प्रोटीन अभिव्यक्ति (यानी ४२ मिमी न 2 HPO 4 , 22 एमएम KH 2 पो 4 , ८.६ एमएम NaCl, पीएच ७.४) ए 4 एल Erlenmeyer कुप्पी में । एक बार शांत, फिल्टर 20% (डब्ल्यू/वी) डी ग्लूकोज, 1 एम CaCl 2 का एक मिश्रण, १ एम thiamine, १ एम MgSO , १ मिलीग्राम/एमएल बायोटिन और ०.२ ग्राम/एमएल 15 एन-एनएच 4 सीएल के माध्यम से एक ०.२ & #956; मी बाँझ सिरिंज में फिल्टर 1 L बाँझ M9 नमक घोल ताकि इन घटकों के अंतिम सांद्रता ०.२% (डब्ल्यू/वी) डी ग्लूकोज हैं, १०० & #956; म CaCl 2 , ५० & #956; m thiamine, 1 मि MgSO 4 , 1 & #956; छ/मब बायोटिन और 1 mg/मब 15 N-NH 4 Cl.
  4. अगले दिन
  5. , aseptically एक ५० मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब में 20 मिलीलीटर रातोंरात तरल स्टार्टर संस्कृति हस्तांतरण और २,४०० & #215 पर केंद्रापसारक; जी 15 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली ।
  6. पौंड मध्यम खिचड़ी भाषा के बाद, M9 ंयूनतम मध्यम के 10 मिलीलीटर में परिणामी सेल गोली reसस्पेंड और एंटीबायोटिक के साथ M9 ंयूनतम माध्यम के 1 एल में reसस्पैंड गोली मिश्रण हस्तांतरण (यानी ६० & #956; g/mL कनमीसिन) ।
  7. ३७ & #176 पर बैक्टीरियल स्टार्टर संस्कृति युक्त M9 न्यूनतम मध्यम के 1 एल विकसित; सी और ~ १९० rpm लगातार मिलाते हुए जब तक ६०० एनएम (OD600) पर ऑप्टिकल घनत्व ~ 0.6-0.8 पहुंचता है ।
  8. जब specfified OD600 रेंज में पहुंच जाता है, तो add २०० & #956; मी ऑफ isopropyl & #946;-d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) प्रोटीन एक्सप्रेशन प्रेरित करने के लिए.
  9. के बाद IPTG अलावा, निरंतर मिलाते के साथ परिवेश के तापमान पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की मशीन जारी ~ १९० rpm ~ 16 घंटे के लिए (यानी रात भर) ।
  10. अगले दिन
  11. , पर केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया फसल ~ १०,००० & #215; g, 4 & #176; C for 30 min.
  12. खिचड़ी भाषा पौंड और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल गोली हस्तांतरण । दुकान पर गोली-८० & #176; ग तक शुद्धि.
< p class = "jove_title" > 3. ई. कोलाई .

से संयोजक प्रोटीन का शुद्धिकरण < p class = "jove_content" > नोट: विभिन्न संयोजक प्रोटीन्स को अलग-अलग शुद्धि प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है । 6 & #215 के लिए प्रोटोकॉल निम्न है; उनके-टैग शामिल किए जाने वाले निकायों से EFSAM शुद्धि पालतू-28a का निर्माण.

  1. मैन्युअल homogenize 6 एम guanidine-एचसीएल में जमे हुए बैक्टीरियल सेल गोली, 20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8) और 5 मिमी & #946;-mercaptoethanol का उपयोग कर एक मोटर चालित 10 मिलीलीटर अंतरण पिपेट. इस चरण के लिए लगभग ४० मिलीलीटर के गीले सेल गोली के 5 मिलीलीटर प्रति guanidine-एचसीएल जोड़ें ।
  2. एक संकरण ओवन में लगातार रोटेशन के साथ परिवेश के तापमान पर एक ९० मिनट की मशीन के बाद, मिश्रण केंद्रापसारक पर ~ १५,००० & #215; जी, 8 & #176; सी के लिए ४० मिनट अघुलनशील कोशिका के मलबे को अलग करने के लिए ( यानी & #160; गोली) घुलनशील प्रोटीन से मिश्रण (अर्थात supernatant).
  3. Add ७५० & #181; L a ५०% (v/v) Ni 2 + -nitrilotriacetic एसिड agarose मनका घोल को स्पष्ट lysate और एक संकरण ओवन में उलटा के साथ कमरे के तापमान पर एक और ९० मिनट के लिए मशीन ।
  4. बाद, 6 & #215 पर कब्जा; अपने-टैग प्रोटीन नी 2 + एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह प्रोटीन शुद्धि कॉलम में agarose मोतियों को इकट्ठा करके । lysate चरण ३.५ करने के लिए ले जाने से पहले पूरी तरह से स्तंभ के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति दें ।
  5. एकत्र मोतियों को धोकर तीन बार 10 मिलीलीटर 6 मीटर यूरिया, 20 एमएम Tris-एचसीएल नं० 8 व 5 एमएम & #946;-mercaptoethanol के साथ
  6. । सुनिश्चित करें कि पूरे 10 मिलीलीटर प्रत्येक बाद 10 मिलीलीटर धोने से पहले स्तंभ के माध्यम से गुजरता है ।
  7. Elute 2 मिलीलीटर अंश की श्रृंखला में प्रोटीन 6 एम यूरिया, 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, ३०० मिमी imidazole, और 5 मिमी & #946;-अंश के बीच ९० एस मशीन समय के साथ mercaptoethanol का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि पूरे 2 मिलीलीटर प्रत्येक बाद के रेफरेंस स्टेप से पहले कॉलम के माध्यम से गुजरता है ।
  8. इस अवस्था में, ब्याज के प्रोटीन की पुष्टि करें Coomassie नीले दाग सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) की विधि का उपयोग करके eluted अंशों में मौजूद है Laemmli < सुप वर्ग = "xref" > ४७ . मानक आणविक वजन मार्कर बैंड जो दोनों से कम है और ब्याज की प्रोटीन की उंमीद आणविक भार से अधिक से अधिक के खिलाफ तुलना द्वारा प्रोटीन का आकार, मात्रा और शुद्धता का आकलन करें ।
  9. पूल eluted प्रोटीन एक डायलिसिस झिल्ली में अंश के साथ एक ३,५०० दा आणविक वजन कटऑफ और 1 एल में मशीन का खुलासा बफर (20 मिमी Tris, ३०० मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 5 मिमी CaCl 2 , पीएच 8) पर 4 & #176; सी रात भर जबकि बफर एक magneti द्वारा उभारा जा रहा है c चमचे.
  10. के बाद ~ 16 घंटे का समय है, जोड़ें ~ 1 thrombin के प्रति मिलीग्राम प्रोटीन के लिए सीधे डायलिसिस बैग और गर्मी में 4 & #176; C के लिए एक अतिरिक्त ~ 24 h.
  11. 6 & #215 की हद तक
  12. सत्; उनका टैग क्लीवेज by Coomassie-नीले दाग के ~ 15 & #956; एल प्रोटीन aliquots डायलिसिस बैग से पहले और बाद में thrombin के साथ मशीन है जो electrophoresed denaturing जैल (polyacrylamide-पृष्ठ) पर एसडीएस कर रहे है के साथ लिया Laemmli < सुप class = "xref" > 47 की विधि । यदि माइग्रेशन में कोई ~ 2 केडीए शिफ्ट किया जाता है, तो 6 & #215 के आणविक भार के अनुरूप मनाया जाता है; उसका टैग, ३.११ कदम जारी है; यदि अपच प्रोटीन का एक अंश रहता है कि Coomassie द्वारा पता लगाने की है-नीले धुंधला, जोड़ें ~ ०.२ यू के प्रति thrombin प्रोटीन की मिलीग्राम सीधे डायलिसिस बैग और गर्मी में 4 & #176; C के लिए एक अतिरिक्त ~ 24 h.
  13. का उपयोग करें आकार अपवर्जन या आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी आगे प्रोटीन शुद्ध करने के लिए । EFSAM के आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए, डायलिसिस बैग से प्रोटीन समाधान निकालें और ध्यान ~ 10-एक १०,००० डीए आणविक वजन cutoff के साथ एक ultrafiltration केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग गुना । बाद में, पुन: पतला समाधान ~ 20-एक NaCl-मुक्त बफर में गुना (20 मिमी Tris, 5 मिमी CaCl 2 , 1 मिमी डीटीटी, पीएच 8).
  14. Equilibrate चरण ३.११ में वर्णित NaCl-फ़्री बफ़र के 10 स्तंभ वॉल्यूम के साथ एक प्री-पैक आयनों exchange स्तंभ है । Equilibrate एक luer में लोड बफर का प्रयोग-ताला एक dropwise तरीके से कॉलम के माध्यम से समाधान धक्का द्वारा कोई हवा बुलबुले युक्त सिरिंज और सिरिंज दबाव जो समाधान की स्थिर धाराओं के कारण कॉलम से बाहर निकलने से परहेज । एक मजबूत आयनों एक्सचेंजर का प्रयोग करें (जैसे चतुर्धातुक अमोनियम कार्यात्मक समूहों के साथ crosslinked agarose) ।
  15. लोड प्रोटीन समाधान NaCl-मुक्त बफर में पतला (चरण ३.११) स्तंभ पर ३.१२ चरण में वर्णित के रूप में.
  16. Elute प्रोटीन्स & #160; एक ढाल में [अर्थात् 0-60% (v/v)] NaCl बफर बढ़ाने का (20 मिमी Tris, 1 एम NaCl, 5 मिमी CaCl 2 , 1 मिमी डीटीटी, पीएच 8) एक दो पंप फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली का उपयोग कर. FPLC प्रणाली सेट ~ 1-1.5 मिलीलीटर अंशों को इकट्ठा करने और प्रोटीन रेफरेंस प्रोफाइल यूवी २८० एनएम अवशोषक और एक प्रवाह दर ०.५ मिलीलीटर का उपयोग कर मॉनिटर/
  17. Coomassie नीले दाग एसडीएस-पृष्ठ जैल की विधि का उपयोग करके प्रोटीन शुद्धता के साथ ही ब्याज के प्रोटीन युक्त रेफरेंस चोटियों और अंशों की पहचान Laemmli < सुप वर्ग = "xref" > ४७ .
  18. पूल अंश दिखा & #62; ९५% (यानी अंशों के रूप में लिया गया जो Coomassie-नीला दाग जैल पर केवल एक ही प्रोटीन बैंड दिखाते हैं) एक डायलिसिस बैग और डायलिसिस द्वारा ब्याज की प्रयोगात्मक बफर में विनिमय के रूप में ३.८ कदम में वर्णित है.
< p class = "jove_title" > 4. ग्लूकोज-5-MTS से प्रोटीन का रासायनिक लगाव डायलिसिस द्वारा ।

  1. n के ५५ mM शेयर सॉल्यूशन तैयार-(& #946;-d-glucopyranosyl)-n & #39;-[2-methanethiosulfonyl) एथिल] यूरिया (ग्लूकोज-5-MTS) को भंग करके 10 मिलीग्राम यौगिक में ५०० & #956; l का १००% (v/v) DMSO. स्टोर अप्रयुक्त ग्लूकोज-5-MTS solubilized में DMSO पर-20 & #176; C.
  2. संशोधन के लिए प्रोटीन के नमूने तैयार ~ ६० & #956 के dialyzing १.५ एमएल, संशोधन बफर के 1 एल में 20 मिमी MOPS, १५० मिमी NaCl, 5 मिमी CaCl 2 और ०.१ मिमी TCEP, पीएच ८.३ से बना में एम प्रोटीन । एक डायलिसिस झिल्ली आणविक वजन कटऑफ जो प्रोटीन के आकार से छोटा है का उपयोग करें संशोधित किया जा रहा है (उदाहरण के लिए एक ३,५०० दा cutoff ~ १७,५०० दा EFSAM के लिए उपयोग).
  3. के बाद 24 ज पर 4 & #176; ग, डायलिसिस बैग से नमूना एक microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण । DMSO-solubilized ग्लूकोज-5-MTS एक अंतिम एकाग्रता करने के लिए जोड़ें 2 mM.
  4. परिवेश के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में नमूना मशीन । 1 एच की मशीन अवधि के दौरान, ट्यूब हर 10 मिनट के कोमल दोहन द्वारा समाधान मिश्रण
  5. बाद में, फिर से अंतिम प्रयोगात्मक बफर में प्रोटीन विनिमय 4 & #176 पर डायलिसिस से कम नहीं एजेंट युक्त; सी के रूप में ४.२ कदम में वर्णित है या केंद्रापसारक ultrafiltration द्वारा । ultrafiltration प्रक्रिया के लिए, ध्यान ~ १.५ एमएल प्रोटीन के लिए नमूना & #60; ०.५ मिलीलीटर और बाद में प्रयोगात्मक बफर के साथ एक ही संकेंद्र में पतला । दोहराएं इस एकाग्रता-कमजोर पड़ने कदम दो अतिरिक्त बार इतना है कि कुल विनिमय ंयूनतम 30 & #215; 30 & #215; 30 = २७,०००-गुना । EFSAM के लिए, प्रायोगिक बफर के रूप में 20 मिमी Tris, १५० मिमी NaCl, 5 मिमी CaCl 2 , पीएच ७.५ का उपयोग करें ।
  6. ४.२ और ४.५ चरणों में वर्णित के रूप में डायलिसिस या ultrafiltration एक्सचेंज द्वारा electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार, क्रमशः 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट या 25 मिमी अमोनियम एसीटेट में । यदि डायलिसिस का उपयोग कर, आप किसी भी अवशिष्ट NaCl और CaCl 2 साल्ट को दूर करने के लिए ंयूनतम तीन बार विनिमय सुनिश्चित करते हैं ।
  7. सटीक द्रव्यमान का निर्धारण (अर्थात & #177; 1 Da) के प्रोटीन का उपयोग electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री < सुप वर्ग = "xref" > ४८ , < सुप वर्ग = "xref" > ४९ . एक Cys thiol के माध्यम से एक आबंध ग्लूकोज के अलावा methanethiosulfonate रासायनिक के माध्यम से उम्मीद प्रोटीन द्रव्यमान के लिए २८१.३ दा जोड़ने के लिए (यानी ग्लूकोज के लिए ३६०.४ दा जोड़ने-5-MTS और घटाना ७९.१ दा के लिए CH 3 तो 2 के दौरान समूह छोड़ने आबंध अनुलग्नक).
< p class = "jove_title" > 5. modif का समाधान एनएमआर भतication दक्षता और संरचनात्मक perturbations.

  1. सुनिश्चित करें कि संशोधित प्रोटीन की एकाग्रता & #62; १०० & #956; M के बाद ग्लूकोज लगाव और अंतिम बफर एक्सचेंज. EFSAM के लिए, अनुमान प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर एक यूवी विलुप्त होने गुणांक २८० एनएम पर १.५४ (मिलीग्राम मिलीलीटर - 1 ) cm - 1 .
  2. के साथ प्रोटीन समाधान के पूरक ६० & #956; M के 4, 4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic अम्ल (DSS) के लिए shimming और नाड़ी अंशांकन और 10% (v/v) डी 2 हे के लिए संकेत ताला. उच्च सिग्नल के लिए शोर का उपयोग करने के लिए ६०० & #956; L नमूनों में आवृत्ति-मिलान 5 मिमी एनएमआर ट्यूबों, में डाला एक न्यूनतम ६०० मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर एक ट्रिपल अनुनाद HCN क्रायोजेनिक जांच से सुसज्जित.
  3. कलेक्ट स्टैण्डर्ड 1 h- 15 n HSQC स्पेक्ट्रा पहले विस् तृत < सुप class = "xref" > 50 , < सुप वर्ग = "xref" > 51 at तापमान, 1 h र 15 n झाडू की चौड़ाई, क्षणिक और वृद्धि विशेष नमूना के लिए उपयुक्त सेटिंग्स । EFSAM स्पेक्ट्रा के लिए, उपयोग 20 & #176; सी, २५६ 1 एच यात्रियों, ६४ 15 n आयाम वेतन वृद्धि और 1 एच और 15 एन स्वीप चौड़ाई ८,००० और १,८०० हर्ट्ज के लिए सेट, क्रमशः.
  4. ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण के बाद, एक 1 मीटर शेयर से एनएमआर नमूना करने के लिए dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ें 15 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए. डीटीटी डाइसल्फ़ाइड-मध्यस्थता लगाव की कमी से प्रोटीन से ग्लूकोज moiety निकालता है.
  5. अधिग्रहण एक दूसरे 1 H- 15 N HSQC के तहत इन कम/संशोधित शर्तों, ग्लूकोज लगाव के कारण संशोधन दक्षता और संरचनात्मक perturbations का आकलन करने के लिए एक संदर्भ स्पेक्ट्रम प्रदान.
  6. के रूप में NMRPipe का उपयोग कर एनएमआर डेटा संसाधित पहले < सुप वर्ग = "xref" > ५२ . यह सुनिश्चित करें कि प्रसंस्करण न्यूनतम डेटा रूपांतरण, चरणबद्ध, विलायक दमन, रूपान्तर रूपांतरण और स्पेक्ट्रा के प्रारंभिक दृश्य भी शामिल है ।
  7. के बीच पीक तीव्रता और संशोधित और कम स्पेक्ट्रा कारा < सुप वर्ग पर NEASY प्लगइन का उपयोग कर में रासायनिक बदलाव मूल्यों को मापने के द्वारा संशोधन दक्षता का आकलन = "xref" > 53 . ग्लूकोज संलग्न और कम स्पेक्ट्रा में दोनों के बीच Cys की चोटी की तीव्रता का मूल्यांकन करने के लिए सुनिश्चित करें. Cys के बीच मज़बूती से दोनों स्पेक्ट्रा में स्थित नहीं किया जा सकता है, तो एक readout के रूप में Cys के निकट अवशेषों की तीव्रता का उपयोग करें ।
  8. से छुटकारे की तीव्रता के रूप में दक्षता की गणना Cys-संशोधित Cys से छुटकारे की तीव्रता से विभाजित स्पेक्ट्रम (यानी डीटीटी-इलाज) स्पेक्ट्रम, १०० से गुणा:
    के रूप में < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56302/56302eq1.jpg"/>, जहाँ मैं मी Cys-संशोधित स्पेक्ट्रम में छुटकारे की तीव्रता और i R में Cys-कम स्पेक्ट्रम में छुटकारे की तीव्रता है । वैकल्पिक रूप से, कई चोटियों के बीच में मतलब दक्षता का मूल्यांकन:
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56302/56302eq2.jpg"/>, जहाँ दक्षता i प्रत्येक के लिए अलग से निर्धारित दक्षता परिकलित की जाती है अवशेष, i, और n गणना में उपयोग किए जाने वाले अवशेषों की कुल संख्या है ।
  9. की गणना रासायनिक shift perturbations (CSP) के बीच रासायनिक shift अंतर से 15 n और 1 H आयाम प्रत्येक चोटी के और बड़े 15 N रासायनिक shift श्रेणी का उपयोग कर के लिए सामान्य करने के लिए दो स्पेक्ट्रा में स्वीकार्य निंन समीकरण:
    < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56302/56302eq3.jpg"/>, जहाँ & #916; H में पीपीएम परिवर्तन है प्रोटॉन आयाम और & #916; एन नाइट्रोजन आयाम में पीपीएम परिवर्तन है ।

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Representative Results

इस दृष्टिकोण के पहले चरण के लिए उंमीदवार ग्लाइकोसिलेशन अवशेषों Cys अवशेषों जो ग्लूकोज-5-MTS. EFSAM का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है के लिए mutagenesis की आवश्यकता है कोई अंतर्जात Cys अवशेषों, तो कोई विशेष विचार करने के लिए पहले से किया जा करने की आवश्यकता mutagenesis । हालांकि, मूल Cys अवशेषों को गैर-संशोधित करने योग्य अवशेषों को वर्णित रसायन प्रदर्शन करने से पहले रूपांतरित किया जाना चाहिए । के लिए ंयूनतम मूल संरचना प्रभाव, हम सुझाव है कि ब्याज की प्रोटीन के एक वैश्विक अनुक्रम संरेखण प्रदर्शन और निर्धारण जो अंय अवशेषों सबसे अक्सर अंतर्जात Cys स्थिति (ओं) में पाया जाता है । इन अंय अवशेषों जो अंय जीवों में प्राकृतिक रूप से होने के लिए Cys उत्परिवर्तन प्रोटीन संरचना पर सबसे कम प्रभाव पड़ सकता है । यदि अंतर्जात Cys अवशेषों कड़ाई से संरक्षित है, हम Ser जो सबसे संरचनात्मक Cys के समान है में रूपांतरित करना सुझाव है । चित्रा 1 पीसीआर प्रतिक्रिया की सफलता का मूल्यांकन एक ठेठ पीसीआर mutagenesis जेल से पता चलता है, प्रवर्धित डीएनए नमूने के साथ कई गुना उच्च तीव्रता के प्रदर्शन के एक नियंत्रण राशि की तुलना में प्रवर्धित टेंपलेट पालतू-28a डीएनए जो पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया गया था । अगले कदम प्लाज्मिड मरंमत के लिए टेंपलेट डीएनए पाचन और ई. कोलाई में परिवर्तन शामिल हैं । तरल संस्कृति, प्लाज्मिड अलगाव और अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन (एस) की पुष्टि में प्लाज्मिड प्रचार के बाद, रूपांतरित वेक्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्र 2a NaCl सांद्रता बढ़ाने के सापेक्ष आयनों एक्सचेंज कॉलम से EFSAM का एक विशिष्ट रेफरेंस प्रोफाइल दिखाता है । चित्रा बी + Coomassie नीले दाग एसडीएस-पृष्ठ जैल पर EFSAM की पवित्रता से पता चलता है.

शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के बाद, डायलिसिस कदम की एक श्रृंखला के लिए मुफ्त thiol के साथ MTS प्रतिक्रिया के माध्यम से ग्लूकोज moiety संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है । चित्रा 3 ए झिल्ली क्लिप द्वारा डायलिसिस झिल्ली में बंद एक छोटे से प्रोटीन की मात्रा के ठेठ सेटअप की एक छवि से पता चलता है और ब्याज की बफर युक्त एक बड़े 1 एल चोंच में समाहित । संशोधन की सफलता की एक प्रारंभिक जांच सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया जा सकता है । चित्र बी एक Cys thiol में संशोधित EFSAM के एक प्रतिनिधि electrospray बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम से पता चलता है । एक विशिष्ट प्रोटीन, संशोधन दक्षता और संरचनात्मक perturbations के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना के बाद एक समान रूप से 15N-लेबल नमूने से मूल्यांकन किया जा सकता है । 1एच-15एन-HSQC स्पेक्ट्रम से पहले और बाद के एजेंट डीटीटी (चित्रा 4a) को कम करने के अलावा अधिग्रहण कर लिया है । संशोधन दक्षता की गणना प्रोटोकॉल चरण ५.८ (चित्रा 4B) में विस्तृत रूप में संशोधित और कम स्पेक्ट्रा में चोटी की तीव्रता के बीच की तुलना के माध्यम से किया जा सकता है । अंत में, जब रासायनिक बदलाव कार्य एक प्रोटीन के लिए जाना जाता है, जो संरचनात्मक परिवर्तन के साथ सहसंबंधी CSPs चरण ५.९ (चित्र 4c) में विस्तृत के रूप में परिकलित किया जा सकता है.

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए agarose mutagenic प्राइमरों के साथ वेक्टर टेम्पलेट की प्रवर्धन जाँच दिखा जेल.
छवि डीएनए मार्कर (एम), वेक्टर नियंत्रण (वीसी) और पीसीआर प्रवर्धित टेम्पलेट (पीसीआर) के साथ एक १.०% (डब्ल्यू/वी) agarose जेल से पता चलता है । डीएनए 0.5 x ताे बफर में ४५ मिनट के लिए १२० वी पर ट्रो से अलग था । कुलपति के ०.५ एनजी के कुल, पीसीआर लेन में लोड खाके की राशि के बराबर लोड किया गया था । जेल ethidium ब्रोमाइड (~ ०.५ μg/एमएल) 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश (३०२ एनएम) के तहत दृश्य से पहले का उपयोग दाग था । जेल वेक्टर का अपेक्षित आकार (black ऐरोहेड) के लिए करीब परिवर्धित डीएनए के एक उच्च स्तर से पता चलता है । संभावना है कि १,००० और १,५०० बीपी मार्कर बैंड के बीच चल रही पीसीआर लेन में दूसरा बैंड एक गैर विशेष रूप से परिवर्धित पीसीआर उत्पाद का प्रतिनिधित्व करता है । प्रवर्धित डीएनए का तीव्रता स्तर कुलपति की तीव्रता स्तर से अधिक होना चाहिए ताकि इसे सफल समझा जा सके । कई अंय डीएनए रंजक कम mutagenic के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, ethidium ब्रोमाइड धुंधला करने के लिए सुरक्षित विकल्प (उदाहरण के लिए देखें ५७) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: STIM1 EF-SAM के लिए विशिष्ट क्रोमेटोग्राफिक शुद्धिकरण और शुद्धता जांच ।
(क) आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी रेफरेंस प्रोफाइल ऑफ़ STIM1 EF-SAM. के बाद मैनुअल बाध्यकारी EF-सैम आयनों एक्सचेंज कॉलम (क्यू एफएफ) के लिए बुनियादी पीएच और कम NaCl एकाग्रता में एक सिरिंज के साथ, और अकटा FPLC (जीई हेल्थकेयर) एक elute ढाल के साथ प्रोटीन NaCl करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस रेफरेंस 1 एम NaCl के एक 0-60% (वी/वी) ढाल पर यूवी २८० एनएम संकेत का उपयोग कर अकटा द्वारा निगरानी की जाती है । (ख) Coomassie नीले दाग एसडीएस-(ए) से रेफरेंस अंशों के पृष्ठ जेल । denaturing प्रोटीन जेल से पता चलता है कि EF-सैम elutes में दो प्रमुख चोटियों पर ~ २५० mm और ~ ४५० mm NaCl । शुद्धि प्रोटोकॉल पैदावार & #62; ९५% शुद्ध EF-सैम किसी भी contaminant बैंड Coomassie नीले दाग जेल में दिखा की कमी के द्वारा सबूत के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डायलिसिस सेटअप और की पुष्टि इन विट्रो प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन.
(क) ठेठ डायलिसिस सेटअप के लिए इस्तेमाल किया इन विट्रो में ग्लूकोज की संलग्नक Cys thiol के माध्यम से MTS जेट । छवि दिखाता है ~ डायलिसिस टयूबिंग के भीतर निहित प्रोटीन की १.५ मिलीलीटर प्रयोगात्मक बफर के ~ 1 एल के खिलाफ बफर । यह महत्वपूर्ण है कि बफर लगातार पूरा आदान प्रदान सुनिश्चित करने के लिए उभारा है । छवि से पता चलता है एक microcentrifuge ट्यूब अतिरिक्त डायलिसिस टयूबिंग को काटा डायलिसिस बैग और घूर्णन हलचल बार द्वारा नुकसान के डूबने को रोकने के लिए । (ख) Electrospray संशोधित Asn171Cys EF-सैम प्रोटीन के ionization जन स्पेक्ट्रम । मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक सुविधाजनक और सटीक दृष्टिकोण का आकलन है कि संशोधन प्रक्रिया सफल रहा था । एक ठेठ जन वर्णलेख संशोधित और संशोधित Asn171Cys EF-सैम के सैद्धांतिक और मापा जनता के साथ दिखाया गया है संकेत दिया । नमूना द्रव्यमान का बहुमत एक macromolecule जो भीतर है के लिए मेल खाती है ~ १.३ ग्लूकोज की उम्मीद सैद्धांतिक जन के दा-संयुग्मित Asn171Cys EF-SAM. में डेटा (B) को ४२से पुनर्प्लॉट और संशोधित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: संशोधन दक्षता और एक एकल एनएमआर नमूना से संरचनात्मक perturbations का समाधान एनएमआर आकलन.
(क) 1 एच-15एन-HSQC वर्णक्रमीय ओवरले ग्लूकोज-संयुग्मित Asn131Cys EFSAM से पहले (red crosspeaks) और उसके बाद (black crosspeaks) 15 mM डीटीटी के अलावा । ओवरले स्पष्ट रूप से प्रोटीन और संरचनात्मक perturbations के दोनों संशोधन का संकेत रासायनिक बदलाव परिवर्तन के बीच कई अवशेषों-विशिष्ट से पता चलता है । लाल बॉक्स Asn131Cys के बीच के स्थान को दर्शाता है । (ख) 1एच-15एन-HSQC क्षेत्र Asn131Cys के बीच युक्त में ज़ूम दृश्य । संशोधित स्पेक्ट्रम (iM) में पीक के बीच Asn131Cys की तीव्रता ((दिखाया गया) दक्षता की गणना के लिए कम (संशोधित) स्पेक्ट्रम (iR) में तीव्रता से विभाजित है । कई प्रभावित अवशेषों की अर्थ कुशलता की गणना एक त्रुटि अनुमान सहित दक्षता का एक बेहतर अनुमान प्रदान करता है । मतलब दक्षता 5 अवशेषों (यानी 129-133) के आधार पर Asn131Cys EFSAM के लिए दिखाया गया है । (ग) सामान्यीकृत केमिकल शिफ्ट perturbations के कारण ग्लूकोज विकार को Asn131Cys EFSAM प्रोटीन होता है. HSQC प्रयोगों के सेट से पहले और एजेंट को कम करने के साथ पूरक के बाद एक एकल नमूना पर एकत्र न केवल पीक तीव्रता विश्लेषण द्वारा संशोधन दक्षता का एक सुविधाजनक अनुमान प्रदान करता है [ (B)में दिखाया गया है], लेकिन यह भी डेटा प्रदान करता है के लिए संशोधन के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन । ग्लूकोज विकार १३१ स्थिति के पास सबसे बड़ा perturbations स्थानीयकृत कारण; हालांकि, इस विश्लेषण से पता चलता है perturbations जो केवल अनुक्रम निकटता के आधार पर अप्रत्याशित हैं, इस विश्लेषण में मूल्य का संकेत है । (C) में डेटा को ४२से पुनर्प्लॉट और संशोधित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

STIM1 उत्परिवर्तनएक दिशाb डीएनए अनुक्रमसी
Asn131Cys आगे 5 '-GTCATCAGAAGTATACटीजीटीTGGACCGTGGATGAGG-3 '
Asn131Cys रिवर्स ५ '-CCTCATCCACGGTCCAऐकाGTATACTTCTGATGAC-३ '
Asn171Cys आगे 5 '-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG-3 '
Asn171Cys रिवर्स 5 '-CCCTGTCATGGTGGTजीसीएGGTGACAGCCAGCCTTGG-3 '
एक STIM1 अमीनो अम्ल क्रमांकन के आधार पर NCBI सेस afz 76986.1.
' रिवर्स ' प्राइमर से मेल खाती है रिवर्स ' आगे ' प्राइमर के अनुक्रम पूरक ।
रेखांकित codon triplet Cys उत्परिवर्तन से मेल खाती है ।

तालिका 1. उदाहरण oligonucleotide (प्राइमरी) Asn के लिए जुगाड़ के भीतर Cys mutagenesis के लिए पालतू-28a STIM1 EFSAM का निर्माण.

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Discussion

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन एक पोस्ट-शोधों संशोधन है जहां शर्करा एमिनो एसिड साइड चेन को लिंकेज के माध्यम से मुख्य रूप से polypeptides से जुड़ी covalently है । स्तनधारी प्रोटीन के रूप में कई के रूप में ५०% ग्लाइकोसिलेटेड ५४रहे हैं, जहां ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन बाद में आणविक बंधन संबध बदलने से प्रभाव की एक विविध रेंज हो सकता है, प्रोटीन तह को प्रभावित करने, चैनल गतिविधि में फेरबदल, लक्ष्यीकरण क्षरण और सेलुलर तस्करी के लिए अणु, कुछ नाम करने के लिए (३३में समीक्षित) । स्तनधारी फिजियोलॉजी में ग्लाइकोसिलेशन की महत्वपूर्ण भूमिका से स्पष्ट होता है कि प्रोटीन के कई सैकड़ों स्तनधारी glycan संरचनाओं की पूर्ण विविधता का निर्माण करने के लिए विकसित ३३। बदल एन-और -ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न प्रोस्टेट सहित कई रोग राज्यों के साथ संबद्ध किया गया है (वृद्धि हुई है और कम), स्तन (वृद्धि हुई है और कम), जिगर (बढ़ा), डिम्बग्रंथि (बढ़ा), अग्नाशय (बढ़ा) और गैस्ट्रिक कैंसर (वृद्धि हुई) ५५ इसके अलावा, ताऊ, huntingtin, α-synuclein के ग्लाइकोसिलेशन अल्जाइमर के साथ जुड़े इन प्रोटीन की विषाक्तता को विनियमित करने के लिए पाया गया है, हटिंगटन है और पार्किंसंस रोगों ५६, और ग्लाइकोसिलेशन के जन्मजात विकारों के एक समूह किया गया है एंजाइमों जो मध्यस्थता ग्लाइकोसिलेशन ५४में heritable दोषों से उत्पन्न की पहचान की. इस प्रकार, सटीक, जैव रासायनिक और ग्लाइकोसिलेशन के संरचनात्मक प्रभाव को समझने के लिए काफी प्रोटीन विनियमन और स्वास्थ्य और रोग में समारोह के बारे में हमारी समझ को प्रभावित करने की क्षमता है ।

स्तनधारी glycome में पाया glycan संरचनाओं की विविधता के लिए नेतृत्व जो दस चीनी इमारत ब्लॉकों में शामिल हैं fucose, गैलेक्टोज, ग्लूकोज, n-acetylgalactosamine, एन-acetylglucosamine, ग्लुकुरोनिक एसिड, iduronic एसिड, mannose, sialic अम्ल और xylose ३३. जबकि एन-ग्लाइकोसिलेशन हमेशा एक एन-acetylglucosamine चीनी सीधे लिंक प्रोटीन के लिए, -ग्लाइकोसिलेशन के किसी भी एनसे परिणाम कर सकते हैं-acetylgalacotose, n-acetylglucosamine, xylose, fucose, ग्लूकोज या गैलेक्टोज covalently से जुड़ी पॉलीपेप्टाइड. को समझने के लिए कैसे इन शर्करा तुरंत प्रोटीन की सतह से सटे भौतिक और संरचनात्मक गुणों को प्रभावित शुरू करने के लिए, हम यहां साइट के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन-चुनिंदा प्रोटीन में इंजीनियर thiols के माध्यम से Cys अवशेषों को चीनी देते अनुक्रम. यहाँ, अवशेषों कि endogenously ग्लाइकोसिलेटेड हैं Cys द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं और एक सरल रासायनिक दृष्टिकोण के माध्यम से इन विट्रो में संशोधित. इस तरह, एकल और एकाधिक ग्लाइकोसिलेशन साइटों के लिए बाहर एक विशिष्ट साइट के रूप में अच्छी तरह से तह और स्थिरता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समग्र संरचना और प्रोटीन के समारोह में संचई संशोधनों के योगदान को चिढ़ा मूल्यांकन किया जा सकता है ।

हाल ही में, इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक EFSAM के साथ व्यक्तिगत रूप से और संचयी Asn131 और Asn171 एन-ग्लाइकोसिलेशन साइटों ४२की भूमिका का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Cys और Asn131 या Asn171 साइटों के लिए ग्लूकोज की आबंध लगाव करने के लिए उत्परिवर्तन एक घटी हुई Ca2 + बंधन संबध और दबा स्थिरता का पता चला. जब दो साइटों को एक साथ ग्लूकोज लगाव के साथ संशोधित किया गया था, बंधन संबध और स्थिरता में कमी potentiated में संवर्धित oligomerization प्रवृत्ति के लिए अग्रणी थे इन विट्रो. संरचनात्मक रूप से, यहाँ वर्णित दृष्टिकोण Asn131 या Asn171 संशोधनों पारस्परिक रूप से perturb-हाथ जोड़ी के निकट सैम डोमेन पर स्थित कोर α8 कुंडलित है कि दिखाया गया है । इस संरचनात्मक विश्लेषण expounds कैसे प्रोटीन की सतह पर ग्लूकोज संशोधनों EF-हाथ के भीतर एक converging और potentiated संरचनात्मक परिवर्तन के लिए नेतृत्व: सैम इंटरफेस है जो अंततः प्रोटीन स्थिर और SOCE ४२बढ़ाता है ।

हालांकि इस साइट के आवेदन-चयनात्मक दृष्टिकोण मदद कैसे एक monosaccharide EFSAM प्रभाव तह, स्थिरता और संरचना की सतह के करीब पर प्रकाश डाला, इस प्रक्रिया को आसानी से अब एर, Golgi और प्रधानमंत्री के लिए विशिष्ट कार्बोहाइड्रेट संलग्न संशोधित किया जा सकता है स्थानीयकरण (यानी अलग परिपक्वता के ग्लाइकोसिलेशन राज्यों), बशर्ते वहां एक विश्वसनीय स्रोत के लिए इन कार्यात्मक समूहों जो ऐसे mts. mts के रूप में thiols के लिए लिंक कर सकते है के रूप में thiol संशोधन प्रतिवर्ती है के बाद से बेहतर है युक्त एक का उपयोग कर एजेंट को कम करने और एक संदर्भ स्पेक्ट्रम आसानी से प्राप्त किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण से लिपिड जैसे प्रोटीन को अन्य पोस्ट-शोधों moieties लिंक करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है । एक ही समय में, इस दृष्टिकोण है जो विचार किया जाना चाहिए करने के लिए कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, विधि ग्लाइकोसिलेशन साइटों के उत्परिवर्तन पर Cys जो संरचना, स्थिरता और किसी भी ग्लूकोज संशोधन के अभाव में भी तह को प्रभावित कर सकते है पर निर्भर करता है । इसी प्रकार, प्रोटीन में देशी Cys अवशेषों को भी गैर-ग्लाइकोसिलेटेड साइटों पर ग्लूकोज लगाव को रोकने के लिए रूपांतरित किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, Cys अवशेषों के अलावा अक्सर Cys crosslinking और खुलासा करने के कारण बैक्टीरिया में शामिल शरीर के गठन को बढ़ावा देता है, शुद्धि और अधिक चुनौतीपूर्ण बना । फिर भी, इस साइट-चयनात्मक Cys-crosslinking दृष्टिकोण यहां वर्णित एक नियंत्रित करने के लिए बाहर संरचनात्मक, जैव रासायनिक और प्रयोगों में विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन साइटों के भौतिक प्रभाव जो उच्च स्तर की आवश्यकता को चिढ़ाने का मतलब प्रदान करता है सजातीय प्रोटीन । गैर की संरचना पर देशी Cys अवशेषों के प्रभाव, स्थिरता और तह बस जंगली प्रकार प्रोटीन विशेषताओं ४२की तुलना द्वारा किसी भी संशोधनों के अभाव में पता लगाया जा सकता है । कार्यात्मक युकेरियोटिक कोशिकाओं में प्राप्त डेटा के साथ एक साथ ले लिया है जो संशोधन एक्सप्रेस-प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करण अवरुद्ध (जैसे Asn के लिए ाला), वर्तमान में वर्णित दृष्टिकोण प्रोटीन के संरचनात्मक तंत्र में नई अंतर्दृष्टि उपज होगा पद-शोधों के संशोधनों द्वारा विनियमन ।

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Acknowledgements

इस अनुसंधान के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (०५२३९ P.B.S.), अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन/ओंटारियो अनुसंधान कोष (P.B.S.), प्रोस्टेट कैंसर लड़ो फाउंडेशन-पिताजी के लिए Telus सवारी (P.B.S.) और ओंटारियो द्वारा समर्थित था स्नातक छात्रवृत्ति (Y.J.C. और एन के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

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