Metoder för att analysera effekterna av naturligt uran på In Vitro Osteoclastogenesis

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Uran är kända för att påverka benmetabolism. Här presenterar vi ett protokoll som syftar till att undersöka effekten av naturligt uran exponering på livskraft, differentiering och funktionen av osteoklasterna, cellerna som ansvarar för benresorption.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uran har visat sig störa ben fysiologi och det är klart fastställt att denna metall ackumuleras i ben. Men är lite känt om effekten av naturligt uran på uppförandet av benceller. I synnerhet är effekterna av uran på osteoklasterna, cellerna som är ansvariga för resorption av ben matrisen, inte dokumenterad. För att undersöka denna fråga, har vi etablerat ett nytt protokoll med uranyl acetat som en källa av naturligt uran och den murin cellinje-RAW 264,7 som en modell av osteoclast prekursorer. Häri, detaljerad vi alla de analyser som krävs för att testa uran cytotoxicitet på osteoclast prekursorer och utvärdera dess inverkan på osteoclastogenesis och resorbing fungera av mogna osteoklaster. Villkoren har vi utvecklat, i synnerhet för beredning av uranyl-innehållande kulturmassmedia och för odling av RAW 264,7 celler gör för att få tillförlitlig och mycket reproduktiv resultat. Dessutom har vi optimerat användningen av programvaruverktyg för att underlätta analysen av olika parametrar såsom storleken på osteoklaster eller andelen resorberas matris.

Introduction

Uran är ett naturligt förekommande radioaktivt grundämne som förekommer i jord, luft och vatten; som sådan, utsätts djur och människor för naturligt uran i sin kost. Förutom naturliga källor påbörjar uran från antropogena aktiviteter, vilket ökar dess överflöd i miljön. Uran medför både kemiska och radiologiska faror. Men eftersom naturligt uran (vilket är en isotopisk blandning innehållande 99,27% 238U och 0,72% 235U 0,006% 234U) har en låg specifik aktivitet (25,103 Bq.g-1), dess hälsoeffekter tillskrivs dess kemisk toxicitet.

Oavsett dess post rutt (inandning, förtäring eller dermal exponering), mest av uran kommer in i kroppen elimineras med avföring och endast en liten del når den systemiska cirkulationen. Cirka 67% av uran i blodet filtreras i sin tur av njurarna och lämnar kroppen i urin inom 24 h1. Resten är mestadels deponeras i njurar och ben, de två viktigaste målorganen av uran toxicitet2,3,4. Eftersom skelettet har identifierats som den primära platsen av uran långsiktiga retention2,3,4,5,6, flera studier har genomförts för att utforska den effekt av uran på ben fysiologi7.

Ben är en mineraliserad vävnad som är kontinuerligt renoverats under hela dess livstid. Benremodellering är en komplex process som beror på specialiserade celltyper och består mestadels av två faser: resorption av befintliga gamla matrisen av osteoklaster följt av de novo ben konstruktion av osteoblaster. Osteoklaster är stora multinukleära celler som härrör från fusionen av prekursorceller av hematopoetiska ursprung som migrerar till benresorption platser där de fäster ben8. Deras fastsättning sker samtidigt med en omfattande omorganisation av deras cytoskelettet9. Denna omorganisation krävs för inrättandet av en isolerad fack mellan cellen och benytan som utsöndrar osteoclast protoner, vilket leder till upplösningen av hydroxyapatit och proteaser deltar i nedbrytningen av den organisk matris. Resulterande nedbrytningsprodukterna är endocytosed, transporteras genom cellen till området membran motsatt benytan och utsöndras, en process som kallas transcytos10,11.

Resultat från in-vivo och in vitro- studier visar att uran hämmar benbildningen och ändrar antalet och aktiviteten av osteoblaster7,12. Effekterna av uran på benresorption och osteoklaster har däremot varit dåligt utforskat. Flera in-vivo studier har rapporterat en förbättring av benresorption efter administrering av uranyl nitrat till möss eller råttor13,14. Dessutom föreslagit en epidemiologisk utredning att ökningen av uran intag via dricksvattnet tenderade att vara förknippad med en ökning av serum nivån av benresorption markör i män15. Sammantaget dessa fynd ledde till slutsatsen att uran, som ackumuleras i ben kunde främja benresorption. De cellulära mekanismerna som är inblandade i denna potentiella effekt av uran är dock fortfarande en öppen fråga. Därför beslutade vi att undersöka effekterna av uran på uppförandet av resorbing benceller.

Här, vi beskriver de protokoll som vi har fastställt att karakterisera och kvantifiera effekterna av naturligt uran före osteoklaster livskraft och osteoklaster differentiering och resorberande aktivitet. De experiment som beskrivs häri har gjorts med RAW 264,7 murina transformerad makrofag cell-linjen, som lätt kan differentieras till osteoklaster när odlade i närvaro av cytokin RANKL för 4 eller 5 dagar, och som klassiskt används för att studera osteoclast differentiering och funktion16. De förfaranden som utvecklas är tillförlitliga, ge mycket reproducerbara resultat och är fullt tillämpliga på primära osteoklaster. Alla dessa skäl anser vi att denna metod är användbar för att få en bättre förståelse av molekylära mekanismer som är involverade i uran toxicitet i ben. Dessutom tror vi att denna metod kunde anpassas som en screeningmetod för att identifiera nya uran kelatbildare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av Uranyl Acetat lösning

  1. För att förbereda 2 mL av en 100 mM uranyl Acetat lösning, tillsätt 85 mg uranyl acetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) i fast tillstånd till ett 5 mL plaströr.
  2. Tillsätt 2 mL destillerat vatten till plast röret och montera den med plast propp.
  3. Skaka tuben kraftigt tills den totala upplösningen av fast. Sätta lösningen i kylskåpet för 24 h.
    FÖRSIKTIGHET: Manipulering av uranyl [rådande] presenterar några kemiska och radiologiska faror. Alla prover bör förberedas och kännetecknas med ad hoc-utrustning i särskilda laboratorier. Alla U VI-innehållande vätskor bör samlas i specifikt tilldelade avfallsbehållare och bortskaffas som giftigt avfall. Torrt avfall (pipetter, rör, etc.) kunde tvättas med 0,1 N HNO3 lösning som kommer att solubilize och ta bort rådande.
  4. Kontrollera pH-värdet i lösningen med en mikroelektrod och pH-mätare.
    Obs: Mikroelektrod bör tidigare kalibreras med hjälp av kommersiella buffertlösningar (pH = 4 och pH = 7).

2. RAW 264.7 cellkultur

  1. Underhåll av cellerna.
    1. Odla RAW 264,7 celler (ATCC, TIB-71) i 75 cm2 kolvar i följande odlingsmedium: Dulbecco ändrade örnens medium (DMEM) kompletteras med 5% fetalt bovint Serum och antibiotika: 100 IE/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin. Upprätthålla celler i inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
    2. Ändra medium varje 2 till 3 dagar. När cellerna är 85-90% konfluenta, mekaniskt ta bort dem från kultur kolven med en cell skrapa (som rekommenderas av ATCC) och dela upp dem i ett förhållande av 1:6.
      Obs: endast celler mellan passager 3 till 10 används för differentiering experiment.
  2. Beredning av cellerna för experiment
    1. Rubba celler från kolven substratet som beskrivs ovan och överföra dem till en steril 50 mL tub. Blanda celler genom pipettering upp och ned för att bryta upp klumpar. Räkna dem med en hemocytometer. Räkna med 35-40 miljoner celler per 75 cm2 kolv.
    2. Beräkna volymen av celler suspension nödvändigt för varje experiment enligt följande:
      Antal experimentella villkor x 3 (exemplar) x 1 mL per brunn + 3-4 mL (pipettering förluster).
      Obs: Sådd densitet för alla analyser som beskrivs i detta protokoll är 5 000 celler/cm2. Därför för en 24-väl plåt, det betyder 10 000 celler per brunn i 1 mL av medium och cell uppskov densiteten är alltså 10 000 celler/mL.
    3. Förbereda nödvändig volym av 10 000 celler/mL cellsuspension och utsäde cellerna in 24 brunnar. Använd normalt odlingsmedium för cytotoxicitet analyser. För differentiering och resorption analyser, använda alpha modifierade minst viktigt Medium (αMEM) kompletteras med 2 mM L-glutamin, 5% FBS och 50 ng/mL GST-RANKL17.
      Obs: Den GST-RANKL protein som produceras in-house kan ersättas med någon kommersiellt tillgänglig RANKL cytokin. När du arbetar med en ny RANKL-batch, kan det användbart för att testa dess effektivitet för att framkalla osteoclastogenesis genom att utföra en dos svar experiment med RANKL koncentration allt från 20 till 150 ng/mL.

3. spädning av 100 mM Uranyl acetat-lösningen i odlingsmedium

Obs: Uranyl joner [rådande] i odlingsmedium bildar flera komplex med andra medelstora komponenter som kan ändra sina cellulär toxicitet18,19,20,21. Av denna anledning bör uranyl-innehållande media vara tempore utan utelämnande eller förkorta Jämviktstiden steg.

  1. Valde uranyl exponering koncentrationer och beräkna volymer av kultur media krävs för experimentet (med hänsyn till att varje villkor utförs i tre exemplar).
  2. Start från steril cellkulturen testade 7,5% natriumbikarbonat vattenlösning ([HCO3] = 893 mM), förbereda en 100 mM HCO3 lösning i vatten och kyla det på is.
  3. Tillsätt droppvis-1 volym av uranyl acetat 100 mM stamlösning till 9 volymer av iskall 100 mM HCO3 lösning, försiktigt skaka blandande röret. Denna operation kommer att späda ut uranyl acetat stamlösning ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) till 10 mM och föra pH runt 7.
  4. Lägga till 1 volym sterilt vatten i 9 volymer av iskall 100 mM HCO3 lösning att nå 90 mM HCO3 (lika med HCO3 koncentration i 10 mM uranyl lösningen), som kommer att kunna förbereda kontroll medium.
  5. Tillåta beredda lösningar att stå för 3 h i rumstemperatur (RT) för Jämviktstiden.
  6. Under tiden förbereda grundläggande exponering medium: αMEM med 2 mM L-glutamin och 5% FBS.
    Obs: För differentiering och resorption analyser, lägga till 50 ng/mL av GST-RANKL till grundläggande exponering medium.
  7. Efter 3 h, späd lämpliga mängder 10 mM uranyl lösningen droppvis i exponering medlet för att uppnå den önskade uranyl arbetar koncentrationer. Förbered samtidigt kontroll mediet genom att lägga till mängden bikarbonat används i mest koncentrerade uranyl-behandlade villkoret, till exponering medium.
  8. Tillåta beredda media stå i 3 h på RT för Jämviktstiden.
  9. Ta bort tillväxt medier från brunnarna och ersätta den med kontrollen och uranyl-innehållande media.

4. analys av RAW 264.7 prekursorer livskraft i närvaro av rådande (MTT cytotoxiska analyser)

FÖRSIKTIGHET: Både MTT och DMSO kan orsaka hud och ögonirritation. Använd handskar och skyddsglasögon vid hantering av dem. Samla avfallsprodukter i specifikt tilldelade avfallsbehållare.

  1. Lös upp en lämplig mängd 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) pulver i PBS att erhålla 10 x stamlösning vid 5 mg/mL. Sterilisera det genom filtrering med 0,22 µm filter och förvara alikvoter vid-20 ° C.
  2. Platta celler på 24 brunnar (3 brunnar per experimentella villkor per platta). Glöm inte att reservera 3 tomma brunnar per platta för spektrofotometer tomrummen.
  3. Inkubera cellerna vid 37 ° C för 22-24 h innan uran exponering att låta celler bifoga.
  4. Förbereda uranyl-innehållande media som beskrivs i avsnitt 3.
  5. Ersätta odlingsmedium i cell-seedade tallrikar med uranyl-innehållande media. Inkubera under 24 h.
  6. Beräkna den nödvändiga volymen 1 x MTT lösning enligt följande:
    (Antal experimentella förhållanden + tom) x 3 (exemplar) x 0,4 mL per brunn + 10% volym för pipettering förluster.
  7. Förbereda volymen som krävs av 1 x MTT lösning genom att späda 10 x stamlösning MTT i örnens minst viktigt Medium (EMEM) utan fenolrött.
    Obs: för en lyckad kolorimetriska analys, MTT bör skyddas från ljus. Det rekommenderas att späda MTT i EMEM snarare än DMEM för att begränsa den bakgrund signalen.
  8. Ta bort uranyl-innehållande media från brunnarna, tvätta dem med PBS och tillsätt 400 µL MTT lösning till varje brunn (inklusive 3 tomma brunnar för tomma celler). Inkubera 2,5 timmar vid 37 ° C i mörker. Kontrollera under Mikroskop att mörka lila formazan kristaller har bildats inuti viabla celler.
  9. Kassera den MTT lösningen och tillsätt 220 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) per brunn. Wrap plåtar i aluminiumfolie för att skydda dem från ljuset och blanda försiktigt i ca 10 min att upplösa formazan kristaller.
  10. Använda en mikroplattan spektrometer läsare för att avgöra den optiska densiteten (OD) vid 570 nm (formazan specifik) och 690 nm (bakgrund). För varje brunn, subtrahera 690 nm OD från 570 nm OD att justera för möjliga icke-specifika OD värdeförändringar på grund av repor eller grumlighet22.
  11. Beräkna blank-korrigerade OD för varje brunn genom att subtrahera genomsnittliga OD av Tom från OD erhållits i föregående steg. Bestämma medelvärdet OD-värde för varje experimentella villkor.
  12. Ange medelvärdet OD av villkoret kontroll ([UO22 +] = 0 mM) 100% lönsamhet och beräkna den motsvarande procentandelen av cellernas viabilitet för andra testade uranyl koncentrationer. Rita en dos-respons kurva. Utvärdera de cytotoxicitet Index 50 (CI50), definierat som uranyl koncentrationen leder till celldöd 50% efter 24 h exponering.

5. analys av Osteoclast differentiering i närvaro av rådande

  1. Differentiering av RAW 264,7 celler i närvaro av uranyl och TRAP (tartrat-resistenta syra fosfatas) färgning.
    1. Tallrik rå 264,7 celler på en 24-well platta, 3 brunnar per experimentella villkor. Inkubera vid 37 ° C i ca 6 h, tid att förbereda och temperera uranyl-innehållande exponering media.
    2. Förbered differentiering med önskad uranyl koncentrationer som beskrivs i avsnitt 3 (inte Glöm att lägga till GST-RANKL i media).
    3. Försiktigt ersätta bassubstratet i brunnar med uranyl-innehållande medium. Denna dag är ansedd som dag 0 osteoklastisk differentiering.
    4. Ändra mediet på dag 2 eller 3 i osteoklastisk differentiering genom att upprepa steg 5.1.2 och 5.1.3. Multinucleära osteoklaster ska visas mellan dag 3 och 4.
    5. Utför TRAP färgningen med kommersiellt tillgängliga leukocyt syra fosfatas kit följa tillverkarens instruktioner.
      Obs: tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) även kallad syra fosfatas 5, tartrat resistenta (ACP5) är starkt uttryckt i mogna osteoklaster och i stor utsträckning används som markör för osteoclast differentiering. Därför utförs fälla färgning för att visualisera osteoklaster. Beroende på experimentella förhållanden och graden av osteoclastogenesis, kunde det göras på dag 4 eller dag 5 av differentiering processen.
    6. Hålla TRAP-färgade brunnar i PBS vid 4 ° C för ytterligare analys (de kan bibehållas under dessa förhållanden upp till 3 eller 4 veckor).
  2. Osteoclast storlek/morfologi analys.
    1. Skaffa en bild av hela ytan av varje brunn. Upplösningen på bilden bör vara tillräckligt att skilja cellkärnor. Betrakta TRAP-positiva celler med 3 eller fler kärnor, som osteoklasterna.
    2. Öppna en bild av en brunn i programmet ImageJ: ”Arkiv” → ”Öppna”.
    3. Verifiera skalningsenheter i det övre vänstra hörnet av bilden. För relativ kvantifiering, kan någon enhet användas. Om det absoluta värdet av osteoclast storlek är nödvändigt, konvertera skalningsenheter till µm: ”Image” → ”egenskaper”. Markera rutan ”global” i popup-fönstret för att få nya skalenheter som tillämpas på alla bilder öppnas senare.
      Obs: Om Mikroskop användes för bild förvärvandet, pixelstorlek i µm är indicerat för varje mål i avbildningsprogrammet.
    4. Ange mätparametrar som skall analyseras: ”analysera” → ”ange mätningar”. I fönstret Ange mätningar kryssrutorna ”område” och ”Visa etiketten” och avmarkera alla andra lådor.
    5. Öppna hanteraren för ROI (region av intresse): ”analysera” → ”verktyg” → ”ROI Manager”.
    6. I huvudfönstret, Välj verktyget Rektangulär markering. Använda det överallt i bilden för att skissera en sektor av ca 1000 x 1000 µm. Detta val nu definierar den första regionen i vilken osteoclast storlek kommer att analyseras.
    7. I fönstret ROI Manager, klicka på ”Lägg till” knappen för att lägga till denna region av intresse till ROI manager och spara den genom att klicka på ”mer” → ”Spara”. Den Spara ROI kan nu laddas till ROI manager när som helst genom att klicka på ”mer” → ”öppna”.
    8. Upprepa steg 5.2.5 - 5.2.6 att definiera 4 ytterligare regioner för osteoclast storlek analys (figur 2A och 2D).
      Obs: De definiera regionerna kommer att användas för att analysera osteoclast storlekar i alla bilder.
    9. Skapa en kopia av en av de 5 regionerna ska analyseras: valde denna ROI i huvudsak ROI chefen (motsvarande markeringen visas på huvudbilden) → Högerklicka inuti i urval → ”dubblett”. Använd denna dubblett för vidare analys.
    10. I fönstret ROI Manager, kryssrutorna ”Visa Al” l och ”etiketter”.
    11. I huvudfönstret, Välj polygon markeringsverktyget till manuell disposition en av osteoklaster i markeringen. Lägg till detta utkast till ROI manager genom att klicka på ”Lägg till” i fönstret ROI manager. Fortsätt på samma sätt för alla osteoklasterna som ligger helt inom den valda regionen (figur 2B och 2E).
    12. I fönstret ROI Manager, Välj alla konturerna och mäta deras yta genom att klicka på ”åtgärd”. Överföra de mått som har dykt upp i ett nytt fönster (resultat fönster, figur 2 c och 2F) till ett kalkylblad.
      Obs: Vid denna punkt, regionen av analys med alla osteoklaster konturer kan sparas som en oberoende bild: ”” → ”Spara som” filformat val.
    13. Upprepa steg 5.2.8 - 5.2.12 för de återstående regionerna av analys av den aktuella bilden. Upprepa hela proceduren för alla övriga bilder.
  3. Osteoclast nummer analys med ImageJ programvara.
    Obs: Som osteoclast distribution i brunnen är sällan homogen, utföra räkna på det hela taget väl i stället för på några valda zoner. Osteoklaster är heterogena i form och storlek, inte automatiserade inventeringsmetod cell är praktiskt möjligt.
    1. Öppna en hela-bra bild i programmet ImageJ (för denna analys, Använd bilder från föregående avsnitt).
    2. Öppna fönstret cell counter: ”Plugins” → ”analysera” → ”Cell Counter”. Klicka på kryssrutan ”typ 1” och ”Initialize” (eller vad Skriv numret som du föredrar). Kontrollera att ”visa nummer” är ikryssad och ”ta bort Mode” rutan är avmarkerad.
    3. På bilden, klicka på en osteoclast: färgad prick och ett nummer visas där du klickade. Fortsätt på samma sätt för alla osteoklaster. Spara markörer regelbundet genom att klicka på ”Spara markörer” i fönstret cell counter
      Obs: Om den sista punkten har tagits bort från räkningen, klicka på ”Radera” i fönstret cell counter. Om det finns mer än en punkt att ta bort, markera rutan ”ta bort Mode” och ange alla ogiltiga punkter genom att klicka på dem. Sedan avmarkera rutan ”ta bort Mode” för att fortsätta räkna.
    4. Visa resultatet av räkna genom att klicka på resultat i fönstret cell counter. Överföra de slutliga beräkningsresultat till ett kalkylblad.

6. analys av Osteoclast funktion i närvaro av rådande

  1. Grop resorption assay.
    1. Tallrik rå 264,7 celler på en 24-väl osteo assay plattan, som ger en syntetiska oorganiska osteomimetic yta som kunde vara resorberas av osteoklaster.
      Obs: för att låta celler bifoga biomimetiska yta, är det ofta bättre att plattan dem dagen innan du lägger till differentiering medium.
    2. Differentieras RAW 246,7 celler till osteoklaster som beskrivs i avsnitt 5 (steg 5.1.2 - 5.1.4)
    3. På dag 5 av osteoclastogenesis, ta bort osteoklaster från mimetiska benytan genom att ersätta uranyl-innehållande medium med 10% blekmedel lösning. Inkubera i 5 min i rumstemperatur. Tvätta brunnarna två gånger med avjoniserat vatten och låt dem lufttorka.
    4. Lägga till en 1% Alizarin Red S natrium salt lösning till brunnarna att färga kalciumsalter i områdena icke-resorberas. Ta bort Alizarin lösning efter 10-15 s inkubation och försiktigt Tvätta brunnarna 3 - 4 gånger med vatten. Låt brunnarna lufttorka.
      Obs: Färgning proceduren ovan är avsedda att öka kontrasten mellan det resorberas och de icke-resorberas områdena för att underlätta efterföljande analys. Denna procedur måste göras noggrant eftersom om brunnar inte är helt torr innan färgning, delar av den kvarvarande ben-mimetiska ytan kunde tas bort av misstag. Dessutom om Alizarin lösning är kvar för länge i brunnarna, visas en ihållande icke-specifik färgning. Det bör noteras att den provning som beskrivs i detta avsnitt avser effekten av uran på både osteoklastisk differentiering och funktion. För att studera effekten av uran på resorption oberoende av osteoclast bildandet, RAW 264,7 celler kan behandlas med uranyl-innehållande medium för 24 timmar, först när mogna osteoklaster bildas (på dag 4 eller 5 av differentiering processen) 23.
  2. Grop resorption analys.
    1. Skaffa en bild av hela ytan av varje brunn av osteo assay plattan.
      Obs: Bilden förvärvsmetoder kan variera men bör vara konsekvent i hela replikera experiment. De kan innehålla en bild tagen med ett makro mål för en fast kamera, en högupplöst skanning eller en mosaik bild med en automatiserad hög genomströmning mikroskopet.
    2. Påbörja analysen genom att upprepa steg 5.2.2 till 5.2.4 från föregående avsnitt.
    3. Konvertera en RGB-bild till en gråskala 8-bitars format: ”Image” → ”typ” → ”8-bitars”.
    4. I huvudfönstret, Välj verktyget oval markering. Använda det för att rita en cirkel som beskriver alla ytan av brunnen för att analyseras för resorption.
    5. Spara denna nya ROI som i steg 5.2.6.
    6. För att underlätta tröskeln urval, avmarkera alla funktioner utanför den definiera ROI: ”redigera” → ”rensa utanför”.
      Obs: Vid denna punkt, är det ofta bättre att göra några kopior av bilden: Avmarkera ROI genom att klicka utanför den markerade zonen → Högerklicka på bild → ”dubblett”. Denna åtgärd kommer att bidra till att undvika en upprepning av bild behandling beskrivs ovan om tröskeln valt i nästa steg är otillfredsställande.
    7. Välj ”bild” → ”justera” → ”tröskel”. I fönstret tröskel, Använd skjutreglaget för att välja en lämplig tröskel. Alla resorberas områden bör det tröskelvärdet (vit) och icke-resorberas, ovan (röd). För att slutföra tröskel markeringen, klicka på ”Apply” i fönstret tröskel.
    8. Spara den slutliga binära bilden: ”” → ”Spara som” → format för ditt val.
    9. Definiera mått tas i regionen av intresse: ”analysera” → ”ange mätningar”. I fönstret Ange mätningar, Kontrollera ”område”, ”området bråk” och ”begränsa till tröskel” lådor och avmarkera alla andra.
    10. För att erhålla fraktionen av ”resorberas” område direkt i fönstret resultat, Invertera binära bilden (”redigera” → ”Invertera”). Kontrollera att den huvudsakliga ROI är markerad på den slutliga binära bilden (annars resorberas området bråkdel beräknas baserat på ytan av hela bildfönstret). Åtgärd resorberas området bråk genom att antingen klicka på ”åtgärd” i fönstret ROI manager eller på ”analysera” → ”mäta”. Spara resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tartrat-resistenta syra fosfatas färgning användes för att visualisera osteoklasterna som stora lila celler som har 3 eller fler kärnor. Representativa bilder av osteoklaster erhållits från RAW 264,7 celler odlade i närvaro av RANKL och uranyl joner visas i figur 1. Förändringar i antal och storlek av osteoklaster svar på uran är väl synlig i sammansatta bilder av hela brunnar och förstorade bilder.

Storleken på osteoklaster analyserades med hjälp av ImageJ programvara (figur 2). För detta ändamål användes hela-bra bilder av TRAP målat osteoklaster och samma regioner behandlades i varje brunn av varje kultur villkor (figur 2A och 2D). Alla osteoklaster närvarande i varje region har beskrivits (figur 2B och 2E) vilket tillät bestämning av deras areal (uttryckt i µm2) (figur 2 c och 2F). Exempel visas i figur 2 illustrerar den starka effekten av uran på osteoclast storlek.

För att undersöka effekterna av uran på aktiviteten hos osteoklasterna resorption, var RAW 264,7 celler klädd och differentierade på osteomimetic yta tallrik. I slutet av analysen, togs osteoklaster bort. Sedan mimetiska benytan i varje väl behandlades av Alizarin Red S natriumsalt för att fläcken icke-resorberas område och bilder av varje hel väl förvärvades (figur 3A och 3D). De resulterande bilderna bearbetades med bild J programvara. De konverterades i 8-bitars gråskalebilder (figur 3B och 3E), utsätts för tröskelvärde (figur 3 c och 3F) och resorberas området (vita regioner) beräknas automatiskt.

Figure 1
Figur 1: visualisering av effekten av rådande på osteoclast bildandet. RAW 264.7 celler var differentierade i närvaro av den avlästa koncentrationen av uranyl. På dag 4 utfördes tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) färgning. Representativa hela-väl micrographs (övre paneler) Visa TRAP-färgade osteoklaster erhållits i dessa villkor. Exempel på Multinucleära osteoklaster i boxed områden visas vid en högre förstoring (pilar i bottenpaneler). Dessa bilder illustrerar dosberoende effekt rådande på osteoclast bildandet. Svart huvud pilar visar exempel på osteoclast atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: analys av effekten av rådande på osteoclast storlek. (A och D): hela-bra bilder av osteoklaster med boxed areal som motsvarar de regioner i vilka osteoclast analyserades storlek visas. Röda rutorna området i (A och D) som motsvarar de som anges i (B) och (E), respektive. ( EochB ): manuell ritningen osteoclast kanter i de två villkor som uranyl-koncentration är visas i blått. (C och F): leda windows från ImageJ programvara visar mätningarna från (B och E) analys respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: analys av effekten av rådande på osteoclast funktion. Bilder av Alizarin målat osteomimetic yta efter osteoklastisk benresorption som ägde rum i avsaknad (A) eller i närvaro av 25 µM av uranyl (D). Bilder i (A och D) konverterades först i 8-bitars gråskalebilder som visas i ( EochB ) och därefter i binära bilder (C och F) genom att tillämpa en lämplig tröskel inställning. Dessa binära bilder användes för att beräkna procentandelen av området resorberas i varje skick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Såvitt vi vet, är detta första gången som ett detaljerat förfarande som syftar till att studera effekten av naturligt uran på ben resorbing celler beskrivs. Detta tillvägagångssätt kommer att vara användbart att uppnå en bättre förståelse av uran inverkan på ben fysiologi och får ett intressant nytt verktyg för screening av uran kelater. Dessutom anser vi att det protokoll som beskrivs här kan tillämpas för att studera effekterna av andra tungmetaller på osteoclatogenesis.

Det är känt att uranyl är komplex med oorganiska och organiska komponenter i odlingsmedier18,19,20,21. Dessa complexations inflytande på artbildning av uran och på detta sätt, dess cytotoxicitet. Av denna anledning är ett kritiskt steg i protokollet utarbetandet av uran som innehåller kulturmassmedia. Vi har tidigare visat23 som närvaro av 5% fetalt bovint serum i odlingsmediet RAW 264,7 celler hade ingen signifikant effekt på cytotoxiciteten hos uranyl när den används i koncentrationer från 0 till 400 µM. Detta är en viktig punkt, eftersom förekomsten av serum i mediet krävs för att analysera effekten av uran exponering under hela processen för osteoklastisk differentiering. Vi vill dock betona att lång tvåstegsförfarandet beskrivs för beredning av exponering media (6 timmar) måste följas noggrant. Faktiskt INKUBERINGSSTEGET 3 timmar efter varje utspädning av uranyl salter kan stabilisering av uranyl komplexen potentiellt bildades lösning före ytterligare spädning eller cell exponering. Detta är absolut nödvändigt att erhålla tillförlitliga och reproducerbara resultat.

En annan viktig parameter för reproducerbarhet av osteoclast differentiering och resorption analyser är sådd tätheten av RAW 264.7 celler. Det har faktiskt visat att mononukleära föregångare densitet är en kritisk faktor för osteoclast-formationen, troligen eftersom cell till cell i närheten påverkar cellulära fusion händelser24. Särskild uppmärksamhet måste därför ägnas cell räkna, cellulära suspension förberedelse och homogenitet i sådd i varje brunn, för att undvika feltolkningar.

Verktyget tröskelvärde är användbart för att automatisera kvantifiering av resorption. Det bör påpekas att denna analys kräver ordentligt belysta bilder. Ett vanligt problem oavsett vilken typ av kamera och bild förvärvsmetoden är dock ojämn belysning vid kanterna av bilden. I så fall kan en flerstegs tröskelvärde metod vara nödvändigt.

Sammanfattningsvis har vi etablerat ett robust protokoll som möjliggör studier av uran inverkan på osteoclast bildandet, livskraft och funktion. Detta förfarande har utvecklats med hjälp av den råa 264,7 cellinje men är fullt tillämpliga på primära benmärg hos osteoklasterna prekursorer som vi har visat23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja

Acknowledgments

Författarna vill tacka Chantal Cros för bra tekniskt stöd.
Denna forskning finansierades genom bidrag från den ”Commissariat à l'Energie Atomique et aux energier alternativ” (URANOs - programmet övergripande de Toxicologie du CEA och CPRR CEA-AREVA), och från ANR (toxicitet av uran: multi-level tillvägagångssätt av biomineralization processen i ben, ANR-16-CE34-0003). Detta arbete stöddes också av universitetet i Nice Sophia-Antipolis och CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51, (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57, (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110, (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67, (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25, (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236, (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159, (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276, (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276, (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91, (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54, (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79, (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113, (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22, (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18, (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252, (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250, (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861, (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics