Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

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Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J., Kaspers, G. J., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

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Abstract

Ansprechkriterien in akute myeloische Leukämie (AML) wurde vor kurzem wieder hergestellt, mit morphologische Untersuchung genutzt, um festzustellen, ob Patienten eine kompletten Remission (CR) erreicht haben. Etwa wird die Hälfte der erwachsenen Patienten, die CR eingegeben innerhalb von 12 Monaten wegen der Auswuchs der verbleibenden AML-Zellen im Knochenmark Rückfall. Die Quantifizierung dieser verbliebenen Leukämiezellen, bekannt als minimal oder messbare Resterkrankung (MRD), kann ein robustes Biomarker für die Vorhersage der diese Schübe. Darüber hinaus hat die Retrospektive Analyse mehrerer Studien gezeigt, dass die Anwesenheit von MRD im Knochenmark von AML-Patienten mit schlechten Überleben korreliert. Nicht nur ist die Gesamtbevölkerung der leukämischen, reflektiert von Zellen beherbergen eine Leukämie associated Immune-Phänotyp (LAIP), verbunden mit klinischen Ergebnis, aber so ist die unreifen Niederfrequenz-Subpopulation von Leukämie-Stammzellen (LSC), die beide werden können überwacht durch Durchflusszytometrie MRD oder MRD-ähnliche Ansätze. Die Verfügbarkeit von sensiblen Assays, die Erkennung der restlichen Leukämiezellen (Stem) auf der Grundlage von krankheitsspezifischen oder krankheitsassoziierten Features (abnorme molekulare Marker oder abweichende Immunophenotypes) aktivieren haben drastisch verbesserte MRD-Bewertung in AML. Allerdings sollte angesichts der inhärenten Heterogenität und Komplexität der AML als Krankheit, Methoden zur Probenahme Knochenmark und MRD und LSC Analyse wenn möglich harmonisiert werden. In diesem Manuskript beschreiben wir eine detaillierte Methode für angemessene Knochenmark Aspirat Probenahme, transport, probieren Sie processing für optimale Multi-Color Flow Cytometry Bewertung und gating Strategien zur Beurteilung MRD und LSC in therapeutischen Entscheidungsfindung helfen für AML-Patienten.

Introduction

Akuter myeloischer Leukämie (AML) ist, dass eine Bösartigkeit des Knochenmarks durch defekte Reifung mit im Programm, abnorme Proliferation und Anhäufung von myeloischen Vorläuferzellen, Hemmung der normalen Hämatopoese und letztlich Knochenmarkinsuffizienz gekennzeichnet . Die Krankheit ist sehr heterogen hinsichtlich Morphologie, Immunophenotype, Zytogenetik, molekulare Aberrationen und gen Ausdruck Signaturen sowie Behandlungserfolg und Behandlung Ergebnis1,2. Aktuelle Management umfasst Induktions-Chemotherapie mit dem Ziel zu erreichen, kompletten Remission (CR), gefolgt von der Post-Remission Behandlung, sich weitgehend an die Ergebnisse der molekularen, zytogenetische orientiert und Immunophenotypic Studien und besteht aus entweder mehrere Studiengänge zusätzliche Chemotherapie oder (autologen oder allogenen) Stammzellen Transplantation3. Trotz hohen Remissionsraten nach intensiver Chemotherapie von bis zu 90 % 5-Jahres-Überlebensrate bei Erwachsenen nur ca. 30-40 %, überwiegend aufgrund der Entwicklung der Rückfall häufig resistent gegen Chemotherapie und dadurch sehr schwer zu behandeln sind. Ergebnis bei Kindern ist besser, obwohl etwa ein Drittel auch Rückfall. Daher, Früherkennung von drohenden Rückfall füllt einen ungedeckten medizinischen Bedarf und führe nach Remission Therapie4.

Resterkrankung nach Therapie die Summe aller Diagnose und Post-Diagnose Mechanismen/Resistenzfaktoren wiedergibt; Daher kann seine Messung prognostische und Instrumentalmusik für die Führung der Behandlung sein. Die Möglichkeit der Definition Resterkrankung (ehemals minimaler Resterkrankung und jetzt bezeichnet als messbare Resterkrankung oder MRD) weit unter dem morphologischen Kriterium der 5 % Blasten wandelt sich die Landschaft des Risiko gehört. Derzeit sind die beiden Methoden meist verwendet, um MRD erkennen Flow Cytometry und molekular-basierten, letzteres durch Reverse Transkriptase PCR (RT-qPCR)5 bewertet wird oder, obwohl in einem frühzeitigen Stadium von next Generation sequencing (NGS). Viele Studien bei Erwachsenen sowie bei Kindern zeigten bereits, dass verschiedene MRD Ansätze starke prognostische Informationen in AML sowohl nach Induktion und Konsolidierung Therapie6,7, und eine neue Definition der Krankheit Belastung ( besser als morphologische CR) entsteht nun8. Dies deutet darauf hin, dass MRD durch Strömung beurteilt und/oder molekulare Techniken werden sollte, und in der Tat werden bereits, standard in jeder klinischen Prüfung AML.

Dieses Manuskript beschreibt das detaillierte Flow Cytometry Verfahren um eine genaue und reproduzierbare Immunophenotypic Charakterisierung von MRD in Knochenmarkproben, einschließlich das Knochenmark-Sampling und Verarbeitungsverfahren vor Durchflusszytometrie zu erhalten. Die Verfügbarkeit von guter Qualität des Knochenmarkproben bei Diagnose und Nachsorge ist entscheidend für den Erfolg dieser Messung über klinische und klinische Studien. In der Tat sind diese Pre-analytischen Überlegungen auch von entscheidender Bedeutung für molekulare (PCR und NGS) MRD Ansätze. Zur Immunophenotypic Charakterisierung von MRD werden akzessorisch zum Ausdruck gebrachten Marker kombiniert mit Normal myeloischen und Stammvater Marker zu identifizieren, eine Leukämie-assoziierten Immunophenotype (LAIP)9. MRD misst die Resultante viele Einflussfaktoren Ansprechen auf die Therapie, wie intrinsischen oder erworbene Leukämie Resistenzen, Pharmakodynamik und Kinetik-Therapie, Immunüberwachung und Compliance. MRD ist daher ein sehr stark nach Diagnose prognostische Parameter zugeordnete klinische Outcome als dichotome auf ein Abkürzungniveau von Empfänger-Betrieb Merkmal (ROC) Analyse bestimmt. Für unsere Erwachsenen AML-Kohorte der HOVON 42a Studie, die Abkürzungniveau befindet sich bei 0,1 % LAIP positive Zellen/Gesamtzahl weißer Blutkörperchen. Verwenden dieses Kriterium zur Bestimmung negativ Vs positive MRD Status, kann eine Gruppe von Patienten identifiziert werden, die haben eine deutlich schlechtere Rückfall auftreten, Rückfall-freie und allgemeine überleben6. Darüber hinaus beschreiben wir die Messung von unreifen, resistente Leukämiezellen mit Stammzell-ähnliche Funktionen (CD34 + CD38-Leukämie-Stammzellen oder LSC), bietet einen starken Prädiktor des Patienten-Outcome-10. Zusammen LAIP und LSC nähert sich Form der Strömung durchflusszytometrischen MRD Ansatz. LAIP Ansatz eignet sich für etwa 90 % der Patienten, während der LSC-Ansatz in etwa 80 % der Patienten angewendet werden kann. Zusammen mehr als 95 % der Patienten auswertbar für einen Parameter oder beide.

Zu guter Letzt bietet diese Publikation eine detaillierte operative Beschreibung um MRD durch Durchflusszytometrie zu beurteilen. Dazu gehören: (1) Harmonisierung und/oder Standardisierung von Knochenmark Stichprobenverfahren, 2) Probe Transport Beratung (3) detaillierte Beschreibung der leukämischen Zellen Erkennung mit FACS durch mehrere Antikörper-Platten einschließlich Einzelzelle Rohr Ansätze zur Charakterisierung der LSC, 4) Aufbau der FACS Maschinen für standardisierte Messungen, 5) analytische Programme für MRD-Messungen und 6) analytische Programme für LSC-Erkennung.

Wir wollen zeigen alle Facetten des Verfahrens einschließlich der Probenvorbereitung, da, die selten diskutiert wird, während es ein wichtiges Thema für die Qualität der das Endergebnis ist. Knochenmarkaspiration und Biopsie sind klinische Verfahren verwendet, um die blutbildenden Zellen im Knochenmark zu bewerten. Diese werden zusammen mit ein komplettes Blutbild (CBC) und Blutausstrich durchgeführt. Die optimale Methode für die Knochenmarkaspiration ist entscheidend für die genaue Diagnose und Nachbereitung für MRD Messung. Darüber hinaus sollte eine erfolgreiche Knochenmark Aspirat genügend Zellen ausführen LAIP und LSC Strömungsanalyse (mindestens 10 Millionen lebensfähige Zellen) enthalten. Hier beschreiben wir die Methode zum Durchführen einer Knochenmarkaspiration und Leitlinien, die angemessene Zelle Probenahme (und begrenzt das Potenzial für Polopiryna) benötigt für präzise Diagnostik und zusätzliche Forschung führen sollte. Diese Pre-analytischen Überlegungen sind auch von entscheidender Bedeutung für molekulare (PCR und NGS) MRD Ansätze. Alle Proben für die Immunphänotypisierung sollte vorzugsweise innerhalb von 24 h Kollektion verarbeitet werden. Obwohl nicht zu empfehlen, können bei bis zu 72 h bei Raumtemperatur aufbewahrt dem Knochenmark und peripherem Blutproben noch verarbeitet und analysiert werden. Darüber hinaus sollten alle Handhabungen mit dem Material unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um die Kryokonservierung von sterilen Zellen zur späteren Forschung/Qualitätsbewertung etc. zu ermöglichen.

Protocol

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Forschung-Code und der Forschungsethikkommission der VU University Medical Center.

(1) Knochenmark Aspiration und Probe-Vorbereitung

  1. Geduldig und materielle Vorbereitung
    1. Füllen Sie ein oder zwei 10 mL Spritzen mit 1 % Lidocain mit einer 16-Gauge-Nadel. Ersetzen Sie die Nadel für eine 21-Gauge-Nadel.
    2. Legen Sie zwei Tropfen 5 % EDTA auf einem Uhrglas.
    3. Glas-Objektträger eingerichtet (n = 15 mit konsequenten Patienten Nummerierung und Datum) für die Vorbereitung der Abstrich.
    4. Setzen Sie auf seitlichen Dekubitus Patienten. Suchen Sie die überlegene hintere Beckenkamm Wirbelsäule und mit Stift markieren.
      Hinweis: im Allgemeinen ist die posteriore superior Beckenkamm Wirbelsäule befindet sich einerseits breite distal zum Beckenkamm und einerseits breite seitlich an der Mittellinie. Bei Frauen kann die tatsächliche Wirbelsäule ein bisschen mehr seitliche, bei einigen Männern, die ein bisschen mehr mediale sein.
    5. Desinfizieren Sie die Haut mit Chlorhexidin 0,5-1 % in Ethanol aus der beabsichtigten Biopsie Bereich nach außen im Kreis.
    6. Öffnen Sie die Verpackung der sterile Handschuhe, sterile Handschuhe anziehen und legte das Paket auf den Tisch zu einen sterilen Bereich erstellen. Öffnen Sie das Paket mit der Aspiration-Nadel, und platzieren Sie es auf den sterilen Bereich.
    7. Haut und Unterhautgewebe und schließlich Periost zu infiltrieren. Verwalten Sie an der Knochenhaut das Lidocain in einer Weise, dass eine Fläche von 1 cm Durchmesser betäubt worden.
      Hinweis: Ausreichende Gabe von Lidocain, das Periost ist einer der wichtigsten Faktoren für hohen Patientenkomfort. Testen Sie, ob der Knochenhaut ausreichend betäubt wurden, hat durch Tippen auf den beabsichtigten Biopsie-Standort mit der eingeführten Nadel und Fragen Sie, ob der Patient keine Schmerzen spürt. Anmerkung: Kinder werden während des gesamten Verfahrens vollständig betäubt.
    8. Halten Sie die Nadel Absaugen (15 Ga x 2,8") mit dem proximalen Ende in die Handfläche und Zeigefinger gegen die Seite der Nadel Metallschaft nahe der Spitze; Diese Position ermöglicht eine bessere Kontrolle.
    9. Einführen der Nadel mit einer rotierenden Bewegung (durch schnell wechselnde pronierenden/supinating Bewegung) durch die Haut in Richtung Beckenkamm Wirbelsäule und bringen Sie die Nadel in Kontakt mit der hinteren Beckenkamm Wirbelsäule.
    10. Sicher das heißt Nadel zu betäubten Bereich der Knochenhaut eingeführt wird; der Patient sollte nur Druck und keine Schmerzen fühlen. Wenn der Patient Schmerzen verspürt, positionieren Sie die Nadel zu oder verwalten Sie mehr Lidocain.
    11. Mit sanften, aber festen Druck, vorab die Nadel in eine abwechselnd im Uhrzeigersinn gegen Uhrzeigersinn drehen. Eingang in das Knochenmark Hohlraum wird in der Regel durch verringerten Widerstand erkannt.
    12. Entfernen Sie das Stilett aus der Nadel. Legen Sie eine leere Spritze 10 mL auf die Nadel.
    13. Negativer Druck durch den Rückzug der Spritzenkolben mit einem sanften Ruck. Warnen Sie dem Patienten, dass sie ein Gefühl Krämpfe und Schmerzen fühlen können, wenn Knochenmark aspiriert werden. Wenn nicht genügend Knochenmark Knochensplitter freigegeben sind, sollte ein weiteres Absaugen mit einem schnellen Zug durchgeführt werden. Die meisten Knochensplitter werden in den ersten 1-2 mL entnommen den ersten Zug. Aspirieren Sie nur 1-2 mL Verdünnen der Probe zur Vermeidung.
      Hinweis: Verdünnung führt zu Polopiryna und kann verwirren MRD Ergebnisse).
    14. Ziehen Sie die Spritze und ersetzen Sie der Mandrin in die Aspiration-Nadel zu. Werfen Sie Teil des Knochenmarks in einem Uhrglas und den Rest in eine 8 mL-Tube mit Heparin beschichtet.
      Hinweis: Invertieren Sie jedes Röhrchen sofort nach dem Anbringen der Knochenmark-Aspirat in die Probe Tube um adäquate Antikoagulation zu gewährleisten. Knochenmark-Koagulation ist oft die Ursache für ungeeignetes Material. Zusätzliche Knochenmark kann von der gleichen Stelle abgesaugt werden, aber vorzugsweise die Nadel 5-10 mm fortgeschritten ist, bevor eine neue Aspirat getroffen wird. Vorzugsweise sollten nicht mehr als 2 Ziehungen pro Aufnahme Ebene getroffen werden. Reservieren Sie sich die Rohre mit einer zunehmenden Zahl aus der ersten, zweiten und/oder in Folge zieht. Es ist gemeinsame Regel, die erste Ziehung für die wichtigsten diagnostischen Analyse zu verwenden.
    15. Alternativ die Nadel aus der Einfügung Ort zurückziehen und in den Hohlraum Knochenmark ein paar Millimeter außerhalb des ursprünglichen Einfügung Wiedereinführung und wiederholen Sie den Vorgang.
      Hinweis: Aspirieren Sie nicht mehr als 1-2 mL pro Zug, zur Vermeidung von Kontaminationen erhebliche Blut.
    16. Wiederholen Sie so oft wie Material benötigt wird. Wenn ausreichend Material für die spezifische klinische Studienprotokoll aspiriert ist entfernen Sie die Knochenmark Nadel.
      Hinweis: Im Falle eines sonst nur schwer oder langsam Knochenmark Bestrebungen kann die Verwendung von Spritzen, die vorab gespült mit Antigerinnungsmittel waren hilfreich sein. Führen Sie bei einem trockenen Hahn eine Trephine Biopsie, die nicht in den Anwendungsbereich dieser Handschrift ist.
  2. Prüfungsvorbereitung der Abstriche morphologische
    1. Wählen Sie für optimale morphologische Beurteilung Schwammnadeln (z.B. mit einem Kunststoffspachtel) aus dem Aspirat in das Uhrglas und legen Sie sie auf einen Objektträger.
    2. Sanft lege eine andere Glas-Folie über der Folie mit dem Knochenmark und schieben; vermeiden Sie jeglichen Druck.
      Hinweis: Nur bei sehr großen Knochenmark Knochensplitter kann leichter Druck ausgeübt werden, um die Dicke der Zelle Ausbreitung zu verringern. Das Verfahren profitiert von Hilfe von einen Assistenten, der die Probe Rohre verarbeiten kann. Genaue Kennzeichnung der Rohre mit der Patientennummer und Anzahl der sequentiellen Knochenmark Auslosung ist entscheidend.
    3. Trocknen Sie die Folie gründlich, und führen Sie dann möglicherweise Giemsa Grünwald Färbung (siehe Tabelle der Materialien). Unter dem Lichtmikroskop für Morphologie zu prüfen (siehe Abbildung 1).
      Hinweis: Abbildung 1A zeigt die Abstriche des gesunden Knochenmarks bestehend aus verschiedenen funktionalen Zelltypen während Abbildung 1 b einen AML-Patienten mit vorwiegend leukämischen Blasten. Um die verbleibenden leukämischen Belastung besser definieren zu können, muss die Immunphänotypisierung durchgeführt werden.

2. Transport von Material zur Weiterverarbeitung

  1. Vorbereitung der Proben für den transport
    1. Um sicherzustellen, dass das Material nicht undicht und die Rohre nicht brechen, gewährleisten korrekte Verpackung (siehe Abbildung 2).
      Hinweis: Von unseren und anderen Erfahrungen die Lebensfähigkeit der Zellen ist am besten erhalten, wenn das Knochenmark bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Für langfristige Transport erfolgt dies am besten über Zimmertemperatur "Gel-Pack" um Temperaturstabilität während des Transports zu unterstützen.
    2. Pakete zu beschriften und fügen Sie die richtigen Formulare zur Vermeidung von Verlust des Pakets, längeren Transport oder Umschalten des Patienten.
      Hinweis: Diese sollte mindestens enthalten: Patientendaten (Form 1). Dies sollte die Studie Zahl und allgemein das "Geburtsdatum" enthalten. Entscheidend für die richtige Verarbeitung des Materials nach der Ankunft am empfangenden Lab ist eine klare Aussage speziell angeforderte Laboranalyse (molekulare Diagnostik, Immunphänotypisierung, MRD etc.) auf diesem Formular. (Formular 2) Adresse und Telefon Nummer eines Ansprechpartners, und wenn nötig, Papiere für den Zoll. Zur Vermeidung von Verlust von Pakete auf dem Postweg benachrichtigt sendende Labor immer das empfangende Labor, das eine Probe gesendet wurde. "Track and Trace" wird empfohlen.
  2. Proben von anderen Instituten erhalten
    1. Stellen Sie sicher, dass die passende Logistik gibt es am Institut zu die Probe im Labor zu erhalten, sobald es am Institut geliefert wird.
      Hinweis: Für optimale logistische Organisation vorzugsweise eines Zentrallabors notwendig, die empfängt und sammelt alle Material aus der örtlichen Klinik und externe Krankenhäuser. Insbesondere ist das Zuweisen von Protokolle für Verteilung und klare Kommunikation mit dem Vorstand Labors unerlässlich.
    2. Nach Erhalt der Proben, genau beachten Sie die entsprechende Nummerierung in Papierform Formen und eine gesicherte Datenbank mit wichtigen Bereichen wie MRD-ID-Nummer, Trial spezifische ID-Nummer, Krankenhaus-Registrierungsnummer senden Institut, Geburtsdatum, material Typ (Knochenmark oder peripheren Blut), weißen Blutkörperchen (WBC), Datum der Knochenmarkaspiration, Datum der Messung der Probe und allfällige Bemerkungen relevant für die Qualität der Messung.
      Hinweis: Vorzugsweise diese Datenbank verfügt auch zusätzliche Daten enthalten (oder mit anderen Datenbanken verknüpft werden) der Analyseergebnisse und weitere Patientendaten wie Follow-up-Daten.

(3) Flow Cytometer Setup

Hinweis: Dieser Abschnitt basiert auf Euroflow Anweisungen. 11

  1. Einrichten der Photomultiplier (PMT) Spannungen für FCS-SSC-Parameter und Ziel-Fluoreszenz-Kanäle
    1. Für FCS-SSC-Parameter das Durchflusszytometer starten und Ausführen der "Cytometer Setup und Tracking (CST)" führen auf das Durchflusszytometer mit CST Perlen (siehe Tabelle der Materialien). Lyse der roten Blutkörperchen eines gesunden Spenders (beschrieben in Abschnitt 4.1).
      1. Erstellen eines neuen Experiments (im Menü: Experiment, neue experimentieren, wählen Sie leere Experiment) mit der Software des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) mit ein Forward Scatter (FSC) gegen seitliche (SSC) Dot Streudiagramm für die FSC und SSC Parameter einrichten. Dieses Experiment FSC/SCC PMT mit dem Datum zu nennen. Verwenden Sie zuerst die aktuelle Cytometer Einstellungen (Rechte Maustaste: "Bewerben aktuelle CST"). Diese Einstellungen sind mit den CST-Performance-Check mit CST-Kalibrierung Perlen (siehe Tabelle der Materialien) generiert worden. Passen Sie FSC und SSC um die Lymphozyten in "globales Experiment Settings" zu visualisieren. Hinweis: in unserem Durchflusszytometer sind 285 V und 400 V bzw.. Abhaken "Kompensation zu ermöglichen",: Inspektor/Instrument Einstellungen/Entschädigung.
      2. Zur Beurteilung der Größe der Zellen (FSC) und Granularität (SSC) lysiert Start messen unbeschriftete peripheren Blutzellen durch die Funktion "Zellen zu erwerben". Tor der Lymphozyten und anpassen/fein-tune FSC und SSC Spannungen, die folgenden mittleren Zielwerte für die gated Lymphozytenpopulation zu erreichen: FSC: 100.000 (Bereich 95.000 105.000); SSC: 15.000 (Bereich 13.000-17.000).
      3. Erwerben und durch die Messung mindestens 10.000 Ereignisse aufzuzeichnen. Überprüfen Sie den Mittelwert FSC und SSC Zielwerte für nichtöffentliche Lymphozyten und ggf. neu einstellen.
    2. Für die Einrichtung der Ziel-Fluoreszenz verwendet Kanäle PMT Spannungen 8-Gipfel Regenbogen Perlen Kalibrierung Partikel (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Erstellen Sie ein neues Experiment auf die FACS für 7-Gipfel. Erstellen Sie ein Arbeitsblatt "Ziel bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI)" mit allen notwendigen Punkt plottet (n = 2; FSC gegen SSC, FITC gegen PE), Histogramme (n = 8; ein Histogramm für jeden Fluoreszenz-Detektor) und Statistik zeigt die Referenz Spitzenwerte (MFI und Variationskoeffizienten (CV)) für jeden Kanal Fluoreszenz.
      2. Bereiten Sie frisch eine Lösung mit 1 Tropfen (± 60 µL) Regenbogen Perlen in 1 mL dH2O. sanft Wirbel, die Perlen in Lösung zu mischen.
      3. Verwenden Sie die PMT-Einstellungen der FSC/SSC Spannungen von oben und Messung der Fluoreszenz der Regenbogen Perlen mit der "acquire" Funktion (ohne Aufnahme) mit "LOW"-Flow Rate mit einer Schwelle von 5.000. Verwenden Sie den Button"rechteckigen Tor" zum Tor der Singulett Perlen Bevölkerung P1 in der FSC gegen SSC-Dot-Plot. Tor der 7th PEAK - Bevölkerung P2 in der IRB im Vergleich zu PE-Dot-Plot.
      4. Weiterhin die Übernahme der 7-Peaks Regenbogen Perlen Federung und anpassen/fein-tune PMT Spannungen in allen Kanälen der Fluoreszenz MFI Zielwerte nach kommentierte MFI Ziel Kanäle zu erreichen, wie mit Perlen versehen.
      5. "Record" verwenden, um Daten von ca. 10.000 Veranstaltungen sammeln und prüfen der MFI für 7th Peak Perlen. Korrigieren Sie die PMT-Spannungen bei Bedarf. Einmal Ziel MFI-Werte für die 7th -Peak erreicht, Datensatz/Überschreiben der Datei für die Finale PMT-Werte.
      6. Speichern Sie die Finale PMT-Werte und benennen Sie die Datei speichern PMT Setup mit dem Datum, werden in den Katalog der Software des Herstellers. Verwenden Sie dieses PMT Setup für die Korrektur der Spill über für jede Fluoreszenz-Farbstoff.
  2. Fluoreszenz Kompensation Einstellungen
    1. Beschriften Sie ein Rohr für die ungefärbten Kontrolle und jeder Fluorochrom konjugierten Antikörper (siehe Tabelle S1 für die verwendeten Fluorochromes). Pipette 100 µL Puffer in jedes Rohr.
    2. Wirbel der Durchstechflasche mit mehrfarbigen Entschädigung Perlen (siehe Tabelle der Materialien) gründlich und fügen Sie dann 1 volle Tropfen (± 60 µL) dieser Perlen für jedes Rohr.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Perlen auf der Seite des Rohres während der Aufnahme in jedes Rohr tropft. Dies kann zu niedrigen Wulst Konzentration führen und könnte Auswirkungen auf die Ergebnisse der Entschädigung Matrix.
    3. Pipette das entsprechende Volumen für einen Test von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern ausreichend berechnet (das wäre ausreichend, um 106 Zellen färben) in die entsprechenden Rohr- und Wirbel gründlich. Die ungefärbten Kontrollröhrchen keine Antikörper hinzu. 15 bis 30 min. im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    4. Fügen Sie 4 mL Waschpuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/0.05% azide-0.1% human Serumalbumin (HSA) (siehe Tabelle der Materialien)) für jedes Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300g für 10 min. Überstands entfernen und Aufschwemmen der Wulst Pellet durch Zugabe von 0,2 mL Waschpuffer für jedes Rohr. Wirbel die Rohre gründlich.
    5. Analyse-Software des Herstellers zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien) und erstellen Sie ein neues Experiment (im Menü: Experiment, neue experimentieren, wählen Sie leere Experiment) und benennen Sie als Entschädigung Datei mit aktuellen Datum.
    6. Gehen Sie zu "Cytometer Einstellungen" und verwenden Sie die PMT-Einstellung von Abschnitt 3.1. Achten Sie darauf, dass der Schwellenwert in FSC 5.000 und die Kompensationswerte von den verwendeten Fluorochromes gleich Null sind.
    7. Entschädigung-Steuerelemente, einschließlich Label-spezifische Röhren, je nach Bedarf zu erstellen. Achten Sie darauf, einen ungefärbten Steuerelement enthalten. Wählen Sie aus dem Menü: Experiment, Entschädigung Setup erstellen Entschädigung Kontrollen.
    8. Laden Sie die ungefärbten Kontrollröhrchen und passen Sie das P1 Tor um den Singulett-Perlenpopulation und sicherstellen Sie, dass die P1-Tor nur Singulett Perlen enthält.
    9. Mit der rechten Maustaste des P1-Tores, und wählen Sie "Gelten für alle Entschädigung Steuerelemente". Datenaufzeichnung für alle single beschrifteten Fluoreszenz-Röhren. Vergewissern Sie sich, dass P2 Tor die positiven Bevölkerung auf jeder Fluoreszenz-Histogramm umfasst. Wenn nötig, passen Sie das Tor.
    10. Die Entschädigung zu berechnen. Wählen Sie Experiment, Entschädigung Setup berechnen Entschädigung.
    11. Wenn die Entschädigungsberechnung nicht erfolgreich ist, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Die erforderlichen Anpassungen vornehmen und neu berechnen. Wenn die Entschädigungsberechnung erfolgreich ist, erscheint ein Dialog Abfrage für den Namen für die Entschädigung-Setup.
    12. Geben Sie einen Namen (zum Beispiel YY-MM-DD 8 Farbe Setup) und klicken Sie auf, verknüpfen und speichern. Das Ersatz-Setup wird auch zum Ausgleich Setup Katalog gespeichert werden.
      Hinweis: Die gleichen Einstellungen können für alle Experimente mit der gleichen Fluorophore verwendet werden.

(4) Flow Cytometry Bewertung (LAIP und LSC)

Hinweis: Hier beschreiben wir die Masse Lyse Verfahren vor Färbung, ermöglicht es, um eine bevorzugte Konzentration des WBC zu beflecken. Die meisten MRD Protokolle verwenden Sie diese Vorgehensweise, obwohl einige andere Optionen wie Verfärbungen vor Lyse erfolgreich eingesetzt haben. Ganze Knochenmark vor Lyse Färbung minimiert bevorzugte Zelle Verlust12, hat aber den Nachteil des unvorhersehbaren, zu niedrig Zelle Konzentrationen.

  1. Bulk-lyse der Zellen
    Hinweis: Halten Sie die unmanipuliertes Proben horizontale RT, beim Fluss Cytrometric Erwerb am selben Tag durchgeführt werden kann, um den Vorgang am nächsten Tag starten.
    1. Aufschwemmen der Knochenmarkprobe Antikoagulanzien zur Homogenität durch die Probe mehrmals umdrehen. Die Konzentration von Knochenmarkzellen (Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC)) mit einer Zelle zählen Kammer mit Zelle Tuerk Färbelösung zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Das benötigte Volumen des Knochenmarks in ein separates 15 mL Röhrchen pipettieren. Die Anzahl der Zellen ist abhängig von der Anzahl der separaten Färbung Röhren; Verwenden Sie für eine Färbung (ein Schlauch) ca. 2 x 106 weißen Blutkörperchen für die LAIP Messungen und 8 x 106 weißen Blutkörperchen zur Messung der LSC-Röhre.
    3. Lyse der roten Blutkörperchen durch Zugabe von Lysiereinrichtung Lösung (siehe Tabelle der Materialien). Erforderliche Menge Lyse Lösung sollte 10 Mal das Volumen der Zellsuspension.
    4. Mischen Sie, durch Umkehrung und 10 min bei RT inkubieren Zentrifugieren Sie für 7 min 800g bei RT verwerfen des Überstands (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette). Aufschwemmen der Zelle Pellet in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/0.05% azide-0.1% human Serumalbumin (HSA) (siehe Tabelle der Materialien) unter RT Anwendung die maximale Lautstärke des Rohres.
    5. Zentrifuge für 7 min 800g bei RT den überstand (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette) zu verwerfen. Wieder die Zelle Pellet in PBS/0.05% azide-0.1% HSA zu einer Zelle Konzentration von 100 x 106 WBC/mL, und verteilen Sie über die Anzahl der vorgesehenen Rohre.
  2. Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
    1. Pipettieren monoklonaler Antikörper (MoAb) cocktail Lösung mischen in die entsprechenden Fluoreszenz-activated Cell Sorter (FACS) Röhren und inkubieren Sie mit lysierten Knochenmarkzellen für 15 min in der Dunkelheit.
      Hinweis: Dies ist sehr wichtig, wenn Tandem-Farbstoffe verwendet werden. Beispielsweise sehen Sie die Mischungen der Paneele standardgemäß in unserem Labor (Tabelle S1) verwendet.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% hat. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 400g. Entsorgen Sie der Überstand (z. B. mit einer Vakuumpumpe oder Pasteurpipette) und das Aufschwemmen der Zelle Pellet in 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. LSC-Messung: Aufschwemmen der Zelle Pellet in 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA und fügen Sie 4 µL leer Perlen (z.B. Spherotech, siehe Tabelle der Materialien) als Negativkontrolle Bevölkerung in der Analyse verwendet.
    4. Öffnen Sie die MRD oder LSC Experiment Lay-Out auf die FACS (siehe Tabelle der Materialien) und Maßnahme für MRD mindestens 100.000 WBC gated Ereignisse für die Messung von AML Patientenproben zur Diagnose und 1 X 106 WBC für AML-Proben bei der Nachuntersuchung. Für den LSC messen Experimente mindestens 4 x 106 WBC sowohl bei der Diagnose und Folgemaßnahmen für ein zuverlässiges Ergebnis des LSC.
    5. Speichern Sie die Daten mithilfe eines standardisierten entsprechenden Dateinamens für die Analyse der Ergebnisse. Machen Sie eine Bestandsaufnahme der verschiedenen gemessenen Marker auf der AML-Zellen und die AML-Stammzellen (positiv, negativ, über/unter Ausdruck) und speichern Sie diese Daten in das Laborjournal.
    6. Für den Fall, dass keine Diagnose LAIP verfügbar ist, Messen Sie alle 4 Röhren bei der Nachuntersuchung, um sicherzustellen, dass alle möglichen messbaren LAIP in einem unterschiedlichen aus Normal-Ansatz ermittelt werden kann.
    7. Wählen Sie die zuverlässigsten LAIP(s)13 bei der Diagnose festgestellt und erwerben so viele Veranstaltungen wie möglich, aber > Mindestzahlen definiert.

5. Identifizierung der Leukämie verbunden Immuno-Phänotypen (LAIP): Analyse der unterschiedlichen Zellpopulationen

Hinweis: FCS-Dateien können mit mehreren Software-Programm für optimale Visualisierung der unterschiedlichen Zellpopulationen (siehe Tabelle der Materialien) analysiert werden.

  1. Weißen Blutkörperchen Bevölkerung
    1. Tor der CD45-positiven Zellen und die tragfähigen erscheinenden Zellen, niedrigen FSC (nicht-lebensfähige Zellen, erythroiden Zellen) innerhalb der FSC/SSC Handlung weglassen; Diese enthalten die WBC (Abbildung 3Aich). Zeigen Sie den WBC und verwenden Sie eine der primitiven Marker (z. B. CD34; Abbildung 3AIi) dazu beitragen, um die endgültige Position von den Anschlägen in de CD45dim Bereich (Abbildung 3AIii) zu ermitteln.
    2. Tor der CD45dim Zellen und wieder Tor die Zellen im FSC/SSC-Plot (Abb. 3 bich). Entfernen Sie das CD34-Tor (Abbildung 3Bii) beim melden % Zellen in dieses Tor als % Blasten im Stammbaum Bevölkerung im Programm. Zeigen Sie die Blasten im SSC/CD34 plot und gate-die CD34-positiven Zellen (Figure3Biii).
  2. Lymphozyten
    1. Verwenden Sie Lymphozyten als interne Kontrolle: myeloische Populationen als Negativkontrolle und lymphatischen Populationen als Positivkontrolle.
    2. Starten Sie von der weißen Blutkörperchen Bevölkerung (Abb. 4A). Tor-Lymphozyten als CD45hohe/SSCniedrige Bevölkerung (Abbildung 4 b).
    3. Stellen Sie sicher, dass es gibt keine myeloischen Zellen im Tor mit CD34, CD117, CD13 oder CD33 und Tor für die CD13 negativ/CD33 negative Zellen (Abbildung 4C-E). Rufen Sie diese Population "Lymphozyten" in der Bevölkerung-Struktur (Abb. 4F).
  3. LAIP zum Zeitpunkt der Diagnose
    1. Tor der Blasten und anschließend die CD34 positive Zellen in einem SSC/CD34 plot und nennen diese "primitive Marker" in der Struktur der Bevölkerung.
    2. Die primitive Zellen, in diesem Fall CD34-positiven und die Lymphozyten in ein neues Grundstück mit einem lymphatischen Marker (CD7) gegen ein myeloischer Marker (CD33) Grundstück. Tor der aberranten Bevölkerung (siehe Richtlinien zusätzliche Datei 1) und nennen sie "LAIP positiv" in der Struktur der Bevölkerung.
      Hinweis: Das Finale LAIP gewählt wird als % LAIP auf die Bevölkerung Explosion gemeldet. Die Sensitivität, Spezifität und Stabilität der den LAIP können nur von Fachpersonal mit langjähriger Erfahrung in MRD Messungen hergestellt werden. Die Summe dieser Parameter bestimmt die Qualität der LAIP. Beispiele für vier unterschiedliche LAIP Einschätzungen zum Zeitpunkt der Diagnose sind in Abbildung 5 A-Dangegeben.
    3. Bestimmen den Ausdruck der LAIP (% Blasten) und bewahren Sie diese Daten in einer Datenbank oder excel-Datei.
    4. Stellen Sie Berichte der FACS-Analysen und die Noten des LAIP, die bei MRD Messungen verwendet werden.
      Hinweis: Die Definition von LAIP ist berechtigt in einem Team von Experten da es ein wesentliches Merkmal für genaue Messungen der MRD zu folgen ist.
  4. MRD bei Follow-up
    1. Tor die Blasten wie in 5.1 jedoch je nach der Zeit nach der Therapie; richtige Einschätzung dieses Tores kann eine Herausforderung sein. Im Fokus des LAIP Phänotyps, der zum Zeitpunkt der Diagnose gegründet wurde und die unreife Bevölkerung Tor.
    2. Wie in 5.1 beschrieben. finden Sie das richtige Knaller-Tor basierend auf den definierten Aberrancy und Regeneration des Knochenmarks und normale Ausdrücke um sie Tor bewusst sein
    3. Wiederholen Sie das gleiche Anspritzung Strategie überhaupt Follow-up-Punkte und bestimmen Sie MRD als Prozentsatz der LAIP Zellen in der gesamten weißen Blutkörperchen Bevölkerung zu. Siehe zum Beispiel Abbildung 6A und 6 b.
    4. MRD-Positivität zu melden, wenn die % der MRD ≥ 0,1 % der weißen Blutkörperchen. Drucken Sie analysierte Daten in einem Standardformat, wöchentlich mit dem MRD-Team zu diskutieren. Registrieren Sie die Ergebnisse nach Konsens erreicht wird. Lassen Sie die Ergebnisse durch den Vorgesetzten genehmigt werden, bevor die Ärzte die Ergebnisse mitzuteilen.

6. Analyse der Stem cell MRD (LSC Single Tube)14

  1. Analysen der LSC bei der Diagnose und Folgemaßnahmen
    1. Tor der Blasten, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben.
    2. Als mögliche negative Kontrolle für CD38-Tor Erythrozyten-Anteil (d.h. verbleibenden Erythrozyten nach lyse, gekennzeichnet als SSCniedrige/FSCniedrig und CD45negativ). Falls erforderlich, können abgestorbene Zellen und Zellfragmente durch ein zusätzliches Tor in dieser Handlung ausgeschlossen werden.
    3. Bestimmen Sie innerhalb der leukämischen Explosion Tor der Subpopulation mit Ausdruck der CD34. Select innerhalb dieser Population die CD34+ CD38 Zellen (verwenden Sie als Cut-off: obere Grenze der leere Kalibrierung Perlen für Schwelle Bestimmung (siehe Tabelle der Materialien), der rot-Anteil oder Nutzung 103 als Cut-off Point). Rufen diese Population "CD38niedrigen Stammväter" (Abbildung 7).
      Hinweis: Siehe ergänzende Datei 1 Näheres über die Einstellung der CD38-cut-off-Ebenen.
    4. Bestimmen innerhalb dieser CD38geringe Bevölkerungsdichte der wahre CD34 + CD38sehr niedrig Stammzell-Bevölkerung, mit dem Median der roten Fraktion, den unteren Rand der leeren Kalibrierung Perlen oder wählen Sie 102 als Cut-off Point (Abbildung 7 ). Siehe zusätzliche Datei 1 weitere Informationen zur Festlegung der CD38-cut-off.
    5. Innerhalb beider Völker Tor der leukämischen Stammzellen vs. normale hämatopoetischen Stammzellen (LSC gegen HSC) durch die Analyse von einzelnen leukämischen Marker in der Systemsteuerung zur Verfügung gestellt (d.h. CD45RA, Combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 und CD56 alles in PE), CD123, CD33 und CD44).
    6. Plot-Stammzell-Marker von Interesse im Vergleich zu anderen Stammzell-Marker, Positivität/Negativität mit Positivität/Negativität von anderen Markern zu vergleichen und um LSC gegen HSC Frequenz zu optimieren.
    7. Den Anteil der unreifen Blasten, Lymphozyten, CD34 + Zellen zu melden. Listen Sie für alle separaten Marker die Gesamtzahl der CD38niedrig und CD38Verylow und die Anzahl von CD38niedrig und CD38Verylow die Marker positiv (und damit neoplastischen) sind.
    8. Wählen Sie den Marker unterscheidet, die am besten normale Blutstammzellen vs. leukämischen Stammzellen zur weiteren Analyse. Berechnen Sie den Prozentsatz der LSC und HSC als Prozentsatz der gesamten WBC.
      Hinweis: Ein Prozentsatz des LSC ≥ 0,004 % wird als LSC positiv bei der Diagnose, während der Cut-off 0,0001 % bei Follow-up berichtet. Aberrante Stammzellen Anspritzung im Follow-up-Proben ist ähnlich wie Analyse, wie zum Zeitpunkt der Diagnose, aber Zellzahlen in der Stammzell-Populationen sehr klein sein können. Daher die Notwendigkeit des Erwerbs von genügend Ereignisse.

Representative Results

In 90 % der AML-Patienten kann mindestens eine LAIP identifiziert werden. Um die genauen Prozentsätze LAIP + Zellen des primitiven Blasten bei der Diagnose zu generieren, die entsprechende Einstellung des Tores Blast ist entscheidend und braucht Kontrolle als in Abbildung 3visualisiert. Ein Beispiel für jeden Patienten eine bestimmte Art von Aberrancy auf die primitiven CD34 + Zellen beherbergen ist in Abbildung 5dargestellt. Zur Messung von MRD bei Follow-Up, die zuvor definierten LAIP + Zellen sind eingezäunt und definiert als Anteil der LAIP + Zellen des WBC. Die Einstellung dieses Tores ist daher entscheidend für die richtige MRD-Ergebnisse zu erzielen. Abbildung 6 zeigt ein Patient, der Rückfall nach MRD positiv (≥ 0,1 %) und Patienten in kompletter Remission bleibt nach dem zweiten Zyklus der Induktions-Therapie.

Das aktuelle Protokoll eignet sich nur Stammzellen im CD34 + Zellen, hinterlegen, da umfassende Charakterisierung von diesem Fach gezeigt hat, dass die CD38-Bevölkerung die potentesten Stammzelle wie Bruchteil birgt. Um die LSC vom HSC innerhalb dieser Fraktion zu trennen, werden weitere Symbole verwendet. Am häufigsten ausgewählten Marker, LSC zu unterscheiden sind CD45RA und der Combi-Kanal beherbergen 6 spezifische LSC-Marker mit PE gekennzeichnet. Basierend auf weitere klinische Auswertungen, ein Abkürzungniveau von ≥ 0,004 % wurde definiert als LSC-positiv und war verbunden mit schlechter überleben bei der Diagnose, während ein Abkürzungniveau von 0,0001 % bei hohen bis10verwendet wurde.

Figure 1
Abbildung 1 : Knochenmark Abstrich. (A) gesunden Spendern und (B) AML Patienten (FAB 5 Subtyp). Giemsa Fleck auf 100 X Vergrößerung gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Verpackungsmaterial für biologische Flüssigkeiten zu korrigieren. Weitere Details zu den Regeln und Vorschriften für den Transport von biologischen Flüssigkeiten finden Sie auf der Webseite15 Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Strategie für die Definition von Blasten gating. (A) CD45dim, B Gating) Gating CD34 + sprengt.

Figure 4
Abbildung 4 : Lymphozyten gating. (A) blauen Zellen sind WBC gezeigt im FSC/SSC Plot B) grüne Zellen sind Lymphozyten gekennzeichnet durch CD45hohe/SSCniedrig, C) Negativität für CD34, (D) Negativität für CD117 und Negativität (E) für CD13, F) die verschiedenen Zelltypen sind Beispiele für eine Übersichtsbaum Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Bei der AML Diagnose LAIP. (A) LAIP basierend auf cross-Linie Aberrancy (CD7 auf CD33 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), B) LAIP basierend auf asynchrone Differenzierung (CD11b auf CD13 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), (C) LAIP basierend auf Überexpression im Vergleich zu normalen Zellen (CD34sehr hoch auf CD13 mit dem Ausdruck ihrer Zellen), (D). LAIP basierend auf minder im Vergleich zu normalen Zellen (HLA-DRniedrig auf CD33 Ausdruck Zellen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : LAIP gefolgt während der Therapie. (A) LAIP Definition bei der Diagnose (CD34 + / CD13 + / CD33-) und Verlust von LAIP während Follow-up bei einem Patienten, der in kontinuierlichen kompletter Remission, (B) LAIP Definition bei der Diagnose blieb (CD117 + / CD7 + / CD33 +) und Persistenz von LAIP während Follow-up bei einem Patienten, der einen Rückfall. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Stem Cell gating. (A) Herbeirufung der verschiedenen CD34 + / CD38 Populationen anhand Perlen (CD38niedrig ist unterhalb der oberen Grenze der Perlen, während CD38sehr niedrig sind definiert als die wahren negativen Zellen repräsentieren die LSC und befinden sich unter dem Median der Perlen), (B) zwei Beispiele von Patienten mit Unterscheidung zwischen HSC und LSC bei Follow-up basierend auf CD45RANeg und CD45RApos Ausdruck. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1. Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.

Ergänzende Datei 2. Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.

Ergänzende Datei 3. Klicken Sie bitte hier zum Downoad Datei.

Discussion

Sind genügende Daten zur Verfügung, die den Beweis für MRD-Positivität mit Armen überleben assoziiert wird, und daher kann MRD Bewertung Patienten-Outcome verbessern, indem Sie zusätzliche prognostische Informationen auf dem klinischen Entscheidungen getroffen werden können. Daher unbedingt eine konsistente und abgestimmte Methode für Immuno-phänotypische Beurteilung der MRD letztlich Patient Therapie zu verbessern. Dies ist auch wichtig, beim Vergleich von klinischer Studies in verschiedenen Studienzentren, und kann letztlich Hilfe in klinischen Entscheidung machen und dient als ein Surrogat klinischen Endpunkt für die Gesamtüberlebenszeit. Die Vorstellung, dass solide Richtlinien für genaue und konsistente MRD-Messungen gerechtfertigt sind führte zu einer konzertierten Aktion der Europäischen Leukämie Netzwerk (ELN), State-Of-The-Art-Design-Richtlinien. Dieses umfassende Dokument veröffentlichte Ende 2017 werden, und werden für viele Studiengruppen und Labors voran.

Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls

Ein wichtige und oft übersehener Aspekt der MRD-Analyse ist die Auswirkung der Sample-Qualität über die genaue Bestimmung der MRD. Dies wird deutlicher, wenn Material muss transportiert werden, an anderen Instituten in weltweiten klinischen Studien gegeben, die zusätzliche betriebliche Aspekte, die in diesem Rahmen berücksichtigt werden müssen. Um das Risiko der Verwechslung von Patienten ist Informationen und pünktliche Lieferung der Proben angemessene Verwaltung entscheidend. Auch in diesem Stadium des Transports ist die richtigen Formen und/oder Import in elektronischen Krankenhaussysteme mit klaren Zuordnungen der gewünschten Analyse erforderlich. Kenntnis nehmend von der Bühne Therapie MRD Sampling ist auch entscheidend, da es möglicherweise relevant für die klinische Entscheidungsfindung (zum Beispiel nach dem zweiten Kurs der Therapie) und sollte daher klar definiert werden. Die Verwendung von simulierten Daten (wie zum Beispiel 1. Januar pro Geburtsjahr) erhöht das Risiko der Verwechslung von Patienten oder Analysen. Sofern dies gesetzlich vorgeschrieben ist, sollte eine alternative anonymisierte Form der Identifizierung verwendet werden.

Alle Proben für die Immunphänotypisierung sollte vorzugsweise innerhalb von 24 h Kollektion verarbeitet werden. Obwohl nicht zu empfehlen, können bei bis zu 72 h bei Raumtemperatur aufbewahrt dem Knochenmark und peripherem Blutproben noch verarbeitet und analysiert werden. Darüber hinaus alle Handhabungen mit dem Material können am besten durchgeführt werden unter sterilen Bedingungen, so dass weitere Kryokonservierung von Zellen in (lokalen) Biobanken relevant bleibt: zahlreiche klinische Studien haben zusätzliche Analysen, Leukämie-Zellen mit weiter zu untersuchen in Bezug auf molekularer, Immuno-phänotypische und funktionelle Eigenschaften zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Details des Biobanking sind jedoch nicht in den Anwendungsbereich dieser Handschrift.

Mit MRD als Diagnosewerkzeug impliziert, dass es ein akkreditiertes Labor nicht nur für Durchflusszytometrie, aber auch zur Qualitätskontrolle von MRD Bewertung braucht. Dies erfordert möglicherweise Muster zu bestimmten Referenzlaboratorien oder (wieder-) analysieren Flow-Dateien mit der MRD-Messungen von Referenz-Teams zu verteilen.

Dieser Artikel beschreibt die wichtigsten Aktionen aus dem Knochenmark Aspirat Sammlung zur Bestimmung der MRD in klinischen Proben - erfordern ein ganzes Team von Experten mit spezifischen Aufgaben, Zuständigkeiten, und häufige Kommunikation für eine effektive Charakterisierung und Analyse. Da jede Aufgabe entscheidend für das Verfahren ist, empfiehlt es sich, haben solide Logistik einschließlich der Protokolle bei jedem Labor und ausreichend speziell dafür geschultem Personal sichern. Darüber hinaus gibt es einige relativ subjektive Schritte Teil der Verfahren (vor allem LAIP und LSC aberranten Marker-Identifikation), gilt es, Diskussionen über das Endergebnis vom Team, und haben den Abschlussbericht autorisiert durch ein Team von Aufsichtsbehörden. Aktuelle Bemühungen verfolgen Computer-Software-Entwicklung, die hilft, die (LAIP und LSC) MRD-Analyse zu standardisieren.

Modifikation und Fehlerbehebung

Jede Übungseinheit haben einen eigenen Satz von Antikörpern, die verwendet werden können, die verschiedenen Subpopulationen zu definieren, obwohl mit einem standardisierten Rückgrat der Marker essentiell für vergleichbare Ergebnisse wie in den ELN-Stand der Technik-Leitlinien für MRD Messungen Dokument beschrieben oben genannten. Unabhängig von der gewählten Marker gibt es einige Probleme, die die Analyse der Ergebnisse erschweren und müssen berücksichtigt werden können.

Grenzen der Technik

Die Identifizierung von LAIP und LSC aberranten Marker Ausdruck ist zuerst bei der Diagnose bewertet und überwacht im Laufe der Zeit (während und nach der Therapie) für die genaue Charakterisierung des Phänotyps MRD. Während mehr als 95 % der Patienten über LAIP LSC (oder beides) ausgewertet werden kann, noch einige Patienten haben keine definierte LAIP oder keine CD34 + CD38-LSC mit CD34 negative Blasten zu präsentieren oder haben eine fehlende Diagnose Probe. In diesen Fällen lohnt sich immer noch versuchen zu messen MRD mit einem Panel von Antikörpern so breit wie die Anzahl der verfügbaren Zellen ermöglicht und wählen Sie dann die zuverlässigste (was der stärkste Unterscheidung der leukämischen Zellen) LAIP. Wenn man bedenkt, dass ein Teil der Patienten, die letztlich Rückfall nicht vollständig Diagnose Immunophenotype, aufgrund der Heterogenität der AML Krankheit ähneln messen eine breite Gruppe von Antikörper bei MRD wird jedenfalls empfohlen. Diese Immunophenotypic Verschiebungen gehören Blasten und LSC und haben gezeigt, dass während der Therapie16 auftreten und messbare Erkrankung auf diese sogenannten kommende Populationen beruhen kann. Zu diesem Zeitpunkt wurde jedoch es nicht bestimmt, ob alle Immunophenotypic Sub-Populationen zum Rückfall der Erkrankung führt, und daher nicht allgemein üblich, MRD zugeschnitten-Therapie Berichten auf diese Zellen in klinischen Studien basiert. Es ist wichtig zu beachten, dass das Risiko der fehlenden LSC wegen der Bevölkerung Verschiebungen durch eine Röhre Ansatz reduziert wird, in dem die wichtigsten Aberrancy definierenden Marker in einem Durchflusszytometrie (PE) Kanal14 sind.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden

In diesem Protokoll beschriebene Methode stützt sich auf die Definition von einem oder mehreren LAIP, welche Zellen während der Therapie gefolgt sind. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass es vor kurzem gezeigt hat, dass LAIP während der Therapie ändern kann. Auf diese Weise können einige kommende Populationen mit verschiedenen aberranten Marker übersehen werden. Um dies zu umgehen, wäre es am besten, alle aberranten Marker anstatt nur diejenigen, die zum Zeitpunkt der Diagnose gefunden zu messen. Dies dann wäre ähnlich wie bei der "unterscheidet sich von normalen" Ansatz, die von mehreren Labors17verwendet wird.

Zukünftige Anwendungen

Vor kurzem erhielt MRD zusätzliche Aufmerksamkeit für neue klinische Studien-Entwurf. In der Ära der spezialisierten Behandlungsmöglichkeiten und gezielte medikamentöse Therapie wird die Verwendung von MRD als Ergebnis Maßnahme reduzieren den Zeitaufwand für die klinischen Wirksamkeit von neuen Behandlungsmethoden, letztlich so, dass die schnellere Einführung von therapeutischen dringend zu etablieren Optionen in der Klinik. Die Bedeutung der entsprechenden Logistik und praktische Ausführung einer harmonisierten MRD-Bewertung sind entscheidend für den zukünftigen Erfolg der AML-Behandlung, da die FDA untersucht derzeit die Machbarkeit der Verwendung MRD als Surrogat Endpunkt anstelle des Gesamtüberlebens misst18.

Disclosures

Die Antikörper-Cocktails verwendet für die Validierung der Stammzell-Röhre in mehrere unabhängige Institute wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von BD. Die Autoren haben nichts in Bezug auf diese Handschrift offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von niederländischen Krebsgesellschaft (ALPE 2013-6371) und Egbers Stiftung für VONK unterstützt. Wir danken der niederländischen AML-MRD-Arbeitsgruppe für die Zusammenarbeit und fruchtbaren Diskussionen zur kontinuierlichen Verbesserung und Standardisierung der AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Canto II  BD Biosciences 338962
CD7 FITC  (50µg/ml) BD Biosciences 555360
CD2 FITC (Unknow) DAKO F076701
CD36 FITC (25µg/ml) Sanquin M1613
CD15 FITC (200 µg in 200 ml) BD Biosciences 332778
CD45RA FITC (50µg/ml) BD Biosciences 335039
CD56 PE (50µg/ml) BD Biosciences 345810
CD22 PE (12,5µg/ml) BD Biosciences 337899
CD14 PE  (50µg/ml) BD Biosciences 345785
CD133 PE (16,5µg/ml) Miltenyi Biotec 130-080-801 Will be replaced soon by Miltenyi for 130-113-108 (75µg/ml) and needs to be titrated
Clec12a PE (Unknow) BD Biosciences 562566
Tim-3 PE (100µg/ml) BD Biosciences 563422
CD7 PE (25µg/ml) BD Biosciences 555361
CD11b PE  (50µg/ml) BD Biosciences 333142
CD34 PERCP-CY5.5 (12,5 µg/ml) BD Biosciences 347222
CD123 PERCP-CY5.5 (25µg/ml) BD Biosciences 558714
CD117 PC7 (12,5µg/ml) Beckman Coulter B49221
CD33 PE-CY7 (25µg/ml) BD Biosciences 333952
CD19 APC (50µg/ml) BD Biosciences 345791
CD11b APC (50µg/ml) BD Biosciences 333143
CD33 APC (12,4µg/ml) BD Biosciences 345800
CD38 APC  (25µg/ml) BD Biosciences 345807
HLA-DR APC-H7  (50µg/ml) BD Biosciences 641411
CD44 APC-H7  (800µg/ml) BD Biosciences 560532
CD13 BV421 (Unknow) BD Biosciences 562596
CD34 BV421  (50µg/ml) BD Biosciences 562577
CD45 Krome Orange (100µg/ml) Beckman Coulter B36294
CD45 HV500c  (100µg/ml) BD Biosciences 655873
CST beads  BD Biosciences 655051
Pharm lysing solution BD Biosciences 555899
Multicolor CompBeads BD Biosciences 644204
FACSDiva software BD Biosciences 659523
Infinicyt  Cytognos CYT-INFINICYT-AOM
Rainbow Calibration Particles, 8 peaks, Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Tuerk solution Brocacef No longer available but can be purchades from different companies
Blank Calibration Particles Beads Spherotech BCP-100-5
Albuman 200g/l Sanquin GTIN8717185830910
Azide Acros Organics 190381000
ddH2O Water demineralized in our institute
10*PBS Lonza BE17-517Q
May Giemsa Grünwald Merck  1.01424.2500

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References

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