Neuroscience
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Vorbereitung von peripheren Nervenstimulationselektroden für die chronische Implantation bei Ratten
Chapters
Summary July 14th, 2020
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Bestehende Ansätze für den Bau chronisch implantierbarer peripherer Nervenmanschettenelektroden für den Einsatz bei kleinen Nagetieren erfordern oft spezielle Ausrüstung und/oder hochqualifiziertes Personal. In diesem Protokoll zeigen wir einen einfachen, kostengünstigen Ansatz zur Herstellung chronisch implantierbarer Manschettenelektroden und ihre Wirksamkeit für die Vagusnervstimulation (VNS) bei Ratten.
Transcript
Die periphere Nervenstimulation wird zunehmend als Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht, darunter entzündliche Erkrankungen und neuronale Erkrankungen. Der Bau chronisch implantierbarer peripherer Nervenmanschettenelektroden für kleine Labortiere kann zeitaufwändig und teuer sein. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen, kostengünstigen Ansatz für den Bau chronisch implantierbarer peripherer Nervenstimulationselektroden für den Einsatz bei Ratten.
Das Verfahren erfordert nur sehr wenige und leicht zugängliche Materialien und Vorräte sowie eine reduzierte Anzahl gefährlicher oder technisch erforderlicher Schritte im Vergleich zu ähnlichen Techniken, was sowohl die Kosten des Geräts als auch die Zeit für die Schulung des Personals und der Gerätemontage reduziert. Diese Technik wurde entwickelt, um präklinische Studien zu ermöglichen, die die Wirksamkeit der chronischen Vegas-Nervenstimulation während der Schlaganfall-Wiederherstellung oder anderen Arten von Metro-Dysfunktion testen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Manschette Schlauch.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein 2,5-Millimeter-Stück Polymerschläuche zu schneiden. Legen Sie dann eine Büroklammer oder Kraftspitzen durch den Schlauch und machen Sie einen längs durch die Wand der Schläuche auf einer Seite der Manschette gleiten. Entfernen Sie die Zange aus dem Schlauch und legen Sie eine große Nähnadel durch die Mittellinie der Manschette.
Legen Sie die Nadel in die Schaumstoffplatte, um die Manschette während der verbleibenden Montageschritte an Ort und Stelle zu fixieren. Um eine Naht zur Sicherung manschettenverschluss während der Implantation setzen eine kleine Nähnadel durch die Wand der Manschette auf der Mittellinie etwa Punkt fünf Millimeter von der oberen Schlitz auf einer Seite. Dann legen Sie zwei Zentimeter einer sechs Null Naht durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch die Wand des Schlauches, um die Naht in die Manschette zu fädeln.
Durchbohren Sie ein zweites Loch durch die Rohrwand etwa fünf Millimeter unter das erste Loch entlang der Mittellinie der Manschette. Legen Sie die Naht durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch die Schlauchwand. Tragen Sie eine kleine Menge UV-Härtekleber auf das kurze Ende der Naht auf, die sich vom unteren Loch aus erstreckt, und ziehen Sie das längere Nähtedesende, bis der untere Schwanz mit der Außenwand des Schlauches fast bündig ist.
Dann den Klebstoff mit einem UV-Stab aushärten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine weitere Naht auf der gegenüberliegenden Seite der Manschette zu platzieren. Als nächstes führt der Platinum Iridium Draht.
Verwenden Sie die kleine Nähnadel, um vier Löcher in der Manschettenwand zu machen. Dann setzen Sie die Nähnadel wieder ein, diesmal arbeiten sie von außen nach innen durch das erste Bleiloch. Legen Sie etwa Punkt fünf Zentimeter eines 7,5 Zentimeter Platin Iridium Draht durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um die Drahtleitung durch die Manschettenwand zu fädeln.
Stellen Sie den Draht so ein, dass sich ca. 4,5 Zentimeter auf der Außenseite der Manschette erstrecken. Setzen Sie die Nadel durch das erste Bleiloch wieder ein, dann durch das zweite Bleiloch. Setzen Sie Punkt fünf Zentimeter des kürzeren Endes des Drahtes durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um den Draht durch die Manschettenwände zu fädeln.
Wiederholen Sie den Vorgang, um den Draht durch die dritte und vierte Bleibohrung zu fädeln. Mit einem Butan-Feuerzeug, entfernen Sie vorsichtig die Isolierung von fünf bis sechs Millimeter der Drähte, die sich von der zweiten und vierten Bleilöcher erstrecken, dann ziehen Sie vorsichtig am Ende des Drahtes, der sich vom ersten Loch aus erstreckt, bis der nicht isolierte Teil des Drahtes mit dem Loch bündig ist. Wiederholen Sie dies mit der anderen Leitung, um das nicht isolierte Ende des Drahtes auszurichten, der durch das dritte und vierte Bleiloch gefädelt wird.
Tragen Sie eine kleine Menge UV-Härtekleber auf die Drahtschlaufen an der Außenseite der Manschette an der ersten und dritten Bleibohrung auf. Dann verwenden Sie den UV-Stab, um den Klebstoff auszuhärten und die Leitungen an Ort und Stelle zu sichern. Verwenden Sie eine kleine Pipettenspitze, um die nicht isolierten Drahtleitungen gegen die Innenwand der Manschette zu schieben.
Ziehen Sie die ein Millimeter Schwänze des Drahtes flach gegen die Außenfläche der Manschette, wobei darauf zu achten ist, sie nicht zusammen zu kurz zu machen. Dann eine kleine Menge UV-Klebstoff auftragen, um die beiden Schwänze zu bedecken und auszuhärten. Entfernen Sie die große Nadel mit der Manschettenanordnung von der Schaumstoffplatte.
Legen Sie eine Länge von drei Zentimetern von sechs Nullen durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch den Schlauch, um die Naht durch den Boden der Manschette in der Mitte zu fädeln. Setzen Sie die kleine Nähnadel durch das gleiche Mittellinienloch, das von innen nach außen arbeitet, um Verformungen, Rohre und Drahtleitungen zu vermeiden. Dann legen Sie den äußeren Schwanz der Naht durch das Nadelöhr und ziehen Sie die Nadel durch die Manschettewand, um eine Schlaufen von Naht um den Rand der Manschette zu erstellen.
Erstellen Sie die zweite Schleife um das gegenüberliegende Ende der Manschette, indem Sie die Enden der Naht und einen halben Knoten an der Außenseite der Manschette binden. Während Sie den Knoten flach gegen den Schlauch halten, eine kleine Menge UV-Klebstoff auf den halben Knoten auftragen und aushärten. Schneiden Sie die Enden des Nahtgewindes vorsichtig so nah wie möglich am Knoten.
Verwenden Sie dann ein Butan-Feuerzeug, um die Isolierung von etwa drei Millimetern am Ende jedes Der Platin-Iridium-Drahtleitungen zu entfernen. Löten Sie die Becherseite eines Goldstifts an das ungedämmte Ende jeder Leine. Bevor Sie mit dem Implantationstest fortfahren, wird die Impedanz des montierten Geräts überprüft, ob die montierte Manschette eine Impedanz von weniger als zwei Kilo Ohm bei einem Kilohertz aufweist.
Nach der Montage der Kopfkappe und dem Implantieren der Manschettenelektroden nach Manuskriptanweisungen, stimulieren Sie den Vagusnerv, während die Ratte wach ist. Schließen Sie die Ratte über die implantierte Kopfkappe an einen Stimulusgenerator an und passen Sie die Stimulationseinstellungen an. Für die VNS-induzierte Reorganisation der motorischen kortikalen Karte liefern Sie einen einzigen Zug von 15 biphasischen Impulsen mit einer Breite von jeweils 100 Mikrosekunden und einer Amplitude von 800 Mikro-Ampere bei einer Frequenz von 30 Hertz.
Ein Stimulationszug wird unmittelbar nach der Erkennung jeder erfolgreichen Hebelpresse während 10, 30 Minuten Trainingseinheiten geliefert. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die erfolgreiche Bereitstellung der Stromstimulation zu überwachen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um chronisch Vagus-Nervenmanschettenelektroden und Kopfkappen bei Ratten zu implantieren.
Während der Implantation wurde die funktionelle Validierung aller Manschetten durch Tests auf einen VNS-induzierten Tropfen der Blutsauerstoffsättigung durchgeführt. Um diese Reaktion zu beschwören, wurde ein 10-Sekunden-Zug mit 30 Hertz-Impulsen mit einer Breite von jeweils 100 Mikrosekunden und einer Amplitude von 800 Mikro-Ampere über die Manschettenleitungen geliefert. Für alle Manschetten beobachteten wir eine VNS-induzierte Einstellung der Atmung für die Dauer der 10 Sekunden Stimulation, die von einem Rückgang der Blutsauerstoffsättigung von mindestens 5% bestätigenden Manschettenfunktion und korrekter Implantation begleitet wurde.
Um die Langzeitfunktionalität der Geräte zu testen, wurden Ratten sechs Wochen nach der Implantation beästheisiert und VNS wieder angewendet. Bei sieben von neun Geräten unterschied sich die Größe der Stimulation, die eine Veränderung der Sauerstoffsättigung im Blut hervorrief, nicht von der bei der ersten Implantation beobachteten, was auf eine weiterhin ausgezeichnete Leistung hindeutet. Die beiden übrigen Geräte, die die Stimulationsamplitude auf 1,6 Milliampere erhöhten, reichten aus, um eine zuverlässige Reduktion der Sauerstoffsättigung im Blut um mindestens 5 % hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass diese Geräte weiterhin funktionieren.
Aber die Veränderungen in der Impedanz, Nervenschäden oder Manschettenausrichtung können zu einer leistungsreduzierten Leistung geführt haben. Um die Langzeitfunktionalität der chronisch implantierten Geräte weiter zu testen, wurde eine zweite Rattengruppe auf eine vereinfachte Version einer geschickten Greifhebelpressaufgabe geschult. Die Ratten mussten zwei Zentimeter vor dem Trainingsstand erreichen, um den Hebel vollständig zu drücken und ihn dann innerhalb von zwei Sekunden freizugeben.
In Übereinstimmung mit früheren Studien, die zeigten, dass die Vagusnervstimulation die Ausweitung aufgabenrelevanter Motorkartendarstellungen antreibt, zeigten VNS-behandelte Ratten signifikant größere proximale Vorderbeindarstellungen als sham behandelte Ratten. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um chronische Stimulationsexperimente in anderen Laborarten oder an anderen peripheren Nervenstandorten, einschließlich Ischias- oder Sakralnerven, unterzubringen. Zum Beispiel.
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