Överlappande peptid-bibliotek för att mappa Qa-1 epitoper i ett Protein

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

QA-1 (HLA-E i mänskliga) tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b molekyler. Immunisering med Qa-1-bindning epitoper har visat sig öka vävnadsspecifika immunreglering och lindra flera autoimmuna sjukdomar. Detta dokument beskriver vi en överlappande peptid Biblioteksstrategi för identifiering av Qa-1 epitoper i ett protein.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

QA-1 (HLA-E i mänskliga) tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b (MHC-Ib) molekyler. Senaste data tyder på att Qa-1 molekyler spelar viktiga roller i lantmäteri celler för strukturella och funktionella integritet, förmå immunreglering och begränsa immunsvar mot virusinfektioner. Dessutom, funktionell förstärkning av Qa-1-begränsat CD8+ T celler genom epitop immunisering har visat effekter i flera autoimmun sjukdom djurmodeller, e.g. experimentell allergisk encefalomyelit, kollagen-inducerad artrit, och icke-feta diabetes. Därför finns det ett brådskande behov av en metod som kan snabbt och effektivt identifiera funktionella Qa-1 epitoper i ett protein. Här beskriver vi ett protokoll som använder Qa-1-begränsat CD8+ T cell linjer specifika för ett överlappande peptid (OLP)-bibliotek för att bestämma Qa-1 epitoper i ett protein. Detta OLP bibliotek innehåller 15-mer överlappande peptider som täcker hela längd av ett protein, och intilliggande peptider överlappning av 11 aminosyror. Använder det här protokollet, vi har nyligen identifierat en 9-mer Qa-1 epitop i myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Detta nyligen mappad MOG Qa-1 epitop visades att inducera epitop-specifik, Qa-1-begränsat CD8+ T cells förbättrade myelin-specifik immun förordningen. Detta protokoll är därför användbart för framtida utredning av nya mål och funktioner av Qa-1-begränsat CD8+ T celler.

Introduction

QA-1 tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b (MHC-Ib) molekyler i möss. Dess mänskliga homolog är HLA-E. Tidigare bevis har visat att Qa-1 molekyler har viktiga biologiska funktioner. För det första, Qa-1 molekyler spelar en viktig roll i lantmäteri celler för strukturella och funktionella integritet. Qa-1 molekyler har i detta avseende utvecklats flera strategier för att övervaka den normala funktionen av en cell. En sådan strategi kan Qa-1 molekyler att bilda komplex med en bearbetade ledare peptid (epitop), dvs den Qa-1 avgörande modifierare (Qdm) som bearbetas från klassiskt MHC-Ia molekyler i endoplasmatiska retikulet1. Dessa Qa-1/Qdm-komplex senare Visa på ytan av en cell och binder till hämmande NKG2A receptorer på NK celler att hämma NK döda aktivitet2. Om uttrycket av MHC-Ia molekyler bryts, blir en cell (t.ex. en elakartad cell) känslig för NK döda2. Den andra strategin gör det möjligt för Qa-1 molekyler att bilda nya Qa-1/epitop komplex på ytan av en cell som är bristfällig i TAP (transportör är associerad med antigen bearbetning)3 och/eller ERAAP (endoplasmatiska nätverket aminopeptidase associerade med antigen bearbetning)4 (båda brister ofta förekommer i maligna celler). Cellen som uttrycker dessa nya Qa-1/epitop komplex kan då identifieras och elimineras genom de epitop-specifika Qa-1-begränsat CD8+ T celler. För det andra, Qa-1 molekyler inducerar immunreglering5. I detta avseende, Qa-1/epitop komplex har visat sig stimulera CD8+ regulatoriska T (Treg)-celler som är viktiga för förhindrandet av immunmedierade skada av self-vävnader6,7,8 ,9,10. För det tredje, Qa-1-begränsat CD8+ Treg celler har visat att begränsa immunsvar mot virusinfektion11.

Därför viss förstärkning av epitop-specifika CD8 Qa-1-restrictred+ T celler är en potentiellt lovande strategi för eliminering av onormala celler, om förbättring av immunreglering och för kontroll av omfattningen av virus-inducerad immunsvar. Samtidigt som det inte har bestämts om förstärkning av epitop-specifika Qa-1-begränsat CD8+ T celler kan förbättra immun övervakning och begränsa virus-inducerad immunsvar, våra laboratorier och andra har tydligt visat att immunisering med Qa-1 epitoper kan utöka funktionen av Qa-1-begränsat CD8+ Treg-celler specifika för patogena autoimmuna CD4+ T celler, vilket leder till effektiv kontroll av CD4+ T cell-medierade autoimmuna sjukdomar i en mängd djur modeller såsom experimentell allergisk encefalomyelit (en djurmodell av mänskliga multipel skleros)6,10, kollagen-inducerad artrit (en djurmodell av mänskliga reumatoid artrit)7, och icke-feta diabetes (en djurmodell av mänskliga typ 1-diabetes)8. Dessutom har vi upptäckt att immunisering med en vävnadsspecifika Qa-1 epitop leder till specifik kontroll av immunmedierad inflammation i denna vävnad genom förstärkning av CD8+ Treg-celler12. De ovanstående framgångarna i prekliniska studier indikerar ett behov av en fullständig utvärdering av Qa-1 epitop immunisering för behandling av vävnadsspecifika immunmedierade sjukdomar och potentiellt för terapin av andra sjukdomar förknippade med brister i tryck och ERAAP.

Därmed, det finns en efterfrågan på en teknik som kan tillförlitligt och snabbt analysera Qa-1 epitoper i ett protein. I detta sammanhang har ett begränsat antal biologiskt viktiga Qa-1 epitoper beskrivits. De flesta av dessa Qa-1 epitoper identifierades serendipitously under studien av CD8+ T cell Svaren till bakterier13, celler bristfällig i tryck3, celler bristfällig i ERAAP4och cellerna som orsakar EAE6, 9. En hög genomströmning teknik är därför önskvärt för identifiering av biologiskt viktiga Qa-1 epitoper i ett definierat protein. I följande beskriver vi en överlappande peptid (OLP) Biblioteksstrategi som kartor funktionella Qa-1 epitoper i ett protein med Qa-1-resrticted CD8+ T cell linjer specifika för OLP pool (OLP_pool) av ett protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med en institutionell djur vård och använda protokoll godkänts av djur vård och användning kommittén på vid University of Texas i El Paso och Loma Linda University.

1. generering av en OLP bibliotek som täcker hela längd av ett Protein

  1. Designa en OLP bibliotek där alla peptider är 15-mer i längd, och intilliggande peptider överlappning av 11 aminosyror.
    Obs: I studien MOG OLP sekvens av MOG föregångare [Mus musculus] var Hämtad från NCBI protein databasen genom att följa denna länk: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. MOG föregångaren (247 aminosyror), som innehöll både signal och mogen peptider, användes eftersom de flesta rapporterade Qa-1 (HLA-E) epitoper var belägna i signal peptider (e.g. Qdm1). Början på dess N-terminalen, identifierades sekvenserna av 15-mer peptider så att två intilliggande peptider överlappas av 11 aminosyror (figur 1). Därför identifierades exakt 59 OLPs i 247 aminosyra MOG föregångaren. Dock kan den sista OLP variera från 12 till 15-mer beroende på längden av protein. Dessutom väljer vi 15-mer bibliotek eftersom vi och andra har visat att 15-mer peptider, när det adderas till dendritiska celler (DCs) eller makrofager, kan vara effektivt+ T förädlats till epitoper för erkännande av CD8-celler14,15 .
  2. Köpa varje enskilda peptid kommersiellt. 5 mg per peptid bör vara tillräckligt för screening. OLPs och trunkerade peptider (steg 6.1) kan vara desalted peptider (renhet är cirka 50-70%). Renhet av optimal peptid (steg 6,2) som används för generering av tetramer och för framtida biologiska analyser bör > 90%. Beredes peptiderna under sterilt skick.
  3. Gör 50 mg/mL enskilda peptid bestånd i 100% DMSO. För 5 mg varje peptid, lägga 100 μL av DMSO i varje rör, blanda, och lagra peptiderna vid-20 ° C. Dessa bestånd kommer att användas för att göra en OLP_pool lager för generering av CD8+ T cell linjer reaktiva att OLP_pool. Dessa bestånd kommer dessutom också användas för att göra 10 mg/mL enskilda peptid bestånd för att fastställa varje enskild peptid förmåga att stimulera en Qa-1-begränsat svar i en OLP_pool-reaktivt CD8+ T cell fodrar.
  4. Tillverka OLP_pool lager genom att lägga en lika stor volym av varje peptid i en frisk slang. Denna OLP_pool lager innehåller 100% DMSO. I MOG OLP-studien fanns det 59 OLPs12. Koncentrationen av varje peptid i OLP_pool var därför 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Gör 10 mg/mL enskilda peptid bestånd genom att späda (5 x) 50 mg/mL beståndet i sterila H2O i en V-botten 96 brunnar tallrik (detta lager innehåller 20% DMSO). Göra dessa bestånd i en plattan med 96 brunnar eftersom fastställandet av varje enskild peptid Qa-1-begränsat svar kommer att utföras i en plattan med 96 brunnar med hjälp av en 8 - eller 12-kanals flerkanalspipett.
    Obs: Alla peptider, inklusive OLPs och trunkerade peptider, ska spädas i antingen en V-botten 96 brunnar tallrik eller en 96 brunnar prov rack fyllda med 1 mL tuber eftersom peptiden bibliotek screening utförs i 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Om det är svårt att försvaga en peptid, tillsätt 1 N NaOH droppe klokt att hjälpa lös peptiden.

2. priming av Kb-/- Db-/- CD8+ T-celler med OLP_pool pulsade Kb-/- Db-/- dendritiska celler (DCs).

Obs: Det finns två stora Qa-1 alleler: en är Qa-1en, och den andra är Qa-1b. Sedan djuren vanligen används för akademisk forskning, e.g. C57BL/6 och Balb/c-möss, bär Qa-1b, det här protokollet beskriver förfarandet för mappning Qa-1b epitoper i ett protein. CD8+ T celler som används i detta protokoll renas från Kb-/-Db-/- möss (C57BL/6 bakgrund) i vilken CD8+ T celler begränsas främst av icke-klassisk MHC-Ib molekyler inklusive Qa-1.

  1. Producera benmärgen-derived DCs som tidigare beskrivits12.
    1. Kort, kultur benmärgen enda cellsuspensioner (1 x 106 celler/mL) i RPMI-10 medium (RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanol, 1 mM natrium pyruvat och 0,1 mM icke nödvändig aminosyra) innehållande 10 U/mL IL-4 och 100 U/mL GM-CSF i en 6-well platta (4 mL per brunn) vid 37 ° C, 5% CO2.
    2. Två dagar senare, ta bort icke-anhängare celler försiktigt och tillsätt färsk media och cytokiner.
    3. Efter att odla cellerna i ytterligare två dagar, överföra icke-anhängare celler som innehåller färska media och cytokiner till en ny 6-bra platta.
    4. Odla cellerna i ytterligare två dagar och fylls på med färska media och cytokiner som innehåller LPS (0.1 µg/mL) att aktivera domänkontrollanterna.
    5. 24 h senare, samla DCs för experiment.
  2. Bestråla DCs med 3000 Rads.
    1. Alternativt kan behandla DCs (5 x 107 celler/mL) med mitomycin C (50 μg/mL) i PBS vid 37 ° C i 20 min. Tillsätt RPMI-0 (RPMI 1640 utan serum) för att fylla röret (~ 12 mL) och snurra cellerna för 10 min i en bordsskiva centrifug 300 x g. Kassera supernatanterna och REPEAT t förfarandet tvätt två gånger. Dessa tre tvättar är kritisk eftersom alla spår mängd mitomycin C kan hämma svaret av CD8+ T celler under DC-T cell samarbete kultur.
  3. Justera DC koncentration till 5 x 106 celler/mL i serumfritt medium (AIM-V serumfritt medium kompletteras med 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanol, 1 mM natrium pyruvat och 0,1 mM icke nödvändig aminosyra).
  4. Lägg till OLP_pool stamlösning, som innehåller 100% DMSO, till DCs så att slutlig DMSO koncentration kommer att vara 0,5% (200 x). I MOG OLP-studien var koncentrationen av varje OLP i OLP_pool 847.46 μg/mL; därav var den slutliga koncentrationen av varje OLP i DC kulturen 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Dock kan denna koncentration skalas upp till 100 μg/mL så länge DMSO koncentrationen i cellkulturen är mindre än 1%.
  • Inkubera DCs i rumstemperatur i 3 h och skaka cellerna försiktigt varje 15 min.
  • Under denna inkubationstid, rena CD8+ T celler från skördade mjälte eller lymfkörtlar av Kb-/-Db-/- möss använder en kommersiell CD8+ T cell rening kit, justera cellkoncentrationen till 10 x 106 celler/mL i serumfritt medium innehållande 50 U/mL interleukin 2 (IL-2) och 100 U/mL av IL-7.
  • Nu lägger CD8+ T celler till en 48-well platta som 0,5 mL per brunn (efter tillsats av 0,5 mL/väl av OLP_pool pulsade domänkontrollanterna i steg 2,8, CD8 slutliga koncentration+ T celler kommer att vara 5 x 106 celler/mL).
    Obs: CD8+ T celler från mus mjälten och lymfkörtlarna kan renas med hjälp av CD8 positiv isolering Kit genom att följa instruktioner som tillhandahålls av tillverkaren. CD8+ T celler som erhållits är gratis pärlor.
  • Snurra ner OLP_pool pulsade DCs (300 x g, 10 min) på RT. Beredes OLP_pool pulsade DCs till 2 x 106 celler/mL i serumfritt medium och tillsätt 0,5 mL per brunn i 48-väl plattan som innehåller CD8+ T cells (slutlig koncentration på OLP _pool-pulsade DCs är 1 x 106 celler/mL, slutlig koncentration av CD8+ T celler är 5 x 106 celler/mL, slutlig koncentration av IL-2 är 25 U/mL och slutlig koncentration av IL-7 är 50 U/mL). Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
  • På dag 4, ta bort och släng ca 400 μL odlingssubstrat och tillsätt 500 μl av färska serumfritt medium som innehåller 100 U/mL IL-2 och 100U/mL av IL-7 till varje brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
  • Dag 7 eller 8, åter stimulera den OLP_pool-primade CD8+ T celler med OLP_pool.
  • 3. restimulering av den primade CD8+ T celler med makrofager pulsade med OLP_pool

    1. Fyra dagar innan ny stimulering av den OLP_pool-primade CD8+ T celler, förbereda 2% (v/v) polyakrylamid pärla lösning: tvätta 2 g av polyakrylamid pärlor två gånger i 20 mL endotoxinfria H2O eller PBS. Pellet polyakrylamid pärlorna genom centrifugering (400 x g) i 5 min och resuspendera i 100 mL PBS. Autoklavera vid 15 lb/m för 20 min. Store vid rumstemperatur.
    2. Injicera möss intraperitonealt med 1 mL/mus den sterila 2% polyakrylamid pärla lösning att locka migration av monocyter/makrofager i bukhålan16.
    3. Fyra dagar senare, offra djur av CO2 överdosering.
      1. Under sterila förhållanden och skär en liten öppning i mitten av buken så att öppningen är precis tillräckligt för att passera en 5 mL överföring pipett. Fyll pipetten överföring med RPMI-0 och sätt pipetten i det buk-hålet genom öppningen.
      2. Skölj det buk-hålet genom pipettering. Pipettera ut så mycket vätska som möjligt från det buk-hålet i ett sterilt rör (dessa är peritoneal makrofager). Upprepa detta skölj 4 - 5 gånger.
    4. Bestråla peritoneal makrofager med 3000 Rads.
      1. Alternativt kan behandla peritoneal makrofager med mitomycin C (Följ proceduren som beskrivs i steg 2.2).
    5. Justera koncentrationen av peritoneal makrofager till 5 x 106 celler/mL i serumfritt medium. Lägga till OLP_pool lager (slutliga DMSO koncentration är mindre än 1%) och M-CSF (slutlig koncentration = 100 U/mL).
      Obs: I denna MOG OLP studie använde vi 0,5% DMSO. MOG OLP_pool lager var alltså utspädda 200 x (t.ex. 1 μL av MOG OLP_Pool lager lades in 199 μL av peritoneal makrofager). Den slutliga koncentrationen av varje OLP var därför 4,2 μg/mL).
    6. Tillsätt 200 μL/brunn (1 x 106 celler per brunn) i en 48-väl vävnadsodling tallrik och inkubera plattan vid 37 ° C i 4 h.
    7. Ta bort icke-anhängare cellerna och polyakrylamid pärlor genom skonsam tvättning med 200 μL/brunn för pre värmde RPMI-0.
    8. Samla och pool i OLP_pool primade CD8+ T celler från steg 2.10. Justera OLP_pool primade CD8+ T cell koncentration till 1 x 106 celler/mL i serumfritt medium innehållande 25 U/mL IL-2 och 50 U/mL av IL-7. Tillsätt 1 mL per brunn till 48-väl plattan som innehåller OLP_pool-pulsade peritoneal makrofager.
    9. Fyra dagar senare, fylla på mediet i 48-väl plattan. Ta bort och släng ca 400 μL av odlingssubstratet i 48-väl kultur tallrikar. Tillsätt 500 μL av färska serumfritt medium innehåller 100 U/mL IL-2 och 100 U/mL av IL-7 i varje brunn. Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
    10. Tre eller fyra dagar senare, undersöka de OLP_pool-restimulerat CD8+ T-celler för OLP_pool-specifika, Qa-1-begränsat svar med enzymkopplad immunospot assay (ELISPOT). Efter denna punkt åter stimulera CD8+ T cells varje 7-10 dagar.
      Obs: Makrofager är att föredra för förnyad stimulering av den OLP_pool-primade CD8+ T celler. Vi märkte att CD8+ T celler åter stimuleras av makrofag växte bättre än DCs in vitro.

    4. bestämning av OLP_pool-specifika, Qa-1-begränsat svar i en OLP_pool-restimulerat CD8+ T Cell linje

    Obs: OLP_pool-specifika, Qa-1-begränsat svar i en OLP_pool-restimulerat CD8+ T cell fodrar bestäms av IFNγ sekretion efter stimulering av OLP_pool i närvaro av C1R eller C1R. QA-1b -celler med en IFNγ ELISPOT-analys. C1r celler kan erhållas kommersiellt. C1R. QA-1b -celler kan genereras av transducing C1R cellerna med Qa-1 lentiviral vektorn.

    1. Tillsätt 100 μL/brunn antikroppar tillfångatagandet anti-IFN-γ utspädd i coatingbuffert (PBS) i brunnar av en ELISPOT-platta.
    Försegla och inkubera plattan vid 4 ° C över natten.
  • Den andra dagen, kassera beläggning bufferten som innehåller fånga anti-IFN-γ antikroppen och lägga till 200 μL/brunn-blocking lösning (serumfritt medium) och inkubera plattan för 2 h i rumstemperatur.
  • Bestråla den C1R och C1R. QA-1b -celler med 9600 Rads.
    1. Alternativt kan behandla C1R och C1R. QA-1b -celler med mitomycin C som beskrivs i den steg 2,2 Förutom att behandlingstiden blir 30 min.
  • Justera C1R och C1R. QA-1b -celler i serumfritt medium 4 x 106 celler/ml.
  • Kassera den blockerande lösningen i plattan och tillsätt C1R och C1R. QA-1b -celler på 50 μL/brunn (200 000 celler per brunn) och blanda.
  • Tillsätt 50 μL/brunn 100 x utspädd OLP_pool lager (i serumfritt medium) och blanda ordentligt. Inkubera plattan i rumstemperatur i 2-3 h.
  • Justera den OLP_pool-restimulerat CD8+ T celler till 1-2 x 106 celler/mL i serumfritt medium innehållande 150 U/mL av IL-7 och tillsätt 50 μL/brunn (50 000-100 000 celler per brunn) till plattan. Centrifugera plattan (58 x g) för 5 min.
  • Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 över natten.
  • Aspirera cellsuspension. Tvätta brunnarna 2 gånger med avjoniserat vatten (DI) vatten (250 μl per brunn). Tillåta brunnar i blöt i 5 min på varje tvättningen.
  • Tvätta brunnarna 3 gånger med tvätta buffert jag (PBS som innehåller 0,05% Tween20). Tillåta brunnar i blöt i 1 min på varje tvättningen. Kassera tvättbuffert.
  • Tillsätt 100 μL av detektionsantikropp utspätt i en förtunningsbuffert (PBS som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS)).
  • Inkubera plattorna i rumstemperatur i 2 h.
  • Kassera upptäckt antikropp lösning. Tvätta brunnarna 3 gånger med 250 µL per brunn tvätta buffert I. möjliggör brunnar i blöt i 1 min på varje tvättningen.
  • Tillsätt 100 μL/brunn av enzymkonjugat (streptividin-HRP) utspätt i utspädning bufferten vid spädning 1: 100.
  • Inkubera plattorna för 1 h i rumstemperatur.
  • Kassera enzym konjugat lösning. Tvätta brunnarna 4 gånger med 250 µL per brunn tvätta buffert I. möjliggör brunnar i blöt i 1 min på varje tvättningen.
  • Tvätta brunnarna 2 gånger med 250 µL per brunn tvätta buffert II (PBS).
  • Tillsätt 100 µL substratlösning (blanda 1 droppe = 20 µL av AEC kromogen med 1 mL av AEC substrat) till varje brunn. Övervaka plats utveckling för 5 till 60 min.
  • När önskat resultat börjar dyka, stoppa substrat reaktionen genom att Tvätta brunnarna med destillerat vatten.
  • Lufttorka plattorna i rumstemperatur i 2 timmar eller över natten tills den är helt torr. Borttagning av plast facket under plattorna underlättar torkning. Förvara tallrikar i en förseglad plastpåse i mörkret tills det är analyserat.
  • Räkna upp ställen manuellt genom att inspektera en dissekera Mikroskop eller använda en ELISPOT-spektrofotometer. Se representativa resultatet i figur 2.
  • 5. prövning av enskilda peptider i OLP_pool som stimulerar till Qa-1 begränsad IFN-γ utsöndringen i en OLP_pool-specifika CD8+ T Cell fodrar

    1. Fastställa de enskilda peptider som stimulera den OLP_pool-specifikt, Qa-1-restrictred IFN-γ sekretion i en OLP_pool-specifika CD8+ T cell fodrar med hjälp av ovanstående beskrivs IFN-γ ELISPOT assay (slutlig koncentration på varje enskild peptid som används för ELISOPT är analysen 10 μg/mL). Se representativa resultat i figur 3.
      Obs: En OLP-specifika, Qa-1-restircted svar definieras som ett svar som är minst tre gånger i svaret i närvaro av C1R. QA-1b -celler, men utan OLP. I MOG OLP studie, OLP68, OLP96 och OLP105 uppfyllda alla detta kriterium. Alla de tre OLPs innehåller därför potentiellt Qa-1 epitoper12 (figur 3). OLP105 gav dock konsekvent den starkaste Svaren; vi därför genomfört en detaljerad analys av OLP105 (figur 4 och figur 5)12.

    6. identifiering av den optimala Qa-1 epitop i en 15-mer OLP som stimulerar den epitop-specifika, Qa-1-begränsat svaren i en OLP_pool-specifika CD8+ T Cell fodrar

    1. Syntetisera C - och N-terminalt trunkeras peptider av en 15-mer OLP som visas i figur 4.
    2. Undersöka IFN-γ sekretion i en OLP-specifika CD8+ T cellinje genom att stimulera CD8+ T celler med var och en av de trunkerade peptiderna samt föräldrarnas 15-mer OLP i närvaro av C1R eller C1R. QA-1b -celler med hjälp av ovanstående beskrivs IFN-γ ELISPOT assay. Den slutliga koncentrationen av varje enskild peptid används för ELISPOT-analysen är 10 μg/mL. En peptid är definierad som den optimala Qa-1 epitop om peptiden: 1) konsekvent ger liknande eller starkare IFN-γ svar, jämfört med den ursprungliga 15-mer peptiden, i närvaro av C1R. QA-1b -celler; (2) är mellan 8 - 10-mer (9-mer peptid program) som är peptid längderna bundna till MHC-jag molekyler15,17. Se Representativa resultat i figur 5.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Utformningen av en OLP bibliotek som täcker hela längd av ett protein

    Början vid N-terminalen av ett protein, är varje peptid 15 aminosyror (15-mer). Därför spänner den första peptiden position 1 till positionen 15. N-terminalen av andra peptiden överlappar C-terminus av första peptiden av 11 aminosyra. Därav, andra peptiden spänner ståndpunkten 5 position 19. Design resten av peptiderna till slutet av C-terminus av proteinet (figur 1). Vi valde 15-mer biblioteket eftersom vi och andra har visat att 15-mer peptider, när det adderas till dendritiska celler (DCs) eller makrofager, kan vara effektivt+ T förädlats till epitoper för erkännande av CD8-celler14,15. Antalet OLPs i ett bibliotek beror på längden av ett protein. Dessutom, kan den senaste OLP variera från 12 till 15-mer beroende på längden av protein. Exempelvis har myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) en längd av 247 aminosyror. MOG OLP biblioteket innehåller 59 OLPs12. Representativa resultat presenteras i denna handskrift är från analysen av MOG OLP biblioteket.

    Bestämning av OLP_pool-specifika, Qa-1-begränsat svar i en OLP_pool-stimulerad CD8+ T cell fodrar

    Genererade vi en CD8+ T cell linje som var Primas av Kb-/-Db-/- DCs pulsade med MOG OLP_pool (MOG_pool) och restimulerat av pulsade MOG_pool Kb-/-Db-/- peritoneal makrofager som beskrivs i den ovannämnda protokollet (protokoll 1, 2 och 3). Att bestämma potentiella MOG_pool-specifika, Qa-1-begränsat svar i denna CD8+ T cell linje, vi granskat svaret av denna CD8+ T cell fodrar till MOG_pool i närvaro av antingen C1R eller C1R. QA-1b -celler med IFN-γ ELISPOT-analys (figur 2), (protokoll steg 4). Våra data visade att den MOG_pool-stimulerad CD8+ T cell fodrar utsöndras en låg nivå av IFN-γ i närvaro av C1R. QA-1b -celler (32 plats bildar celler eller SFCs) men inte C1R celler (2 SFCs), tyder förekomsten av CD8+ T celler som svarat på Qa-1-bindning epitoper härrör från C1R celler (C1R celler är mänskliga B lymfoblastoida celler). SFCs höjdes när MOG_pool lades till i brunnen som innehöll C1R celler (78 SFCs), tyder förekomsten av CD8+ T celler som svarat på icke-Qa-1 epitoper. SFCs ökade dramatiskt när MOG_pool lades till i brunnen som innehöll C1R. QA-1b -celler (320 SFCs), tyder förekomsten av CD8+ T celler som svarat på Qa-1-bindande peptider. Data visar också att MOG_pool innehåller Qa-1-bindande epitope(s).

    Bestämning av enskilda peptider i OLP_pool som bidrar till Qa-1-begränsat IFN-γ utsöndringen i en OLP_pool-reaktivt CD8+ T cell fodrar

    Att bestämma peptiderna i den OLP_pool som stimulerade Qa-1-begränsat IFN-γ utsöndringen i en MOG_pool-reaktivt CD8+ T cell linje, vi stimuleras de MOG_pool-reaktivt CD8+ T celler med enskilda 59 OLPs i närvaro av antingen C1R eller C1R. QA-1b -celler (figur 3) (protokollet steg 5). Våra data visade att några SFCs observerades i brunnarna som innehöll C1R celler och i OLPs. Däremot ökade SFCs i alla brunnar som innehöll C1R. QA-1b -celler och i OLPs. Från figur 2, vi lärde oss att CD8+ T celler i närvaro av C1R. QA-1b ensam bildade också SFCs. De ökade SFCs i de flesta brunnar kan därför på grund av icke-specifika stimulering till följd av presentationen av Qa-1 epitoper härrör från intracellulära proteiner i C1R cellerna av Qa-1 molekyler. Dock OLPs i 3 inramade brunnarna i figur 3 c (B8, D12 och E9), som matchade 3 markerade OLPs i figur 3A (OLP68, OLP96 och OLP105), träffade kriteriet för att definiera en OLP-specifika, Qa-1-begränsat IFN-γ-svar som beskrivs i protokollet steg 5.112. Data tyder på att de 3 OLPs innehåller Qa-1 epitope(s). Eftersom OLP105 produceras genomgående högsta svaret, utfört vi detaljerad analys av OLP10512.

    Design av en stympad peptid-bibliotek för en 15-mer OLP

    En 15-mer OLP, som har fastställts att stimulera Qa-1-begränsat IFN-γ sekretion i den OLP_pool-reaktivt CD8+ T cell fodrar, behöver analyseras för den optimala epitop använder en stympad peptid-biblioteket. Sådan trunkerade peptid bibliotek är designad av successivt trunkera den 15-mer OLP av 1 aminosyra på dess N - och C-termini (figur 4). Liknar andra MHC klass I molekyler, Qa-1 molekyler binder främst till 8 - 10-mer peptider. Därför rekommenderar vi att den kortaste trunkerade peptiden är 6-mer i längden.

    Identifiering av den optimala Qa-1 epitop i en 15-mer OLP som stimulerar Qa-1-begränsat IFN-γ sekretion i en OLP_pool-reaktivt CD8+ T cell fodrar

    Ovan N - och C-obotligt trunkeras Peptiderna är testade för styrkan i stimulerande IFN-γ sekretion i en CD8+ T cell fodrar specifikt för OLP_pool eller den 15-mer OLP använder den IFN-γ ELISPOT beskrivs ovan. I studien av Qa-1 epitoper i MOG12, genererade vi en CD8+ T cell linje som var specifika för det MOG OLP105 (figur 5A). Ytterligare analys visade att den N-terminalt trunkerade 9-mer peptid uppfyllde de två kriterierna för en optimal epitop som beskrivs i protokollet steg 6,2 (figur 5B). Vi drog därför slutsatsen att den N-terminalt förkortas 9-mer peptid var den optimala Qa-1 epitop.

    Figure 1
    Figur 1: Design av en OLP bibliotek som täcker hela längd av ett protein. Början vid N-terminalen, identifierades peptider av 15 aminosyra (15-mer) längd.N-terminalen av varje peptid, utom den första peptiden, överlappas med C-terminus av tidigare peptiden av 11 aminosyror.

    Figure 2
    Figur 2: MOG_pool-stimulerad CD8+ T celler var delvis MOG_pool specifika och Qa-1-begränsad12. In vitro CD8+ T celler stimuleras av det MOG OLP_pool (MOG_pool) undersöktes för svar på MOG_pool i närvaro av antingen C1R eller C1R. QA-1b -celler som antigen presenterande celler med en IFN-γ ELISPOT-analys. Representant ELISPOT bilder visas. Numrerar av spot-bilda celler (SFCs) visas i övre vänstra hörnen av varje brunn. CD8+ T celler: 50.000 celler per brunn. C1r eller C1R. QA-1b -celler: 200 000 celler per brunn.

    Figure 3
    Figur 3: analys av de OLPs i MOG_pool som var ansvariga för Qa-1 begränsat svar. (A) Layout av V-botten 96 brunnar plattan som innehöll den 10 mg/mL enskilda MOG OLPs. Siffror i brunnarna representerade OLP IDs. De markerade 3 brunnarna innehöll de OLPs som uppfyllde kriteriet för en OLP-specifika, Qa-1-begränsat IFN-γ-svar som beskrivs i protokollet steg 5.112. (B) representant SFCs i varje brunn som innehöll en OLP (slutlig koncentration = 4,2 μg/mL, OLP ID matchade som i ”A”), den MOG_pool-reaktivt CD8+ T celler (50.000 celler per brunn) och C1R celler (200 000 celler per brunn). (C) representant SFCs i varje brunn som innehöll en OLP (slutlig koncentration = 4,2 μg/mL, OLP ID matchade som i ”A”), den MOG_pool-reaktivt CD8+ T celler (50.000 celler per brunn) och C1R. QA-1b -celler (200 000 celler per brunn). 3 inramade brunnarna innehöll de OLPs som uppfyllde kriteriet för en OLP-specifik, Qa-1-begränsat IFN-γ svar12. Figuren har anpassats från referens12Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: Design av trunkerade peptider av en 15-mer peptid. En 15-mer peptid trunkerades successivt på dess N - och C-termini av 1 aminosyra 6-mer. Den 15-mer och dess trunkerade peptider var sedan syntetiseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5: analys av den optimala Qa-1 epitop i OLP105. (A) en OLP105-stimulerad CD8+ T cell fodrar undersöktes för svar till OLP68, OLP96 och OLP105 i närvaro av C1R eller C1R. QA-1b -celler med en IFN-γ ELISPOT-analys. Representant IFN-γ SFCs (nummer på de övre vänstra hörnen) visas. (B) de OLP105-specifika CD8+ T cell fodrar, som visas i (A), undersöktes för svar på enskilda N - och C-obotligt trunkeras peptider, som visas i figur 4, i närvaro av C1R. QA-1b -celler med IFN-γ ELISPOT-analys. OLP105: en 15-mer OLP. N6-14: Stympade N-terminalt OLP105 peptider. C6-14: Stympade C-obotligt OLP105 peptider. CD8+ T celler: 50.000 celler per brunn. C1R. QA-1b -celler: 200 000 celler per brunn. Antalet till det övre vänstra hörn var SFCs per 50.000 CD8+ T-celler. Röd rektangel markerade den brunn som uppfyllde kriterierna för att definiera de optimala Qa-1 epitop i en OLP som beskrivs i protokollet steg 6,2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Här har vi beskrivit ett protokoll för att analysera Qa-1 epitoper i ett protein. I förhållande till detta protokoll rapporterades också flera andra strategier tidigare. Första, allogen CD8+ T cellinjer och kloner användes för identifiering av Qdm1. För det andra, en förmodad Qa-1-bindning motiv från analysen av Qdm användes för identifiering av den HSP60p216-224 och TCRBV8.1 epitop9,18. Tredje, enskilda överlappande peptider från ett protein användes att vaccinera djur. Därefter CD8+ T celler isolerade från immuniserade djur användes för att identifiera den TCRBV8.2 peptid p42-50 vilket bekräftades därefter för bindning till Qa-16,10,19. Fjärde, funktionella CD8+ T cell linjer i kombination med cDNA display bibliotek användes för identifiering av FL9 Qa-1 epitop4.

    Med hänvisning till den tidigare tekniken, användningen av allogena CD8+ T cell linjer och kloner maj inte vara lämpliga för att analysera Qa-1 epitoper som presenteras under fysiologiska immunsvar. Dessutom tyder ackumulerar data på att det tidigare beskrivna bindande motivet endast delvis kan utgöra peptid-bindande kapacitet Qa-1 molekyler. Därför, exakta Qa-1-bindning motivet är fortfarande inte känt4. Dessutom är immunisering med enskilda peptid för identifiering av Qa-1 epitoper arbetskrävande. Slutligen, cDNA display Biblioteksstrategi innebär byggandet av många vektorer som bär olika peptid längder för cell transfection. Däremot OLP bibliotek strategin beskrivs här är enkel, och de mappade Peptiderna är kända för att stimulera Qa-1-begränsat CD8+ T celler. Vår strategi har därför en unik fördel.

    Den strategi som beskrivs här används OLP_pool-specifika CD8+ T celler som genereras av in vitro- grundning och restimulering. En alternativ källa av CD8+ T celler kan vara från dränerande lymfkörtlar en kb-/-Db-/- mus som är immuniserats med källa protein20. Sådan immun CD8+ T celler kan sedan undersökas för IFN-γ Svaren till OLPs och trunkerade peptider för identifiering av Qa-1 epitoper. Teoretiskt, den i vivo immun CD8+ T celler är närmare det fysiologiska tillståndet än den in vitro- genererade CD8+ T celler. Men vi fann att svaret från immun CD8+ T celler direkt renad från immuniserade mössen var svag och ofta krävs in vitro- restimuleringarna för en tillfredsställande peptid screening resultat. Detta protokoll är dessutom designad för framtida översättning till mänskliga studie av HLA-E epitoper vari i vivo immunisering inte är praktiskt.

    Tekniskt sett är den kritiska delen av detta protokoll är generation av CD8+ T cell linjer som är specifika för OLP_pool eller en enskild OLP. Sedan Qa-1/peptid komplex är instabila jämfört klassiskt MHC-jag/peptid komplex21, efter antigen presenterande celler är pulsade med OLPs eller en peptid, bör pulsad cellerna inte tvättas i stor utsträckning. Vi har funnit att peptid pulsade celler, om tvättade i stor utsträckning, förlora eller avsevärt minska förmågan att stimulera CD8+ T celler. Därför rekommenderar vi tvätta den peptid pulsade antigen presenterande celler en gång omedelbart innan de är samtidig odlade med CD8+ T celler.

    Också, på grund av instabiliteten i Qa-1/peptid komplex, vi rekommenderar användning av ett serumfritt medium för den peptid pulserande och stimulering av CD8+ T celler. Dessutom vi rutinmässigt lägga 50 U/mL av IL-7 under CD8+ T cellodling samt under den IFN-γ ELISPOT assay. Syftet med den IL-7 är att upprätthålla livsduglighet och funktion av CD8+ T celler. IL-7 själv inte stimulera CD8+ T celler för att producera IFN-γ.

    Liknar alla strategier, Qa-1 epitoper mappas av denna strategi också undersökas ytterligare för biologisk betydelse. Exempelvis är en viktig fråga huruvida den mappade epitop fysiologiskt kan presenteras. För att lösa denna fråga, kan DCs vara sensorik med en lentiviral vektor som uttrycker proteinet epitop källa (t.ex. MOG i the MOG OLP studie). Därefter svar av den epitop-specifika CD8+ T celler till transduced DCs undersöks. Ett positivt svar antyder att epitop fysiologiskt kan bearbetas och presenteras av DCs. I tillägg, funktionella konsekvenser till följd av epitop erkännande av CD8+ T celler bör undersökas vidare. I detta avseende har analyserna av Qdm och FL9 Qa-1 epitoper ledde till slutsatsen att Qa-1 molekyler är viktiga för immun övervakning1,4. Dessutom, studier av HSP60p216, TCRBV8.1 peptid, och den p42-50 har lett till slutsatsen att Qa-1-begränsat CD8+ T celler reglerar immunsvaret genom målgruppsinriktning patogena CD4+ T cells 6,7 ,9,19. Vidare studier av MOG196 har för första gången avslöjade att Qa-1-begränsat CD8+ T celler kunde reglera immunsvaret genom att direkt rikta en vävnad för att förhindra det från att skadas av potentiellt patogena autoimmuna celler12 . Slutligen, funktionell analys av en epitop-specifik, Qa-1-begränsat CD8+ T cell kan biträdas av tetramer. Sådan tetramer kan produceras i NIH tetramer core facility (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) eller ett företag. För att begära generationen av en tetramer, kan en skicka funktionella data som stöder bindningen av den nyligen mappad optimal Qa-1 epitop till Qa-1 protein för deras godkännande för generering av en Qa-1 tetramer.

    Sammanfattningsvis, tidigare studier har visat att Qa-1-begränsat CD8+ T celler har en viktig roll i regleringen av lokala immunsvaret12. I detta avseende kan vävnad skador orsakas av ett immunsvar som direkt mål vävnaden. Säkerheter skadestånd kan dessutom orsakas av ett immunsvar som mål en invaderande patogen. Därför förstå rollen som Qa-1-begränsat CD8+ T celler i dessa två olika vävnad skador är viktigt för deras kliniska tillämpningar.För att uppnå detta mål krävs en grundlig analys av Qa-1 epitoper i en self-vävnad eller en invaderande patogener. Detta protokoll kommer att vara lämpliga för dessa analyser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar någon intressekonflikt.

    Acknowledgements

    Vi tackar Penelope Garcia för hennes tekniskt bistånd och beredning av detta manuskript. Detta arbete stöds av en forskning Innovation Grant (RIG) från Institutionen för medicin vid Loma Linda University (681205-2967) och en pilot bidrag från nationell multipelskleros samfund (PP1685) till XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79, (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188, (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207, (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13, (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5, (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177, (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123, (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113, (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178, (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72, (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8, (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350, (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360, (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3, (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182, (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172, (3), 1661-1669 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics