Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains
Summary
Un protocole pour construire un illuminateur pénétration tissulaire pour fournir la lumière au-dessus de grands volumes dont le diamètre minimal est présenté.
Abstract
Ce protocole décrit un illuminateur de grand volume, qui a été développé pour des manipulations d’optogenetic dans le cerveau de primate non humain. L’illuminateur est une fibre optique à mis à jour le plastique avec embout gravé, tels que la superficie d’émettant de la lumière est > 100 fois celui d’une fibre conventionnelle. En plus de décrire la construction de l’illuminateur de grand volume, ce protocole détaille l’étalonnage de contrôle de la qualité utilisé pour assurer la distribution même la lumière. De plus, ce protocole décrit des techniques pour insérer et retirer l’illuminateur de grand volume. Les structures superficielles et profondes peuvent être éclairés. Ce projecteur grand volume n’a pas besoin d’être physiquement couplée à une électrode, et parce que l’éclairage est fait de plastique, pas de verre, il se pliera simplement dans des circonstances, lorsque des fibres optiques traditionnelles serait briser. Car cet illuminateur distribue la lumière sur les volumes de tissus pertinents sur le plan comportemental (≈ 10 mm3) sans dommage de pénétration supérieure à une fibre optique conventionnelle, il facilite les études comportementales chez les primates non humains à l’aide d’optogenetics.
Introduction
Optogenetic outils, qui permettent un contrôle neuronal milliseconde-précis et axée sur la lumière sont largement utilisés pour étudier la physiologie fonctionnelle et le comportement des rongeurs et des invertébrés. Toutefois, des défis techniques ont limité l’utilisation d’optogenetics dans le cerveau de primate non humain, qui a un volume ~ 100 x plus grand que le cerveau de rongeurs 1.
Pour faciliter les études d’optogenetics chez les primates non humains, enlumineur a été conçu pour répondre à deux objectifs contradictoires : illumination de grand volume et dommages de pénétration minimale. Les tentatives précédentes pour relever l’un de ces préoccupations sont venus à la coûteuse de l’autre. Faisceaux de fibres s’allument plus grands volumes mais avec diamètre augmenté et, par conséquent, dommages2,3. Fibre de verre coniques réduire les dommages de pénétration, mais étroitement mise au point de lumière émettant des surfaces < 100 µm2 4,5. Illumination de cerveau externe à travers une vitre dans la dure-mère contourne le défi des dommages de la pénétration et peut permettre pour l’éclairage de volume important, mais il seulement peut être utilisé pour quelques de zones cérébrales superficielles6.
Pour créer un illuminateur de grand volume, petit diamètre (Figure 1 a), la pointe d’un plastique optique fibre est conique de la chaleur et le noyau et le revêtement sont gravés (Figure 1 bc). Contrairement à d’autres fibres coniques qui se concentrent la lumière à un point précis, la gravure permet à la lumière de s’échapper uniformément sur les côtés de la pointe, ainsi, distribuer la lumière largement sur une grande surface (Figure 1 de). Parce que les dommages de pénétration sont proportionnel au diamètre de la pénétration, ce projecteur a aucun dommage de pénétration plus qu’une fibre conventionnelle, pourtant, il a > 100 x la lumière émettant une lumière de zone et livre surface plus large avec 1/100e la puissance lumineuse densité dans un cerveau fantôme (1,75 % d’agarose) (Figure 1e). Un modèle Monte Carlo (Figure 1f) illustre la différence dans la propagation de lumière entre une fibre conventionnelle et l’illuminateur de grand volume lorsqu’ils ont des densités de puissance lumineuse égale comme leur éclairantes. Chaque projecteur est calibré individuellement à l’aide d’une sphère d’Ulbricht (Figure 2 a, b) pour assurer la distribution même la lumière le long de la pointe (Figure 2c).
Ce projecteur grand volume a été validé avec optogenetic manipulation du comportement et de décharge neuronale chez les primates non humains. La longueur de pointe de fibre peut-être être personnalisée à une zone du cerveau et au mappage de champ réceptif individuels de chaque animal. L’illuminateur peut être couplé avec une électrode pénétrante pour les enregistrements neuronales qui s’étendent sur la durée de l’éclairement. En outre, parce que la fibre peut porter n’importe quelle couleur de la lumière visible, il peut être couplé avec n’importe lequel des molécules disponibles optogenetic disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que les outils d’optogenetic sont largement utilisés pour étudier la maladie et la physiologie chez les rongeurs, le défi technique de volumes de gros cerveau éclairante a limité l’utilisation des optogenetics chez les primates non humains. Pionnier des études chez le singe utilisé des densités de grande puissance lumineuse (~ 100 mW/mm2 à 20 L/mm2) pour illuminer de petits volumes, peut-être < 1 mm3et effets comportements modestes rapportés avec excitateurs opsin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA reconnaît financé par une bourse NDSEG, la NSF GRFP et les amis de l’Institut de McGovern. EP reconnaît le Harry et Eunice Nohara t fonds, la classe MIT du fonds t 1995 et le MIT t fonds de financement. ESB reconnaît financement de NIH 2R44NS070453-03A1, le prix Harvey de IET et le prix de Fondation-Robertson de cellules souches de New York. RD reconnaît financement du NIH EY017292. Michael Williams a aidé l’équipe à organiser et rassembler les fournitures avant le tournage.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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