Implantation von chronischen Silicon Sonden und Aufzeichnung der Hippocampal Platzzellen in eine angereicherte Laufband-Vorrichtung

Neuroscience

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Summary

Wir beschreiben die verschiedenen Schritte, chronische Silicium-Sonden zu implantieren und Platzzellen bei Mäusen zu erfassen, die laufen Kopf fixiert auf einen Cue-angereicherten Laufband Apparat sind.

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Sariev, A., Chung, J., Jung, D., Sharif, F., Lee, J. Y., Kim, S., Royer, S. Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus. J. Vis. Exp. (128), e56438, doi:10.3791/56438 (2017).

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Abstract

Eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis der Funktion des Gehirns ist die Identifizierung von Verhalten und Zell-Aktivität korreliert. Silizium-Sonden sind Elektroden für groß angelegte elektrophysiologische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität fortgeschritten, aber die Verfahren für ihre chronische Implantation sind noch unterentwickelt. Ist die Aktivität der hippocampal Platzzellen korrelieren mit einem Tier Position in der Umgebung bekannt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch unklar. Ortszellen untersuchen, beschreiben wir hier eine Reihe von Techniken, die das Spektrum reicht von der Herstellung von Geräten für chronische Silizium Sonde Implantate für die Überwachung der Ort Feld Aktivität in einem Cue-angereicherten Laufband-Apparat. Ein Mikro-Laufwerk und einen Hut entstehen durch Montage und Befestigung zusammen 3D-gedruckten Kunststoffteile. Eine Silizium-Sonde ist montiert auf dem Mikro-Laufwerk gereinigt und beschichtet mit Farbstoff. Eine erste Operation wird durchgeführt, um den Hut auf den Schädel einer Maus zu beheben. Kleine Sehenswürdigkeiten sind hergestellt und von einem Laufband am Gürtel befestigt. Die Maus ist darin geschult, Kopf fixiert laufen auf dem Laufband. Eine zweite Operation wird durchgeführt, um die Implantat-Silikon-Sonde im Hippocampus, nach welcher Breitband elektrophysiologische Signale aufgezeichnet werden. Schließlich ist die Silizium-Sonde wiederhergestellt und für die Wiederverwendung gereinigt. Die Analyse der Ort Zell-Aktivität in der Tretmühle zeigt eine Vielfalt von Mechanismen Feld Gliederung der Vorteil des Ansatzes.

Introduction

Silizium-Sonden präsentieren mehrere Vorteile für elektrophysiologische Aufnahmen, einschließlich der Tatsache, dass sie dazu, mit scharfen Profilen, die Minimierung von Gewebeschäden und bestimmt sind, dass sie ein präzises Layout der dicht gedrängten Aufnahme Websites1präsentieren, 2,3,4. Sie werden verwendet, um verschiedene Systeme in verschiedenen Arten, darunter Menschen3,5,6, mit unterschiedlichen Ansätzen1,7zu studieren. Ihre wiederkehrende Verwendung ist jedoch wegen ihrer Kosten, Zerbrechlichkeit und die Tatsache, dass bequeme Methoden für chronische Experimente8fehlen noch relativ begrenzt. Jüngste Fortschritte in der 3D-Drucktechnologie haben die individuelle Gestaltung der Geräte wie Mikro-Antriebe und Kopf-Platten ermöglichen eine einfachere Handhabung der diese empfindlicheren Elektroden möglich gemacht. In einem ersten Schritt werden wir beschreiben, wie erstellen und verwenden eine Reihe von Tools, die wir entwickelt haben für die Implantation von chronischen Silizium Sonden14.

Während Ortszellen mit frei beweglichen Tiere laufen in Labyrinthe in der Regel untersucht sind, wurden vor kurzem sie auch in virtuellen Umgebungen15 und Laufband Apparatii9 (Abbildung 1A) untersucht. Diese experimentelle Methoden bieten den Vorteil, dass Tiere Kopf-zurückhaltend können werden, Nutzung der 2-Photonen-Mikroskop15, Patch-Clamp16und Optrode9,10,11 Techniken einfacher, neben der verbesserten Kontrolle über Tierverhalten und ökologische Hinweise12. In einem zweiten Schritt präsentieren wir die Verfahren für die Ausbildung von Mäusen und Aufnahme Ort Zell-Aktivität in einem Laufband-Apparat.

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Protocol

alle beschriebene Methoden von Animal Care und Use Committee des Korea Institute of Science und Technologie genehmigt worden.

1. Vorbereitung der Micro-Drive und Elektrode

  1. Montage das Micro-Drive.
    1. Die Teile des Mikro-Laufwerks (Schieberegler, Körper und Shell) Drucken 14 mit einem hochauflösenden 3D-Drucker. Sicherstellen, dass die Teile haben keine Mängel.
    2. Fixieren den Schieberegler in den Mikro-Antrieb-Körper mit einer Schraube (Größe 000-120 x 1/4).
    3. Löten eine Nuss (Größe 000-120 000-120/64 Hex) auf die Spitze der Schraube.
    4. Drehen Sie die Schraube im Uhrzeigersinn bewegen Sie den Schieberegler nach oben oder nach unten gegen den Uhrzeigersinn drehen.
    5. Befestigen Sie die Schale auf den Körper mit einer Schraube (Größe 000-120 x 1/4).
  2. Montage der Sonde auf dem Mikro-Laufwerk.
    1. Fixieren der Mikro-Antrieb in horizontaler Position unter einem Binokular.
    2. Verwenden eine flache Krokodilklemme mit Kautschuk Polsterung, um Flex-Kabel des Prüfpunkts Silizium zu greifen, während sorgfältig trennen die Sonde aus dem Versand-Gehäuse mit der Pinzette. Fix die Krokodilklemme, ein Manipulator.
    3. Mit dem Manipulator die Silizium-Sonde auf den Micro-Drive-Regler parallel zur Richtung der Bewegung lag.
    4. Geben Sie einen Tropfen von dental Zement (Raumtemperatur aushärtende Acryl dental Reparatur Material), die Sonde an den Schieberegler zu beheben. Korrigieren Sie die Sondenposition, wenn es verschoben hat. Kleber wird nicht empfohlen, da es sehr schnell heilt und es schwierig macht, die Elektrodenposition nachjustieren.
    5. Befestigen Sie den Anschluss der Sonde an den C-Halter (Steckerhalter) mit dental Zement.
  3. Reinigung und Aufsetzen der Sonde Farbstoff.
    1. Fix die Microdrive/Sonde Gefüge auf dem Sonde-Reinigungs-Gerät. Das Gerät verfügt über 2 kleine rotierende Schaumstoff Schwämme (nicht-sterile Tupfer). Passen Sie die Lücke durch den Manipulator.
    2. Die Schwämme mit Reinigungsmittel einweichen.
    3. Bewegen sich langsam die Sonde nach oben und unten zwischen die Schwämme, so dass eine sanfte Berührung. Die Reinigung unter dem Mikroskop zu überwachen.
    4. Spülen die Sonde mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Sonde in Alkohol für die Sterilisation.
    5. Anwenden Dil (lipophile Fluoreszenzfarbstoff) auf der Rückseite der Ableger der Sonde mit einem Schaum-Tupfer. Dies ermöglicht die Visualisierung der Schaft stellen im Gehirn in einer späteren Phase.
  4. Montage des Hutes
    1. Teile des Hutes (Kopf-Platte, Steckerhalter und Mütze) Drucken 14 mit einem 3D Drucker. Die 3 Teile fügen sich zu eine geschlossene Gehäuse bilden.
    2. Muttern (Größe M2 und 00-90 00-90/4) in die Schlitze an der Kopfplatte und befestigen Sie mit Leim und dental Zement einsetzen.
    3. Legen Sie eine Unterlegscheibe in den Schlitz der GAP und fixieren mit dental Zement.

2. Operation zur Fixierung des Hutes auf den Schädel

alle Hilfsmittel für die Chirurgie sind vorher durch Autoklavieren sterilisiert. Eine trockene Hitze-Perlen-Gerät dient Forto sterilisieren Werkzeuge, die kontaminiert werden und müssen während der Operation sterilisiert werden.

  1. Die Isofluran auf 4 % für die Einleitung der Narkose festlegen. Setzen Sie die Maus in der Anästhesie-Kammer für 5 min.
  2. Installieren Sie die Maus in einer stereotaktischen Apparatur.
  3. Verringern Isofluran auf 1,5-2 %. Stellen Sie den Pegel während der Operation nach Tier stand, Atemfrequenz, und Körper Temperatur 20.
  4. Augensalbe auf die Augen auftragen.
  5. Die Kopfhaut rasieren und reinigen Sie den Kopf des Tieres mit antiseptischen (Iodopovidone). Aseptische Bedingungen bei allen Arbeitsschritten der Chirurgie zu erhalten.
  6. Inject Bupivacain (1 mg/kg) unter der Kopfhaut. Schneiden Sie und entfernen Sie Teil der parietalen Haut von der Maus-Kopf mit einer feinen Schere um zu den Schädel an den Rändern zu entlarven. Verwenden Sie Kochsalzlösung und eine blutstillende Schwamm zu reinigen und zu kontrollieren, die Blutung während der Operation.
  7. Entfernen der Knochenhaut mit einem Etikettenschaber.
  8. Finden Sie die Referenzpunkte auf der Schädel 21: Bregma, Lambda, koronal und sagittale Naht. Passen Sie den Kopf ' s Winkel entlang der sagittalen Achse, so dass die Bregma und Lambda Punkte auf gleicher Höhe sind.
  9. Bohren Sie zwei Löcher (~0.5 mm Durchmesser) in den Schädel für die Referenz und Boden Elektroden. Die Löcher sollten etwa kaudalen 1 mm und 1 mm seitlich des Lambda werden.
  10. Legen Sie die Boden und Verweis Elektroden (Größe 000-120 000-120/16 Miniatur Edelstahl-Schrauben mit Pin Stecker Kabel gekoppelt).
  11. Apply ultraviolettes (UV) Licht kleben Dentin Aktivator auf den Schädel und wenden Sie dann UV-Licht für 45-60 s.
  12. Tragen Sie eine Schicht von dental Zement an den Rändern des Schädels. Vermeiden Sie die Verbreitung von Zement auf die Haut und Haar der Mäuse.
  13. Fixieren die Kopfplatte zu einer stereotaktischen Manipulator und positionieren Sie es über den Schädel. Langsam senken Sie die Kopfplatte, bis es leicht den Schädel berührt, und wenden Sie dental Zement an der Kreuzung mit dem Totenkopf. Lassen Sie die dental Zement Aushärten für 15 min.
  14. Entfernen die Narkose. Befestigen Sie ein Steckerhalter und eine Kappe auf der Kopfplatte. Setzen Sie die Maus in seinem Käfig nach geben eine subkutane Injektion von Ketaprofen 5 mg/kg
  15. Geben subkutane Injektionen von Ketaprofen 5 mg/kg für die nächsten zwei Tage und Monitor sorgfältig auf Anzeichen von Schmerzen. Mäuse in der Regel aufwachen aus der Narkose innerhalb von 20-40 min. Das Hut-Implantat ist relativ leicht (3,34 g), solche, die Mäuse haben keine Mühe, den Kopf zu heben, laufen in Labyrinthe und Klettern an den Rändern ihrer Heimat Käfig.

3. Verhaltenstraining

  1. nach einer postoperative Erholungszeit von 7 Tagen beginnen die Beschränkung des Wassers bei 1 mL pro Tag.
  2. Auf den Laufband Gürtel machen schneiden Sie ein Stück samt Stoff (5 cm x 1-2 m) und kleine Objekte mit Heißkleber befestigen. Befestigen Sie errichteten Gegenstände an den Rändern des Bandes um nicht mit der Bewegung der Maus stören.
  3. Durch Vernähen zusammen die beiden Enden der Gürtel an den Rädern des Laufbandes zu beheben.
  4. Installieren Sie die Maus in der Tretmühle Kopf fixiert durch einsetzen und anziehen der beiden Schrauben von der Kopfplatte in die Schlitze der Kopf-Fixierung Platte.
  5. Start training der Maus Kopf zurückhaltend laufen auf dem Laufband für die Wasser-Belohnung. Liefern Sie die Wasser-Belohnung über einen Port lecken. Zunächst setzen Sie die Maus auf dem Laufband für einen Zeitraum von 10 min, 3 Mal pro Tag.
  6. Wie die Maus gewöhnt sich an den Kopf-Fixierung und beginnt sich zu bewegen den Gürtel (in der Regel nach ~ 3 Tage), erhöhen die Trainingseinheit bis 30 min Dauer. Nach ca. 2-3 Wochen, laufen einige Mäuse mehr als 100 Studien in 30 min (ein Verfahren wird eine volle Umdrehung des Riemens).
  7. Wählen Sie die Mäuse zeigen die besten Verhalten Leistungen für die Aufnahme Experimente.

4. Implantation von Silizium-Sonde

  1. die Maus unter Narkose.
  2. Installieren Sie die Maus in der stereotaktischen Vorrichtung durch die Festsetzung der Kopfplatte. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kochsalzlösung.
  3. Finden stereotaktischen Marker: Bregma, Lambda, koronal und sagittale Naht. Messen Sie den Abstand zum Einfügepunkt und markieren it.
  4. Bohren Knochen sorgfältig, bis es dünn und transparent wird. Befeuchten und reinigen Sie mit Kochsalzlösung während des Bohrens.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den ausgedünnten Knochen und die Dura Materie Präzision GewaltanwendungPS: Halten Sie die Gehirn-Oberfläche mit Kochsalzlösung ständig nass.
  6. Fixieren die Microdrive/Silizium Sonde Assemblage zu einer stereotaktischen Manipulator. Bringen Sie die Silizium-Sonde oberhalb der Kraniotomie. Schrauben Sie Silizium Sondenhalter Connector an der Kopfplatte.
  7. Verbinden die Aufnahme Verstärker und Bezugsmasse/Elektroden. Die Maus mit Alu-Folie zum Schutz vor elektromagnetischen Lärm zu schützen. Starten Sie die Aufnahme-System zur Überwachung der elektrischen Aktivität des Gehirns.
  8. Setzen Sie langsam die Silizium-Sonde in das Gehirn mit dem Mikromanipulator. Kontinuierlich zu überprüfen, die elektrischen Signale der Manipulator reiste Abstand und die Schäfte der Sonde (stellen Sie sicher, sie sind in das Gehirn eindringen). Einheit Aktivität ist sichtbar in der Hirnrinde, während die weiße Substanz unter relativ leise ist. Einheit-Aktivität erscheint wenn die Schäfte die pyramidale Schicht des Hippocampus berühren. Ab diesem Zeitpunkt Einfahren der Silizium-Sonde 200 µm (Mikro-Antrieb am nächsten Tag verwenden, um den Schaft in die pyramidale Schicht zurückzubringen).
  9. Bedecken die Oberfläche des Gehirns mit einer Mischung aus Knochen Wachs und Mineralöl.
  10. Fix Micro-Drive auf der Kopfplatte mit dental Zement. Lassen Sie die dental Zement Aushärten für 15 Minuten. Dann lösen Sie die Mikro-Fahrt von der stereotaktischen Manipulator und legte die Mütze Kappe wieder auf.
  11. Die Maus zurück in seinen Käfig setzen und geben eine subkutane Injektion von Ketaprofen 5 mg/kg. Suchen Sie nach Anzeichen von Schmerzen. Diese Operation ist deutlich weniger invasiv als die erste und Mäuse sind in der Regel innerhalb von 45 min aktiv, nachdem sie aus der Narkose aufwachen. Aber lassen Sie die Maus, die einen ganzen Tag zu erholen, da die Silizium-Sonde im Gehirn zu stabilisieren muss.

5. Aufnahme

  1. Installation die Maus Kopf-fixiert auf dem Laufband. Entfernen Sie die Mütze Cap
  2. Den Aufnahme-Verstärker zu verbinden und starten Sie die Aufnahme.
  3. Am ersten Tag der Mikro-Laufwerk verwenden, um die Silizium-Sonde in die pyramidale Schicht des Hippocampus zu bewegen. Zuges der Schraube gegen den Uhrzeigersinn bewegt sich die Schäfte 200 µm tiefer. Passen Sie die Schaft Position langsam (~ 20-50 µm zu einem Zeitpunkt) bis Welligkeit Schwingungen 13 und Einheit Aktivität angezeigt werden.
  4. An den nächsten Tagen tune die Schaft-Position und warten ~ 1 h vor der Aufnahme der hippocampalen Aktivität, während die Maus auf das Band läuft. Um gute Aufnahmequalität Signal für mehrere Tage zu erhalten, entfernen Sie harte Gegenstände und niedrige Decke von der Maus ' s Käfig um die Chance zu minimieren, der Hut auf harten Oberflächen stößt.

6. Wiederherstellung der Sonde

  1. die Maus unter Narkose.
  2. Installieren Sie die Maus in der stereotaktischen Vorrichtung durch die Festsetzung der Kopfplatte. Entfernen Sie die Mütze Cap
  3. Bringen den stereotaktischen Manipulator oberhalb der Mikro-Antrieb. Der Mikro-Antrieb für den Manipulator zu beheben. Schrauben Sie den Steckerhalter aus der Kopfplatte. Entfernen Sie die Schraube, die Verbindung zwischen der Schale und Körper die Micro-Drive.
  4. Shell Teil hinterließ Binokular Aufsicht, langsam hochziehen, Mikro-Antrieb/Silizium Sonde Assemblage mit der stereotaktischen Manipulator.
  5. Reinigen die Silizium-Sonde mit dem Reinigungsgerät.

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Representative Results

Eine Maus trainierte zunächst auf einem zwei Meter langen Gürtel frei von Cues (Abbildung 1) ausgeführt. Nach der Implantation der Elektroden, einem neuen Gürtel von gleicher Länge aber 3 Paare von Cues zu präsentieren wurde auf dem Laufband, installiert, um Allocentric räumliche Darstellungen12,14zu generieren. Bei einer Abtastrate von 30.000 Hz mit einer 250-Kanal Recording-System (Verstärker-Board mit USB-Interface-Platine und maßgeschneiderte Labview Schnittstelle) und zwei Silizium-Sonden (Abbildung 1A, 4 Schäfte, 8 Seiten pro Ableger) implantiert wurden Breitband-Signale aufgezeichnet. in CA1 und CA3 (Abbildung 1 b). Einheiten wurden mit einem Schwellwert-Funktion auf die Hochpass-gefilterte Signale erkannt (0,8-5 kHz). Zelle Isolierung erfolgte mittels einer halbautomatischen Spike Sortierung Methode15,16,17. Die vorwärts/rückwärts Bewegung des Laufbandes wurde überwacht, mit LED und Fotosensor Paare und durch digitale Eingangskanäle des Recording-System aufgezeichnet.

Ein Durchschnitt von 148±35 Zellen (mean±s.e.m) konnte in jeder Sitzung isoliert werden, unter denen 38.4±3.5 % klar Ort Feld Aktivität (Abbildung 2) zeigte. Der Ort waren relativ stabil über viele Prüfungen, entweder des Anfangstag der Aufnahme (Abbildung 2A) oder nach einigen Tagen der Exposition gegenüber den wartenden Riemen (Abb. 2 b und Abbildung 2). Verschiedene Arten von räumlichen Darstellungen konnte erkannt werden. Einige Zellen zeigte wiederholt Ort Felder korreliert mit der Identität der Cues (Abbildung 2A), während andere Zellen ein einzigartiger Ort Feld (Abbildung 2)12 zeigten. Daher konnten wir aufzeichnen hippocampal Platzzellen über mehrere Tage und identifizieren eine Vielfalt von Mechanismen Feld, zwei wichtige Voraussetzungen für die Erforschung der Mechanismen und Dynamiken, die räumliche Navigation, lernen und Gedächtnis zugeordnet.

Figure 1
Abbildung 1: Silizium-Sonde und Laufband-Apparat. (A) Schaft und Website Layout der Silizium-Sonde. (B) Implantationsort. (C) Laufband Apparat und das Layout der Hinweise auf den Gürtel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: chronische Aufnahme der Platzzellen. (A) farbcodierte Darstellung der Ort Felder (oben), spike Auto-Correlogram (unten links) und spike Wellenformen (unten rechts) für eine Zelle Beispiel auf Tag 1 aufgenommen. (B-C) Identisch mit (A) beispielsweise Zellen aufgenommen am Tag 3 (B) und 5 (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Chronische Aufnahme von neuronaler Aktivität ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der neuronalen Prozesse wie z. B. hippocampal Ort Felder. Unser Ansatz, chronische Silicium-Sonde Implantantation durchzuführen unterscheidet sich von anderen Methoden7,18,19,20 durch die Tatsache, dass es relativ einfach, die Elektrode Paket wiederherzustellen das Ende des Experiments. Während Platzzellen in der Regel frei beweglichen studiert werden Bedingungen, die Laufband-Apparat nicht nur deutlich vereinfacht, experimentelles Design und Analyse von Daten, sondern ermöglicht auch Forscher Feld Mechanismen in minimalen Kontexten während unter die Lupe nehmen viele Wiederholungen von Stereotypen Tier Bahnen12. Es ist auch viel einfacher zu bauen als virtual Reality-Systeme, da es nur 3D-gedruckten Räder, eindimensionale Bewegungssensoren und einem Mikrocontroller benötigt.

Stabilen Ort Feld Aktivität konnte über viele Tage, eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung der langfristigen Netzwerk Dynamik lernen aufgezeichnet werden. In dieser Hinsicht sollten einige Punkte berücksichtigt werden. Erstens könnte sich die Prozesse des Gehirns Degeneration und Narbe Gewebeanordnung um die Silikon-Sonden langfristige Variationen in Aktivitätsmuster generieren. Es ist daher wichtig für alle chirurgischen Eingriffe sorgfältig durchgeführt werden, um minimale Schäden an Gehirn Gewebe und Blutgefäße. Zweitens ist es relativ schwierig, einzelne Zellen in aufeinander folgenden Tagen wegen Elektrode driftet in den Gehirn-14zu verfolgen. In dieser Hinsicht lassen bildgebende Verfahren, wie z. B. zwei-Photonen-Mikroskopie und Mikro-Endoskopie möglicherweise besser geeignet, als Zelle Identität sich von der Morphologie und räumliche Konfiguration der Zellen21,22,23 . Sie erlauben auch ein größerer Ertrag in Bezug auf die Anzahl der Zellen aufgenommen und direkte Informationen über Zelle gen Ausdrücke24. Bildgebende Verfahren sind jedoch sehr invasiv, wenn tiefe Gehirnregionen betroffen sind und einzelne Aktionspotentiale können nicht aufgelöst werden, da sie vor allem auf Kalziumsignale angewiesen sind. Daher wäre eine optimale Lösung für Längsschnittstudien, sowohl optische als auch elektrophysiologische Methoden kombinieren.

Schließlich ist es erwähnenswert, dass der Satz von Techniken, die wir beschrieben haben möglicherweise leicht anpassbar für andere Arten von Elektroden, einschließlich Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) und Optrodes11,25 , 26, und kann in eine Reihe von experimentellen Modellen außer hippocampal Platzzellen verwendet werden. Mit dem schnellen Fortschritt in der 3D-Druck Technologie sollte die weitere Verbesserung und Anpassung von Aufnahme- und Verhaltensstörungen Geräte einfacher und für die Labs zugänglich geworden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Science und Technology institutionelle Program (Projekte Nr. 2E26190 und 2E26170) und das Human Frontier Science Program (RGY0089/2012) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Probe Neuronexus Buzsabi32 Recording electrode
Recording system Intantech RHD2132/RHD2000
3D printer Asiga Pico Plus 27 High resolution printer for micro-drive
3D printer Stratasys Mojo Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus Kopf Model 963
Binocular microscope Leica M60
Treadmill apparatus We build them

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