שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שינויים ב- pH תאיים (פי) תפקיד חשוב בוויסות תאיים רבים, כולל מטבוליזם, התפשטות של בידול. בדרך כלל, דינמיקה פי נקבעים בתאים בתרבית, אשר נתונות מדידה וטיפול השפעול pHi. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיות וכלים חדשים איפשרה בחקר דינמיקה פי בתוך רקמת ללא פגע, בשידור חי. דרוזופילה מחקר, פיתוח חשוב אחד היה הדור של קו הטרנסגניים נושאת ביוסנסור על פי, mCherry::pHluorin. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בהם אנו עושים שימוש שגרתי הדמיה ovarioles דרוזופילה בשידור חי כדי למדוד את פי בשושלת זקיק אפיתל תאי גזע (FSC) בקווים הטרנסגניים פראי סוג mCherry::pHluorin; עם זאת, בשיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות בשביל לרקמות אחרות, כולל דיסקים כנף עין האפיתל. אנו מתארים שיטות לביטוי mCherry::pHluorin בשושלת FSC, שמירה על רקמות השחלה במהלך חיים הדמיה, ואת רכישת וניתוח תמונות כדי להשיג פי ערכי.

Introduction

מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות3, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .

כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי8. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.

כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית12 , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה15,germarium16. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק2. חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כדי למדוד פי בשושלת FSC, לנו לחשב את היחס שבין עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin כדי mCherry, FSCs, pFCs ותאים זקיק בתנאים פיזיולוגיים, ולהמיר את היחס פי ערכים עם תקן עקומות כיול עבור כל תא הקלד 7. הראשון, לחיות ניסויים הדמיה מבוצעות למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של pHluorin ו mCherry ב germaria גזור לתוך מאגר המכיל NaHCO 3, אשר מחקה בתנאים פיזיולוגיים 1 , 7. הבא, רגיל עקומות מופקים על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin ו- mCherry נה +-K + מאגר המכיל את nigericin ionophore חינם, התרגלו שני ערכי pH שונים, 6.5 ו- 7.5. בנוכחות nigericin, פי equilibrates עם ה-pH של המאגר על פני קרום פלזמה, גורם פי להתאים את ה-pH חוץ-תאית. לבסוף, העיקולים רגילים משמשים כדי להמיר pHluorin mCherry יחסי לערכים פי המשוער.

1. קדם משפט: הכנה לפני מדידה פי Vivo ב

הערה: כדי למדוד פי ויוו, חייב להביע את transgene mCherry::pHluorin בסוג התא עניין. להלן כמה דרכים נפוצות כדי ליצור pHluorin הטרנסגניים זבובים בשושלת FSC. יצירת שיבוטים mCherry::pHluorin שימושי במיוחד לזיהוי FSCs, אשר ממוקמים בקצה הקדמי שיבוט FSC. רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי שימושי למדידת פי על פני הרקמה כולה, והוא גם נוח יותר בעת שילוב עם ביטוי של RNAi או transgene.

  1. דור של pHluorin הטרנסגניים זבובים
    1. mCherry::pHluorin-ידי FSC שיבוטים
      1. כדי להפוך mCherry::pHluorin FSC שיבוטים, חצו UAS-mCherry::pHluorin 1 flipout Act-Gal4 במלאי או אחרים מניות עם Gal4 inducible Flp/והשפלתם.
      2. כדי להפוך heatshock inducible שיבוטים, heatshock F1s למבוגרים במשך יומיים לפרסם וגיחתו ב ריקה vials h 1 בתוך אמבט מים 37 ° C, ארבע פעמים כ כל ה 12
      3. כדי להבטיח צמיחה רגיל שיעור מרבי של oogenesis בתקופה זו, לשמור על זבובים על-ידי מתן שמרים רטובה (בחלקים שווים בקירוב יבש בייקר ' s שמרים ומים) מדי יום במשך לפחות 6 ימים לאחר אינדוקציה שיבוט.
    2. רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי
    3. קרוס UAS-mCherry::pHluorin 1 כדי זקיק תא מנהל ספציפי, 1 w y *; P {GawB} 10930/ארגון הקתולים הצעירים (בלומינגטון מזהה: 7023).
    4. 3 ימים לאחר זבובים להתחיל eclosing, לאסוף ומניחים בקבוקונים המכילים שמרים רטובה, במשך לפחות 24 שעות לפני ניתוח.
  2. שהופך פתרונות
    הערה: חשוב להכין המאגרים הבאים ביום של הניסוי, כי ריכוז ה-pH ו ממס במאגר יכולים להשתנות לאורך זמן.
    1. הכן ביקרבונט, nigericin, ניתוח מאגרי. הוסף הרכיבים לפי הסדר הרשום כדי למנוע היווצרות פוחת משקעים (עיין טבלה 1, בטבלה 2 של טבלה 3).

2. משפט: מדידת פי בשושלת FSC

הערה: הקרע, הרכבה והדמיה חי את השלבים עבור המאגר ביקרבונט ותנאי מאגר nigericin שני ייתכן שתצטרך לבצע פעמיים: פעם אחת כדי לקבוע את המיקרוסקופ הגדרות של פעם נוספת כדי לאסוף נתונים ניסיוני. עיין בסעיף 2.2 להלן לקבלת מידע נוסף.

  1. לנתיחה, הרכבה
    הערה: החומרים הדרושים לביצוע שלב זה עיין באיור 1 ו לטבלה של חומרים. עבור הרכבה מודפס 3D צ'יימברס, ניתנים הקבצים במדפסת תלת-ממד כמו משלימה קובץ 1 ו- 2 קובץ משלים.
    1. ניתוח:
      1. הכן צ'יימברס גובר על-ידי החלת ציפוי דק של גריז ואקום לצד להחמיא של 3D מודפס הרכבה קאמרית. למקם את הצד הזה coverslip 22 x 40 מ מ כדי לאטום את coverslip אל התא הרכבה.
    2. לנתח השחלות של נקבות הזבוב הבוגר במאגר 500 µL לנתיחה (ביקרבונט או nigericin מאגר, טבלה 3)
      1. עזים ומתנגד 3-4 זבובים באמצעות גז 2 CO וזבובים העברה על גבי משטח לטוס perfused עם CO 2 גז-
      2. להרים של זבוב anesthetized עם מלקחיים ומקום לתוך כלי התקשורת לנתיחה.
      3. לצבוט את בית החזה של הזבוב עם forcep אחד, בזמן המשוחררים על קצה הבטן שלה עד השחלות שלה חשופים.
      4. לאחר ניתוק השחלות מן האיברים האחרים, להקניט לגזרים את ovarioles באמצעות 22 1/2 מחטי מזרקים. מעטפת השריר בקפידה נפרד מן השחלות נפרד ovarioles בודדים מהאשכול של ovarioles. טכניקה יעילה כדי לבודד למעטפת השרירים היא להשתמש מחט מזרק אחת כדי להחזיק את האשכול של ovarioles במקום בקצה הקדמי שלו, ולטף כלפי מטה לאורך יחיד ovarioles.
      5. דגירה את שחלות והטרף בתקשורת לנתיחה בדיוק 10 דקות לפני שתמשיך לשלב הרכבה על כך שאין מספיק זמן פי תאים equilibrate באופן מלא עם ה-pH של התקשורת דיסקציה nigericin.
        הערה: ודא כי נדן שריר מוסר את ovarioles. שריר נדן עשוי להחליש את האות פלורסצנטיות, מה שהופך את זה קשה לזהות תאים בודדים באמצעות Concanavilin-A, עלול לגרום ovarioles להעביר באופן ספונטני במהלך דימות בשידור חי-
    3. הרכבה
      1. מקום טיפה קטנה של מדיה דיסקציה coverslip זכוכית בתוך החדר הרכבה.
      2. העברת מופרדים באמצעות מלקחיים ovarioles.
      3. להפריד תאי ביצה בשלב מאוחר יותר germaria המשויך צ'יימברס ביצה בשלב מוקדם יותר, ולנסות להבטיח germaria גזור ממוקמים במרכז הירידה מדיה לנתיחה.
      4. להוסיף 2 טיפות קטנות של לק צידי coverslip 12-מ מ עגול, לתת לו אוויר יבש כ-10 ס
      5. Coverslip
      6. מקום בסיבוב על המסירה של דיסקציה המדיה המכילה מופרדים germaria כך את הצד הזה עם לק פונה כלפי מטה ואנשי קשר התקשורת לנתיחה. לחץ כלפי מטה החלקים של הקצה עם לק לשטח ולאבטח את germaria בעמדה. אנו ממליצים על שימוש לק בוגרים כי זה מכפיש פחות על coverslip פני כמו זה המאובטחת במקום.
      7. למלא תא הרכבה עם מדיה נוספים לנתיחה. מאגר ספציפי תנאי שאינו מכיל צבע Concanavalin-A יכול לשמש כדי למלא התא.
        הערה: הזמן הכולל בילה לנתח, הרכבה לא יעלה על 15 דקות. זה חשוב למזער את ההשפעות של נזק לרקמות ותא מוות.
  2. הדמיה בשידור חי:
    הערה: בשלב זה, קודם לאסוף תמונות מן התנאי ביקרבונט, שני תנאים nigericin כדי לקבוע את הגדרות מיקרוסקופ נכונה; לכוונן את הגדרות מיקרוסקופ לפי הצורך, . ולאחר מכן לאסוף תמונות עבור המידע מהניסוי השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי המסוגל הדמיה 3 ערוצים: GFP (פליטת עירור 475/509), mCherry (575 פליטה עירור/610), ואת מרחיקת אדום (633 עירור/647 פליטה).
    הערה: ערכת מיקרוסקופ הגדרות: ניתן לכמת עוצמות פיקסל תמונות שנאספו כדי לקבוע את ההערכות של pHi, לכן חשוב כי ערכי העוצמה של האות בערכת כל תמונה היא לא נמוכה מדי ולא רוויים. טווח ממידות ניתן ללכוד תמונה מוגדרת על-ידי עומק הסיביות התמונה. במקרים רבים, תמונות של 8 סיביות נוצרות כברירת מחדל, אך אנו ממליצים על רכישת הנתונים כתמונות 16 סיביות, אשר יש טווח דינאמי רחב יותר. חשוב להבטיח כי crosstalk בין ערוצי פלורסנט ממוזער, אז צריך ניתן להתאים את ההגדרות כך ספקטרום הפליטה שנאסף בכל fluorophore לא חופף. כדי לבדוק את הגדרות אלה, קח תמונה לדוגמה באמצעות הקשת עירור GFP ולאסוף ספקטרום הפליטה של mCherry, ולהיפך. אם ההגדרות הותאמו כהלכה, צריך להיות בלי קליטה בכל מקרה. קבע את הגדרות מיקרוסקופ (כלומר, הגדרות מתח על סריקתה לייזר קונפוקלי, גודל הכוח ואת חריר לייזר) כך פיקסל עוצמות האות כל תמונה שלוש ערכות הם בתוך הטווח הדינמי של קובץ התמונה. עבור כל הניסויים שלנו, השתמשנו לייזר אור לבן מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד 40 x סורק כדי לרכוש תמונות 16 סיביות בתבנית 1,024 × 1,024, בעוד אנחנו ממוטב מתח הרווח עבור כל ניסוי לפי הצורך. לדוגמה, בניסוי אחד, נוכל להגדיר את הרווח מתח עבור ה-GFP, mCherry, ו מרחיקת אדום כמו 37.8%, 72.9% ו- 260%, בהתאמה.
    1. התמונה ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 6.5, והתאם את הגדרות כאלה פיקסל עוצמות של תמונות pHluorin ו- mCherry נמוכים, אך לא מתחת לגבולות של זיהוי של המצלמה.
    2. תמונה קבוצה נוספת של ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 7.5 והתאם את ההגדרות כאלה עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry הם גבוהה, אבל לא רוויים.
    3. השחלות תמונה של ביקרבונט לנתיחה מאגר ולהבטיח כי עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry לא רוויים עם ההגדרות שבחרת. אם הפיקסלים רוויים, להתאים את ההגדרות לפי הצורך.
      הערה: מיקרוסקופ הגדרת פרמטרים עשויות להשתנות בהתבסס על הכיוונון מיקרוסקופ המדויק בשימוש, חייב להיות אופטימיזציה עבור ניסוי. לאחר מיקרוסקופ הוגדרו הגדרות, אל תשנה אותם לאורך כל הניסוי. הגדרות צריכות להיות עקביים על-פני שליטה ומצבים ניסיוני. בניסויים פי הראשונית שלנו, אנחנו שנוצר 2 ו 3 עקומות כיול נקודת nigericin ומצא הבדל משמעותי בין פי מחושב באמצעות כל אחת מהשיטות. עם זאת, באופן כללי, התוספת של יותר נקודות בתוך עקומת כיול יהיה צפוי לשפר את דיוק. לכן, אנו ממליצים להפקת העקומות עם מספר שונה של נקודות כדי לקבוע כמה נדרשים קבוצה נתונה של תנאי הניסוי-
  3. איסוף נתונים:
    1. לבצע ניתוח, הרכבה, והדמיה של הדגימות בתנאים מאגר ביקרבונט ו- nigericin. לאחר ניתוח, הרכבה, הזמן המרבי הדמיה ערכה אחת של דגימות לא יעלה על 45 דקות על מנת להבטיח כי המדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עשויים ברקמת בשידור חי, בריא.
    2. עבור כל תנאי, לרכוש תמונות לפחות 5 germaria.

3. שלאחר המשפט: ניתוח תמונות

  1. למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב FSCs, pFCs, ותאים זקיק
    1. רקע חיסור:
      1. פתוח לא מעובדת תמונות בפיג'י עם כל ערוץ (בחלון נפרד איור 4C).
      2. השתמש בכלי מלבן כדי לצייר אזור בעל עניין (ROI) בחלון ערוץ pHluorin בחלק של התמונה ללא האות.
      3. שלב
      4. אופציונלי: להגדיר את הגבול התחתון של הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע הם לא נכלל והגדר את הגבול העליון של הסף המרבי. הסף מוגדר באופן זה, האזורים של התמונה ללא האות הם בעיקר כחול, האות הוא נראה בבירור ( איור 4A).
      5. למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של רועי. אם הסף הוגדר בשלב 3, הקפד לבדוק " הגבלה על סף " תיבה בתיבת הדו-שיח הגדרת המידות.
      6. להפחית את עוצמת רקע נמדד מן הערוץ כל פרוסה של התמונה באמצעות הפונקציה הפחת, נמצא בתהליך → תפריט במתמטיקה-
      7. חזור על צעדים 3.1.1.2-6 עבור החלון ערוץ mCherry חוץ מזה, בשלב 3.1.1.2, במקום ציור מלבן חדש עם הכלי מלבן, השתמש בפונקציה הבחירה שחזור, נמצאו ערוך → תפריט הבחירה, כדי להוסיף מלבן עם אותם המידות והמיקום על התמונה.
    2. FSCs לזהות, pFCs ותאים זקיק:
      1. לזהות את FSCs, pFCs ותאים זקיק לפי תאור ומיקום באמצעות ההכתמה Concanavalin-A כדי למצוא תא לגבולות התא ( איור 2).
      2. FSCs הם תאים משולשים דקים ממוקם על קצה germarium בגבול אזור 2a/2b. אם mCherry::pHluorin מתבטאת של שיבוט FSC, FSC גם ניתן לזהות של התא הקדמי ביותר של השיבוט.
      3. pFCs הם תאים בצורת לא סדיר ב אזור 2b, מיד בסמוך ויוצאת של FSCs.
      4. זקיק תאים הם תאים מרובע או טורי המקיפים ציסטה תא הנבט 3 אזור.
    3. קבלת קרינה פלואורסצנטית יחסי העוצמה
      1. בחרו פרוסה אחת או יותר שבו התא של עניין יש עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה בערוץ mCherry ולוודא כי כתמים Concanavalin-A, ראיתי בערוץ מרחיקת אדום, יש foc אותנו בתוך הפרוסה שנבחר.
      2. לצייר רועי סביב כל FSC ולמדוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע pHluorin ו mCherry כל פרוסות שבחרת למדידות.
      3. לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע בערוץ pHluorin על ידי עוצמת קרינה פלואורסצנטית אכזרי של הערוץ mCherry כדי לחשב יחס של pHluorin כדי mCherry זריחה.
  2. Derive פי ערכים, ליצור תמונות pseudocolored
    1. Derive פי ערכים
      1. בכל המקרים, העקומה רגרסיה ליניארית צריך להיווצר באמצעות שימוש השחלות מהזבובים של גנוטיפ באותה לשניהם ניסיוני ולשלוט תנאים. יוצרות עקומה רגרסיה ליניארית לכל סוג התא באמצעות הנתונים nigericin שני מאגר תנאים ( איור 3). ב- Excel, זה יכול להיעשות על-ידי התוויית הנתונים על גרף והוספת קו מגמה ליניארי. לחלופין, לראות:
      2. שימוש המדרון וחיתוך y של העקומה רגרסיה ליניארית שמחושבים התנאים nigericin, המשוואה של קו (y = mx + b) כדי להמיר את pHluorin mCherry יחס ערכי שמחושבים דוגמאות ביקרבונט מצב ערכי pH. במשוואה הזו, תחליף את הטופס מדרון (החיתוך-y) b, לשים את הערך יחס עבור x ו לפתור עבור י'
    2. ליצור תמונת pseudocolored המשקף את ערכי יחס בפיג'י.
      1. בצע ההליך לעיל על רקע חיסור (שלב 3.1.1 ואיור 4).
      2. לחלק את הערוץ pHluorin מערוץ mCherry באמצעות הפונקציה תמונת מחשבון, למצוא בתפריט תהליך. ודא " יצירת חלון חדש " ו " 32-bit (float) תוצאה " תיבות סימון מסומנות שתיהן. לשנות את טבלת בדיקת מידע (LUT), נמצאו תחת תפריט תמונה, תרמית או LUT של בחירה. ראה איור 4 אפשרויות מתאימים אחרים.
      3. כוונון הבהירות והניגודיות בתיבת הדו-שיח (תמונה → התאם → בהירות/ניגודיות), לחץ על " להגדיר " לחצן. קבע המינימום מוצג הערך 0 ותוצג המרבי ערך לכל יחס הטובים ביותר לוכדת את הנתונים, בדרך כלל 1.0-2.0 ( איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן תארנו את התהליך של מדידת פי בתוך האפיתל זקיק, אשר כרוך במספר שלבים. ראשית, השחלות הן גזור מהזבובים של גנוטיפ המתאים באמצעות כלים לנתח, הרכבה (איור 1). Ovarioles ואז הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות כמותית, הדימויים מנותחות לקבל מדידות של פי פי. עבור כל תמונה, סוגי תאים עניין מזוהים כמתואר בסעיף 3.1 (איור 2). היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים GFP, mCherry מומר על פי ערכים באמצעות עיקול רגיל (איור 3 א), כפי שמתואר בסעיף 3.2. באמצעות שיטה זו, מצאנו שאת פי עולה עם בידול בשושלת מוקדם FSC, מ- 6.8 ב FSCs, אל 7.0 בתאים prefollicle, כדי 7.3 בתאים זקיק (איור 3B). פי הערכים של כל סוג התא יכול להיות מיוצג מבחינה גרפית, כמו באיור 3B, או כמו מיקרוסקופ pseudocolored המציג את ההבדלים pHluorin אל mCherry יחס (איור 4 , איור 5). בתמונות האלה, הבדלים pHluorin אל mCherry יחס מוצגים ההבדלים בצבע, כמוגדר פבואר. חשוב לבחור LUT ואת הערכים מינימלי ומקסימלי של טווח הצבעים לייצר דימוי זה נציג רוב הנתונים. למרות זאת, באופן כללי, הבחירה של הגדרות LUT וטווח לא ייתן את המראה של הבדלים שלא נמצאים בתמונה, מבחר LUTs פחות מתאים עשוי לטשטש הבדלים פי נוכח micrograph (איור 5).

Figure 1
איור 1: חומרים עבור ניתוח מכשירי הרכבה דרוזופילה ovarioles. (א) תמונה מראה: (1) לק; (2) עצה גריז, כוס כימית, pipet ואקום המשמש להחלת גריז; (3) 23-מד מזרק מחטים; (4) דומונט Inox מלקחיים, גודל 5; (5) 3D מודפס לחדר הרכבה; (6) 22 X 40 מ מ coverslips זכוכית דקה; (7) סביב coverslips זכוכית דקה, בקוטר 12 מ מ, 0.13-0.16 מ"מ עובי; (8) 9-ובכן זכוכית לנתח מאכל. (B) א תמונה של צילום המקרוב של תא הרכבה מודפס 3D. (ג) תמונה המציגה זוג wildtype שחלות והטרף. (ד) תמונה מראה מופרדים היטב ovarioles. (E) של תמונה של החדר 3D עם שחלות והטרף מותקן תחת coverslip זכוכית עגול. הנקודות השחורות הן טיפות לק נהגו להחזיק את coverslip עגול במקום. Coverslip הזכוכית (F) תמונה של ovarioles גזור מתחת סיבוב לאחר הרכבה. הקופסה השחורה מציינת אזור בתמונה עם ovariole גזור יחיד. סולם העמודות מייצגות כ 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זיהוי FSCs, pFCs ותאים זקיק. שתי דוגמאות germaria עם UAS-mCherry::pHluorin ו- 10930 Gal4 מוכתם Concanavilin-א רועי בהתוויית FSC של טוראי ראשון, תא זקיק מוצג כל תמונה. עוצמות קרינה פלואורסצנטית רשע בערוצים pHluorin ו- mCherry משמשים כדי לחשב את pHluorin אל mCherry יחס. סולם העמודות מייצגות כ 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פי עולה במהלך התמיינות בשושלת FSC. נציג התוצאות שנלקחו Ulmschneider. et al. 2 מראה: עקומה (A) רגרסיה ליניארית טיפוסית המשמשת לחישוב ערכי pH מ pHluorin כדי mCherry יחסי; וערכים (B) פי מחושב עם 95% מרווחי ביטחון FSCs, pFCs ותאים זקיק. איור זה היה מותאם לאחר אישור, Ulmschneider. et al. 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שימוש פיג'י כדי להפיק תמונה רציומטרי pseudocolored. תמונות (A) מציג את התוצאות של כל שלב בתהליך חיסור רקע. החל מתמונה שלא עובדו (לוחות שמאלה), הצעד הראשון הוא להגדיר את גבולות הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע אינם נכללים. הגבול העליון של הסף נקבע ל מרבי. פיג'י צבע הפיקסלים נשלל כחול, ונוצרת תמונה עם רקע כחול, של germarium נראה בבירור (לוחות האמצעי). שימו לב, שלב זה הוא אופציונלי. השלב השני הוא לצייר רועי בחלק של התמונה ללא האות (ריבועים אדומים פאנלים האמצעי), מידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית אומר רועי, ואת הפחת את הכמות כזו של התמונה כולה, וכתוצאה מכך רקע המופחת תמונה (לוחות נכון). השלב השלישי הוא להשתמש בפונקציה חישוב התמונה כדי לחלק את התמונה בערוץ pHluorin לפי התמונה בערוץ mCherry. התוצאה תהיה תמונה המוצגת עם טבלת בדיקת המידע ' אפורים ' והגדר ערכי התצוגה של התמונה כדי להקיף את כל הטווח הדינמי שמספק עומק סיביות של התמונה. השלב הסופי הוא כדי לכוונן את הגדרות התצוגה של התמונה אל טווח יותר מתאים בחר טבלת בדיקת מידע. (B) תמונות לדוגמה מראה את התוצאה של חישוב תמונה עם המינימום להציג ערך מוגדר 0 וערך התצוגה מרבי מוגדר כ- 2.5 באמצעות ארבע טבלאות בדיקת מידע שונים. המלבן ליד כל תמונה מראה הצבעים על פני הטווח הדינמי המשמשים כל טבלת בדיקת מידע. שים לב כי חילו, 16 צבעים של תרמית, שצבעים שונים משמשים הפיקסלים בעוצמה שערכו 0 או מקסימום (למשל, כחול ואדום, בהתאמה, בהילו). זה מספק עזר חזותי קל גבולותיו של הטווח הדינמי, ומאפשר לצופה לראות האות בתוך הטווח הדינמי. (ג) מסך ירה מציג את האפשרויות שנבחרו בשעת ייבוא קובץ לתוך ImageJ באמצעות יישום plug-in ייבוא של ביו-תבניות. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לאס = "jove_content" fo:keep-together.within-דף = "1" >Figure 5
איור 5: הגדרת התמונה ערכי תצוגה של תמונות רציומטרי pseudocolored. יש להגדיר את ערכי התצוגה של התמונה המינימלי והמקסימלי כך האות בתמונות מן התנאי ביקרבונט, כמו גם בין שני התנאים nigericin הם בתוך הטווח הדינמי. כדי להמחיש נקודה זו, שתי תמונות מכל שלושת התנאים מוצגים עם ארבע הגדרות התצוגה תמונה שונה (0-0.5, 0-1, 0-2.5 ו- 0-5) באמצעות טבלת בדיקת המידע תרמי. שים לב כי עבור כל שלושה תנאים ניסיוני, התמונות מוצגות עם ערכת הערך המוצג המרבי ל 0.5, הרבה של האות ליד או מקסימום בסולם ערכי צבע מוחלטים, כאשר זה מוגדר כ- 5.0, הרבה של האות ליד מינימום על הצבע או סולם imetric. בשני המקרים הללו, ההבדלים pHluorin יחס mCherry על פני הרקמה לא יכול להיות בקלות מוערכת אז הגדרות אלה אינן אידיאלי. לעומת זאת, ערכי תצוגה המרבי של 1.0 או 2.5 מתאימים יותר. עם הגדרות אלו, ניתן להערכה הבדלי יחסי על פני הרקמות בקלות, האותות של תמונות של כל שלושת התנאים ניסיוני מוצגים צבעים שנמצאים בתוך הטווח הדינמי של הסולם ערכי צבע מוחלטים. סולם העמודות מייצגות כ 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה למדידת על פי של תאים בשושלת FSC בתוך רקמת wildtype. פרוטוקול זה פותחה, מעודן בחמש השנים האחרונות, מאז אנחנו הראשונים החלו ללמוד פי ברקמת השחלה דרוזופילה . במהלך זמן זה, הפרוטוקול שימש בהצלחה על ידי מספר חוקרים במעבדה שלנו, על פחות ארבעה דיסק מסתובב שונים ועל סריקת מיקרוסקופ לייזר. הפארמצבטית ההתבוננות שלנו המקורי, כי גדל פי כמו תאים בשושלת FSC להבדיל מתא גזע טוראי המדינה תא זקיק, על פני אלה ניסויים מרובים מדגים הן תופעה ביולוגית זו היא חזקה וזה המתודולוגיה היא אמינה. עם זאת, מניסיוננו, זהו תהליך מאתגר להתמחות. זה דורש תשומת לב לכל פרט בכל שלב, ביצוע מהיר, מיומן מאוד הקרע, הרכבה, והדמיה צעדים. כאמור בפרוטוקול, ההליך לנתיחה, הרכבה כולל הדגירה 10 דקות אך לא יעלה על 15 דקות סה כ, יש להשלים את ההליך הדמיה בעוד 45 דקות. בתנאים אידיאליים, דרוזופילה ovarioles יכול להישמר בתרבות עבור עד 14 h17, אבל מצאנו כי הרקמה מתחילה למות מהר יותר במאגרי nigericin המשמש להפקת העקומות סטנדרטי. ההנחיות שלנו להבטיח כי כל הנתונים נאספים בעוד הרקמה הוא עדיין בתוך החלון של פעם שהוא מופיע מורפולוגית תקין. זה לא מותיר הרבה זמן עבור כל שלב, אף, לכן חשוב לתכנן מראש לוודא שהכל מוכן להמשיך משלב אחד למשנהו. למעשה, זה הרבה יותר יעיל אם שני אנשים עובדים ביחד על הקרע, הרכבה, הדמיה נהלים, עם אדם אחד ביצוע שלב תוך האדם האחר מכין עבור השלב הבא.

מאז פי עשוי להיות רגיש המניפולציות ניסיוני נדרשים תמונה של רקמות ex-vivo, כגון טמפרטורה, מאגר הרכב, שיטה זו היא הטובה ביותר לזהות שינויים יחסית pHi. בהינתן כי המכשיר מורכב שני חלבונים פלורסנט ברורים, תכונותיהם פלורסצנטיות כמו תשואה קוונטית, חיים, ומתקפלים עשויים להיות מושפעים באופן שונה סוגי תאים שונים. לכן, זה חיוני כדי לכלול דגימות שטופלו התנאים מאגר nigericin וכדי להשתמש בהם כדי לייצר עקומת כיול חדש עבור כל סוג התא בכל משפט. על מנת למזער את מקורות נוספים עבור השתנות, שמירה על כל התנאים עקבי במהלך דימות מודגשת. דוגמאות בתנאים מאגר nigericin צריך להיות מוכן, עם תמונה באותו יום כמו אלה התנאי מאגר ביקרבונט ההכנה ותמונה רכישת כל דוגמאות יש לשמור עקבי ככל האפשר. זה חשוב כי המדידות פי מבוססים על השוואה בין קבוצות תמונות, הבדלים אז ניסיוני המשפיעות על הגילוי של mCherry pHluorin אחד או יותר של ערכות התמונה עשויה להקטין את הדיוק של הערכות-פי. גורמים כגון שינויים בהגדרות מתח של הצינורות האופטיקה (אם משתמש לייזר קונפוקלי סורק) או פעמים חשיפה (אם משתמשים דיסק מסתובב קונאפוקלית) או עדשה מלוכלך מקטין את כמות האור להגיע למצלמה, תשפיע על תוצאות . אבל יש מספר עצום של גורמים אחרים יותר עדין עשוי להשתנות היומיומית, עשויה גם להשפיע על התוצאות, כגון אם הזבובים הם מוזן היטב, הגיל של הזבובים ולאחר כמה הלייזרים זמן על לפני הדמיה. הכנת הדמיה כל שלושה תנאים באותו יום ממזער את ההבדלים הללו, ובכך יפיקו את התוצאות הכי עקבי. ראוי לציין, בכל פעם העברנו מיקרוסקופ חדש או רכיבים של המיקרוסקופ שודרגו, היה צורך reoptimize את ההגדרות על הציוד החדש. לעיתים קרובות כתוצאה מכך שינוי הערכים ממוצע של מדידות אבל, כל עוד עקומות כיול חדשים נוצרו בכל ניסוי, השינויים בציוד הייתה השפעה מינימלית על פי ההערכות. בנוסף, ההשוואה הרלוונטית לעיתים קרובות בין סוגי תאים שונים בתוך הרקמה זהה (למשל, FSCs, תאים pFCs ואת זקיק), ולכן הם פנימי נשלטת וריאציות ניסיוני.

למרות פרוטוקול זה התמקדה מדידה פי רקמת wildtype, המתודולוגיה הוא תואם בשיטות הרגילות דרוזופילה מניפולציות ביטוי גנים, כגון הביטוי של RNAi או של transgene באמצעות UAS/Gal4, וניתוח פסיפס. מאז mCherry::pHluorin נדחף על ידי יזם UAS זה תמיד יהיה ביטוי במשותף עם RNAi או transgene, MARCM18 יכול לשמש כדי ליצור שיבוטים מוטציה homozygous עם mCherry::pHluorin כמו דה מרקר המשובטים. מהסיבות שתוארו לעיל, רקמת wildtype צריך להיות מנותח כפקד לצד כל משפט עם גנוטיפ מוטציה. לבסוף, ניתן להחיל את עקרונות כלליים המתוארים כאן על השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי ברקמות אחרות גם כן. אכן, פרוטוקול זה מקורי עבור שימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי ב העין דרוזופילה 7פרוטוקול, השתמשנו מתודולוגיה דומה כדי תמונה mCherry::pHluorin במוח זחל. בסך הכל, הכלים והשיטות המתוארים כאן מספקים הזדמנויות חדשות לחקור פונקציות מגוונות רבות של pHi ויוו בתוך רקמת חי, ללא פגע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים Bryne Ulmschneider על תרומתה הפרוטוקול ואת מספרה דיאן לקבלת הצעות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי מכון הלאומי של בריאות גרנט GM116384 Nystul ת. ג, די. אל הספר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
  2. Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215, (3), 345-355 (2016).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  5. Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202, (6), 849-859 (2013).
  6. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  7. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
  8. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  9. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17, (1), 15-25 (2007).
  10. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  11. Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21, (1), 159-171 (2011).
  12. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
  13. St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141, (5), 757-774 (2010).
  14. Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
  15. Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121, (11), 3797-3807 (1995).
  16. Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1, (3), 277-285 (2007).
  17. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  18. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24, (5), 251-254 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics