Implantation des sondes de silicium chronique et enregistrement des cellules hippocampiques Place dans un appareil de tapis roulant enrichi

Neuroscience

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Summary

Les auteurs décrivent les diverses étapes d’implant chronique silicium sondes et d’enregistrer des cellules de lieu chez les souris qui sont la tête de la course-fixé sur un appareil de cue-enrichi le tapis de course.

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Sariev, A., Chung, J., Jung, D., Sharif, F., Lee, J. Y., Kim, S., Royer, S. Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus. J. Vis. Exp. (128), e56438, doi:10.3791/56438 (2017).

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Abstract

Un critère important pour comprendre le fonctionnement du cerveau est l’identification du comportement et de l’activité des cellules en corrélation. Sondes de silicium sont avancés électrodes d’enregistrement électrophysiologique à grande échelle de l’activité neuronale, mais les modalités de leur implantation chronique sont encore peu développées. L’activité des cellules de l’hippocampe lieu est connue pour mettre en corrélation avec la position de l’animal dans l’environnement, mais les mécanismes sous-jacents sont encore peu clairs. Pour étudier les cellules de lieu, nous décrivons ici un ensemble de techniques qui vont de la fabrication de dispositifs pour sonde de silicium chronique les implants à la surveillance de l’activité de champ de place dans un appareil de cue-enrichi le tapis de course. Un micro et un chapeau sont construits par montage et fixation ensemble 3D-imprimé des pièces en plastique. Une sonde de silicium est montée sur le micro-lecteur, nettoyée et recouvert de colorant. Une première intervention chirurgicale est réalisée pour fixer le chapeau sur le crâne d’une souris. Petits points de repère sont fabriqués et attachés à la ceinture d’un tapis roulant. La souris est formée pour exécuter tête-fixé sur le tapis roulant. Une deuxième chirurgie est réalisée pour implanter la sonde de silicium dans l’hippocampe, suivant Quels signaux électrophysiologiques à large bande sont enregistrées. Enfin, la sonde de silicium est récupérée et nettoyée pour être réutilisés. L’analyse du lieu l’activité des cellules dans le tapis roulant révèle une diversité des mécanismes de champ, soulignant l’avantage de l’approche.

Introduction

Silicium sondes présentent plusieurs avantages pour les enregistrements électrophysiologiques, y compris le fait qu’ils sont conçus avec des profils pointus, réduisant au minimum les lésions tissulaires et qu’ils présentent une disposition précise de dense enregistrement sites1, 2,3,4. Ils sont utilisés pour étudier les différents systèmes chez différentes espèces, dont5,3,les humains6, avec des approches diverses1,7. Pourtant, leur utilisation récurrente est encore relativement limitée en raison de leur coût, fragilité et le fait que des méthodes pratiques pour expériences chroniques font défaut8. Les progrès récents dans la technologie d’impression 3D ont rendu possible la conception personnalisée de dispositifs tels que micro-disques et plaques de tête pour permettre une manipulation plus facile de ces électrodes délicats. Dans un premier temps, nous décrirons comment construire et utiliser un ensemble d’outils que nous avons élaborée pour l’implantation de la chronique de silicium sondes14.

Tandis que les cellules de lieu sont généralement étudiés en utilisant des animaux se déplaçant librement en cours d’exécution dans des labyrinthes, récemment ils ont été également étudiés dans des environnements virtuels15 et tapis roulant apparatii9 (Figure 1 a). Ces méthodes expérimentales présentent l’avantage que les animaux peuvent être tête-immobilisés, rendant l’utilisation du microscope 2 photons15, patch clamp16et optrode9,10,11 plus faciles, en plus de fournir le renforcement du contrôle sur le comportement animal et signaux environnementaux12techniques. Dans un second temps, nous présenterons les modalités de formation souris et place l’activité des cellules d’enregistrement dans un appareil de tapis roulant.

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Protocol

toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme de l’Institut coréen des sciences et de la technologie et d’animalier.

1. préparation du Micro-drive et l’électrode

  1. montage du micro-lecteur.
    1. Imprimer les pièces de la micro-drive (curseur, le corps et coquille) 14 à l’aide d’une imprimante 3D haute résolution. Veillez à ce que les parties n’ont aucun défaut.
    2. Fixer le curseur dans le corps du micro-lecteur avec une vis (taille 000-120 x 1/4).
    3. Souder un écrou (au format hexadécimal 000-120 000-120/64) sur le bout de la vis.
    4. Tournez la vis vers la droite pour déplacer le curseur en haut ou dans le sens antihoraire pour le déplacer vers le bas.
    5. Fixer la coque sur le corps avec une vis (taille 000-120 x 1/4).
  2. Montage de la sonde sur le micro-lecteur.
    1. Difficulté le micro-lecteur en position horizontale sous un microscope binoculaire.
    2. Utiliser une agrafe plate avec un rembourrage en caoutchouc pour saisir le câble flex de la sonde de silicium tout en détachant soigneusement la sonde de l’enveloppe d’expédition avec une pince. Difficulté la pince crocodile à un manipulateur.
    3. à l’aide de celui qui les manipule, poser la sonde de silicium sur le curseur micro-lecteur, parallèle à la direction du mouvement.
    4. Avec une goûte de ciment dentaire (température ambiante polymérisation acrylique dentaire matériel de réparation) pour fixer la sonde sur le slider. Corriger la position de la sonde si il s’est déplacé. La colle n’est pas recommandée car elle durcit très vite et il est difficile de régler la position de l’électrode à.
    5. Fixer le connecteur de la sonde au titulaire du C (socle de connecteur) avec ciment dentaire.
  3. Nettoyage et en mettant le colorant sur la sonde.
    1. Fixer la sonde/Microdrive assemblage sur le dispositif de nettoyage sonde. L’appareil est équipé de 2 rotation petit mousse, éponges (écouvillons non stérile). Régler l’écart par le manipulateur.
    2. Faire tremper l’éponge avec un détergent.
    3. Bouger lentement la sonde de haut en bas entre les éponges, permettant une légère pression. Surveiller le processus de nettoyage sous un microscope.
    4. Rincer la sonde avec de l’eau distillée. Plonger la sonde dans l’alcool pour la stérilisation.
    5. Appliquer Dil (lipophile colorant fluorescent) à l’arrière de la queue de la sonde, à l’aide d’un tampon de mousse. Cela permettra à un stade ultérieur de la visualisation des lieux de la tige dans le cerveau.
  4. Assembler le chapeau
    1. imprimer les pièces du chapeau (tête-plaque, socle de connecteur et cap) 14 à l’aide d’une imprimante 3D. Les 3 parties s’assemblent pour former un boîtier scellé.
    2. Insérer les écrous (au format M2 et 00-90 00-90/4) dans les fentes de la plaque de tête et la fixer avec la colle et ciment dentaire.
    3. Insérer une rondelle dans la fente de la PAC et le fixer avec du ciment dentaire.

2. Chirurgie pour la Fixation du chapeau sur le crâne

tous les outils utilisés pour la chirurgie sont préalablement stérilisés à l’autoclave. Un dispositif de perles de chaleur sèche forto stériliser les outils qui sont contaminés et doivent être stérilisés pendant la chirurgie.

  1. Réglez le niveau d’isoflurane à 4 % pour l’ouverture de l’anesthésie. Placez la souris dans la chambre de l’anesthésie pendant 5 min.
  2. Installer la souris dans un appareil stéréotaxique.
  3. Réduire le niveau de l’isoflurane à 1,5 à 2 %. Ajuster le niveau au cours de la chirurgie selon état animal, rythme de la respiration et le corps de température 20.
  4. Pommade oculaire sur les yeux.
  5. Raser le cuir chevelu et nettoyez la tête de l’animal avec un antiseptique (iodopovidone). Maintenir des conditions d’asepsie durant toutes les étapes de la chirurgie.
  6. Inject bupivacaïne (1 mg/kg), sous le cuir chevelu. Coupez et enlevez la partie de la peau pariétale de la tête de la souris à l’aide des ciseaux pour exposer le crâne sur ses bords. Utiliser une éponge hémostatique et sérum physiologique pour nettoyer et contrôler le saignement pendant la chirurgie.
  7. Supprimer le périoste en utilisant un outil racleur.
  8. Trouver les points de référence dans le crâne 21 : bregma, lambda, coronale et la suture sagittale. Ajuster la tête ' s angle le long de l’axe sagittal, telle que le Bregma et points lambda sont à la même hauteur.
  9. Percer deux trous (~0.5 mm de diamètre) dans le crâne pour les électrodes de référence et de la terre. Les trous devraient être d’approximativement 1 mm caudal et latéral de 1 mm de la Lambda.
  10. Insérer des électrodes de référence et au sol (vis taille 000-120 000-120/16 miniature en acier inoxydable fils couplés aux connecteurs à broches).
  11. Appliquer la lumière ultraviolette (UV) collage activateur de dentine sur le crâne et appliquez ensuite la lumière UV pour les 45-60 s.
  12. Appliquer une couche de ciment dentaire sur les bords du crâne. Éviter la propagation de ciment sur la peau et les cheveux des souris.
  13. Fixer la plaque de tête à un manipulateur stéréotaxique et positionnez-le au-dessus du crâne. Lentement la tête-plaque inférieure jusqu'à ce qu’il touche légèrement le crâne et appliquer un ciment dentaire à la jonction avec le crâne. Laissez la cure de ciment dentaire pendant 15 min.
  14. Enlever l’anesthésie. Fixer un socle de connecteur et un capuchon sur la plaque de tête. Placez la souris dans sa cage après avoir donné une injection sous-cutanée de kétaprophène 5 mg/kg
  15. Donner des injections sous-cutanée de kétaprophène 5 mg/kg pour les deux prochains jours et surveiller attentivement pour tout signe de douleur. Souris en général réveillent de l’anesthésie dans 20-40 min. L’implant de chapeau est relativement léger (3,34 g), tels que les souris n’ont aucune difficulté à lever la tête, courir dans des labyrinthes et grimper sur les bords de leur cage maison.

3. Formation comportementale

  1. après une période de récupération après la chirurgie de 7 jours, commencez la restriction de l’eau à 1 mL par jour.
  2. Faire le tapis, couper un morceau de tissu de velours (5 cm par 1-2 m) et fixer des petits objets sur elle à l’aide de colle chaude. Attachez des objets érigées sur les bords de la ceinture pour ne pas gêner le mouvement de la souris.
  3. Fixer la ceinture sur les roues du tapis roulant en suturant ensemble les deux extrémités.
  4. Installer la souris tête fixe dans le tapis roulant en insérant et en serrant les deux vis de la plaque de tête dans les fentes de la plaque de fixation tête.
  5. Début de formation de la souris pour exécuter tête-retenu sur le tapis roulant pour la récompense de l’eau. Remettre la récompense de l’eau via un port de lécher. Au départ, placez la souris sur le tapis roulant pendant 10 min, 3 fois par jour.
  6. Que la souris s’habitue à la tête-fixation et commence à actionner la courroie (typiquement après environ 3 jours), augmenter la session de formation Durée 30 min. Après 2-3 semaines, certaines souris courir plus de 100 essais en 30 min (un procès soit une rotation complète de la ceinture).
  7. Choisir les souris montrant les meilleurs performances comportementales pour les expériences d’enregistrement.

4. Implantation de la sonde de silicium

  1. Mettez la souris sous anesthésie.
  2. Installer la souris dans l’appareil stéréotaxique en fixant la plaque de tête. Nettoyer la surface du crâne avec une solution saline.
  3. Trouver des marqueurs stéréotaxiques : bregma, lambda, coronale et la suture sagittale. Mesurer la distance et le point d’insertion et marquer it.
  4. Percer l’OS soigneusement jusqu'à ce qu’il devienne fine et transparente. Humidifier et nettoyer avec du sérum physiologique pendant le forage.
  5. Retirer délicatement l’OS éclaircis et l’affaire Dura utilisant la force de précisionPS. Garder la surface de cerveau mouillé avec du sérum physiologique tout le temps.
  6. Fixer l’assemblage de sonde Microdrive/silicium à un manipulateur stéréotaxique. Mettre la sonde de silicium juste au-dessus de la craniotomie. Vissez le socle de connecteur de sonde de silicium à la plaque de tête-.
  7. Connecter les électrodes d’amplificateur et de repérage au sol/enregistrement. Bouclier de la souris avec du papier d’aluminium pour protéger du bruit électromagnétique. Démarrer le système d’enregistrement pour surveiller l’activité électrique du cerveau.
  8. Introduire doucement la sonde de silicium dans le cerveau utilisant le micromanipulateur. Vérifier en permanence les signaux électriques, la distance parcourue de manipulateur et les jarrets de la sonde (Assurez-vous qu’ils pénètrent dans le cerveau). Activité de l’unité est visible dans le cortex, tandis que la substance blanche sous est relativement silencieuse. Activité de l’unité réapparaît quand les queues touchent la couche pyramidale de l’hippocampe. De ce point, rétracter le silicium sonde 200 µm (utiliser le micro-drive le lendemain pour ramener la tige dans la couche pyramidale).
  9. Couvrir la surface du cerveau avec un mélange de cire d’os et de l’huile minérale.
  10. Fixer le micro-drive à la plaque de tête à l’aide de ciment dentaire. Laissez la cure de ciment dentaire pendant 15 min. Puis détacher la micro-en voiture depuis le manipulateur stéréotaxique et remettre le chapeau bonnet sur.
  11. Remettre la souris dans sa cage et donner une injection sous-cutanée de kétaprophène 5 mg/kg. Recherchez tout signe de douleur. Cette chirurgie est beaucoup moins invasive que la première et la souris sont généralement actifs au sein de 45 min après qu’ils réveil de l’anesthésie. Cependant, laisser la souris récupérer une journée entière que la sonde de silicium a besoin de se stabiliser dans le cerveau.

5. Enregistrement

  1. installer la souris tête-fixe sur le tapis roulant. Retirer le chapeau chap.
  2. Connectez l’amplificateur d’enregistrement et de lancer l’enregistrement.
  3. Le premier jour, utiliser le micro-drive pour déplacer la sonde de silicium dans la couche pyramidale de l’hippocampe. Chaque tour dans le sens inverse de la vis déplace les jarrets 200 µm plus profond. Ajustez la position de la tige lentement (environ 20-50 µm à la fois) jusqu'à apparition des ondulation oscillations 13 et unité activité.
  4. Sur les prochains jours, régler la position de la queue et attendre environ 1 h avant d’enregistrer l’activité de l’hippocampe, tandis que la souris fonctionne sur la ceinture. Pour maintenir la qualité du signal bon enregistrement pendant plusieurs jours, supprimer des objets durs et plafond de la souris bas ' cage de s pour minimiser le risque que le chapeau bosses dans des surfaces dures.

6. Récupération de la sonde

  1. Mettez la souris sous anesthésie.
  2. Installer la souris dans l’appareil stéréotaxique en fixant la plaque de tête. Retirer le chapeau chap.
  3. Amener le manipulateur stéréotaxique juste au dessus du micro-drive. Fixer le micro-lecteur pour le manipulateur. Dévissez le support de connecteur de la plaque de tête. Enlever la vis de connexion de la coquille et le corps du micro-lecteur.
  4. Sous la supervision de microscope binoculaire, tirez lentement vers le haut de l’assemblage de la sonde micro drive/silicium avec le manipulateur stéréotaxique, abandonnant la partie coque.
  5. Nettoyer la sonde de silicium avec le dispositif de nettoyage.

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Representative Results

Tout d’abord, une souris a été formée pour fonctionner sur une courroie longue de deux mètres dépourvu de repères (Figure 1). Après l’implantation de l’électrode, une nouvelle courroie de même longueur mais présentant 3 paires d’indices a été installé sur le tapis roulant, afin de générer des représentations spatiales d’allocentrique12,14. Signaux à large bande ont été enregistrées à une fréquence d’échantillonnage de 30 000 Hz, utilisant un système de 250-canaux d’enregistrement (Office d’amplificateur avec carte d’interface USB et interface de Labview sur mesure) et de deux sondes de silicium (Figure 1 a, 4 queues, 8 sites par shanks) implantés dans la région CA1 et CA3 (Figure 1 b). Unités ont été détectées en utilisant une fonction de seuil sur le signal filtré passe-haut (0,8-5 kHz). Isolement de cellules a été réalisée à l’aide d’un épi semi-automatique tri méthode15,16,17. Le mouvement vers l’avant/arrière du tapis roulant a été surveillé à l’aide de LED et capteur photo couples et enregistrée par des canaux d’entrée numériques du système d’enregistrement.

Une moyenne de cellules 148±35 (mean±s.e.m) pouvait être isolée dans chacune de ses sessions, parmi lesquels 38.4±3.5 % a montré l’activité domaine clair lieu (Figure 2). Les champs de lieu étaient relativement stables à travers de nombreux essais, soit dans la journée initiale de l’enregistrement (Figure 2 a) ou après plusieurs jours d’exposition à la ceinture indicée (Figure 2 b et Figure 2). Différents types de représentations spatiales pourraient être discernés. Certaines cellules ont montré les champs lieu répétées en corrélation avec l’identité des signaux (Figure 2 a), tandis que les autres cellules ont montré un lieu unique zone (Figure 2)12. Par conséquent, nous pourrions enregistre les cellules hippocampiques lieu pendant plusieurs jours et identifier une variété de mécanismes de champ, deux conditions importantes pour étudier les mécanismes et dynamique associée à la mémoire, d’apprentissage et d’exploration spatiale.

Figure 1
Figure 1 : sonde et tapis de course appareil de Silicon. (A) présentation tige et de l’emplacement de sonde de silicium. (B) site d’Implantation. (C) appareils de tapis roulant et mise en page des repères sur la courroie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : enregistrement chronique des cellules de lieu. Code de couleur de (A) représentation des champs de lieu (en haut), spike auto-corrélogramme (en bas à gauche) et doper les formes d’onde (en bas à droite) pour un exemple de cellule enregistré le jour 1. (B-C) Même que (A) pour des exemples de cellules enregistrées les jours 3 (B) et 5 (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Enregistrement chronique de l’activité neuronale est essentiel pour la compréhension des processus neuronaux comme les champs de lieu hippocampe. Notre approche pour effectuer des implantantation de sonde de silicium chronique se distingue d’autres méthodes7,18,19,20 par le fait qu’il est relativement simple de récupérer le paquet de l’électrode à la fin de l’expérience. Alors que les cellules de lieu sont généralement étudiés en se déplaçant librement des conditions, l’appareil de tapis roulant ne simplifie pas seulement considérablement la conception expérimentale et analyse des données, il permet également aux chercheurs d’examiner la place des mécanismes de champ dans des contextes minimales au cours nombreuses répétitions de trajectoires animaux stéréotypés12. Il est également beaucoup plus simple à construire que les systèmes de réalité virtuelle, puisqu’il requiert seulement imprimés 3D roues, capteurs de mouvement unidimensionnel et un microcontrôleur.

Activité de champ endroit stable pourrait être enregistrée sur plusieurs jours, un critère important pour l’enquête sur la dynamique de réseau à long terme associée à l’apprentissage. À cet égard, on devraient considérer certaines questions. Tout d’abord, les processus de formation de la dégénérescence et la cicatrice de tissu cerveau autour les sondes de silicone pourraient eux-mêmes générer des variations à long terme dans les patterns d’activité. Il est donc important pour toutes les interventions chirurgicales à faire soigneusement pour causer des dégâts minimes aux tissus du cerveau et les vaisseaux sanguins. Deuxièmement, il est relativement difficile de suivre les cellules individuelles au cours des jours consécutifs, en raison de dérives des électrodes dans le cerveau14. À cet égard, techniques d’imagerie telles que la microscopie biphotonique et micro-endoscopie peut-être mieux adapté, comme cellule identité peut être retracée de la morphologie et la configuration spatiale des cellules21,22,23 . Elles permettent également un plus grand rendement en terme de nombre de cellules enregistrées et fournir des informations directes sur la cellule gène expressions24. Cependant, les techniques d’imagerie sont assez envahissantes lorsque les régions cérébrales profondes sont concernées et ne peut pas résoudre seule les potentiels d’action car ils s’appuient principalement sur les signaux calciques. Par conséquent, une solution optimale pour des études longitudinales pourrait être de combiner les approches électrophysiologiques et optiques.

Enfin, il est à noter que l’ensemble des techniques que nous avons décrit peut être facilement adaptable pour d’autres types d’électrode, dont Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) et consommation11,25 , 26et peuvent être utilisés dans une gamme de modèles expérimentaux, autres que les cellules de lieu hippocampe. Avec les progrès rapides dans la technologie d’impression 3D, l’amélioration et la personnalisation des dispositifs d’enregistrement et comportements supplémentaires devraient devenir plus simple et plus accessible aux laboratoires.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’Institut coréen des sciences et technologie programme institutionnel (projets n° 2E26190 et 2E26170) et le Human Frontier Science Program (RGY0089/2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Probe Neuronexus Buzsabi32 Recording electrode
Recording system Intantech RHD2132/RHD2000
3D printer Asiga Pico Plus 27 High resolution printer for micro-drive
3D printer Stratasys Mojo Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus Kopf Model 963
Binocular microscope Leica M60
Treadmill apparatus We build them

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