생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

Developmental Biology

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Summary

우라늄은 골 대사에 영향을 미칠으로 알려져 있다. 여기, 선물이 생존, 분화, 및 osteoclasts 뼈 재흡수를 담당 하 고 세포의 기능에 자연 우라늄 노출의 효과 조사 하기 위한 프로토콜.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

우라늄은 뼈 생리학 방해을 보여줘 왔다 그리고 그것은 잘이 금속 뼈에 축적 되어 설립. 그러나, 작은 뼈 세포의 행동에 자연 우라늄의 효과 대 한 알려져 있다. 특히, osteoclasts 뼈 매트릭스의 재흡수에 대 한 책임 셀에 우라늄의 충격은 문서화 되어 있지. 이 문제를 조사, 우리 osteoclast 선구자의 모델로 자연 우라늄의 원본과 murine RAW 264.7 세포 라인으로 uranyl 아세테이트를 사용 하 여 새 프로토콜을 설립 했다. 여기, 우리가 상세한 osteoclast 선구자에 우라늄 세포 독성을 테스트 하 고는 osteoclastogenesis에 그리고 성숙한 osteoclasts의 resorbing 기능에 미치는 영향을 평가 하는 데 필요한 모든 분석 실험. 우리가 개발한 조건, 특히 uranyl 포함 된 문화 미디어의 준비와 RAW 264.7 시드 셀 안정적이 고 높은 생식 결과를 얻을 수 있습니다. 또한, 우리 osteoclasts의 크기 또는 resorbed 매트릭스의 비율 등 다양 한 매개 변수 분석을 촉진 하기 위하여 소프트웨어 도구의 사용을 최적화 했습니다.

Introduction

우라늄은 자연 발생 방사능 요소 토양, 공기 및 물;에 따라서, 동물과 인간은 그들의 규정식에 있는 자연 우라늄에 노출 됩니다. 자연 소스 뿐만 아니라 우라늄 어떤 환경에서 그것의 풍부를 증가 anthropogenic 활동에서 유래. 우라늄 화학 및 방사능 위험 포즈. 그러나, (이 동위 원소 혼합물 포함 99.27 238U, 0.72 235U, 그리고 0.006 234U) 자연 우라늄 낮은 특정 활동 (25.103 Bq.g-1)가 있기 때문에 건강에 미치는 영향에 기인의 화학 독성입니다.

무엇이 든 해당 항목 경로 (흡입, 섭취, 또는 피부 노출), 대부분 우라늄의 배설물 제거는 시체를 입력 하 고 단지 작은 부분에 도달 하면 조직의 순환. 혈액에서 우라늄의 약 67%에 신장에 의해 필터링 되 고 24 h1내 소변에서 시체를 나뭇잎. 나머지는 주로 신장과 뼈, 우라늄의 독성2,,34의 두 가지 주요 표적 기관에 입금 됩니다. 여러 연구 탐험 실시 되어 골격 우라늄 장기 보존2,,34,,56의 주 사이트 발견 되었습니다, 때문에 골 생리학7에 우라늄의 효과.

뼈는 일생에 걸쳐 지속적으로 리 모델링 광물 화 된 조직 이다. 뼈는 복잡 한 프로세스 전문된 셀 형식에 따라 달라 집니다 이며 대부분의 두 단계로 구성 됩니다: osteoclasts 하 여 기존의 오래 된 매트릭스의 재흡수 osteoblasts 드 노 보 뼈 구조에 의해 옵니다. Osteoclasts 있습니다 큰 多 어디 그들은8뼈를 연결 하는 재흡수 사이트로 마이그레이션하는 조 혈 근원의 전조 세포의 융해에서 유래. 그들의 첨부 파일은 그들의 골격9의 광범위 한 개편으로 동시에 발생합니다. 이 개편은 셀과로 osteoclast secretes 양성자, hydroxyapatite, 및의 저하에 관련 된 프로 테아의 해체로 이어지는 뼈 표면 사이 격리 된 구획의 설립을 위한 필요는 유기 매트릭스입니다. 결과 저하 제품 endocytosed, 뼈 표면에 반대 막 영역에 셀을 통해 수송 되며, 분 비, transcytosis10,11을 불리는 과정.

Vivo에서 그리고 생체 외에서 학문에서 결과 우라늄 뼈 형성 억제와 osteoblasts7,12의 활동을 변경 나타냅니다. 대조적으로, 뼈 재흡수 및 osteoclasts에 우라늄의 효과 제대로 탐험 되었습니다 있다. 여러 vivo에서 연구 쥐 또는 쥐13,14uranyl 질 산의 관리 후 뼈 재흡수의 향상을 보고 있다. 또한, 역학 조사는 식 수를 통해 우라늄 섭취의 증가 경향이 남자15뼈 재흡수 표시자의 혈 청 수준에 있는 증가와 관련 된 제안 했다. 함께 찍은, 이러한 결과 우라늄, 뼈에 축적 되어 뼈 재흡수를 홍보할 수 있는 결론으로 이끌어 냈다. 그러나, 우라늄의이 잠재적인 효과에 관련 된 세포 메커니즘 미결 문제 남아 있다. 이러한 이유로, 우리는 뼈 세포 resorbing의 동작에 우라늄의 영향을 검사 하기로 결정 했다.

여기, 우리는 우리가 설정한 프로토콜 설명 하 특성화 고와 osteoclasts 차별화 및 resorptive 활동 사전 osteoclasts 생존에 자연 우라늄의 효과 계량. 여기에 설명 된 실험 RAW 264.7 murine 변형 된 macrophage 셀 라인,는 쉽게 osteoclasts 때 4 ~ 5 일에 대 한 cytokine RANKL의 존재 양식으로 분화 할 수 있다 하 고 고전적인 연구에 사용 되는 할 osteoclast 차별화 및 기능16. 개발 절차는 신뢰할 수 있는, 높은 재현성 결과는 완전히 기본 osteoclasts에 적용. 모든 이러한 이유로, 우리는이 방법론은 뼈에 우라늄 독성에 관련 된 분자 메커니즘을 더 잘 이해 해 줘 유용 믿습니다. 또한, 우리는이 이렇게 새로운 우라늄 킬레이트 화 대리인 확인을 위한 검사 도구로 적응 될 수 있다고 생각 합니다.

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Protocol

1입니다. Uranyl 아세테이트 솔루션의 준비

  1. 100 mM uranyl 아세테이트 솔루션의 2 개 mL를 준비 하려면 추가 uranyl 아세테이트 (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mg M = 424 g.mol-1) 5 mL에 플라스틱 튜브를 고체 상태에서.
  2. 플라스틱 튜브에 증류수 2 mL를 추가 하 고 플라스틱 스 토퍼 맞지.
  3. 고체의 총 해체까지 튜브를 적극적으로 악수. 24 시간 냉장고에 솔루션을 넣어.
    주의: uranyl [U(VI)]의 조작 일부 화학 및 방사능 위험을 선물 한다. 모든 샘플 준비 해야 하 고 특정 실험실에서 임시 장비와 특징. 모든 U VI 포함 된 액체 특별히 할당 된 폐기물 용기에 수집 및 독성 폐기물로 폐기. 건조 폐기물 (pipets, 튜브 ) 0.1 N HNO3 솔루션을 solubilize 및 U(VI) 제거 세척 될 수 있습니다.
  4. microelectrode와 pH 미터를 사용 하 여 솔루션의 pH를 확인 합니다.
    참고:는 microelectrode 한다 이전 보정 상업 버퍼 솔루션을 사용 하 여 (pH = 4와 pH = 7).

2. RAW 264.7 세포 배양

  1. 셀의 유지 보수입니다.
    1. 다음 성장 매체에 75 cm2 플라스 크에서 RAW 264.7 세포 (ATCC, 티비-71)을 육성: Dulbecco이 글의 중간 (DMEM) 5% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 보완 수정의: 100 IU/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스. 37 ° c, 5% CO2배양 기에서 세포를 유지 합니다.
    2. 보통 2 ~ 3 일 마다 변경 합니다. 셀 85-90% 합칠 때, 기계적으로 (로 ATCC에서 권장) 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 문화 플라스 크에서 그들을 제거 하 고 1: 6의 비율로 분할.
      참고: 구절 3 ~ 10 사이의 셀만 차별화 실험을 위해 사용 됩니다.
  2. 실험에 대 한 셀의 준비
    1. 위에서 설명한 대로 플라스 크 기판에서 세포를 꺼내 려 하 고 살 균 50 mL 튜브에 그들을 전송. 위쪽 및 아래쪽 헤어 덩어리를 pipetting으로 세포를 혼합. hemocytometer와 그들을 계산 합니다. 75 c m2 플라스 크 당 35-40 백만 셀을 기대 합니다.
    2. 다음과 같이 각 실험에 필요한 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 계산.
      실험의 수 x 1 mL/음 + 3-4 mL (pipetting 손실) x 3 (triplicates) 조건.
      참고: 5, 000 셀/c m2은이 프로토콜에서 설명 하는 모든 분석에 대 한 밀도 시드입니다. 따라서, 24-잘 접시, 그건 잘 매체의 1 ml에서 당 10, 000 셀 및 셀 서 스 펜 션 밀도 따라서 10000 셀/mL.
    3. 10, 000 셀/mL 셀 서 스 펜 션의 필요한 볼륨을 준비 하 고 24-잘 접시로 셀 씨. 세포 독성 분석 실험에 대 한 정상적인 성장 매체를 사용 합니다. 차별화와 재흡수 분석 실험, 사용 알파 최소 필수 매체 (αMEM) 2 m L-글루타민, 5 보충 수정 %FBS 및 GST RANKL17의 50 ng/mL.
      참고: GST-RANKL 사내 생산 단백질 어떤 상용 RANKL 사이토카인에 의해 대체 될 수 있다. 새로운 RANKL 일괄 처리를 작업할 때 150 ng/mL까지 20에서 RANKL 농도로 복용량 응답 실험을 수행 하 여 유도 하는 osteoclastogenesis에 그것의 효과 테스트 하는 데 유용 수 있습니다.

3. 문화 매체에서 100mm Uranyl 아세테이트 솔루션의 희석

참고: Uranyl 이온 [U(VI)] 문화 매체에 그것의 세포 독성18,,1920,21을 수정할 수 있는 다른 중간 구성 요소와 여러 단지를 형성 한다. 이러한 이유로 uranyl 포함 된 미디어 생략 또는 단축 평형 단계 없이 임기 준비 되어야 한다.

  1. Uranyl 노출 농도 선택 하 고 (고려 하는 각 조건에서에서 수행 하는 3 중) 실험에 필요한 문화 미디어의 볼륨을 계산.
  2. 7.5% 나트륨 중 탄산염 용액을 테스트 메 마른 세포 배양에서 시작 ([HCO3-] = 893 m m), 물에서 100 m m HCO3- 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 냉각.
  3. 얼음 100 m m HCO3- 솔루션, 부드럽게 흔들어 혼합 튜브의 9 볼륨 uranyl 아세테이트 100 m m 재고 솔루션의 드롭 들러 1 볼륨을 추가 합니다. 이 작업 uranyl 아세테이트 재고 솔루션을 희석 됩니다 ([2UO2 +] = 100 m m, pH 4) 10mm 약 7 산도가지고.
  4. 메 마른 물 1 볼륨 90 m m HCO3- (10 mM uranyl 솔루션에서 HCO3- 농도 같음), 컨트롤을 준비 될 것입니다 도달 얼음 100 m m HCO3- 솔루션의 9 볼륨을 추가 중간입니다.
  5. 평형에 대 한 실 온 (RT)에서 3 h 동안 서 준비 솔루션을 허용 합니다.
  6. 한편, 기본 노출 매체를 준비: αMEM 2 m L-글루타민 m와 5 %FBS.
    참고: 차별화와 재흡수 분석 실험, 기본 노출 매체에 GST RANKL의 50 ng/mL를 추가 합니다.
  7. 3 h 후 10mm uranyl 솔루션에 의해에 드롭 원하는 uranyl 농도 작업을 달성 하기 위하여 노출 매체에 적절 한 양의 희석. 노출 매체에 가장 집중된 uranyl 취급 상태에서 사용 하는 중 탄산염의 금액을 추가 하 여 동시에 제어 매체 준비.
  8. 평형에 대 한 RT에서 3 h 동안 서 준비 된 미디어를 허용 합니다.
  9. 우물에서 성장 매체를 제거 하 고 컨트롤 및 uranyl 포함 된 미디어 바꿉니다.

4. U(VI) (MTT 세포 독성 분석 실험)의 RAW 264.7 선구자 생존 분석

주의: 두 MTT와 DMSO 피부를 일으킬 수 및 눈 자극. 그들을 처리 하는 때 장갑과 눈 보호를 착용 하십시오. 구체적으로 할당 된 폐기물 용기에 폐기물을 수집 합니다.

  1. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분말 5 mg/mL에서 10 배 재고 솔루션을 얻기 위해 PBS에서의 적절 한 금액을 디졸브. 0.22 μ m 필터로 여과 하 여 소독 하 고-20 ° c.에 aliquots 저장
  2. 24-잘 접시 (접시 당 실험 조건 당 3 웰 스)에 플레이트 세포. 분 광 광도 계 공백에 대 한 접시 당 3 빈 우물을 예약 하는 것을 잊지 마십시오.
  3. 셀 연결 셀 수 있도록 우라늄 노출 전에 22-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  4. 섹션 3에에서 설명 된 대로 uranyl 포함 된 미디어를 준비 합니다.
  5. Uranyl 포함 된 셀에 씨를 뿌리고 접시에 성장 매체 대체 미디어. 24 h에 대 한 품 어.
  6. 1 x MTT 솔루션의 필요한 볼륨을 다음과 같이 계산.
    (실험 조건 + 빈의 수) x 0.4 mL/음 + 10% 볼륨 pipetting 손실에 대 한 x 3 (triplicates).
  7. 10 재고 MTT 솔루션에서이 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 페 놀 레드 없이 배를 diluting 하 여 1 x MTT 솔루션의 필요한 볼륨을 준비 합니다.
    참고: 성공적인 색도계 분석 결과 대 한 MTT 빛 으로부터 보호 되어야 한다. 배경 신호를 제한 하기 위하여 MTT DMEM 보다는 EMEM으로 희석 하는 것이 좋습니다.
  8. 우물에서 uranyl 포함 된 미디어를 제거 하 고 PBS로 그들을 씻어을 각 영역 (를 포함 하 여 공백에 대 한 3 빈 우물) MTT 솔루션의 400 µ L를 추가. 어둠 속에서 37 ° C에서 2.5 h를 품 어. 현미경 확인 가능한 셀 안에 어두운 자주색 formazan 결정을 형성 하는 있다.
  9. MTT 솔루션을 삭제 하 고 잘 당 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 220 µ L를 추가 합니다. 번호판 빛에서 그들을 보호 하 고 부드럽게 formazan 결정을 해산 하기 위해 10 분 동안 선동에 알루미늄 호 일에 포장.
  10. Microplate 분석기 리더를 사용 하 여 570에서 광학 밀도 (OD)를 결정 (formazan 특정) 및 690 nm (배경). 각 잘 570 nm OD 긁힘 또는 탁도22가능한 일반적인 OD 값 변동에 대 한 조정에서 690 nm OD를 뺍니다.
  11. 각 잘 빈 수정 OD 이전 단계에서 얻은 마약에서 빈의 말은 OD를 빼서 계산 합니다. 평균 각 실험 조건에 대 한 OD 값을 결정 합니다.
  12. 컨트롤 상태의 의미 OD 설정 ([2UO2 +] = 0 m m) 100% 생존을 다른 테스트 uranyl 농도 대 한 세포 생존 능력의 해당 비율을 계산 하 고. 복용량 응답 곡선을 플롯. 세포 독성 색인 50 (CI50), 50% 세포 죽음 후에 24 시간 노출으로 이어지는 uranyl 농도 정의 평가 합니다.

5. U(VI) 존재 Osteoclast 차별화의 분석

  1. Uranyl 및 트랩의 존재의 RAW 264.7 세포 (주석산-저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소) 얼룩.
    1. 플레이트 RAW 264.7 세포 24-잘 접시, 실험 조건 당 3 웰 스. 6 h 약 37 ° C에서 품 어 시간을 준비 하 고 노출 uranyl 포함 된 미디어를 equilibrate.
    2. 섹션 3 (잊지 마세요 미디어 GST RANKL을 추가)에 설명 된 대로 원하는 uranyl 농도로 차별화 미디어를 준비 합니다.
    3. 부드럽게 uranyl 포함 된 우물에서 기본 매체 대체 매체. 이 날 osteoclastic 차별화의 하루 0으로 간주 됩니다.
    4. 5.1.2 및 5.1.3 단계를 반복 하 여 2 또는 osteoclastic 차별화의 3 일에 매체를 변경 합니다. Multinucleated osteoclasts 주 3과 4 사이 나타납니다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 상용 백혈구 산 성 인산 가수분해 효소 키트와 트랩 얼룩을 수행 합니다.
      참고: 주석산-저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 산 성 인산 가수분해 효소 5, 저항 하는 주석산 (ACP5) 라는 매우 성숙한 osteoclasts에 표현과 osteoclast 차별화에 대 한 표식으로 광범위 하 게 사용. 따라서, 트랩 얼룩 osteoclasts 시각화를 수행 됩니다. 실험 조건 및 osteoclastogenesis의 속도 따라 하루 4 또는 5 차별화 과정의 하루에 할 수 있었다.
    6. (그들은 유지 될 수 있다 3 또는 4 주까지 이러한 조건에서) 추가 분석에 대 한 4 ° C에서 PBS에 트랩 스테인드 우물을 유지.
  2. Osteoclast 크기/형태 분석입니다.
    1. 각의 전체 표면의 이미지를 취득 합니다. 이미지의 해상도 세포 핵을 구별 하는 것 충분 해야 한다. Osteoclasts 트랩-긍정적인 셀을 3 개 이상의 핵을 고려 하십시오.
    2. ImageJ 소프트웨어에의 한 이미지 열기: "파일" → "열기".
    3. 이미지의 왼쪽된 위 모퉁이에서 축척 단위를 확인 합니다. 상대 정량화에 대 한 모든 단위를 사용할 수 있습니다. 절대 가치 osteoclast 크기의 필요한 경우 µ m 규모 단위 변환: "이미지" → "속성". 새로운 규모 단위가 나중 모든 이미지에 적용 하려면 팝업 창에서 "글로벌" 상자를 확인 합니다.
      참고: 경우에 현미경 이미지 수집을 위해 사용 되었다, µ m의 픽셀 크기 이미징 소프트웨어에 각 목표에 대 한 표시 됩니다.
    4. 분석 측정 매개 변수 지정: "분석" → "설정 측정". 측정 설정 창에서 "지역" 및 "디스플레이 레이블" 상자를 확인 하 고 모든 다른 사람을 선택을 취소 하십시오 상자.
    5. ROI (관심 지역) 관리자: "분석" → "도구" → "ROI 관리자".
    6. 주 창에서 사각형 선택 도구를 선택 합니다. 사용 하 여 어디서 나 이미지에 약 1000 x 1000 µ m의 부문 개요. 지금이 선택 크기 분석 될 것 이다 어떤 osteoclast에서 첫 번째 영역을 정의 합니다.
    7. 투자 수익 관리자 창에서 ROI 관리자에이 관심 영역을 추가 하 고 "추가" → "저장"을 클릭 하 여 그것을 저장 하려면 "추가" 버튼을 클릭 합니다. 저장 된 투자 수익 수 이제 다시 로드 투자 수익 매니저에 게 언제 든 지 "추가" → "열기"를 클릭 하 여.
    8. 반복 단계 5.2.5-5.2.6 osteoclast 크기 분석 4 추가 영역을 정의 하기 위해 (그림 2A 2D).
      참고: 정의 된 영역에서 모든 이미지 osteoclast 크기를 분석 하 사용 됩니다.
    9. 분석 5 영역 중 하나의 복사본을 만들: (해당 선택 기본 이미지에 나타납니다) ROI 관리자 메인에이 투자 수익을 선택 → 선택 → "중복" 내부 클릭 마우스 오른쪽. 이 복제를 사용 하 여 추가 분석을 위해.
    10. 투자 수익 관리자 창에서 상자 "알 쇼" l "레이블"을 확인 합니다.
    11. 주 창에서 수동으로 선택에서 osteoclasts 중 개요 다각형 선택 도구를 선택 합니다. 투자 수익 관리자 창에서 "추가"를 클릭 하 여이 개요 투자 수익 관리자에 추가 합니다. 선택 된 영역 내에 완전히 거짓말 모든 osteoclasts에 대 한 마찬가지로 진행 (그림 2B 2E).
    12. 투자 수익 관리자 창에서 모든 윤곽선을 선택 하 고 "측정"를 클릭 하 여 측정 하는 그들의 표면. 스프레드시트를 새 창 (결과 창, 그림 2C 2 층)에서 측정을 전송 합니다.
      참고:이 시점에서 모든 osteoclasts 윤곽선 분석의 지역 수로 저장할 수는 독립 이미지: "파일" → "다른 이름으로 저장" 형식의 선택.
    13. 현재 이미지의 분석의 나머지 지역에 대 한 5.2.12 5.2.8-단계 반복 합니다. 그런 다음 다른 모든 이미지에 대 한 전체 절차를 반복 합니다.
  3. Osteoclast ImageJ 소프트웨어 숫자 분석입니다.
    참고: 잘에서 osteoclast 배포 거의 동종으로, 잘 보다는 몇 가지 선택 된 영역에 전체 계산 수행 합니다. Osteoclasts는 형태와 크기, 더 세포 방법 계산 자동화 된 다른 유형의 주어진 실행입니다.
    1. ImageJ 소프트웨어 (이 분석을 위해이, 이전 하위 섹션에서 이미지를 사용)에서 전체 잘 이미지를 엽니다.
    2. 셀 카운터 창을 엽니다: "플러그인" → "분석" → "셀 카운터". "초기화"와 "1 입력" 확인란을 클릭 (또는 무엇이 든 당신이 선호 하는 번호를 입력). "번호 표시" 상자를 선택 "모드 삭제" 상자가 선택 되어 있는지 확인 합니다.
    3. 이미지에 클릭 한 osteoclast: 색 점과 숫자 클릭 한 곳에 나타납니다. 마찬가지로 모든 osteoclasts에 대 한 진행 합니다. 셀 카운터 창에서 "저장 마커"를 클릭 하 여 마커를 정기적으로 저장
      참고: 마지막 카운트에서 제거할 경우, 셀 카운터 창에서 "삭제" 클릭. 경우 하나 이상의 포인트를 제거 하려면 "삭제 모드" 상자를 확인 하 고 그들을 클릭 하 여 모든 잘못 된 요소를 나타냅니다. 다음 수를 계속 하려면 "삭제 모드" 상자를 선택 취소 합니다.
    4. 셀 카운터 창에서 결과 클릭 하 여 계산의 결과 표시 합니다. 스프레드시트를 최종 계산 결과 전송 합니다.

6. U(VI)의 Osteoclast 함수의 분석

  1. 구 덩이 재흡수의 시험
    1. Osteoclasts에 의해 resorbed 수 합성 무기 osteomimetic 표면을 제공 하는 24-잘 osteo 분석 결과 접시에 접시 RAW 264.7 세포.
      참고: 셀 생체 모방 표면에 연결 하기 위해, 그것은 종종 그들에 접시 차별화 매체를 추가 하기 전에 하루를 더 나은.
    2. 섹션 5 (단계 5.1.2-5.1.4)에 설명 된 대로 osteoclasts에 원시 246.7 세포 분화
    3. Osteoclastogenesis의 날 5, 10% 표 백제 솔루션 uranyl 포함 된 매체를 대체 하 여 osteoclasts 뼈 모방 표면에서 제거 합니다. 실 온에서 5 분 동안 품 어. 웰 스 이온된 수로 두 번 세척 하 고 그들이 건조.
    4. 얼룩 resorbed 비 지역에서 칼슘 소금 우물에 1% 알리자린 레드 S 나트륨 소금 솔루션을 추가 합니다. 외피의 10-15 s 후 알리자린 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 씻어 3-4 회 물으로 우물. 우물 건조 보자입니다.
      참고: 위에서 설명한 착 절차는 연속 분석을 촉진 하기 위하여는 resorbed와 비 resorbed 영역 간의 대비를 향상 하도록 설계 되었습니다. 이 절차는 웰 스 얼룩 전에 완전히 건조 하지 않습니다, 경우 나머지 뼈 모방 표면 부분의 실수로 제거 될 수 있기 때문에 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 알리자린 솔루션 우물에 너무 오래 두면 영구 일반적인 얼룩이 나타납니다. 그것은이 섹션에 설명 된 테스트 osteoclastic 감 별 법 및 기능에 우라늄의 효과에 관한 지적 한다. Osteoclast 형성 독립적으로 재흡수에 우라늄의 효과 연구, RAW 264.7 세포 uranyl 포함으로 대우 될 수 있다 성숙한 osteoclasts (하루 4 또는 5의 차별화 과정)에서 형성 된다 한 번만 24 시간 동안 중간 23.
  2. 구 덩이 재흡수 분석.
    1. Osteo 분석 결과 접시의 각의 전체 표면의 이미지를 취득 합니다.
      참고: 이미지 수집 방법은 다를 수 있습니다 하지만 복제 실험에 걸쳐 일관 되어야 한다. 그들은 고정된 카메라, 고해상도 스캔 또는 자동된 높은 처리량 현미경으로 만든 모자이크 이미지의 매크로 목표와 함께 찍은 사진을 포함할 수 있습니다.
    2. 5.2.2를 5.2.4 이전 섹션에서 단계를 반복 하 여 분석을 시작 합니다.
    3. RGB 이미지를 그레이 스케일 8 비트 형식으로 변환: "이미지" → "입력" → "8 비트".
    4. 주 창에서 타원형 선택 도구를 선택 합니다. 그것를 사용 하 여 개요의 재흡수에 대 한 분석 잘 모든 표면 원을 그립니다.
    5. 5.2.6 단계에서이 새로운 수익을 저장 합니다.
    6. 임계값 선택, 촉진 하기 위하여 정의 된 ROI는 모든 기능 취소: "편집" → "외부" 취소.
      참고:이 시점에서 그것은 종종 이미지의 몇 가지 복사본을 만들기 위해 더 나은: ROI → 오른쪽 클릭 선택한 영역 이미지 → "중복" 외부를 클릭 하 여 선택 해제 하십시오. 이 작업은 다음 단계에서 선택한 임계값을 만족 하지 않으면 위에서 설명한 이미지 처리의 반복을 피하기 위해 도움이 됩니다.
    7. "이미지" → "조정" → "임계값"을 선택 합니다. 임계값 창에서 적절 한 임계값을 선택 하려면 슬라이더 막대를 사용 합니다. 모든 resorbed 영역 임계값 (흰색) 및 비-resorbed, (빨간) 위. 임계값 선택 완료 하려면 임계값 창에서 "적용" 클릭 합니다.
    8. 최종 이진 이미지를 저장: "파일" → "다른 이름으로 저장" → 형식 선택의.
    9. 관심 영역에서 측정을 정의: "분석" → "설정 측정". 측정 설정 창에서 "지역", "일부 지역" 및 "임계값 제한" 상자를 확인 하 고 다른 모든 선택을 취소 합니다.
    10. 결과 창에서 직접 "resorbed" 영역의 일부분을 얻기 위하여 ("편집" → "반전") 하는 바이너리 이미지를 반전 합니다. 주요 투자 수익 최종 이진 이미지에 선택 되어 있는지 확인 (그렇지 않으면 resorbed 지역 분수 계산 됩니다 전체 이미지 창의 표면에 따라). 의해 측정 resorbed 지역 분수 클릭 "측정" 또는 투자 수익 관리자 창에서 "분석" → "측정". 결과 저장 합니다.

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Representative Results

주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 얼룩 3 개 이상의 핵 데 큰 보라색 셀 osteoclasts 시각화 사용 되었다. RANKL의 경작 된 RAW 264.7 세포에서 얻은 osteoclasts의 대표 이미지 그리고 uranyl 이온 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclasts 우라늄에 대 한 응답에서의 수와 크기에 변화 전체 우물의 합성 이미지와 확대 사진을 쉽게 볼 수 있습니다.

Osteoclasts의 크기 ImageJ 소프트웨어 (그림 2)를 사용 하 여 분석 했다. 이 목적에 대 한 트랩 osteoclasts 스테인드의 전체 잘 이미지 사용 되 고 동일한 지역에 각 문화 조건의 각 잘 대우 되었다 (그림 2A 2D). 각 지역에 있는 모든 osteoclasts 설명 했다 (그림 2B 2E)는 그들의 지역 (µ m2로 표현)의 결정을 허용 (그림 2C 2 층). 그림 2 에 표시 된 예는 osteoclast 크기에 우라늄의 강한 영향을 보여 줍니다.

Osteoclast 재흡수 활동에 우라늄의 영향 조사, RAW 264.7 세포 도금 되었고 osteomimetic 표면에 분화. 분석 결과의 끝에, osteoclasts 제거 되었습니다. 각 골 모방 표면 잘 대우 되었다 알리자린 레드 S 나트륨 소금 비 resorbed 지역 얼룩 위해 그리고 각 전체 이미지 잘 인수 했다 (그림 3A 3D). 결과 사진 이미지 J 소프트웨어와 함께 처리 했다. 그들은 8 비트 그레이 스케일 이미지에서 개조 되었다 (그림 3B 그리고 3E), 임계 처리를 복종 된 (그림 3C 3 층) resorbed 지역 (백인 지역)은 자동으로 계산 됩니다.

Figure 1
그림 1: osteoclast 형성에 U(VI)의 효과의 시각화. Uranyl의 표시 된 농도의 RAW 264.7 세포 분화 되었다. 4 일에 수행 되었다 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 얼룩. 대표 전체 잘 현미경 (위 패널) 트랩 스테인드 osteoclasts 이러한 조건에서 얻은 보여줍니다. 예 multinucleated osteoclasts 박스형된 영역에서의 높은 배율 (하단 패널에서 화살표)에 표시 됩니다. 이 사진 osteoclast 형성에 U(VI)의 복용량-의존 효과를 보여 줍니다. 검은 머리 화살표 osteoclast 핵의 예를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: osteoclast 크기에 U(VI)의 효력의 분석. (AD): 박스형 영역에 해당 하는 osteoclast 크기 분석 영역 osteoclasts의 전체 잘 이미지 표시 됩니다. 빨간색 상자 영역에 표시 된에 해당 하는 (A와 D)에 (B)와 (E), 각각. (BE): 두 uranyl 농도 조건에서 osteoclast 가장자리의 수동 그림 파란색으로 표시 됩니다. (CF): (B와 E) 분석에서 측정을 각각 보여주는 ImageJ 소프트웨어에서 윈도 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: osteoclast 함수에 U(VI)의 효력의 분석. 알리자린 스테인드 osteomimetic 표면 uranyl (D)의 25 µ M의 존재 또는 부재 (A)에서 개최 되었던 osteoclastic 재흡수 후의 이미지. (BE)에서 같이 (AD) 사진 처음 8 비트 그레이 스케일 이미지에서 개조 되었다 그 후, 적당 한 임계값 설정을 적용 하 여 이진 이미지 (CF)와. 이러한 이진 이미지는 각 조건에 resorbed 영역의 비율을 계산 하기 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

우리가 알기로 이것이 처음으로 뼈 세포를 resorbing에 자연 우라늄의 효과 연구를 목표로 자세한 절차 설명 하. 이 방법은 뼈 생리학에 우라늄 영향의 더 나은 이해를 달성 하는 데 유용 되며 우라늄 chelators의 심사에 대 한 흥미로운 새로운 도구를 제공할 수 있습니다. 또한, 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 osteoclatogenesis에 다른 중 금속의 영향을 연구에 적용 될 수 믿습니다.

그것은 알려져 그 uranyl는 문화 미디어18,19,,2021에 무기 및 유기 구성 요소와 complexed. 이러한 complexations speciation 우라늄의 그리고,이 방법으로, 그것의 세포 독성 영향. 이러한 이유로, 프로토콜에 중요 한 단계는 문화 미디어를 포함 하는 우라늄의 준비 합니다. 우리는 이전23 RAW 264.7 세포의 배양에서 5% 태아 둔감 한 혈 청의 존재 했다 uranyl 0에서 400 µ M에 배열 하는 농도에서 사용 될 때의 세포 독성에 더 큰 영향을 보여주었다. 이것은 매체에서 혈 청의 존재 osteoclastic 차별화의 전체 과정 동안 우라늄 노출의 효과 분석 하는 데 필요한 중요 한 포인트입니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 노출 매체 (6 시간)의 준비에 대 한 설명 하는 긴 2 단계 절차 신중 하 게 따라야 강조 하고자 합니다. 실제로, 3 시간 후 uranyl 소금의 각 희석 uranyl 단지의 안정화를 잠재적으로 수의 인큐베이션 단계 더 희석 또는 셀 노출 하기 전에 솔루션에서 형성. 이것이 절대적으로 안정적이 고 재현 가능한 결과 얻기 위해 필요 합니다.

Osteoclast 차별화와 재흡수 분석 실험의 재현성에 대 한 또 다른 중요 한 매개 변수는 원시 264의 시드 밀도.7 셀. 실제로, 단 전조 밀도 osteoclast 형성에 대 한 중요 한 결정 대부분의 아마 때문에 셀 근접 영향 세포 융합 이벤트24표시 되었습니다. 따라서, 계산, 세포 현 탁 액 준비와의 오해를 피하기 위해 각 잘에서 시드 셀에 특히 주의 지불 한다.

임계 처리 도구는 재흡수의 정량화를 자동화 하는 데 유용. 그것은이 분석 지적 가치가 제대로 조명된 이미지 필요 합니다. 그러나, 카메라와 이미지 수집 방법의 종류에 관계 없이 일반적인 문제는 이미지의 가장자리에 고르지 못한 조명입니다. 이 경우, 다단계 임계 처리 메서드가 필요할 수 있습니다.

요약 하자면, 우리는 우라늄 osteoclast 형성, 생존 능력 및 기능에 미치는 영향의 연구를 허용 하는 강력한 프로토콜을 설립 했다. 이 절차 RAW 264.7 세포 라인을 사용 하 여 개발 되었습니다 하지만23를 같이 우리 주 골 osteoclast 선구자에 완전히 적용 됩니다.

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Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

저자 Chantal Cros 도움이 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다.
이 연구는에서 교부 금에 의해 투자 되었다는 "Commissariat à l'Energie Atomique 외 보조 에너지 대안" (URANOs-프로그램 횡단 de Toxicologie du CEA와 CPRR CEA-AREVA), ANR에서 (우라늄의 독성: biomineralization의 다단계 접근 뼈, ANR-16-CE34-0003에서에서 처리). 이 작품 또한 좋은 소피아 앙 티 폴리스는 CNRS의 대학에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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