Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains

Behavior

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Summary

Un protocole pour construire un illuminateur pénétration tissulaire pour fournir la lumière au-dessus de grands volumes dont le diamètre minimal est présenté.

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Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

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Abstract

Ce protocole décrit un illuminateur de grand volume, qui a été développé pour des manipulations d’optogenetic dans le cerveau de primate non humain. L’illuminateur est une fibre optique à mis à jour le plastique avec embout gravé, tels que la superficie d’émettant de la lumière est > 100 fois celui d’une fibre conventionnelle. En plus de décrire la construction de l’illuminateur de grand volume, ce protocole détaille l’étalonnage de contrôle de la qualité utilisé pour assurer la distribution même la lumière. De plus, ce protocole décrit des techniques pour insérer et retirer l’illuminateur de grand volume. Les structures superficielles et profondes peuvent être éclairés. Ce projecteur grand volume n’a pas besoin d’être physiquement couplée à une électrode, et parce que l’éclairage est fait de plastique, pas de verre, il se pliera simplement dans des circonstances, lorsque des fibres optiques traditionnelles serait briser. Car cet illuminateur distribue la lumière sur les volumes de tissus pertinents sur le plan comportemental (≈ 10 mm3) sans dommage de pénétration supérieure à une fibre optique conventionnelle, il facilite les études comportementales chez les primates non humains à l’aide d’optogenetics.

Introduction

Optogenetic outils, qui permettent un contrôle neuronal milliseconde-précis et axée sur la lumière sont largement utilisés pour étudier la physiologie fonctionnelle et le comportement des rongeurs et des invertébrés. Toutefois, des défis techniques ont limité l’utilisation d’optogenetics dans le cerveau de primate non humain, qui a un volume ~ 100 x plus grand que le cerveau de rongeurs 1.

Pour faciliter les études d’optogenetics chez les primates non humains, enlumineur a été conçu pour répondre à deux objectifs contradictoires : illumination de grand volume et dommages de pénétration minimale. Les tentatives précédentes pour relever l’un de ces préoccupations sont venus à la coûteuse de l’autre. Faisceaux de fibres s’allument plus grands volumes mais avec diamètre augmenté et, par conséquent, dommages2,3. Fibre de verre coniques réduire les dommages de pénétration, mais étroitement mise au point de lumière émettant des surfaces < 100 µm2 4,5. Illumination de cerveau externe à travers une vitre dans la dure-mère contourne le défi des dommages de la pénétration et peut permettre pour l’éclairage de volume important, mais il seulement peut être utilisé pour quelques de zones cérébrales superficielles6.

Pour créer un illuminateur de grand volume, petit diamètre (Figure 1 a), la pointe d’un plastique optique fibre est conique de la chaleur et le noyau et le revêtement sont gravés (Figure 1 bc). Contrairement à d’autres fibres coniques qui se concentrent la lumière à un point précis, la gravure permet à la lumière de s’échapper uniformément sur les côtés de la pointe, ainsi, distribuer la lumière largement sur une grande surface (Figure 1 de). Parce que les dommages de pénétration sont proportionnel au diamètre de la pénétration, ce projecteur a aucun dommage de pénétration plus qu’une fibre conventionnelle, pourtant, il a > 100 x la lumière émettant une lumière de zone et livre surface plus large avec 1/100e la puissance lumineuse densité dans un cerveau fantôme (1,75 % d’agarose) (Figure 1e). Un modèle Monte Carlo (Figure 1f) illustre la différence dans la propagation de lumière entre une fibre conventionnelle et l’illuminateur de grand volume lorsqu’ils ont des densités de puissance lumineuse égale comme leur éclairantes. Chaque projecteur est calibré individuellement à l’aide d’une sphère d’Ulbricht (Figure 2 a, b) pour assurer la distribution même la lumière le long de la pointe (Figure 2c).

Ce projecteur grand volume a été validé avec optogenetic manipulation du comportement et de décharge neuronale chez les primates non humains. La longueur de pointe de fibre peut-être être personnalisée à une zone du cerveau et au mappage de champ réceptif individuels de chaque animal. L’illuminateur peut être couplé avec une électrode pénétrante pour les enregistrements neuronales qui s’étendent sur la durée de l’éclairement. En outre, parce que la fibre peut porter n’importe quelle couleur de la lumière visible, il peut être couplé avec n’importe lequel des molécules disponibles optogenetic disponibles.

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Protocol

Remarque : toutes les procédures d’animaux étaient selon les directives des NIH et ont été approuvés par le Massachusetts Institute Technology Comité de protection des animaux.

1. illuminateur Fabrication

  1. utiliser une paire de ciseaux tranchants pour couper un tronçon de 250 µm de diamètre en plastique fibre optique qui est supérieure à la longueur désirée illuminateur total d’au moins 10 cm.
  2. Enlever 15 à 20 cm de gaine de polyéthylène d’une extrémité de la fibre optique en plastique à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.
  3. Secure distale plus 3 à 5 cm de l’extrémité dénudée de la fibre dans une pince étau de table.
  4. Tenez l’extrémité chemisée de la fibre tendue d’une main avec une traction constante constante. La fibre doit être parallèle au sol, perpendiculaire à l’étau. Maintenir cette tension constante sur la fibre tout au long de chauffage et de refroidissement (étapes 1.5 et 1.6 ci-dessous) pour que la fibre reste droite et tendue comme il amincit.
  5. Au réglage le plus bas d’un pistolet à air chaud température double (570/1 000 ° F), chauffer la partie dénudée de la fibre jusqu'à ce qu’elle est diluée à un diamètre de 60 à 100 μm, ou environ le diamètre d’un cheveu humain.
  6. Maintenir une tension constante sur la fibre tout en permettant à la fibre refroidir. Incapacité à maintenir la tension peut provoquer la fibre à friser.
  7. Confirmer le diamètre de l’extrémité amincie sous un microscope à dissection. Alternativement, on peut utiliser les étriers à la place.
    1. Si la fibre n’est pas assez mince, répétez les étapes 1.4 à 1.6 si nécessaire pour obtenir le diamètre souhaité.
    2. Facultatif si re-tirer, mettre une petite marque à la partie la plus étroite de la fibre si il sera chauffé à nouveau afin que le centre du pistolet à air chaud vise la partie la plus étroite de la fibre.
    3. Si la fibre est trop mince, recommencer.
  8. Une fois que la fibre ait complètement refroidi et le diamètre désiré a été atteint, pincer la fibre 3 cm du point plus étroit de chaque côté. Avec un accès rapide, forte traction dans l’axe de la fibre, séparez les côtés pour créer une pointe effilée.
  9. Examiner l’extrémité effilée sous une faible puissance (par exemple, 4 X) microscope de dissection. Si la pointe est fourchue ou ondulée ( Figure 1f), jeter la fibre.
  10. Préparer vers etch l’extrémité effilée en plaçant un morceau de ruban de laboratoire près de l’extrémité de la pointe, laissant les derniers 5 mm exposé. La bande protège la fibre de la gravure ci-dessus la longueur désirée de la luminescence. Cette longueur de pointe a été sélectionnée sur l’épaisseur du cortex des primates dans la région cible. Une durée plus longue ou plus courte pourrait être exposée selon la longueur désirée de l’éclairement. Si vous souhaitez une longueur de pointe différents etch, le bord de la bande de laboratoire peut être rapproché à ou plus loin de l’extrémité effilée.
  11. Replier un carré petit (~ 1 po x 2 po) de 5 μm feuille rodage de carbure de silicium entre le pouce et l’index. Placer l’extrémité de la fibre entre les deux côtés de la feuille de rodage et etch délicatement la fibre à l’aide de petits mouvements circulaires, comme si un BB de roulement entre le pouce et l’index. Souvent tourner la fibre afin que tous les côtés sont gravées uniformément. L’extrémité de la fibre apparaît “ rugueuse ” à le œil nu dans des zones qui ont été gravés, tandis que les zones non gravées apparaissent généralement lisses.
  12. Répéter l’étape 1.11 avec un oxyde d’aluminium de 3 μm rodage feuille.
  13. , Apposer un connecteur à l’extrémité de l’illuminateur en face de la pointe gravée. Cela permet l’illuminateur pour se connecter à un câble optique ou laser.
    Remarque : Cette méthode diffère de la méthode préférée pour la fixation de verre / fibres optiques silice dans les bagues. Parce que la virole de métal est plus dur que la fibre optique en plastique, polissage de la fibre et une bague en tant qu’unité après que collage peut endommager la fibre optique en plastique comme de minuscules éclats de métal produit pendant le processus de polissage peut intégrer eux-mêmes en fibre plat clivée.
    1. Retirer environ 5 mm de la gaine de polyéthylène du côté opposé de l’illuminateur à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.
    2. Couper l’autre extrémité plate avec un couteau chaud pour lisser la surface.
    3. Polonais à l’autre extrémité plate avec rodage successivement plus fines feuilles : 5 µm, 3 μm, 1 μm et 0,3 µm.
    4. Insérer l’appartement en face de l’extrémité dans une virole d’acier inoxydable de diamètre intérieur 260 µm jusqu'à ce qu’il affleure de l’extrémité de la ferrule.
    5. Confirmer visuellement que l’extrémité opposée est facilement et uniformément polie avec un microscope de fibre.
    6. Retirer l’embout de la fibre et l’embout verticalement sur le bord d’une table de bande avec la fibre vers le bas.
    7. Remplir une seringue de 1 mL avec de l’époxy en plastique et fixer une aiguille de 18 calibre émoussé à la seringue.
    8. Utiliser l’aiguille pour enduire vers le bas dans la virole. L’embout se remplir complètement avec de l’époxy.
    9. Insérer l’embout de la fibre.
    10. Essuyer tout excès époxy de surface polie de la fibre avec un chiffon non pelucheux humide avant séchage si nécessaire. Dans le cas contraire, excès époxy peut être enlevé après 12 à 24 h.
    11. Conserver la fibre doucement jusqu'à l’étalonnage et placer un capuchon sur l’embout.

2. Illuminateur d’étalonnage et de contrôle de la qualité

Remarque : ces méthodes pour l’étalonnage évaluer pour la non-linéarité à différentes distances de l’extrémité de la fibre de sortie de lumière. Inégale répartition de la lumière résulte généralement d’un “ bosselé ” ou “ ondulé ” cône.

  1. Créer un blindage léger diaphragme pour le haut de la sphère intégrant l’aide absorbant léger grille ( Figure 2).
    Remarque : Portez des gants lorsque manipulation lumière absorbant aluminium pour empêcher la peau huiles de la création de légères taches réfléchissantes.
    1. Pli a 2 ” de 4 ” morceau de lumière absorbant aluminium au-dessus sur lui-même pour former un 2 ” x 2 ” square. une autre méthode consiste à couper un 2 ” x 2 ” carré avec une lumière absorbante côté et un feu qui reflète le côté (c.-à-d. un côté de papier d’aluminium standard) ; Toutefois, la méthode pliable est plus sûre parce qu’il fournit un bord terne pour la manipulation du diaphragme dans la prochaine étape.
    2. plier le ruban de laboratoire ou du ruban isolant sur les bords de la place pour lier les bords non plié. Cela cimente les côtés et protège contre les coupures d’arêtes vives.
    3. Percer un trou dans le centre de la place à l’aide d’une aiguille de 26 calibre.
    4. Supprimer la grosse vis sur le cap de la sphère d’intégration et couvrir l’ouverture avec le diaphragme. Recouvrir le trou au centre. Si la membrane a été créée avec une lumière absorbante et une lumière réfléchie côté, placer la lumière absorbant côté vers le haut et la lumière réfléchie vers le bas, vers l’intérieur de la sphère d’intégration.
      Remarque : Pour empêcher la poussière et les débris de pénétrer dans la sphère d’intégration et pour garder le trou centré, fixer le diaphragme à l’extérieur de la sphère d’intégration avec du ruban adhésif lab.
  2. Mesure lumière sortie le long de la pointe par incréments de 500 µm à l’aide d’un micromanipulateur ou un bras et une sphère d’Ulbricht.
    Remarque : Lunettes de protection de la longueur d’onde appropriée devraient être portés à chaque fois que le laser est sur.
    1. Reliez l’autre extrémité de la fibre à un laser ou une lumière source, mais ne déclenchent pas de lumière de sortie encore.
    2. Garantir l’illuminateur à un titulaire stéréotaxique (prefeRahab avec du ruban adhésif lab) avec la pointe 7-10 mm au dessous du fond du support à.
    3. Vis du support stéréotaxique dans l’ARM stéréotaxiques.
    4. Alignez la pointe de l’illuminateur avec le trou dans le centre du diaphragme. Zéro le micromanipulateur lorsque la pointe est au même niveau que le diaphragme exact.
    5. Tourner à éteindre les lumières de la pièce et la sphère d’intégration à zéro.
    6. Déclencher le laser (ou autre source lumineuse) et mesurer la puissance lumineuse totale de sortie à l’aide de la sphère d’intégration.
      Remarque : Utilisez la sortie de lumière le plus bas possible pour les essais d’étalonnage.
    7. Abaisser la fibre 500 µm dans l’intégration sphère et répéter étape 2.2.6.
    8. Continuer à abaisser la fibre dans la sphère d’intégration et puissance lumineuse totale 500 µm par incréments de mesure jusqu'à ce que les niveaux de puissance lumineuse totale OFF.
      Mise en garde : Puissance lumineuse totale doit se stabiliser lorsque la pointe entière est dans le domaine. Ne continuez pas à abaisser la fibre plus de 1-2 mm par rapport à la gravé Astuce longueur. Si la pointe touche la partie inférieure de la sphère d’intégration, il peut faire fondre ou ruiner la sphère d’intégration.
  3. Confirmer une fibre uniformément gravée en traçant la puissance lumineuse totale de sortie comme une fonction de dans quelle mesure la fibre a été abaissée dans la sphère d’intégration pour confirmer la linéarité.

3. in Vivo de l’Illumination

Remarque : ici, ces méthodes sont indiquées à l’aide d’un modèle en plastique plutôt qu’un primate non-humain.

  1. Implant une chambre d’enregistrement de 25 mm de diamètre a été implantée sur la zone de cerveau d’intérêt avant expérimentation.
  2. Exécuter anatomique imagerie de résonance magnétique (IRM) avant l’expérimentation. Placer une grille d’enregistrement personnalisé dans la chambre et le remplir avec un lubrifiant chirurgical stérile permettant de la visualisation de la grille et la détermination du niveau des structures cérébrales dura et cible.
  3. Préparer un tour micro-disque avant chaque séance de test.
    1. Affixe serre-un tube de guidage de 25 calibre avec pointe biseautée au milieu et en bas sur le disque. Deux pinces servent à s’assurer que le tube de guidage reste droit. Deux de ces colliers peuvent être déplacés manuellement si vous le souhaitez.
      Remarque : Le tube de guidage peut être époxy ou soudé au bornier.
    2. Fixer l’illuminateur de grand volume dans la bride du haut sur le même lecteur. Cette pince est attachée à la motorisation.
    3. Visser l’illuminateur de grand volume à travers le tube de guidage complétement et confirmer que la pointe de l’illuminateur s’étend au-delà de l’extrémité de la gaine.
      Remarque : La longueur de l’illuminateur qui va passé l’extrémité de la gaine est égale à la distance entre la dure-mère et la marge inférieure de la région cible du cerveau, comme déterminé par MRI.
    4. Faire tremper le tube de guidage et illuminateur dans une solution antiseptique (p. ex., chlorhexidine) pour stériliser.
  4. , Placer une grille personnalisée stérilisée à l’intérieur de la chambre propre et attachez une orientation pré-spécifié avec une vis sur le côté de la chambre. La grille ci-contre a espacement 1 mm ; Toutefois, l’espacement peut être personnalisé selon les besoins.
    Remarque : Cela devrait être identique à la grille et l’orientation utilisée dans l’IRM anatomique.
  5. Fixer le support de micro-lecteur stéréotaxique sur la chambre d’enregistrement dans une orientation pré-déterminé.
  6. Se rétracter l’illuminateur stérilisé de la gaine en tirant l’illuminateur à l’aide de la pince stérile et arrondi. La pointe de l’illuminateur est 5 à 10 mm au-dessus de l’extrémité du tube de guidage.
    Remarque : L’illuminateur incline vers l’extérieur entre le tube de guidage et la bride. Cela n’endommagera pas l’illuminateur flexible.
  7. Fixer le micro-drive au titulaire et placer le tube de guidage dans le trou de grille cible.
  8. Abaisser la scène micro-lecteur jusqu'à ce que le tube de guidage est juste à travers le niveau de la dure-mère.
    Remarque : Si vous le souhaitez, un second micro-disque avec une électrode peut être placé sur la scène et plongé dans un trou de grille différente. Le champ local potentiel sur cette électrode montrera un artefact léger dépendant de la distance, qui peut être utilisé pour confirmer le placement illuminateur.
  9. Essayez la bas l’illuminateur manuellement avec une pince stérile.
    1. Si il n’y a aucune résistance, rétracter l’illuminateur 5 - 10 mm, attendre 10 min pour permettre le tissu pour s’installer, puis réessayez.
    2. S’il y a encore la résistance à la deuxième tentative, rentrer la pointe de l’illuminateur dans le tube-guide, plus bas le guide tube 0,25 mm, puis réessayez.
    3. Répéter jusqu'à ce que la glisse illuminateur à travers le tube de guidage sans aucune résistance.
    4. Abaisser l’illuminateur jusqu'à ce qu’elle est bien tendue.
      Mise en garde : Ne pas pousser l’illuminateur avec force contre résistance. Dans ces cas le tube de guidage généralement n'a pas pénétré la dure-mère entièrement. En poussant la fibre avec force les fera plier sur lui-même, empêchant les fibres de pénétrer dans le cerveau et éventuellement détruire la pointe ( Figure 1 g).
  10. Connectez l’embout à l’autre bout de l’illuminateur à l’agrandissement optique mis en place ou le laser.
  11. Veiller à ce qu’aucune lumière n’est visible par les primates non humains.
    1. Utiliser occultants blindage ou lumière absorbant aluminium pour entièrement couvrir les tours enregistrement.
    2. Placer toutes les connexions optiques dans des enveloppes blindés faits de la lumière absorbant clinquant.
    3. Protéger tous les câbles de raccordement soit lumière absorbant la feuille ou du ruban isolant noir.
    4. Comme une précaution supplémentaire, placez une banque de diodes électroluminescentes (LED) de leurre de la même couleur de lumière utilisée pour l’expérience derrière le primate non-humain et clignoter les LED en permanence à 2,5 Hz. Cela empêche les yeux de réglage entièrement à l’obscurité. S’il y avait une fuite légère par inadvertance, cette lumière clignotante contribuerait à prévenir la fuite comme un déclencheur comportemental.

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Representative Results

L’éclairage des volumes de gros cerveau chez les primates non humains permet pour une manipulation optogenetic pertinentes sur le plan comportemental. Acker et al. (2016) utilisé cette illuminateur de grand volume avec le Halorhodopsin décalée vers le rouge, Jaws 7 pour étudier la contribution temporelle du champ œil frontal (FEF) pour mémoire guidée par saccades dans deux singes rhésus. Plus précisément, les neurones FEF ont été injectés avec un vecteur viral contenant des mâchoires et puis illuminés par les feux rouges à l’aide de l’illuminateur de volume important lors de la présentation cible, délai ou période de préparation moteur d’une tâche guidée par mémoire saccade 8. la figure 3 illustre les conditions de l’expérience. Taux d’erreur (par exemple, les échecs d’exécuter mémoire guidée par saccades vers l’emplacement cible appropriée) augmentent significativement avec éclairage pour les cibles en matière de réceptif injectée, mais pas pour les cibles en face du site d’inactivation / illumination (Figure 4 a).

Outre les changements comportements induits par l’optogenetics, l’illuminateur de grand volume autorisé pour l’inactivation des neurones pour la durée complète de 2,5 mm du cortex (Figure 4C) et livraison lumière au-dessus de 4,5 mm (Figure 4 b), comme en témoigne le optiquement induite par un champ local potentiel artefact 8.

Figure 1
Figure 1 . Grand Volume illuminateur distribue largement Light
un) interface de manchon/illuminateur fibre optique/accouplement. b) core gravé et bardage répandre lumière largement. c) lumineuses 5 mm de long gravé de pointe. d) Comparaison de pointe formes pour une fibre conventionnelle et d’un illuminateur de grand volume. e) illuminateur et conventionnel fibre optique avec pouvoirs lumière d’entrée totales égaux dans 1" Cube cerveau fantôme (1,75 % d’agar). f) modèles de Monte-Carlo de la section centrale d’un illuminateur de grand volume avec 3 mm de longueur de pointe (à gauche) et une convention plat clivée fibre de diamètre égal avec des densités de puissance lumineuse égale sur leur éclairantes. Consultez les méthodes supplémentaires de Acker et al., 2016 pour les détails de ce modèle. g) défectueux illuminateur de grand volume avec bout recourbé. h) bout de grand volume illuminateur endommagé qui sortent d’un tube de guidage. Ce chiffre a été modifié et tiré en partie de Acker et al., 2016 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Grand Volume illuminateur Calibration
Ce chiffre est tiré de Acker et al., 2016 avec des modifications mineures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Guidée par mémoire Saccade tâche avec Illumination ou Sham à des moments différents.
Ce chiffre est tiré d’Acker et al., 2016 8S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Comportementales et électrophysiologiques des effets d’Inhibition de Optogenetic avec grand Volume d’Illumination
un) taux d’erreur augmentent significativement avec l’illumination. b) parcelles matricielles montrant l’inhibition des neurones s’étendant sur les 2,5 mm d’épaisseur du cortex. c) potentiel de champ Local montrant un artefact lumineux s’étendant sur 4,5 mm. Pour b) et c), les contacts sont espacés de 0,5 millimètres sur la profondeur du cortex, n = 426 essais. Cette figure est adaptée et tirée à Acker et al., 20168S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Alors que les outils d’optogenetic sont largement utilisés pour étudier la maladie et la physiologie chez les rongeurs, le défi technique de volumes de gros cerveau éclairante a limité l’utilisation des optogenetics chez les primates non humains. Pionnier des études chez le singe utilisé des densités de grande puissance lumineuse (~ 100 mW/mm2 à 20 L/mm2) pour illuminer de petits volumes, peut-être < 1 mm3et effets comportements modestes rapportés avec excitateurs opsines dans le cortex4, 9,10,11 et un inhibiteur opsine dans le colliculus supérieur à12.

Par conséquent, un illuminateur de grand volume a été développé pour permettre une livraison lumineuse aux volumes grand tissu. Avec cette lampe et le halorhodopsin décalée vers le rouge, mâchoires, robuste, comportement optogenetically-lecteur a observé chez des primates non humains,8.

Le protocole décrit ici peut être modifié selon le but de l’expérience et de la géométrie de la région du tissu cible. Par exemple, la pointe gravée de la fibre peut être allongée ou raccourcie selon la taille de la zone à éclairer. La pointe peut être tirée avec une pointe plus épaisse que celle décrite ou une fibre de diamètre plus grande pourrait être utilisée pour créer un illuminateur plus robuste. Ce protocole décrit une extrémité de la fibre gravé, mais il est possible vers etch la fibre à la pointe et à un segment plus distal pour un éclairage non contigus.

Contrôles de qualité sont un élément essentiel du présent protocole. La pointe d’un illuminateur de grand volume peut devenir fourchue ou recourbée (Figure 1 g), surtout si elle est endommagée mécaniquement ou si elle est retirée trop mince au départ. Pour tirer la fibre avec une quantité suffisante de force régulièrement, la plupart des expérimentateurs besoin quelques heures de pratique. Étant donné le faible coût de fabrication de fibres (la fibre optique en plastique de recommander coûte moins de 0,03 $ / mètre), nombreux expérimentateurs seulement apposent des fibres avec des conseils parfaits pour viroles et, donc, jetez au moins 30 % de fibres pour les imperfections mineures astuce. Inégale répartition lumineuse découverte lors de l’étalonnage peut être corrigée par re-polissage de l’extrémité de la fibre et de re-calibrer la fibre.

En outre, la pointe de l’éclairage doit être vérifiée après chaque expérience. Si l’expérimentateur force l’illuminateur à travers le tube de guidage avant que le tube de guidage a pénétré la dure-mère, l’illuminateur se plie sur lui-même et il n’entrera pas dans le cerveau. En règle générale, la pointe de l’illuminateur est détruite dans ces cas (Figure 1 h). En dehors de la résistance à l’insertion de l’illuminateur, le potentiel de champ local sert une vérification en-expérience pour le placement correct illuminateur. Si l’illuminateur est courbée vers le haut au-dessus de la dure-mère, le potentiel de champ local n’affichera pas l’artefact lumineux caractéristique, qui sert un chèque pour le placement de l’Illuminateur appropriée pendant l’expérience.

Tandis que l’illuminateur de grand volume est conçu à la lumière de la livraison aux multiples couches corticales simultanément, il n’est pas bien adapté à éclairer les couches corticales plus superficielles tout en épargnant les couches les plus profondes ou à éclairer une seule couche du cortex individuellement. Si l’éclairage dans l’espace très spécifique est souhaitée, fibres traditionnelles qui mettent l’accent plus étroite lumière ou illumination superficielle à travers les fenêtres en dura 6 peut être plus appropriée. En outre, la flexibilité de l’illuminateur de grand volume est fois un avantage et une limitation. Contrairement aux fibres de verre optiques, ce projecteur ne peut pas se briser dans le tissu cérébral, cependant, cette flexibilité rend également difficile de faire progresser l’illuminateur sur grande distance corticale (p. ex., 10 mm ou plus). Par conséquent, pour cibler une structure très profonde du cerveau (par exemple, pulvinar), un tube de guidage devra être avancée au-delà de la dure-mère et dans les tissus cérébraux de renfort mécanique supplémentaire.

Dans l’ensemble, cette méthode présente un avantage considérable par rapport aux méthodes antérieures parce qu’elle permet d’illumination de volumes de cerveau pertinents sur le plan comportemental chez les primates non humains, une clé pour adapter optogenetics aux études de primates non humains. Cette méthode a été montré dans la FEF de singes rhésus, cela fonctionnerait dans plusieurs autres régions du cerveau et même chez d’autres espèces de même gros cerveau.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgements

LCA reconnaît financé par une bourse NDSEG, la NSF GRFP et les amis de l’Institut de McGovern. EP reconnaît le Harry et Eunice Nohara t fonds, la classe MIT du fonds t 1995 et le MIT t fonds de financement. ESB reconnaît financement de NIH 2R44NS070453-03A1, le prix Harvey de IET et le prix de Fondation-Robertson de cellules souches de New York. RD reconnaît financement du NIH EY017292. Michael Williams a aidé l’équipe à organiser et rassembler les fournitures avant le tournage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1,000 °F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

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References

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