Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

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Biochemistry

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Summary

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).

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Abstract

Estructura secundaria de ácidos nucleicos no canónicos que g-quadruplexes (G4) intervienen en diversos procesos celulares, tales como la replicación del ADN, transcripción, procesamiento de RNA y alargamiento de los telómeros. Durante estos procesos, varias proteínas se unen y resolución estructuras G4 para realizar su función. Como la función de G4 a menudo depende de la estabilidad de su estructura doblada, es importante investigar cómo G4 proteínas regulan la estabilidad del G4. Este trabajo presenta un método para manipular las moléculas individuales de G4 con pinzas magnéticas, que permite estudios de la regulación de proteínas G4 en una sola molécula G4 en tiempo real. En general, este método es conveniente para una amplia gama de aplicaciones en estudios de interacciones de proteínas/ligandos y las regulaciones sobre varias estructuras secundarias DNA o RNA.

Introduction

Trenzado de cuatro estructuras de ADN o ARN G4 desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos importantes1. Muchas proteínas están implicadas en el enlace de G4 y regulación, incluyendo proteínas telomere (telomerasa, TRF2, POT1, RPA, TEBPs)1,2, factores de transcripción (nucleolin PARP1)3, RNA, proteínas (hnRNP A1, de procesamiento hnRNP A2)4, helicasas (BLM FANCJ RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5y replicación del ADN relacionadas con proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Unión a proteínas puede estabilizar o desestabilizar las estructuras G4; así regular las funciones biológicas posteriores. La estabilidad del G4 se midió por termo fusión usando radiación ultravioleta (UV) o métodos de dicroísmo circular (CD)7. Sin embargo, tales condiciones no son fisiológicos relevantes y son difíciles de aplicar al estudio de los efectos de la Unión de proteínas7.

El rápido desarrollo de tecnologías de manipulación de una sola molécula ha permitido estudios de plegar y desplegar de una biomolécula, como ADN o una proteína, a nivel de una sola molécula con resolución nanométrica en tiempo real8. Microscopía de fuerza atómica (AFM), pinzas ópticas y pinzas magnéticas son los más utilizados métodos de manipulación de una sola molécula. En comparación con AFM y pinza óptica9, pinzas magnéticas permiten mediciones estables de plegar-desplegar dinámicas de una sola molécula durante días utilizando una técnica anti deriva10,11.

Aquí, una plataforma de manipulación de una sola molécula con pinzas magnéticas para estudiar la regulación de la estabilidad de la G4 de las proteínas es divulgado12,13. Este trabajo describe los métodos básicos, incluyendo preparación de muestra y el flujo de canal, la instalación de pinzas magnéticas y la calibración de fuerza. Permiten el control de la fuerza y los protocolos anti deriva como se describe en el paso 3 para largo tiempo las mediciones con varios controles de la fuerza, como fuerza constante (fuerza de sujeción) y constante carga tarifa (fuerza-rampa) y medición de salto de fuerza. El protocolo de calibración de fuerza se describe en el paso 4 permite calibración de fuerza de < correas cortas 1 μm sobre una fuerza amplia gama pN hasta 100, con un error relativo dentro del 10%. Un ejemplo de regulación de la estabilidad de la helicasa de ARN asociada a helicase de elemento (RHAU) ricos en AU (alias DHX36, G4R1) que juega un papel esencial en la solución de que RNA G4 se utiliza para demostrar las aplicaciones de esta plataforma13.

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Protocol

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  • configuración de la muestra e identificar solo dsDNA tether
    1. formación correa
      1. suavemente el flujo en 200 X diluido granos M-280, paramagnéticos en la solución de ensayo (100 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Tris, pH 7.4 ) en un canal. Incubar durante 10 minutos permitir que los granos que se unen a moléculas de ADN marcada con biotina inmovilizadas en la superficie revestida de SMCC a través del extremo marcado con tiol. Lave suavemente sin tethered cuentas con 200 μL de solución estándar de la reacción.
        Nota: Los granos de M-280 muestran menor fijación no específica a la superficie en comparación con otros granos magnéticos comerciales como M-270.
    2. Instale el canal en la platina del microscopio. La búsqueda para los granos en la superficie inferior con el 100 X objetivo de inmersión de aceite.
    3. Seleccionar una cuenta de referencia en la superficie y un cordón atado movimiento. Construir las bibliotecas de la imagen inicial del grano referencia y grano anclado en planos diferentes desenfoque.
    4. Calibración de imagen de granos
      1. antes de los experimentos, utilizar un actuador piezoeléctrico objetiva para obtener imágenes de referencia y granos anclados en desenfocar diferentes planos espaciados por 20-50 nm, que se almacenan como dos imágenes separadas del grano bibliotecas y son indexadas respectivamente con la distancia del desenfoque ( Figura 2D).
    5. x, y, determinación de la posición de z
      1. durante los experimentos, determinan la posición del grano en el plano x-y por el centroide de grano. Determinar el cambio de altura de los talones atado mediante la comparación de la imagen actual del grano con los almacenados en la biblioteca. Utilizar el análisis de la función de auto correlación del espectro de energía de la transformada de Fourier del grano imágenes 16.
    6. Anti deriva retroalimentación utilizando grano de referencia
      1. durante los experimentos, utilizar el piezo a " bloqueo " la distancia entre el objetivo y una imagen de referencia específica del grano almacenado en la biblioteca a través de una baja frecuencia control de retroalimentación, para que la imagen del grano pegado tiene la mejor correlación con una específica imagen almacenada en la biblioteca ( Figura 2D).
    7. Determinar si el anclaje es una molécula única dsDNA mediante la aplicación de ~ 65 pN fuerza determinar una molécula dsDNA solo si el anclaje somete el ADN característica estirar demasiado transición 17 , 18 , 19. Repita el proceso hasta encontrar un anclaje de dsDNA sola. (Consulte la sección siguiente para la calibración de fuerza y ADN estirar demasiado la transición).
  • 4. Calibración de fuerza de pinza magnética

    1. determinar directamente la fuerza (hasta 100 pN) por largo (48.502 bp ADN λ) las moléculas de ADN con fluctuación de grano a través de:
      Equation 1
      , donde k B es la constante de Boltzmann, T es la temperatura en escala Kelvin, δ 2 y es la varianza de la fluctuación de grano en la dirección perpendicular al campo magnético y la fuerza Dirección. En este sentido, el movimiento del grano puede ser descrito como una fluctuación de péndulo con una longitud de l + r 0, donde l es la distancia de extremo a extremo a lo largo de la dirección de la fuerza (extensión) de la DNA, y r 0 el radio del grano 10 ( Figura 3A).
    2. Determine la curva de calibración para la fuerza F en función de los imanes a la distancia del grano d y F (d) para distintos granos usando la DNA de λ larga. La distancia entre el imán y el cubreobjetos se utiliza generalmente, como la longitud de anclaje de ADN puede ser ignorada. Ajuste F-d curva de la función del decaimiento exponencial doble:
      Equation 2
      , donde la conexión parámetros α1, α2, γ1, γ2 son determinados por la pinzas magnéticas y el parámetro C es determinado por la propiedad heterogénea de las bolas magnéticas. Cambiando la C, F-d curva obtenida de diversos granos puede ser traslapado 10 ( figura 3B).
    3. Experimentos de calibración del parámetro C para granos magnéticos individuales de ADN corto.
      1. Determinación de la fuerza basada en la fluctuación requiere grabar la posición del grano en una frecuencia más alta que la frecuencia esquina:
        Equation 3
        , donde γ es el arrastre coeficiente de la cuenta. Para DNA corto en alta fuerza, requiere grabación de frecuencia superior a 100 Hz, por lo tanto, la fuerza no puede ser directamente medida en base a la fluctuación con la cámara. Sin embargo, el parámetro C se puede determinar midiendo la fuerza en un mínimo fuerza gama (< pN 15) con fluctuación y guarnición de los datos con un calibrado F-d curva para obtener el parámetro C 20.
      2. De forma alternativa, para experimentos con el dsDNA, determinar el parámetro C usando la DNA estirar demasiado la transición a una fuerza de ~ 65 pN ( figura 3) 21 , 22 , 23 mediante el registro de la posición d en que salto de extensión demostró dsDNA (0,6 X aumento de la longitud de la longitud del contorno). Después de determinar el parámetro C, calcular la fuerza de los granos atados.
    4. Control de la velocidad de carga mediante la programación del movimiento de los imanes a través de la función inversa de F (d). El imán debe acercar la muestra doble exponencial.
      Nota: El error relativo de la fuerza determinado por un método de extrapolación es ~ 10% y es causada principalmente por el grano radio heterogeneidad 20.

    5. Manipulación de una sola molécula de G4 en la presencia y la ausencia de proteínas vinculantes

    1. fuerza-rampa experimentos
      1. después de identificar el anclaje de dsDNA, realizar un análisis de aumento de la fuerza a una velocidad de carga de 0,2 pN/s seguido por un exploración de la fuerza-fallecimiento en -0.2 pN/s. Después de cada ciclo de estiramiento, mantenga la molécula de ADN en 1 pN 30 s para permitir el ssDNA replegar a G4.
    2. Experimentos de fuerza de salto
      1. ciclo de la fuerza entre 54 pN 30 s en las que un G4 doblado podría ser desplegado y 1 pN para los años 60, bajo las cuales podría replegar un G4-15T doblado.
    3. Solución de flujo de proteína
      1. flujo de la solución de proteína cuando en ~ 20 pN fuerza para evitar la fijación de los granos el cubreobjetos. La helicasa RHAU DEAH-box, que demostraron alta especificidad a la estructura G4, fue usado 24. La recombinante helicase RHAU (DmRHAU) de Drosophila melanogaster fue expresada en Escherichia coli y purificada como se describió anteriormente 25. El G4 desenrollar actividad de DmRHAU se analiza en un tetramolecular G4 ADN sustrato 13.
    4. Analizar la fuerza de despliegue con un interno escrito Matlab programa 14.

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    Representative Results

    El montaje experimental para estirar una sola molécula G4 se muestra en la figura 4. Una secuencia de formación de G4 de monocatenario atravesada entre dos asas del dsDNA fue anclada entre un cubreobjetos y un talón paramagnético. Para encontrar una tira atada solo dsDNA, se realizó un ensayo demasiado incrementando la fuerza en las tasas de carga constante. A menudo se utilizaron tres tipos de mediciones para estudiar el plegamiento y desplegamiento de biomoléculas: medición de fuerza i constante, (ii) fuerza-rampa medición y medición (iii) fuerza-salto. Debido a las tasas de desarrollo extremadamente lentas de esta estructura de G4, el equilibrio transición plegar-desplegar sólo podría ocurrir durante el tiempo en días, así que las medidas de fuerza-rampa y salto de fuerza fueron utilizadas para caracterizar la cinética de desarrollo y estabilidad de G4 estructuras.

    Medidas de fuerza-rampa para G4 en la presencia o ausencia de la proteína RHAU:

    Figura 4B muestra curvas típicas de extensión de fuerza obtenidas por un aumento de la fuerza de escanear a una velocidad de carga de 0,2 pN/s seguida de una exploración de la fuerza-fallecimiento en -0.2 pN/s. Después de cada estiramiento, la molécula de ADN se realizó en 1 pN 30 s para permitir ssDNA replegar a G4. El salto de extensión en el análisis de aumento de la fuerza indica una transición despliegue de G4. Cuando se utiliza una secuencia de formación no G4, el salto repentino de extensión no puede ser observado. La distribución de fuerza desplegado podía obtenerse mediante el registro de las fuerzas que despliegue ocurrió. El despliegue de la fuerza distribución de G4-15T en 0,2 pN/s demostró un solo pico en ~ 52 pN. Sin embargo, en presencia de 10 nM RHAU, G4-15T permanecido doblado durante la búsqueda de aumento de la fuerza pN hasta 60, indicando G4 estabilización atando RHAU. En presencia de 10 nM RHAU y 1 mM ATP, la distribución de fuerza de despliegue fue cambiado de puesto a una fuerza inferior, indicativa de una desestabilización de ATP dependiente de G4 por RHAU.

    Fuerza de salto medidas de G4 en la presencia o ausencia de la proteína RHAU:

    La figura 5 muestra una traza representativa de la altura de grano durante cuatro ciclos de fuerza de salto (figura 5, panel de la izquierda); la fuerza aplicada a la molécula fue un ciclo de entre 54 pN 30 s que un G4 doblado podría ser desplegado y 1 pN 60 s bajo las cuales podría replegar un G4-15T doblado. La vida media del G4-15T doblado en pN 54 fue ~ 6.4 s, estimada ajustando el histograma de toda la vida con un decaimiento exponencial función13. Después de fluir en una solución de 10 nM RHAU helicase sin ATP, la extensión del ADN atado mantenido en un nivel doblado a lo largo de los tiempo s 30 a 54 pN, indicando que el RHAU fuertemente estabiliza la estructura G4-15T contra despliegue mecánico en la ausencia de ATP. Después de fluir en 10 nM RHAU y 1 mM ATP, la extensión de la misma molécula después de saltar de 1 pN a 54 pN estaba a la altura de la ssDNA desplegada, indicando que el RHAU desestabiliza la estructura G4 en presencia de ATP.

    Figure 1
    Figura 1: Preparación de ADN G4 para los experimentos que una sola molécula.
    Los mangos de dsDNA se prepararon por PCR usando las cartillas tiol 5' y 5'-biotina. Productos de PCR fueron purificados y digerido con la enzima de restricción BstXI y se purificaron por gel de extracción. SsDNA forma G4, dos flanquean ssDNA y dsDNA mango fueron ligarse con T4 ADN ligasa. El producto ligado fue purificado por la extracción de gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 2
    Figura 2: Bocetos del aparato básico pinzas magnéticas.
    (A) esquema de un canal de flujo con un par de imanes arriba y un objetivo de microscopio colocado debajo. (B) esquema de un canal de flujo montado en los rectángulos de color azul representan el cubre-objetos superior e inferior, y gris líneas elípticas representan la entrada y salida del canal de flujo. (C) esquema de la generación de fuerzas y la calibración de la configuración magnética Pinzas. Enfoque de (D) ejemplos de imágenes de la tira de referencia y movimiento del grano en diferentes posiciones almacenados en las bibliotecas de imágenes de grano. La muestra roja denota la imagen de grano de referencia obtenida en un determinado foco de avión utilizado para la fijación del plano focal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 3
    Figura 3: Fuerza calibración de pinzas magnéticas.
    (A) calibración de la fuerza con las fluctuaciones del grano a lo largo de una dirección y rotación libre. Eje x se encuentra en la misma dirección que el campo magnético. Fuerza es a lo largo del eje z y se controla mediante el ajuste de la distancia, d, entre el par de imanes permanentes y el cubreobjetos. (B) calibración de usar un largo 48.502 bp-ADN. Propiedad de grano magnético heterogéneo puede ser descrito por una solo parámetro C. Esta figura se ha modificado de10. (C) calibración del parámetro C de una tira magnética en un 2 kb de ADN utilizando B a S transición el estirar demasiado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 4
    Figura 4: Manipulación de una sola molécula de un G4.
    (A) bosquejo de una sola estructura G4 de estiramiento y medir el desarrollo de los acontecimientos. (B) ejemplo típico de fuerza-incremento (cyan) y curva de disminución de la fuerza de un G4 atada. Esta figura ha sido modificada desde12. (C) curva de fuerza-extensión de G4 en la ausencia (gris) o presencia (rosa) de la proteína RHAU. Desplegado (D) distribución de G4 en la ausencia (gris) de la fuerza (n = 140) o presencia (rojo) de RHAU y ATP (n = 117). Esta cifra ha sido modificada desde el13. Por favor haga clic enaquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figure 5
    Figura 5: Mediciones de fuerza salto de G4 despliegue.
    Rastro de tiempo representativo (A) el cambio de altura de grano durante fuerza salte ciclos entre 1 pN y pN 54 medido sin DmRHAU, con 10 nM DmRHAU pero sin ATP y con 10 nM DmRHAU y 1 mM ATP, como se indica en el panel de la figura. (B) trace de tiempo representativo del cambio de la extensión de una molécula G4 (datos gris) después de saltar a pN 54 en varios ciclos de fuerza salto de datos (A). Las extensiones correspondientes a doblada (F) y G4 (U) desplegado también se indican; G4 acontecimientos están indicados por flechas. Esta cifra ha sido modificada desde el13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Como se describió anteriormente, una plataforma para el estudio de la estabilidad mecánica de la DNA de G4 y las interacciones de la proteína a G4 usando pinzas magnéticas de una sola molécula se divulgan. Acompañando a la plataforma, se desarrollan protocolos eficientes de encontrar anclaje G4 ADN y medición de la dinámica de plegar-desplegar y la estabilidad de la estructura G4 con resolución especial nanómetros. La fijación del plano focal permite control antideriva altamente estable, que es importante para detectar una transición de pequeña estructura como G4 (paso tamaño ~ 7 nm) y las interacciones con las proteínas en experimentos de cambio de buffer. Esta plataforma se ha empleado recientemente para estudios de la dinámica de plegamiento y desplegamiento de telomeric G414 y c-Myc promotor G412, así como estudios de G4 Unión proteína RHAU helicase13.

    Un experimento típico error es el atascamiento no específico de ADN y los granos en el cubreobjetos o múltiples DNAs se unen a bolas magnéticas. Para reducir el atascamiento no específico, en primer lugar, el almacenamiento de productos químicos tales como APTES y SMCC necesita revisarse rutinariamente. En segundo lugar, es importante seleccionar un tipo adecuado de grano magnético y bloquea el atascamiento no específico. Utilizando BSA de 10 mg/mL de tampón o oligo pequeño de DNA, como poli T bloquear la superficie de los granos puede reducir significativamente el atascamiento no específico. Por último, una sola correa de ADN puede fácilmente distinguirse de correas múltiples de DNA por la característica ADN demasiado transición17,18,19.

    Actualmente, la determinación de la posición de la plataforma se basa en el análisis, la proyección de imagen del grano que tiene una resolución espacial limitada de ~ 2 nm. Además, tiene una frecuencia de muestreo limitado de ~ 100 Hz, principalmente debido a la limitada adquisición de cámaras CCD típico y análisis de correlación de las imágenes. Estas limitaciones pueden superarse mediante el uso de iluminación (TIRF) la microscopia de reflexión interna total. Produce una fina capa de luz evanescente que decae exponencialmente con la altura de la superficie, que puede utilizarse para determinar el cambio de extensión de moléculas cortas en un alto cociente signal-to-noise, evitando la adquisición de la imagen del grano y el análisis26 . Otra limitación es que es difícil de visualizar directamente la molécula tethered o ligando enlazado a la molécula anclada usando proyección de imagen de fluorescencia en el diseño vertical de estiramiento, que puede ser superado por el estiramiento de las moléculas en el plano focal pinza magnética transversal27. Por último, el diseño actual del canal de reacción no permite intercambio de solución rápida debido a la perturbación del flujo a la molécula. Además, una fuerza de arrastre grande generada en flujo de alta velocidad incluso puede romperse los amarres. Esta limitación puede superarse mediante la manipulación de amarres dentro de los pocillos a la superficie inferior del canal28.

    G4 compuestos estabilizadores actualmente se consideran como potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades, incluyendo cáncer, virus relacionados con enfermedades y neurodegeneración enfermedades29,30,31. El protocolo se puede aplicar a una amplia gama de G4 vinculante proteínas2 y ligandos pequeños32. Además de las aplicaciones en estudios de G4, esta plataforma, así como los protocolos, en principio, pueden utilizarse para estudios de otras estructuras secundaria de ácidos nucleicos, como ADN y RNA horquillas, triplex, i-motivo33.

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    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgments

    Los autores agradecen a Meng Pan para corregir el manuscrito. Este trabajo es apoyado por Singapur Ministerio de educación académica investigación fondo de nivel 3 (MOE2012-T3-1-001) a J.Y.; la Fundación Nacional de investigación a través de la mecanobiología Instituto Singapur J.Y.; la Fundación Nacional de investigación, oficina, Singapur del primer ministro, bajo su programa de Investigatorship de la NRF (NRF Investigatorship premio no. NRF-NRFI2016-03 J.Y.; el fondo de Investigación Fundamental para las universidades Central (2017KFYXJJ153) a H. Y.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DNA PCR primers IDT DNA preparations
    DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
    restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
    coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
    Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
    APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
    Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
    M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
    Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
    2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
    Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
    Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
    Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
    CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
    Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
    LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
    Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
    Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
    OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis

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