Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detektion av neutraliseringskänsliga epitoper i antigener som visas på virusliknande partikelbaserade vacciner (VLP) med hjälp av en capture-analys
Chapters
Summary February 10th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka neutralisering epitoper på antigen-displaying virus-liknande partiklar (VLPs). Immunoprecipitation av humant immunbristvirus (HIV)-härledda VLPs utförs med hjälp av kuvert glykoproteiner-specifika monoklonala antikroppar kopplade till protein G-konjugerade magnetiska pärlor. Fångade VLPs utsätts därefter för SDS-PAGE och western blot-analys med viralt kärnprotein Gag-specifika antikroppar.
Transcript
I mitt labb utvecklar vi produktionssystem för virusvektorer och virusliknande partiklar, eller VLP-baserade vacciner. VLP-insamlingsanalysen möjliggör mycket känslig detektion av målantigener som visas på VLP: er. I denna analys använder vi brett neutraliserande antikroppar riktade mot neutralisering epitoper för att bevisa exponeringen av dessa epitoper på VLP ytan.
Detta är en viktig kvalitetsbedömning för vaccinkandidater, eftersom endast VLP som uppvisar neutraliserande känsliga epitoper kommer att kunna framkalla ett neutraliserande antikroppssvar i vacciner. Börja med att hänga upp magnetpärlorna genom att antingen pipettera upp och ner, eller blanda på en rotator vid 50 RPM i minst fem minuter. Förbered under tiden antikroppslösningen som innehåller bNAB.
Använd 10 mikrogram av varje bNAB i 200 mikroliter antikroppsbindning och tvättbuffert per reaktion. För varje reaktion överför du 50 mikroliter av den magnetiska pärlalösningen till ett 1,5-milliliter reaktionsrör och placera sedan rören på det magnetiska separationsstället. Vänta tills pärlorna samlas vid rörbollen för att säkerställa att alla pärlor samlas in och ta sedan bort supernatanten.
Ta bort magneten och suspendera pärlorna i 200 mikroliter av den tidigare beredda bNAB-lösningen. Inkubera i 30 minuter till tre timmar medan du blandar på en rotator vid 50 VARV/min vid rumstemperatur. Efter inkubationen placerar du reaktionsrören i det magnetiska separationsstället, väntar och tar bort supernatanten.
Ta bort rören från magneten och tvätta pärlorna genom att suspendera i 200 mikroliter av antikroppsbindning och tvättbuffert. Upprepa tvätten med antikroppsbindning och tvättbuffert och ta bort så mycket tvättbuffert som möjligt när den är klar. Lägg till exemplen i de pärlbundna bNAB: erna.
Om den tillagda provvolymen är under en milliliter, tillsätt PBS för att justera provvolymen till en milliliter och suspendera sedan pärlorna igen genom att försiktigt pipettera. Inkubera proverna och pärlorna i 2,5 timmar på en rotator vid rumstemperatur, se till att pärlorna förblir i suspension och lösningen blandas noggrant under inkubation. Placera rören på magneten och ta bort supernatanten och tvätta sedan de magnetiska pärlorna genom att suspendera dem i 200 mikroliter tvättbuffert.
Häng upp pärlorna i 100 mikroliter tvättbuffert och överför suspensionen till ett rent, värmebeständigt reaktionsrör. Placera röret på det magnetiska separationsstället och ta bort supernatanten helt. För att förbereda denaturerade STS-PAGE-prover, suspendera pärlorna i 20 till 80 mikroliter Laemmli-buffert och inkubera vid 95 grader Celsius i fem minuter.
Fortsätt direkt med SDS-PAGE och placera rören på ett magnetiskt rack för att separera pärlorna från lösningen. Alternativt kan du lagra proverna på minus 20 grader Celsius. Ett representativt resultat av VLPs först fångas från cell-free cell kultur supernatant och VLP pellets med bNABs, och därefter utsätts för västerländsk blot analys för att upptäcka virala kärnproteiner, visas här.
Pärlor som används för fångst analysen var belagda med tre olika bNABs riktade mot neutralisering epitoper av kuvert glykoproteiner och isotyp antikroppar som fungerar som negativa kontroller. Med hjälp av isotopantikroppsbelagda pärlor kunde inga Gag-proteiner påvisas i VLP-prover som innehåller skalliga VLPs, det vill säga Env-negativa VLPs, eller Env-displaying VLPs, vilket visar att den ospecificerade bindningen av VLPs till pärlor belagda med mänskliga antikroppar inte medlade VLP-fångst. Skalliga VLPs var inte heller bundna av bNABs-belagda pärlor, och följaktligen, inga Gag proteiner kunde upptäckas i den västra blot analysen.
Däremot fångades alla tre bNAB VLPs som visar Env-proteiner, därför upptäcktes Gag-proteiner lätt, vilket visar förekomsten av neutralisering epitoper i Env-glykoproteiner som visas på VLPs. Avgörande för framgången för analysen: en grundlig blandning av VLPs med antikropp-belagda pärlor. Detta uppnås bäst med hjälp av volymer större än 500 mikroliter under rotation.
Alternativt kan fångade VLPs eluted under icke-reducerande förhållanden. Detta möjliggör analys av VLPs som använder immuno-elektronmikroskopi, eller undersökning av de visade antigenerna med hjälp av native PAGE.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
