Métodos para analisar os impactos de urânio Natural em In Vitro Osteoclastogenesis

Developmental Biology

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Summary

Urânio é conhecido por afetar o metabolismo ósseo. Aqui, apresentamos um protocolo que visa investigar o efeito da exposição de urânio natural sobre a viabilidade, a diferenciação e a função dos osteoclastos, as células responsável pela reabsorção óssea.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

Urânio foi mostrado para interferir na fisiologia óssea e está bem estabelecido que este metal se acumula no osso. No entanto, pouco é conhecido sobre o efeito do urânio natural sobre o comportamento de células ósseas. Em particular, o impacto de urânio em osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção da matriz óssea, não está documentado. Para investigar esse problema, nós estabelecemos um novo protocolo usando acetato de uranilo como uma fonte de urânio natural e a linha de celular murino 264.7 crus como um modelo de precursores do osteoclast. Neste documento, nós detalhados todos os ensaios necessários para testar a citotoxidade de urânio sobre precursores osteoclasto e avaliar o seu impacto sobre a osteoclastogenesis e a função resorbing dos osteoclastos maduros. As condições que nós desenvolvemos, em particular para a preparação de uranilo, contendo meios de cultura e para a semeadura de RAW 264.7 células permitem para obter resultados confiáveis e altamente reprodutivos. Além disso, otimizamos o uso de ferramentas de software para facilitar a análise de vários parâmetros como o tamanho dos osteoclastos ou a porcentagem de matriz reabsorvido.

Introduction

Urânio é um elemento radioativo ocorre naturalmente presente no solo, ar e água; como tal, animais e seres humanos estão expostos ao urânio natural em suas dietas. Além de fontes naturais, urânio origina actividades antropogénicas, que aumenta a sua abundância no ambiente. Urânio representa perigos químicos e radiológicos. No entanto, porque o urânio natural (que é uma mistura isotópica contendo 99.27% 238U, 0.72% 235U e 0.006% 234U) tem uma baixa atividade específica (25.103 Bq.g-1), seus impactos na saúde são atribuídos à sua toxicidade química.

O que quer que sua rota de entrada (inalação, ingestão ou exposição dérmica), a maioria de urânio, entrando no corpo é eliminado com fezes e apenas uma pequena porção atinge a circulação sistêmica. Cerca de 67% do urânio no sangue, por sua vez é filtrada pelos rins e deixa o corpo na urina dentro de 24 h1. O restante é depositado principalmente nos rins e ossos, os dois órgãos-alvo principal de urânio toxicidade2,3,4. Porque o esqueleto foi identificado como o local principal de urânio de retenção do longo prazo2,3,4,5,6, vários estudos têm sido realizados para explorar o efeito de urânio no osso fisiologia7.

Osso é um tecido mineralizado que é continuamente remodelado durante toda sua vida. Remodelação óssea é um processo complexo que depende de tipos de células especializadas e consiste principalmente em duas fases: reabsorção da matriz antiga pré-existente pelos osteoclastos, seguido por construção de osso de novo pelos osteoblastos. Osteoclastos são células grandes Relaxometria, resultando da fusão de células precursoras de origem hematopoiética que migram para locais de reabsorção, onde eles atribuem ao osso8. Sua fixação ocorre simultaneamente com uma extensa reorganização do seu citoesqueleto9. Esta reorganização é necessária para o estabelecimento de um compartimento isolado entre a célula e superfície óssea no qual o osteoclasto segrega prótons, levando à dissolução da hidroxiapatita e proteases envolvidas na degradação da matriz orgânica. Os produtos resultantes da degradação são endocytosed, transportado através da célula para a área de membrana oposta à superfície óssea e secretada, um processo chamado transcytosis10,11.

Resultados de estudos in vivo e in vitro indicam que o urânio inibe a formação óssea e altera o número e a atividade dos osteoblastos7,12. Em contraste, os efeitos do urânio na reabsorção óssea e osteoclastos têm sido mal explorados. Várias em vivo estudos relataram um aumento da reabsorção óssea após a administração de nitrato de uranilo para ratos ou ratos de13,14. Além disso, uma investigação epidemiológica sugere que o aumento na ingestão de urânio através da água potável tendeu a ser associado com um aumento do nível de soro de um marcador de reabsorção óssea em homens15. Tomados em conjunto, estas descobertas levaram à conclusão de que o urânio, que se acumula no osso poderia promover reabsorção óssea. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos neste efeito potencial de urânio permanecem uma questão em aberto. Por esta razão, decidimos analisar o impacto de urânio no comportamento de resorbing células ósseas.

Aqui, descrevemos o protocolo que estabelecemos para caracterizar e quantificar os efeitos do urânio natural na viabilidade de pre-osteoclastos e na diferenciação de osteoclastos e atividade Odontoclastic. Os experimentos descritos neste documento tem sido feitos com a linha de celular de murino macrófago transformado 264.7 crus, que facilmente pode se diferenciar em osteoclastos quando cultivadas na presença da citocina RANKL por 4 ou 5 dias, e que é classicamente usado para estudar osteoclast diferenciação e função16. Os procedimentos desenvolvidos são confiáveis, dá resultados altamente reprodutíveis e são plenamente aplicável aos osteoclastos primários. Por todas estas razões, acreditamos que essa metodologia é útil para obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade de urânio no osso. Além disso, pensamos que esta abordagem poderia ser adaptada como uma ferramenta de triagem para identificar o urânio novo agentes quelantes.

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Protocol

1. preparação da solução de acetato de uranilo

  1. Para preparar 2 mL de uma solução de acetato de uranilo 100mm, adicione 85 mg de acetato de uranilo (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) em estado sólido para um tubo de plástico de 5 mL.
  2. Adicionar 2 mL de água destilada ao tubo de plástico e ajustá-lo com uma rolha de plástico.
  3. Agite o tubo vigorosamente até a dissolução total do sólido. Colocar a solução em geladeira por 24 h.
    Atenção: A manipulação de uranilo [U(VI)] apresenta alguns perigos químicos e radioativos. Todas as amostras devem ser preparadas e caracterizadas com equipamento ad hoc em laboratórios específicos. Todos os líquidos que contenham U VI devem ser recolhidos em especificamente atribuídos contentores de resíduos e eliminadas como resíduos tóxicos. Resíduos secos (pipetas, tubos, etc.) podem ser lavado com 0.1 N HNO3 solução, o que irá solubilizar e remover U(VI).
  4. Verificar o pH da solução usando um microeléctrodo e um medidor de pH.
    Nota: O microeléctrodo deve ser previamente calibrado usando soluções tampão comercial (pH = 4 e pH = 7).

2. RAW 264.7 celular cultura

  1. Manutenção das células.
    1. Cultivar 264.7 pilhas (ATCC, TIB-71) em frascos de2 75 cm o seguinte meio de crescimento: Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) suplementado com 5% de soro Fetal bovino e antibióticos: penicilina 100 UI/mL, 100 estreptomicina µ g/mL. Manter as células em incubadora a 37 ° C, 5% de CO2.
    2. Médio de mudança a cada 2 a 3 dias. Quando as células são 85-90% de confluencia, mecanicamente, removê-los do balão de cultura com uma espátula de célula (tal como recomendado pelo ATCC) e dividi-los em uma proporção de 1:6.
      Nota: apenas células entre 3 a 10 de passagens são usadas para experiências de diferenciação.
  2. Preparação das células para experimentos
    1. Deslocar células de substrato o balão como descrito acima e transfira para um tubo estéril 50 mL. Misture as células pipetando para cima e para baixo para quebrar aglomerados. Contá-los com um hemocytometer. Espera que 35 milhões de células por balão2 de 75 cm.
    2. Calcule o volume de suspensão de células necessária para cada experimento da seguinte forma:
      Número de experimental condições x 3 (triplica) x 1 mL/bem + 3-4 mL (pipetagem perdas).
      Nota: Semeadura de densidade para todos os ensaios descritos no presente protocolo é de 5.000 células/cm2. Portanto, para uma placa de 24, significa que 10.000 células por poço em 1 mL de meio, e densidade de suspensão celular é assim 10.000 células/mL.
    3. Preparar o volume necessário de 10.000 células/mL de suspensão de célula e as células de sementes em placas de 24 poços. Para os ensaios de citotoxicidade, use o meio de crescimento normal. Para diferenciação e ensaios de reabsorção, uso alfa modificado mínimo essencial médio (αMEM) suplementado com 2 mM L-glutamina, 5% FBS e 50 ng/mL de GST-RANKL17.
      Nota: O GST-RANKL proteína produzida internamente pode ser substituída por qualquer cytokine RANKL comercialmente disponível. Ao trabalhar com um novo lote RANKL, pode ser útil testar a sua eficácia na indução de osteoclastogenesis através da realização de um experimento de resposta de dose com concentração de RANKL, variando entre 20 a 150 ng/mL.

3. diluição da solução de acetato de uranilo 100mm em meio de cultura

Nota: Íons uranilo [U(VI)] em meio de cultura formam complexos múltiplos com outros componentes médios que poderiam modificar sua toxicidade celular18,19,20,21. Por esta razão, mídia contendo uranilo deve ser preparada extemporaneamente sem omitir ou encurtando etapas de equilibração.

  1. Escolheu uranilo concentrações de exposição e calcular volumes de meios de cultura necessário para o experimento (tendo em conta que cada condição é executada em triplicado).
  2. A partir de cultura de pilha de estéril testado 7,5% solução aquosa de bicarbonato de sódio ([HCO3] = 893 mM), preparar uma solução de3 HCO 100mm em água e resfriá-lo no gelo.
  3. Adicione gota a gota 1 volume de solução-mãe de 100mm acetato de uranilo para 9 volumes da gelada 100mm HCO3 solução, agitando suavemente o tubo de misturando. Esta operação irá diluir a solução de acetato de uranilo ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) de 10 mM e trazer o pH em torno de 7.
  4. Adicionar 1 volume de água estéril para 9 volumes da solução de3 HCO gelada 100 mM para atingir 90 mM HCO3 (igual a concentração de HCO3 na solução de uranilo de 10 mM), que servirá para preparar o controle médio.
  5. Permita soluções preparadas repousar durante 3 h à temperatura ambiente (RT) para o equilíbrio.
  6. Entretanto, prepare o suporte de exposição básicas: αMEM com 2 mM L-glutamina e 5% FBS.
    Nota: Para a diferenciação e ensaios de reabsorção, adicione 50 ng/mL de GST-RANKL ao meio de exposição básica.
  7. Depois de 3 h, dilua quantidades apropriadas da solução de uranilo gota a gota no meio de exposição, a fim de alcançar o desejada uranilo trabalhando a concentrações de 10 mM. Prepare-se simultaneamente o meio de controle, adicionando a quantidade de bicarbonato, usado na condição de uranilo-tratados mais concentrada, para o meio de exposição.
  8. Permitir que a mídia preparada repousar durante 3 h no RT para equilibração.
  9. Remova a mídia de crescimento dos poços e substituí-lo com o controle e a mídia contendo uranilo.

4. análise de viabilidade de 264,7 precursores cru na presença de U(VI) (MTT ensaios citotóxicos)

Atenção: Tanto MTT e DMSO podem causar a pele e irritação dos olhos. Use luvas e óculos de proteção quando manuseá-los. Colete resíduos de produtos no especificamente atribuído contentor de lixo.

  1. Dissolva uma quantidade adequada de pó de brometo de 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) em PBS para obter uma solução a 5 mg/mL 10 x. -Esterilizar por filtração com um filtro de 0,22 µm e armazenar alíquotas a-20 ° C.
  2. Células de placa em placas de 24 poços (3 poços por condição experimental por placa). Não se esqueça de reservar 3 poços vazios por prato para os espaços em branco do Espectrofotômetro.
  3. Incube as células a 37 ° C por 22-24 h antes da exposição de urânio para deixar células anexar.
  4. Prepare a mídia contendo uranilo conforme descrito na seção 3.
  5. Substituir o meio de crescimento nas placas de célula-semeado com uranilo contendo mídia. Incube durante 24 h.
  6. Calcule o volume necessário de solução de x MTT 1 da seguinte maneira:
    (Número de condições experimentais + branco) x 3 (triplica) x 0,4 mL/bem + 10% do volume de pipetagem de perdas.
  7. Prepare o volume necessário de 1 x MTT solução diluindo a solução MTT do águia mínimo essencial médio (EMEM) sem vermelho de fenol de 10x.
    Nota: para um bem-sucedido ensaio colorimétrico, MTT deve ser protegido da luz. Recomenda-se diluir MTT em EMEM, ao invés de DMEM, a fim de limitar o sinal de fundo.
  8. Remover mídia contendo uranilo dos poços, lave-os com PBS e adicionar 400 µ l de solução MTT a cada poço (incluindo 3 poços vazios para espaços em branco). Incube a 2,5 h a 37 ° C, no escuro. Verificar sob microscópio que formando cristais formazan roxo escuro dentro de células viáveis.
  9. Descartar a solução MTT e adicionar 220 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) por poço. Enrole as placas em papel de alumínio para protegê-los da luz e agitar suavemente durante 10 minutos dissolver os cristais de formazan.
  10. Use um leitor de espectrômetro de microplacas para determinar a densidade óptica (OD) no 570 nm (formazan específico) e 690 nm (fundo). Para cada poço, subtrai 690 nm OD de 570 nm OD ajustar para possível flutuação de valor de OD específico devido a arranhões ou turbidez22.
  11. Calcule o OD corrigido em branco para cada poço subtraindo OD média de em branco a partir do OD obtido na etapa anterior. Determine a média de valor de OD para cada condição experimental.
  12. Definir significa OD da condição controle ([UO22 +] = 0 mM) a viabilidade de 100% e calcular o percentual correspondente de viabilidade celular para outras concentrações de uranilo testado. Traça uma curva de dose-resposta. Avalie o índice de citotoxicidade 50 (CI50), definida como a concentração de uranilo, levando à morte celular de 50% após a exposição de 24 h.

5. análise da diferenciação Osteoclast na presença de U(VI)

  1. Diferenciação de RAW 264.7 células na presença de uranilo e armadilha (tartarato-resistente ao ácido fosfatase) coloração.
    1. Placa 264.7 pilhas em uma placa de 24, 3 poços por condição experimental. Incubar a 37 ° C, durante cerca de 6 h, o tempo para preparar e equilibrar a mídia de exposição de uranilo-contendo.
    2. Prepare a mídia de diferenciação com concentrações de uranilo desejado conforme descrito na seção 3 (não se esqueça de adicionar o GST-RANKL à mídia).
    3. Substitua suavemente meio básico em poços contendo uranilo médio. Este dia é considerado como o dia 0 de diferenciação osteoclástica.
    4. Mude o médio no dia 2 ou 3 de diferenciação osteoclástica, repetindo as etapas 5.1.2 e 5.1.3. Multinucleadas osteoclastos devem aparecer entre dia 3 e 4.
    5. Realize a coloração de armadilha com o kit de fosfatase ácida de leucócitos comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: tartarato-fosfatase ácida resistente (TRAP) também chamado de fosfatase ácida 5, tartarato resistente (ACP5) é altamente expressa em osteoclastos maduros e usado extensivamente como um marcador para diferenciação do osteoclast. Portanto, armadilha de coloração é realizada para visualizar os osteoclastos. Dependendo de condições experimentais e a taxa de osteoclastogenesis, pode ser feito no dia 4 ou dia 5 do processo de diferenciação.
    6. Manter poços manchadas de armadilha em PBS a 4 ° C para posterior análise (que podem ser mantidos nestas condições até 3 ou 4 semanas).
  2. Análise de tamanho/morfologia do osteoclast.
    1. Adquira uma imagem de toda a superfície de cada poço. A resolução da imagem deve ser suficiente para distinguir do núcleo de células. Considere as células armadilha-positivo com 3 ou mais núcleos, como osteoclastos.
    2. Abra uma imagem de um poço no software ImageJ: "Arquivo" → "Aberto".
    3. Verifique se as unidades de escala no canto superior esquerdo da imagem. Para a quantificação relativa, qualquer unidade pode ser usada. Se o valor absoluto de tamanho osteoclasto é necessário, converter unidades de escala para µm: "Propriedades da imagem" →"". Marque a caixa "global" na janela pop-up para ter novas unidades de escala aplicadas a todas as imagens abertas mais tarde.
      Nota: Se um microscópio foi usado para aquisição de imagem, o tamanho do pixel em µm é indicado para cada objectivo no software da imagem latente.
    4. Especificar parâmetros de medição a serem analisados: "Analisar" → "definir medições". Na janela definir medições, marque as caixas "Área" e "Rótulo de exibição" e desmarque todas as outras caixas.
    5. Abra o Gerenciador de ROI (região de interesse): "Analisar" → "ferramentas" → "ROI Manager".
    6. Na janela principal, escolha a ferramenta de seleção retangular. Usá-lo em qualquer lugar na imagem para delinear um sector de cerca de 1.000 x 1.000 µm. Esta selecção agora define a primeira região no qual osteoclast tamanho será analisado.
    7. Na janela Gerenciador de ROI, clique no botão "Adicionar" para adicionar a esta região de interesse para o Gerenciador de ROI e salve-o clicando em "Mais" → "Salvar". O ROI salvo pode agora ser recarregado com o gerente de ROI a qualquer momento clicando em "Mais" → "Aberto".
    8. Repita as etapas 5.2.5 - 5.2.6 definir 4 regiões adicionais para análise de tamanho de osteoclasto (Figura 2A e 2D).
      Nota: As regiões definidas serão usadas para analisar os tamanhos osteoclast em todas as imagens.
    9. Criar uma cópia de uma das 5 regiões a serem analisados: escolheu este ROI em principal Gerenciador de ROI (a seleção correspondente aparecerá na imagem principal) → clique dentro da seleção → "Duplicado". Use esta duplicado para posterior análise.
    10. Na janela Gerenciador de ROI, verifique as caixas "Mostrar Al" l e "Rótulos".
    11. Na janela principal, escolha a ferramenta de seleção de polígono manualmente delinear dentre os osteoclastos na seleção. Adicione este contorno para o Gerenciador de ROI, clicando em "Adicionar" na janela de Gerenciador de ROI. Proceda da mesma forma para todos os osteoclastos que estar completamente dentro da região selecionada (Figura 2B e 2E).
    12. Na janela Gerenciador de ROI, selecione todos os contornos e medir sua superfície clicando em "Medida". Transferi as medidas que têm aparecido em uma nova janela (janela de resultados, Figura 2 e 2F) para uma planilha.
      Nota: Neste momento, a região de análise com todos os contornos de osteoclastos pôde ser salvo como uma imagem independente: "" → "Salvar como" formato de arquivo de escolha.
    13. Repita os passos de 5.2.8 - 5.2.12 para as restantes regiões de análise da imagem atual. Em seguida, repita o procedimento inteiro para todas as outras imagens.
  3. Análise número osteoclast com software ImageJ.
    Nota: Como distribuição osteoclast no poço é raramente homogênea, realize a contagem em geral bem, ao invés de em algumas zonas selecionadas. Dado que os osteoclastos são heterogêneos em forma e tamanho, não automatizado, contando com o método de célula é praticável.
    1. Abra uma imagem de todo bem no software ImageJ (para esta análise, o uso de imagens da subseção anterior).
    2. Abra a janela de contador de célula: "Plugins" → "analisar" → "Contador de célula". Clique em "Inicializar" e a caixa de seleção "Tipo 1" (ou qualquer outro tipo de número que preferir). Verifique se está marcada a caixa "Mostrar o número" e "Excluir o modo" caixa está desmarcada.
    3. Na imagem, clique em um osteoclasto: ponto colorido e um número aparecerá onde clicado. Proceda da mesma forma para todos os osteoclastos. Salvar os marcadores regularmente clicando em "Salvar marcadores" no contador de célula
      Nota: Se o último ponto deve ser retirado da contagem, clique em "Excluir" no contador de célula. Se houver mais de um ponto para remover, marque a caixa "Excluir Mode" e indicar todos os pontos de inválido, clicando sobre eles. Desmarque a caixa "Excluir Mode" para continuar a contagem.
    4. Exiba o resultado da contagem clicando em resultados no contador de célula. Transferi os resultados de contagem finais para uma planilha.

6. análise da função Osteoclast na presença de U(VI)

  1. Ensaio de reabsorção do poço.
    1. Placa 264.7 pilhas em uma placa de ensaio de osteo 24-bem, que fornece uma superfície de osteomimetic inorgânicos sintéticos que pode ser reabsorvida pelos osteoclastos.
      Nota: para deixar células anexar à superfície biomimético, muitas vezes é melhor para eles da placa no dia antes de adicionar o meio de diferenciação.
    2. Diferenciar células 246,7 RAW em osteoclastos, conforme descrito na seção 5 (medidas 5.1.2 - 5.1.4)
    3. No dia 5 de osteoclastogenesis, remova osteoclastos da superfície óssea mimética, substituindo contendo uranilo médio com solução 10%. Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Lavar os poços duas vezes com água desionizada e deixe-os secar ao ar livre.
    4. Adicione uma solução do sal de sódio 1% alizarina Red S aos poços para mancha de sais de cálcio nas áreas não-reabsorvido. Remover a solução de alizarina após 10-15 s de incubação e delicadamente lavar os poços 3 - 4 vezes com água. Deixe que secar ao ar livre nos poços.
      Nota: O procedimento de coloração acima descrito é projetado para realçar o contraste entre o reabsorvido e as áreas não-reabsorvido para facilitar a análise consecutivo. Este procedimento deve ser feito com cuidado porque se poços não estão completamente secos antes de coloração, partes da superfície óssea-mimética restante poderiam ser removidas acidentalmente. Além disso, se a solução de alizarina é deixada muito tempo em poços, uma mancha persistente não específica irá aparecer. Note-se que o teste descrito nesta seção refere-se ao efeito de urânio na diferenciação osteoclástica e a função. Para estudar o efeito de urânio na reabsorção independentemente da formação de osteoclasto, 264.7 pilhas podem ser tratadas com contendo uranilo médio por 24 horas, apenas, uma vez que os osteoclastos maduros são formados (no dia 4 ou 5 do processo de diferenciação) 23.
  2. Análise de reabsorção do poço.
    1. Adquira uma imagem de toda a superfície de cada poço da placa de ensaio osteo.
      Nota: Métodos de aquisição de imagem podem variar, mas devem ser coerentes ao longo de replicar experiências. Podem incluir uma foto tirada com um objetivo macro uma câmera fixa, uma varredura de alta resolução ou uma imagem de mosaico feito com um microscópio de alta taxa de transferência automatizado.
    2. Começa a análise, repetindo as etapas 5.2.2 para 5.2.4 da seção anterior.
    3. Converter uma imagem RGB em um formato de 8 bits em tons de cinza: "Imagem" → "Digite" → "8 bits".
    4. Na janela principal, selecione a ferramenta de seleção oval. Usá-lo para desenhar um círculo delineando toda a superfície do poço a ser analisado para reabsorção.
    5. Salve este novo ROI como na etapa 5.2.6.
    6. Para facilitar a seleção de limiar, desmarque todas as características do lado de fora o ROI definido: "Editar" → "Limpar do lado de fora".
      Nota: Neste momento, é frequentemente melhor fazer algumas cópias da imagem: desmarque ROI clicando fora do zona selecionada → clique direito sobre a imagem → "Duplicado". Esta ação vai ajudar a evitar uma repetição do tratamento imagem acima descrito, se o limiar escolhido na próxima etapa é insatisfatório.
    7. Selecione "Imagem" → "Ajustar" → "limiar". Na janela de limiar, utilize a barra deslizante para escolher um limite adequado. Todas as áreas reabsorvidas devem estar abaixo do limiar (branco) e não-reabsorvido, acima (vermelho). Para finalizar a seleção de limiar, clique em "Aplicar" na janela do limiar.
    8. Salvar a imagem final binária: "" → "Salvar como" → formato de arquivo de sua escolha.
    9. Definir as medidas a adoptar na região de interesse: "Analisar" → "definir medições". Na janela definir medições, verifique "Área", "Fração de área" e "Limite limiar" caixas e desmarque todas as outras.
    10. A fim de obter a fração de área "reabsorvida" diretamente na janela de resultados, inverta a imagem binária ("Edit" → "Invert"). Certifique-se de que o ROI principal é selecionado na imagem final binária (caso contrário fração de área reabsorvido será calculada com base na superfície da janela de imagem inteira). Fração de área reabsorvido medida por qualquer clicando na "Medida" na janela de Gerenciador de ROI, ou em "Analisar" → "Medir". Salve o resultado.

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Representative Results

Coloração da fosfatase ácida tartarato-resistente foi usado para visualizar os osteoclastos como grandes células roxas tendo 3 ou mais núcleos. Imagens representativas dos osteoclastos obtidos de 264.7 pilhas cultivadas na presença de RANKL e íons uranilo são mostrados na Figura 1. Alterações no número e tamanho dos osteoclastos em resposta ao urânio são facilmente visíveis em imagens compostas de poços inteira e em fotos alargadas.

Tamanho dos osteoclastos foi analisado usando software ImageJ (Figura 2). Para este efeito, foram utilizadas todo bem imagens de armadilha manchado osteoclastos e as mesmas regiões foram tratadas em cada poço de cada condição de cultura (Figura 2A e 2D). Todos os osteoclastos presentes em cada região foram descritos (Figura 2B e 2E) que permitiu a determinação de sua área (expressada em µm2) (Figura 2 e 2F). Exemplos mostrados na Figura 2 ilustram o efeito forte de urânio no tamanho do osteoclast.

Para investigar o impacto de urânio na atividade de reabsorção de osteoclasto, 264.7 pilhas foram chapeadas e diferenciadas na placa de superfície osteomimetic. No final do ensaio, osteoclastos foram removidos. Em seguida, superfície mimética de osso em cada bem foi tratada pelo sal de sódio de alizarina Red S para manchar a área não-reabsorvido e imagens de cada todo bem foram adquiridas (Figura 3A e 3D). As imagens resultantes foram processadas com o software Image J. Eles foram convertidos em imagens de tons de cinza de 8 bits (Figura 3B e 3E), submetidas a limiarização (Figura 3 e 3F) e a área reabsorvida (regiões brancas) foi calculada automaticamente.

Figure 1
Figura 1: visualização dos efeitos da U(VI) na formação do osteoclast. RAW 264,7 células foram diferenciadas na presença da concentração indicada de uranilo. No dia 4, foi realizada coloração fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP). Micrografias de todo bem representativas (painéis superiores) mostram osteoclastos manchadas de armadilha obtidos nestas condições. Exemplos de osteoclastos multinucleados em áreas in a box são mostrados em uma maior ampliação (setas em painéis de fundo). Estas imagens ilustram o efeito dose-dependente de U(VI) na formação do osteoclast. Setas pretas cabeça indicam exemplos de núcleos do osteoclast. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise do efeito de U(VI) no tamanho do osteoclast. (A e D): são mostradas imagens de todo o bem dos osteoclastos com Box área correspondente às regiões nas qual osteoclast tamanho foi analisado. O vermelho caixas área em (A e D) correspondem a esses mostrado em (B) e (E), respectivamente. (B e E): O desenho manual das bordas osteoclast das duas condições de uranilo-concentração é mostrado em azul. (C e F): resultar de windows do software ImageJ mostrando as medições de análise (B e E), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise do efeito da U(VI) em função do osteoclast. Imagens de alizarina manchado osteomimetic superfície após reabsorção osteoclástica ocorrida na ausência (A) ou na presença de 25 µM de uranilo (D). Fotos no (A e D) primeiro foram convertidas em imagens de tons de cinza de 8 bits, como mostrado em (B e E) e, posteriormente, em imagens binárias (C e F) aplicando uma configuração de limite adequado. Estas imagens binárias foram usadas para calcular a porcentagem de área reabsorvida em cada Estado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Tanto quanto sabemos, esta é a primeira vez que um procedimento detalhado com o objetivo de estudar os efeitos do urânio natural no osso resorbing células é descrito. Esta abordagem será útil para alcançar uma melhor compreensão do impacto de urânio na fisiologia do osso e pode fornecer uma ferramenta nova e interessante para o rastreio de quelantes de urânio. Além disso, acreditamos que o protocolo descrito aqui pode ser aplicado para estudar o impacto de outros metais pesados na osteoclatogenesis.

É conhecido que uranilo é complexed com componentes orgânicos e inorgânicos em meios de cultura18,19,20,21. Estes complexations influenciam a especiação de urânio e, desta forma, sua citotoxicidade. Por esta razão, um passo crítico no protocolo é a preparação de meios de cultura contendo urânio. Mostramos anteriormente23 que a presença de 5% de soro bovino fetal em meio de cultura de 264.7 pilhas não teve nenhum efeito significativo sobre a citotoxidade de uranilo quando usado em concentrações que variam de 0 a 400 µM. Este é um ponto importante, como a presença de soro no meio é necessário para analisar os efeitos da exposição de urânio durante todo o processo de diferenciação osteoclástica. No entanto, desejamos enfatizar que longa duas etapas seguir o procedimento descrito para a preparação dos meios de exposição (6 horas) deve ser cuidadosamente. Com efeito, a etapa de incubação de 3 horas após cada diluição dos sais de uranilo permite a estabilização dos complexos uranilo potencialmente formado na solução antes mais diluição ou exposição de célula. Isso é absolutamente necessário para obter resultados confiáveis e reprodutíveis.

Outro parâmetro importante para a reprodutibilidade dos ensaios de diferenciação e reabsorção de osteoclasto é a densidade de semeadura do RAW 264.7 células. Com efeito, ficou demonstrado que precursor mononucleares densidade é um determinante fundamental para formação de osteoclasto, muito provavelmente porque a proximidade de célula para célula influencia a fusão celular eventos24. Portanto, uma atenção especial deve ser pago para celular contando, preparação de suspensão celular e homogeneidade da semeadura em cada poço, a fim de evitar interpretações erradas.

A ferramenta de limiarização é útil para automatizar a quantificação de reabsorção. Vale a pena assinalar que esta análise requer imagens devidamente iluminadas. No entanto, um problema comum independentemente do tipo de método de aquisição de imagem e câmera é iluminação desigual nas bordas da imagem. Nesse caso, um método de limiarização de várias etapas pode ser necessário.

Em resumo, nós estabelecemos um protocolo robusto, permitindo o estudo de impacto de urânio na formação de osteoclasto, viabilidade e função. Este procedimento foi desenvolvido usando a linha de celular 264.7 crus mas é plenamente aplicável aos precursores do osteoclast primária da medula óssea, como mostramos23.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Os autores gostaria agradecer Cros Chantal por assistência técnica útil.
Esta pesquisa foi financiada por doações do "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energias alternativas" (URANOs - programa Transversal de Toxicologie du CEA e CPRR CEA-AREVA) e da ANR (toxicidade de urânio: abordagem multi-nível de biomineralização processo no osso, ANR-16-CE34-0003). Este trabalho também foi apoiado pela Universidade de Nice Sophia-Antipolis e o CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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