携帯電話のアプリケーションのコア-シェル希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶の合成

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Summary

コア-シェル希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶 (ため) の合成と近赤外線 (NIR) 光照射時にチャネル蛋白質の規則のための携帯電話アプリケーションのプロトコルが表示されます。

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Ai, X., Lyu, L., Mu, J., Hu, M., Wang, Z., Xing, B. Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications. J. Vis. Exp. (129), e56416, doi:10.3791/56416 (2017).

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Abstract

希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶 (ため) は近赤外線 (NIR) ライトの吸収を可能にすると、その後にそれを変換することが有望な制御可能な光学特性に基づいて近年注目を集めています。紫外線から可視、近赤外域までの領域の広い範囲にわたって排出を多重化します。この記事は、ランタノイドを組み込む深部組織不可解近赤外励起 (808 を効率的に変換するためのナノ結晶コア-シェルのための高温共沈合成実験手順の詳細を示しますnm) 480 で強い青色発光に nm。生体適合性ポリマー (ポリアクリル酸、PAA) による表面修飾を制御することによってとして準備のため緩衝溶液の偉大な容解性を取得します。親水性ナノ結晶はさらに細胞膜のローカリゼーションのための特異的リガンド (ジベンジル cyclooctyne、DBCO) と官能基化します。近赤外光に (808 nm) 照射、アップ コンバートされる青い発光効果的に細胞膜に光ゲート チャネル蛋白質をアクティブにし、具体的には細胞質に (例えばCa2 +) は陽イオンの流入を調節します。このプロトコルは、コア-シェル希土類をドープしたため、さらに携帯電話用生体適合性表面改質の合成の実行可能な方法を提供します。

Introduction

希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶 (ため) 近年、従来の有機色素および顕著な化学、光学的特性に基づく主に、バイオメディカル分野で量子ドットへの代わりとして広く使用されています。優れた生体適合性、耐退色、および狭帯域発光1,2,3を含みます。もっと重要なは、彼らは優れた組織浸透深さは生体内で紫外、可視からの排出量の広い範囲に近赤外線 (NIR) 励起と多光子による近赤外領域を変換する有望な nanotransducer として使用できます。アップコン バージョン プロセス4,5。これらのユニークな特性を作る生物センシング、医用イメージング、疾患テラノスティクス市場6,7,8の特に有望なベクトルとして希土類元素をドープしたため。

ための一般的なコンポーネントは主に増感剤 (例えばYb3 +Nd3 +) と (例えばTm3 +Er3 +, Ho 活性化を含む絶縁ホスト マトリックスにドープした希土類イオンに基づいてください。3 +)結晶内均一9。ナノ結晶から異なる発光は、はしごのような整理されたエネルギー レベル10によるランタノイド ドーパントの 4f軌道内でローカライズされた電子転移に起因します。したがって、多元系希土類化合物の合成のための形態とサイズを正確に制御する重要です。右、いくつか有望な手法がよく確立されて熱分解高温共沈、水熱合成、ゾル-ゲル法、11を含む希土類元素添加のための準備のため,12,13 、これらの方法の間で高温共沈法は均一な形状と目的の高品質結晶を準備する厳密に制御できるため合成の最も人気のある、便利な戦略の一つと比較的短い反応時間と低コスト14のサイズ分布。ただし、この法により合成されたほとんどのナノ構造は主にオレイン酸とオレイルアミン、一般に水溶液中の疎水性リガンド溶解度の限られているのため、さらにバイオ応用を妨げるなどの疎水性リガンドと上限します。15します。 したがって、それは生物学的応用のin vitroin vivoでの生体適合性のための準備に適した表面改質技術を実行する必要は。

ここで、高温共沈法とのため表面の生体適合性高分子の高機能化を実現可能な改質技術を通じてコア-シェルのためのナノ構造の合成の詳細な実験手順を提案します。さらに携帯電話アプリケーション。このため nanoplatform に組み込む強い青色発光を取得するナノ結晶 3 つの希土類金属イオン (Yb3 +Nd3 +、および Tm3 +) (〜 480 nm) 808 で近赤外光励起による大きい浸透深さのある nm で生体組織。それはよく知られているその Nd3 +-ドープしたためこのスペクトル ウィンドウに最小化された水の吸収と過熱の効果を表示 (808 nm) 従来のために 980 nm 照射16,17,と比較して18. さらに、生物学的システムで、ためを利用するための表面の疎水性リガンド (オレイン酸) がまず削除酸溶液19sonication によって。その後、リガンドの存在しないためはさらに水溶液20偉大な溶解度を取得する生体適合性ポリマー (ポリアクリル酸、PAA) で変更されます。さらに携帯電話アプリケーションでの概念の証拠として、親水性のため、N3の特定のローカリゼーションのための分子配位子 (ジベンジル cyclooctyne、DBCO) さらに修飾-細胞膜をタグ付き。近赤外光に (808 nm) 照射、480 でアップ コンバートされる青い発光 nm 効果的に光ゲート チャネル蛋白質、channelrhodopsins 2 (ChR2) をアクティブに、細胞の表面にし従って (例えばCa2 +イオン) は陽イオンの流入を容易にします。生きている細胞の膜。

このビデオのプロトコルは、希土類をドープしたため合成、生体適合性表面改質と細胞のためのバイオ応用の実行可能な方法を提供します。合成技術やナノ結晶成長で使用される化学試薬の違いは細胞実験で使用される最終のためのナノ構造のサイズ分布、形態、およびアップコン バージョン発光 (UCL) のスペクトルに影響を与えます。この詳細なビデオ プロトコル高温共沈法のための再現性を改善し、さらなるため生体適合性表面改質のための最も一般的な間違いを避けるためにこの分野の新しい研究者を支援する用意があります。携帯電話のアプリケーション。

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Protocol

警告: 使用前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。工学的制御 (ドラフト) と (例えば、安全ゴーグル、手袋、白衣、保護具の使用を含む高温 (~ 290 ° C) のための合成を実行するときにすべての適切な安全対策を使用してください。完全な長さのズボン、および閉鎖つま先の靴).

1 です NaYF 合成 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) コア-シェル結晶

  1. NaYF 合成 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) コア ナノ構造
    1. 。日時 (CH 3 CO 2) 3 NaOH、NH 4 F メタノール貯蔵液の準備
      注: (再) ランタノイド希土類にはネオジム (Nd)、Thulium (Tm)、イッテルビウム (Yb) イットリウム (Y) が含まれます。
      1. 溶解 500 mg 酢酸イットリウム (iii) 水和物のメタノール 5 mL (100 mg/mL) 250 mg イッテルビウム (III) 酢酸 5 mL メタノール (50 mg/mL) 10 mg をメタノール 1 mL (10 mg/mL)、ツリウム (III) 酢酸水和物水和物と 10 mg 1 mL メータ酢酸ネオジム (III) 水和物します。2 分の超音波洗浄でガラスの瓶に nol (10 mg/mL)
      2. NaOH 原液 (20 mg/mL) を準備する超音波洗浄付け 20 mL メタノール 50 mL 遠心管中 400 mg 水酸化ナトリウムを結合します
      3. を組み合わせて NH 4 F 原液 (20 mg/mL) を準備する超音波洗浄付け 30 mL メタノール 600 mg NH 4 F 50 mL 遠心管中です
        。 注: 配置希土類錯体、NaOH、NH の原液 4 F ガラス瓶でパラフィルムでシール、~ 4 ° c 必要になるまで冷蔵庫に保管します。準備されたメタノール溶液は 2 週間に一度を置き換えられます
    2. NaYF 準備 4: Yb/Tm/Nd コア ナノ構造
      1. 50 mL 三首フラスコにオレイン酸と 1 octadecene 7 mL 3 mL をピペットします
      2. Y (CH 3 CO 2) の 3 ストック溶液、Yb (CH 3 CO 2) の 3 在庫ソリューション、Tm (CH 3 CO 2) 3 株式の 83.6 μ L の 0.608 mL 組み合わせる 1.089 mL ソリューションフラスコに Nd (CH 3 CO 2) 3 原液の 128.5 μ L.
      3. は、フラスコ内で温度計 (0 - 360 ° C 範囲) を合わせて、その先端のソリューションに触れます。フェニルメチル シリコン オイルとガラス容器のフラスコを配置します
      4. の熱メタノールを蒸発させホット プレートで 100 ° C にソリューション。残留メタノールを削除し、攪拌しながら 2 〜 3 分の真空下で反応混合物を維持するデュアル真空/ガスマニホールド、シュレンク管にフラスコを接続します
      5. は 150 ° C に温度を上げるし、合成中に攪拌回転数 700 rpm 60 分維持のためこの温度を維持します
        。 注: 中等度ソリューションを水しぶきを避けるから攪拌スピードを設定します
      6. ホット プレートを停止し、フラスコ ソリューションを許可する室温で冷静さを保つダウンゆっくりと
        。 注: プロトコルがここで一時停止にすることができます
      7. 結合 2 mL の NaOH メタノール原液と NH 4 F メタノール 15 mL 遠心管に原液の 2.965 mL。そのキャップとチューブを締め、5 の強力なボルテックスによってソリューションをミックス s.
      8. 追加ガラス ピペット 5 分以上でフラスコにゆっくりと NaOH NH 4 F 混合物
      9. から 50 ° C の混合物の温度を上げるし、30 分のこの温度を保つ
        注意: 高温、結晶の核形成と成長を促進するために 50 ° c 以上温度を設定します
      10. 残留メタノールを削除し、2-3 分の真空下で反応混合物を維持するデュアル真空/ガスマニホールドとメタノールを蒸発させ、シュレンク管にフラスコを接続する (~ 100 ° C) の温度を増加
      11. 窒素でフラスコに合わせて活栓の位置を切り替えます
      12. 増加温度 290 ° C ~ 5 ° C/分の昇温速度を保つ 1.5 h. 290 ° C で反応混合物
      13. ホット プレートを停止し、攪拌しながら室温でゆっくりとクールダウンして反応混合物を許可するようにフラスコを削除します
        。 注意: 高温ホット プレートの注意してください (> 400 ° C) 皮膚への接触時に重度の火傷を避けるためにします
      14. は、50 mL の遠心管にフラスコ内で混合物を転送します。エタノール 30 mL でフラスコを洗い、遠心管に溶液を移します
      15. 室温で 8 分間 4,000 × g で製品を遠心し、上清を捨てる
      16. 追加の 10 mL
      17. は、チューブにエタノール 30 mL を追加します。スピン ・ ダウンで 8 分間 4,000 × g 製品と上澄みを廃棄し
      18. は、5 mL のヘキサンで遠心管の底に固体の製品を再分散します。次のステップのための ~ 4 ° C で冷蔵庫でソリューションを保存します
        。 注: コア-シェルのためのアップコン バージョン発光ソリューション 808 nm レーザー (2 W) を照射することによってテストされます
  2. NaYF 準備 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) コア-シェル結晶
    1. 50 mL 三首フラスコにオレイン酸と 1 octadecene 7 mL 3 mL を組み合わせます。フラスコに 1.082 mL Y (CH 3 CO 2) 3 原液と Nd (CH 3 CO 2) 3 原液 2.87 mL を追加します
    2. フラスコ撹拌しながら得られたコア ナノ構造 (1.1.2.18 のステップから 5 mL のヘキサンで 80 mg) を追加します
    3. は、フラスコ内で温度計 (0 - 360 ° C 範囲) を合わせて、その先端の混合物に触れます。フェニルメチル シリコン オイルとガラス容器のフラスコを配置します
    4. の熱メタノールとヘキサンを蒸発させホット プレートの上に 100 ° C の混合物。残留溶媒を除去し、攪拌しながら 2 〜 3 分のための真空の下で反応混合物を維持するデュアル真空/ガスマニホールド、シュレンク管にフラスコを接続します
    5. 温度を 150 ° C に増加して 60 分維持のため攪拌速度合成の 700 rpm で
      。 注: 中等度ソリューションを水しぶきを避けるから攪拌スピードを設定します
    6. ホット プレートを停止し、室温でゆっくりと冷却するソリューションを許可するようにフラスコを削除します
      。 注: プロトコルがここで一時停止にすることができます
    7. 水酸化ナトリウム ・ メタノールのピペット 2 mL 原液と NH 4 F メタノール 15 mL 遠心管に原液の 2.965 mL。そのキャップとチューブを締め、5 の強力なボルテックスによってソリューションをミックス s.
    8. ガラス ピペット 5 分かけてゆっくりによってフラスコに混合物を追加
    9. から 50 ° C の混合物の温度を上げるし、30 分は 50 ° C に保つ
      注: 高温、結晶の核形成と成長を促進するため 50 ° C よりも高い温度に設定します
    10. 2-3 分の真空下で反応混合物を維持する、残留メタノールを削除するデュアル真空/ガスマニホールドとメタノールを蒸発させ、シュレンク管にフラスコを接続する (~ 100 ° C) の温度を増加
    11. 窒素でフラスコに合わせて活栓の位置を切り替えます
    12. 290 ° C に温度の増加~ 5 ° C/分の昇温速度で 1.5 h. 290 ° C で反応混合物を保つ
    13. ホット プレートを停止し、攪拌しながら室温でゆっくりとクールダウンに反応混合物を許可するようにフラスコを削除します
      。 注意: 高温ホット プレートの注意してください (> 400 ° C) 皮膚への接触時に重度の火傷を避けるためにします
    14. は、50 mL の遠心管にフラスコ内で混合物を転送します。エタノール 30 mL でフラスコを洗い、遠心管に溶液を移します
    15. 室温で 8 分間 4,000 × g で製品を遠心し、上清を捨てる
    16. 追加の 10 mL
    17. は、チューブにエタノール 30 mL を追加します。スピン ・ ダウンで 8 分間 4,000 × g 製品と上澄みを廃棄し
    18. は、5 mL のヘキサンで遠心管の底に固体の製品を再分散します。~ 4 ° c 必要になるまで冷蔵庫でソリューションを保存します
      。 注: コア-シェルのためのアップコン バージョン発光ソリューション 808 nm レーザー (2 W) を照射することによってテストされます

2。生体適合性のためのナノ構造の合成

    1. 準備としてオレイン酸に覆われたため (ステップ 1.2.18) のソリューション 50 mL 遠心管を組み合わせて 30 mL のエタノールの リガンドの存在しないためナノ粒子の作製。室温で 8 分間 4,000 × g で混合物を遠心し、上澄みを廃棄します
    2. 10 mL 酸水溶液を組み合わせる (pH = 4) 50 mL 遠心管中の沈殿物を塩酸 (0.1 M) によって調整し、30 分 (60 kHz、240 W) sonication によって沈殿を溶解
    3. ガラスのソリューションと積極的なバイアル転送攪拌 2 h.
    4. オレイン酸を削除を 3 回繰り返す 30 mL ジエチル エーテルを用いた水溶液を抽出します
    5. 穏やかな揺れで結合されたエーテル層に 10 mL の水を追加します
    6. 水性収集 (20 mL) を一緒に相し、5 のボルテックスと 20 mL のアセトンを追加 s.
    7. スピン 35,000 × g 10 分で製品と、上清を捨てます。2 mL の水に沈殿物を溶解します
  1. ポリマーの作製変更ため (PAA のため)
    1. ポリアクリル酸 200 mg を組み合わせる (PAA、Mw = 1,800) 20 分超音波 (60 kHz、240 W) で 20 mL の水と PAA のソリューションに前述のリガンドの存在しないためを追加激しく撹拌し
    2. 30 分攪拌しながら室温で 24 h の混合物を維持するため超音波 (60 kHz、240 W) と水酸化ナトリウム溶液 (1 M) による 7.4 に pH 値を調整します
    3. 10 分 5 分と 35,000 × g で 10 分間で再び遠心分離は、この手順を繰り返します 3 回の超音波 (60 kHz、240 W) で 10 mL の水に本製品を中断再 35,000 × g で遠心分離で沈殿を集める
    4. 5 分 ~ 4 ° c 必要になるまで冷蔵庫でソリューションを格納するため超音波 (60 kHz、240 W) による水 8 mL で製品を再分散します
  2. 機能 DBCO のためナノ粒子の調製
    1. 35,000 × g で遠心分離によっての準備として PAA@UCNs (1 mg) をスピン 10 分が 1 mL に再沈殿を中断 DMF 超音波 (60 kHz、240 W) 1 分で乾燥再びで遠心 35,000 × g で 10 分間この手順を 2 回繰り返します
    2. 溶解沈殿物の 200 μ L では、ガラス瓶の DMF を乾燥させます。追加 HOBT (12.2 mg)、EDC (14 mg)、DBCO-NH 2 (5 mg)、DIPEA (16 μ L) 24 時間磁気攪拌しながら瓶で
    3. 35,000 × g で 10 分間で再び遠心分離は、この手順を繰り返します 3 回 10 分上澄みを除去し、1 mL の DMSO に沈殿物を再停止し、35,000 × g で遠心分離によって製品を収集します
    4. 0.2 mL の DMSO の製品や店舗の冷凍庫に分散 ~ 使用前に 4 ° C.

3。DBCO バイオ-細胞内の膜チャネルの規制でため

ダルベッコ
  1. 文化、HEK293 細胞 ' s 修正イーグル ' s 媒体 (DMEM) 10 %fbs、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン 100 μ g/mL と12 ウェル プレートで 1 mL DMEM/ウェルの 37 ° c. 種子 1 × 10 5 セルで 5% CO 2 と加湿のインキュベーターで 24 h. のためのインキュベーターで保管して
  2. 結合プラスミッド (pCAGGS-ChR2-金星、1 μ g) イーグルの P3000 トランスフェクション試薬 (2 μ L) と ' s 最低不可欠なメディア (MEM) (100 μ L) で遠心管 A と MEM のトランスフェクション試薬 (1.5 μ L) を追加 (100 μ L) B. 管内
  3. ソリューション室温で 10 分間のチューブを A と B の混合物をインキュベートします
  4. は、400 μ L MEM で A と B のチューブでソリューションを組み合わせます。1 mL でセルを洗浄して無血清 DMEM 2 回
  5. 12 ウェル プレートの各ウェルに 600 μ L トランスフェクション混合物を追加し、孵化 4 h. 削除の 37 ° C の定温器で細胞培地 1 mL DMEM で二回洗う
  6. 井戸の 1 mL 1 μ L Ac 4 マンナズ (DMSO 50 mM) を含む DMEM を追加し、2 日間孵卵器おいて
  7. は、メディアを削除し、1 mL の PBS で 1 回洗浄します。12 ウェル プレートの各ウェルに 1 mL のトリプシン-EDTA (0.25%) のソリューションを追加し、セル (〜 2 分) をデタッチするまで、37 ° C で孵化させなさい。再 1 × 10 5 1 mL DMEM に細胞/ウェルで共焦点料理で一晩培養します
  8. メディアを削除し、1 mL を追加 2 μ L で新鮮な DMEM DBCO のため (50 mg/mL) を 37 ° C で 2 時間料理で共焦点イメージング DMEM で 2 回細胞を洗浄し、1 μ L ロード N 3 (10 mM) のための 30 分を追加
  9. 細胞内カルシウム分析、1 μ L の混合物で細胞をインキュベート ロード 3 AM (10 mM)、10 μ L プロベネシド (250 mM)、および 10 μ L 読み込みバッファー (プルロニック界面活性剤 polyols,0.1% w/v)) 暗闇の中で 30 分間 1 mL DMEM 培地で
  10. 無血清 DMEM に細胞を洗浄し、20 分 (5 分照射後 5 分休憩) 0.8 W/cm 2 の用量で 808 nm の近赤外光を照射します
  11. 共焦点の顕微鏡イメージングの結果の記録 (レーザー ソース: 561 nm レーザー; 検出範囲: 610/75 nm; レンズ: 100 x 1.4 NA オイル、露出時間: 100 ms)。各ウェルにトリプシン-EDTA (0.25%) の解決の 1 mL を追加し、セルをデタッチ (~ 2 分) まで、37 ° C で孵化させなさい。フローサイトメトリー (FCM) 解析のための 1 mL PBS のセルを再停止 (Ex: 561 nm、Em: 582/15 nm).

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Representative Results

コア-シェル希土類をドープしたための回路合成プロセスは、図 1図 2のとおりです。透過型電子顕微鏡 (TEM) とコア ・ コア-シェルのためのナノ構造の高分解能透過電子顕微鏡 (HRTEM) 画像をそれぞれ採取 (図 1)。リガンドの存在しないため、酸溶液のための表面で疎水性のオレイン酸を除去することによって準備、親水性ポリマー (PAA) に変更します。そのアミド縮合反応によって DBCO NH2 COOH 頂いた PAA のため、修飾します。リガンドの存在しないため、PAA のためと DBCO のための TEM 像は、図 2のとおりです。動的光散乱法 (DL)、zeta の潜在的な結果および DBCO のためのアップコン バージョン発光 (UCL) スペクトルはそれぞれ収集されます (図 3)。フーリエ変換の赤外線 (FTIR) 分光は DBCO NH2、PAA のためと DBCO のためは、図 4で示されます。

細胞実験で細胞膜に chr2 成功の式は共焦点顕微鏡 (図 5 a) を使用して明白な緑の蛍光蛋白質 (GFP) マーカー (ヴィーナス) によって確認されます。DBCO のため具体的には、クリック反応 (図 5 a) によって ChR2 発現 HEK293 細胞の表面にローカライズされます。近赤外光の刺激に応じて細胞内カルシウム分析共焦点イメージングとフローサイトメトリー (FCM)、標準蛍光 Ca2 +インジケーターに基づいて、ロード 3 でも確認された AM (図 5 bC)。

Figure 1
図 1。コア-シェルの合成希土類ドープしたため(A)ための合成プロセスの模式図。(B, C)コアの TEM (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) とコア-シェル (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) ためのナノ構造。スケール バー: 50 nm。Inset: コア ・ コア-シェルのためのナノ構造の高分解能電顕画像。スケール バー: 5 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。機能のためのナノ構造の合成します(A)図のリガンドの存在しないため、PAA のためと DBCO のため、合成プロセスのそれぞれ。(B, C, D)リガンドの存在しないため、PAA のためと DBCO のための TEM 画像。スケール バー: 100 パネル B で 50 nm nm パネル c/dこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。DBCO NH2、PAA のためとの DBCO のため、赤外分光法それぞれこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。DBCO のための緩衝液の特性(A) DBCO のための DLS 結果。(B) PAA のためと (平均 ± SD) DBCO のためのゼータの潜在的な結果。(C) UCL スペクトル ヘキサン (1 mg/mL)、PAA のため、水 (1 mg/mL) に DBCO のためのコアとコア-シェルのための別々 に (Ex: 808 nm)。808 nm 照射のためのはめ込み式: 発光の写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5。照明光の NIR に DBCO のための携帯電話アプリケーション(A)共焦点イメージング ChR2 を表現する N3-DBCO のため (上) と PAA のため (下) 100 μ g/mL で 2 時間インキュベート HEK293 細胞をタグ付き。緑: ChR2-金星 (Ex: 488 nm、Em: 530/50 nm)、青: ため (Ex: 543 nm、Em: 580/50 nm)。スケール バー: 20 μ m (B)細胞 Ca2 +イメージング ロード 3 AM 前後の近赤外光照射 (0.8 W/cm2の 20 分)。Ex: 561 nm、Em: 610/75 nm。スケール バー: 10 μ m (C)定量的 FCM 解析細胞 Ca2 +と異なる光用量照明 (平均 ± SD) の正規化された蛍光強度の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

この記事は、携帯電話のアプリケーションの機能的な部分とコア-シェル希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶 (ため) の合成とその表面改質法を提示しています。この斬新なナノ材料は、紫外線、アップコン バージョン多光子過程を通じて近赤外光励起による可視光を発することができる優れた光学特性を有しています。このプロトコルは、コア-シェルのためのナノ構造で (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) 用意していますオレイン酸と 1 octadecene の混合物の高温共沈法により。TEM 像を示す形態これらのコアとコア-シェルの結晶が球状で直径 20 nm、30 nm、それぞれ意味シェルの厚み約 5 nm (図 1)。コア-シェル アーキテクチャは、図 1コアのためのナノ構造と同様の格子縞を表わすのはめ込みの高分解能 TEM 像によっても明らかに。さらに、典型的なd-β-NaYF4の (100) 面の間隔とも一致する nm 0.52 周りの間隔、コア ・ コア-シェルのためのナノ構造をすべて高結晶性し、同じ結晶構造を維持することを示します。さらに、アップコン バージョン発光スペクトルを示すコア-シェル結晶が 480 ではるかに高い強度の強い青色発光を出す nm ダイオード レーザー 808 で連続波を達成するために励起によるコア粒子より nm (図 4)。コア-シェルのための強化された放出は Yb3 +Nd3 +、およびコア-シェル結晶21の内部層に埋め込まれている Tm3 +イオンの消光作用抑制表面に起因します。これらの結果は強くこの提案で希土類をドープしたコア ・ シェルのためナノマテリアルの成功の準備を確認します。

これらのナノ結晶の高温共沈合成におけるいくつかの重要な手順があります。まず、コアとコア-シェルのための合成過程におけるランタニド イオン原液の量を厳格に管理する必要があります (ステップ 1.1.2.2)。ドーピング イオン高のレベルは、濃度関係の交差緩和または消光21ナノ結晶のイオン-イオン相互作用による効果になります。50 ° C 未満 NaOH および NH4F オストヴァルトに基づく結晶成長を促進することによって均一な形態を確保するために不可欠なフラスコ (1.1.2.9 のステップとステップ 1.2.9) に追加した後、完全な核を確保するために、温度を保つ必要が第二に、熟成効果22。第三に、大きさ、コア-シェル粒子の光学特性は、シェル (Y3 +と Nd3 +) と、コア粒子 (ステップ 1.2.1) の前駆体の希土類金属イオンの量を調整することによって主制御されてことができます。コア-シェル ナノ結晶の形態が、近赤外光照射23時にための異なる光放出を調整するために有用であるコア粒子の異なる種類の異方性シェルの成長に基づいていることが重要です。

さらに、効果的に生物学的な親水性のためナノ粒子を疎水性のために変換する大きな課題であるも。緩衝液のための生体適合性を改善するためにいくつかの方法が報告されているが配位子交換、シリカ コーティング、オレイン酸キャッピング配位子酸化等を含む彼らは予期しない集計、時間がかかり、苦しむと複雑な手順24,25,26。ここで、酸水溶液中のオレイン酸に覆われたため表面にオレイン酸を除去することによって水分散性リガンドの存在しないためナノ構造を取得する簡単な方法を開発 (pH = 4)。HCl で調整 pH 値はオレイン酸配位子のリリースを制御するための発光に影響を与える重要です。さらに化学の多くの官能基を提供する調整作用によるための表面ランタニド イオン グループ リンク カルボキシル基の数が多いと生体適合性ポリマー (ポリアクリル酸、PAA) もっと重要なは、変更。したがって、我々 はさらに特定の N3のための表面に DBCO NH2基を施して-細胞膜局在をタグ付き。リガンドの存在しないため、PAA-ため、図 2に DBCO のための TEM 像は、表面改質後偉大なカオリンとこれらナノ構造体緩衝液での溶解性を示しています。さらに、フーリエ変換の赤外線 (FTIR) 分光法を特徴付けるため nanoplatform の DBCO グループの表面改質に行った。3,430 cm-1前後強いバンドが、カルボキシル基の H O 伸縮振動によるは図 3に示すように、1550 cm-1 1458 cm-1を中心とした 2 つのバンドは、非対称に関連付けられているし、UCNP 面上基含有ポリマー COOH (PAA) の成功したコーティングを示す、カルボン酸の陰イオンの対称伸縮振動モード。DBCO NH2基と反応後 1,635 cm-1に明白なバンドは現在に基づいて DBCO NH2基同時の FTIR スペクトルに一貫している DBCO グループの芳香環上の振動をストレッチ C = C波数。さらに、動的光散乱 (DL) 示の水溶液中における DBCO のための増加流体力学的直径 (96.4±10.4 nm) (図 4 a)。ゼータの潜在的な結果はまた PAA のための否定的な面を示す (-26.1±4.4 mV) と DBCO のため (-11.9±5.6 mV) それぞれ (図 4 b)、偉大な溶解度及び緩衝液にこれらのナノ構造の安定性を発揮します。また、PAA のためと DBCO のための UCL スペクトルを示す 480 で似たようなアップ コンバートされる放射を出すことができます 808 nm 光照射 (図 4)、さらに近赤外光を介した光生物学的の利用できる時に nmシステム。

陽イオンの流入を仲介することによって細胞の機能を調節する、細胞表面の光ゲート チャネル蛋白質 (ChR2) の設計さらに証拠の-概念として、生きている細胞の機能のためのバイオ応用を実証するために、(例えばCa2 +) 細胞質27,28,29。HEK293 細胞株の膜に chr2 成功の式は、共焦点顕微鏡 (図 5 a) を用いた緑色蛍光タンパク質 (GFP) マーカー (金星) の存在によって確認されます。さらに、N3のためのローカリゼーション-タグの細胞膜は細胞表面に (青) 2 時間培養後ためナノ構造の表面に残留の DBCO グループと汚れるという事実に帰することができる明らかに可視化アジ化物を含む蛍光染料 (5-carboxytetramethylrhodamine-アジ、ロード N3) 銅無料 bioorthogonal を介して反応をクリックします。さらに、近赤外光 (808 nm) を利用することができますをアクティブにセル表面のローカライズされたため nanotransducer を照射光ゲート ChR2 はチャネル蛋白質および膜を介する Ca2 +イオンの流入を容易にします。赤色蛍光性の細胞質の大幅な増加が観察される図 5 bのように、標準的な蛍光 Ca2 +インジケーター、ロード 3 午前、間光照射の有無で明らかな蛍光インクリメントは記録されません。図 5の定量的流れフローサイトメトリー (FCM) 分析も示して光-用量依存、生体適合性 DBCO のためすることができます効果的に調節することを明らかに示唆をこのような近赤外光応答性蛍光の増強効果には、近赤外光照射時に細胞膜のチャネル蛋白質。

要約すると、上記の結果に基づき、この議定書はだけでなく高温共沈合成コア-シェルのためのナノ構造の詳細な実験手順について説明しますが、単純な開発も期待さらに近赤外光による光生物学的応用のための生体適合性表面改質する技術。もっと重要なは、この方法の後ろの理論的根拠に基づき、ための光学特性さらにによって調整できる各種ランタニド イオンのドーピング (例えばエルビウム (III)、ホルミウム (III)、) UV、グリーン、赤を生成する結晶と近赤外光 808 nm 光照射30に。さらに、ため表面さらに体用31,32また様々 な機能グループ (例えばペプチド、蛋白質、脂質、配位子等を対象) に変更できます。これらの利点は生体適合性のためのナノマテリアルの生理的体外体内の研究に適した候補者を作るし、パーソナライズされたナノメディシンの臨床テラノスティクス市場として、将来的になる可能性があります。

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Disclosures

何を開示する必要があります。

Acknowledgements

この作品は NTU-AIT-マブラヴ ナム/16001, RG110/16 (S), (11/13 RG)、部分的にサポート、ナンヤン工科大学、シンガポール、国家自然科学基金の中国 (NSFC) (第 51628201) (RG 35/15) を受賞します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octadecene Sigma Aldrich O806 Technical grade
oleic acid Sigma Aldrich 364525 Technical grade
Methanol Fisher Scientific A412 Technical grade
Ethanol Fisher Scientific A405 Technical grade
Acetone Fisher Scientific A18 Technical grade
Hexane Sigma Aldrich H292 Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 367702 99.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 325805 99.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326011 99.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326046 99.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F) Sigma Aldrich 338869 ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl) Fisher Scientific A144 reagent grade
polyacrylic acid (PAA) Sigma Aldrich 323667 average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma Aldrich 54802 ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E7750 commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) Sigma Aldrich 761540 ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma Aldrich D125806 ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231 Technical grade
HEK293 cell line ATCC CRL-1573 human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051 ACS reagent
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 10,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) Addgene 15753 Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11965092 High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM) Thermo Fisher 51985034 Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000015 Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) Sigma Aldrich A7605 ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher 25200056 Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit Thermo Fisher R10145 Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) Sigma Aldrich 760757 Azide-fluor 545
Confical dish ibidi GmbH 81158 Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 Polypropylene
Phenylmethyl silicone oil Clearco Products 63148-52-7 Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometer GH Zeal L0111/10 From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plate Sigma Aldrich Z707775 Polystyrene

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