Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Biology

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Summary

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

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Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

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Abstract

Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.

Introduction

En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la hermana chromatids del genoma duplicado son condensado (profase) y son capturadas en sus cinetocoros por microtúbulos del huso mitótico ensamblado (Prometafase), que impulsa su alineación en la placa de la metafase (metafase) seguida por su igual segregación cuando hermana cromátides se divide hacia y transportados en el eje opuesto postes (anafase). Las dos células hijas se separan físicamente por la actividad de un anillo contráctil de actina-basado (telofase y citocinesis). El cinetocoro es una estructura proteica especializada que reúne en la región centromérica de cromátides hermanas y servir como sitios de fijación para los microtúbulos del huso. Su función principal es la captura de cromosoma, alineación, y ayuda en la corrección de accesorio de microtúbulos del huso indebido, al mediar el puesto de control de ensamblaje del huso para mantener la fidelidad de cromosoma segregación3,4.

La técnica de sincronización celular sirve como una herramienta ideal para la comprensión de los eventos moleculares y estructurales implicados en la progresión del ciclo celular. Este enfoque se ha utilizado para enriquecer poblaciones de células en fases específicas de diversos tipos de análisis, incluyendo perfiles de expresión génica, análisis de los procesos bioquímicos celulares y la detección de la localización subcelular de las proteínas. Las células mamíferas sincronizadas pueden utilizarse no sólo para el estudio de productos de genes individuales, sino también de enfoques de análisis de genomas enteros, incluyendo análisis de microarray del gene expresión5, de patrones de expresión de miRNA6, regulación traduccional7y análisis proteómico de proteína modificaciones8. Sincronización puede utilizarse también para estudiar los efectos de genes o proteínas precipitación o knock-out, o de productos químicos en la progresión del ciclo celular.

Las células se pueden sincronizar en las diferentes etapas del ciclo celular. Métodos físicos y químicos son ampliamente utilizados para la sincronización celular. Los criterios más importantes para la sincronización de la célula son que la sincronización debe ser fotoefecto y reversible. Debido a las potenciales consecuencias adversas celulares de la sincronización de las células por agentes farmacológicos, métodos de química dependiente pueden ser ventajosos para el estudio de eventos del ciclo celular clave. Por ejemplo, hidroxiurea, amphidicolin, mimosina y lovastatina, pueden utilizarse para la sincronización de la célula en fase G1/S, pero, debido a su efecto sobre las vías bioquímicas que inhibir, activar mecanismos de control del ciclo celular y matar a un importante fracción de las células9,10. Por otra parte, inhibición de la regeneración de la replicación del ADN mediante la adición de timidina a los medios de crecimiento, conocidos como "bloque de timidina", puede detener el ciclo celular en ciertos puntos11,12,13. Las células también pueden sincronizarse en fase G2/M por tratar con nocodazole y RO-33069,14. Nocodazole, que previene el montaje del microtubule, tiene una relativamente alta citotoxicidad. Por otra parte, las células nocodazole detenido puedan volver a interfase precozmente por deslizamiento mitotic. Doble timidina bloque detención en fase G1/S y después de la liberación del bloque, las células se encuentran células actuar sincrónicamente a través de G2 y mitosis. La progresión normal del ciclo celular de células de bloque de timidina puede observarse bajo microscopia confocal de alta resolución por fijación de la célula o en proyección de imagen. El efecto de la perturbación de las proteínas mitotic puede estudiarse específicamente cuando las células entraran y proceden a través de mitosis después del lanzamiento del bloque doble de timidina. Cdt1, una proteína multifuncional, está involucrado en licencias de origen de replicación de ADN en la fase G1 y se necesita para archivos adjuntos de microtúbulos cinetocoros durante mitosis15. Para estudiar la función de Cdt1 durante la mitosis, es necesario adoptar un método que evita el efecto de su agotamiento en licencias de replicación durante la fase G1, mientras que al mismo tiempo efectuar su agotamiento específicamente durante la fase G2/M solamente. Aquí, presentamos protocolos detallados basados en el bloque de timidina doble para estudiar la función mitótica de proteínas múltiples funciones durante las diferentes etapas del ciclo celular por proyección de imagen fija y células vivas.

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Protocol

1. doble bloque de timidina y liberación: preparaciones de reactivos

  1. Tomar 500 mL que Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, penicilina y estreptomicina.
  2. Hacer caldo de 100 mM de timidina en agua estéril y conservar en alícuotas a-80 ° C.

2. Protocolo para la proyección de imagen de celular fijo de progresión mitótica (figura 1A)

  1. El día 1, semilla ~ 2 x 105 células de HeLa en los pocillos de una placa de 6 pozos con un cubreobjetos (esterilizado con etanol al 70% y la radiación ultravioleta) y 2 mL de medio DMEM. Crecen las células en una incubadora humidificada durante 24 h a 37 ° C y 5% CO2.
  2. a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, mezclar bien el volumen requerido de timidina en el medio DMEM fresco (concentración de 2 mM stock, final de 100 m m).
  3. Añadir 2 mL de timidina contiene medios a las células en cada pozo del pozo 6 de la placa e incubar durante 18 h.
  4. El día 3, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM precalentado fresco; crecen las células en medio DMEM precalentado fresco de 9 h liberar células del bloque.
  5. 2 bloque de timidinand : otra vez, añadir 2 mL de timidina contiene medios (concentración final de 2 mM) a las células en cada pocillo de la placa de la pozo 6.
  6. Incubar durante 18 h otro.
  7. El día 4, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM fresco de precalentado.
  8. SiRNAs diluidos (control y Cdt1) y el reactivo de transfección en medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclan juntos e incuban por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
  9. Incube las células a 37 ° C durante 9-10 h para liberar del bloqueo y fijar las células en el cubreobjetos con el 4% PFA por 20 min a TA.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.
  10. Immunostain células, después permeabilizing con detergente de 0,5% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente y lavado las células dos veces con PBS 1 x durante 5 minutos.
    1. Bloque de celdas con 1% BSA (w/v) de 1 x PBS para 1 h a temperatura ambiente, seguido por el tratamiento de células con 50 μl de anticuerpos primarios (anticuerpo de ratón anti-α-tubulina diluido 1:1, 000, anticuerpos anti-Zwint1 diluido al 1: 400 y mouse anti-phospho-ɣ H2AX diluido en 1:300) en el 1% (p/v) BSA en PBS 1 x por 1 h a 37 oC.
    2. Después de lavar las células con 1 x PBS tres veces, tratar las células con 50 μl de anticuerpos secundarios para cada cubierta de vidrio (Alexa 488 y rojo rodamina en diluciones de 1: 250 en el 1% (p/v) BSA en 1 PBS de x) por 1 h a TA.
    3. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, tratar las células con DAPI (0.1µg / mL en PBS 1 x) por 5 min a TA.
    4. Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, colocar el cubreobjetos frente a las células a los medios de montaje apropiados en un portaobjetos microscópico claro.
  11. Imagen de las células de las proteínas immunostained con 60 X o con objetivo de inmersión de aceite de 100 X 1.4 NA Plan apocromática DIC montadas en un microscopio confocal invertido de alta resolución equipado con una cámara apropiada según sea necesario para la calidad de las imágenes necesarias.
  12. Adquisición de imágenes a temperatura ambiente como z-pilas de 0.2 μm de espesor utilizando el software apropiado para el microscopio.

3. Protocolo para la proyección de imagen de células vivas de progresión mitótica (Figura 3A)

  1. El día 1, aproximadamente 0.5-1 x 105 células de HeLa expresando estable mCherry H2B y GFP-α-tubulina (ligeramente variable basada en el tipo de la célula y las proteínas que expresan) en platos de fondo de cristal de 35 mm con 1,5 mL de medio DMEM de semillas y cultivarlas en un humidificado incubadora para 24 h a 37 oC y 5% CO2.
  2. a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, agregar 1,5 mL de timidina contiene los medios de comunicación a las células en el plato (timidina 100 mM, concentración final de 2 mM,).
  3. Incubar durante 18 h.
  4. El día 3, Aspire el medio que contenía timidina y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado.
  5. SiRNAs diluidos (control y Hec1) reactivo de transfección con medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclar juntos e incubar por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.
  6. Cultivar células en 1,5 mL de medio DMEM precalentado fresco de 8 h liberar células del bloque.
  7. 2 bloque de timidinand : Añadir 1,5 mL de contiene timidina media (concentración final de 2 mM) a las células en el plato.
  8. Incubar durante 18 h otro.
  9. El día 4, Aspire el medio y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado. Luego crecen las células en fresco precalentado Leibovitz de medio (L-15) suplementado con 10% FBS y 20 mM HEPES pH 7.0 durante 8 h para liberar células del bloque.
  10. Coloque el plato en la cámara de control de temperatura en el microscopio confocal de alta resolución que ya ha conectado al menos 30 minutos antes de comenzar la proyección de imagen para estabilizar las temperaturas experimentales y escenario.
  11. Enfoque en campo brillante con el objetivo x 60 hasta que las células son visibles, luego tamizar manualmente el escenario a la región de elección.
  12. Configurar la luz y energía láser, exposición, parámetros de adquisición de imagen y duración del experimento usando el software de adquisición de imagen de microscopio de elección. Utilice filtros para GFP (excitación 488; 385 emisión nm) y mCherry (561 excitación nm y 385 nm emisión) para adquirir imágenes.
  13. Realizar el experimento de Time-lapse por separado adquiriendo pulsada luz transmitida y fluorescencia imágenes cada 10 minutos durante un período hasta 16 h.
  14. Adquisición de imágenes como doce 1.0 μm separado z aviones a las 9 h después de la liberación del bloque doble timidina utilizando software apropiado al microscopio.
  15. Analizar las imágenes de progresión mitótica las células individuales de seguimiento y finalmente montar la película correspondiente con el software ImageJ/Fiji.

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Representative Results

Estudio de la progresión mitótica y estabilidad de los microtúbulos en células fijas después del lanzamiento de doble bloque de timidina
Cdt1 participa en la concesión de licencias de origen de replicación del ADN en la fase G1. Se degrada durante la fase S, pero nuevamente se acumula en la fase G2/M. Para estudiar su papel en la mitosis, Cdt1 endógeno debe agotarse en la fase G/M usando la técnica de sincronización más adecuada de células, la timidina doble bloque15. Células fueron transfectadas con siRNAs inmediatamente después del lanzamiento del bloque 2nd timidina, cuando las células están en el S fase y cuando las licencias de los orígenes de replicación en G1, que requiere también la función de Cdt1, tiempo finalizada. El agotamiento de Cdt1 tras 9 h de la transfección de siCdt1 y doble timidina bloque liberación fue validado por Western Blot (figura 1B). Fijación de las 9 h después de que lanzamiento del bloque de timidina doble muestra que mayoría de las células en la etapa de metafase en control y Cdt1 siRNA células transfected las células. Pero la fijación de células 10 h después de la liberación del bloque doble timidina muestra que mayoría Cdt1 tratados con siRNA de las células todavía son arrestadas en Prometafase tardía, mientras que las células control entrar en anafase y normalmente separar sus cromosomas como esperado (figura 1 ). Para entender el efecto de agotamiento Cdt1 en la estabilidad del cinetocoro-microtúbulo (kMT), las células se fijaron a las 9 h tras liberación de doble bloque de timidina seguido por tratamiento en frío, que sólo conserva estables cinetocoro-microtúbulos (kMTs). KMTs de Cdt1 agota las células son relativamente menos robustas después de tratamiento en frío en comparación con la de las células control (figura 1). Así, usando este enfoque, la progresión de las células mitóticas normales después de la perturbación de la función de proteínas mitotic de interés puede estudiarse eficazmente, incluso sin el uso de imágenes de células vivas.

La figura 2 muestra que licencias de origen de replicación del ADN no es perturbado cuando las células se agotan de Cdt1 en fase G2/M usando nuestro protocolo, que también fue observado en las células del control. Las células agotadas de Cdt1 en fase G2/M no indujo la acumulación de ɣH2AX fosforilada, un marcador de daño en el ADN, durante la posterior fase G2; mientras que la transfección de siRNA de culturas asincrónicas a agotar Cdt1 inducida por la acumulación de focos de fosfo-ɣH2AX-positivo, posiblemente debido a daños en el ADN inducido por licencias de replicación de ADN incorrecto.

Estudio de la progresión mitótica en las células después de lanzamiento del bloque doble timidina por proyección de imagen de células vivas
Después de la ruptura de la envoltura nuclear (NEB), las células normales (en ausencia de perturbación por una funcional proteína mitótica) entrar en mitosis y someterse a Inicio de la anafase de mitosis dentro de unos 30-60 min (figura 3B). Pero se encuentra caída RNAi-mediada de Hec1, una proteína clave cinetocoro que se requiere para la formación de fijación kMT robusto, retrasar progresión mitótica normal. En este escenario, mayoría de las células entrar en mitosis después de la NEB, pero no experimentan el inicio de la anafase o la salida de mitosis incluso después de varias horas de retraso en la mitosis (figura 3). Del mismo modo, el efecto de la caída de RNAi-mediada de cualquier otra proteína que se localiza a cinetocoros o tener una función durante la mitosis así se observan efectivamente mediante el uso de imágenes de células vivas después del lanzamiento de los bloques de timidina doble. Además de estudiar la naturaleza de la progresión mitótica, demora y detención, algunos de los otros fenómenos mitóticos claves que pueden ensayarse mediante este método incluyen cromosoma alineación, formación del huso mitótico y las de colocación y silenciamiento de la puesto de control de ensamblaje del huso.

Figure 1
Figura 1: Análisis de la progresión mitótica y la estabilidad de los microtúbulos del cinetocoro en células fijas después de doble sincronización de timidina. (A) A representación esquemática de sincronización celular, la fijación y la inmunofluorescencia. (B) Western blot por caída de Cdt1 tras 9 h de la liberación de 2 º bloque de timidina. (C) imágenes de inmunofluorescencia para mostrar las células mitotic fijo 9 y 10 h después del lanzamiento de timidina doble bloque y tratamiento con control (parte superior) o Cdt1 siRNA (abajo). Tinción de α-tubulina es en rojo, el ADN es en verde como las células expresan GFP-histona H2B. Barra de escala = 10 μm. Prometafase y metafase las células se indican usando amarillo y blanco las puntas de flecha respectivamente. (D) HeLa células después del tratamiento con siRNA control (panel superior) y después del agotamiento de Cdt1 (panel inferior) durante 9 horas después del lanzamiento de doble bloque de timidina seguido por tratamiento con Leibovitz helada (L-15) medio y fijación. Las células fueron manchados inmune para husillo MT (verde) y un marcador del cinetocoro, Zwint1 (rojo) y DAPI para ADN en blanco y negro. Barra de escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cdt1-agotamiento de la fase G2/M no perturban la replicación de licencias. Células HeLa asincrónicas trataron con luciferasa control (panel superior) o cdt1 siRNAs (panel central) o timidina doble sincronizado células HeLa tratadas con siRNA cdt1 durante el 2nd timidina derrubio seguido de fijación a las 10 h después de la liberación (panel inferior) fueron teñidos con DAPI (pseudo-color verde) y el anticuerpo anti-phospho-ɣH2AX (rojo). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de progresión mitótica por proyección de imagen en vivo de la célula sincronización células. (A) A representación esquemática de sincronización celular y proyección de imagen de células vivas. HeLa células expresando estable mCherry histona H2B y GFP-α-tubulina se liberó de bloque doble timidina durante 8 h para dejarlos pasar a fase G2/M del arresto de fase S. Proyección de imagen de vivo se llevó a cabo utilizando un microscopio confocal de alta resolución a partir de 8 h después de la liberación de las células del bloque de timidina y continuando hasta 16 h de ese punto. Aquí están las imágenes fijas del vídeo capturado cada 10 minutos para las células control sin perturbación de cualquier proteína mitótica (B) o para células agotadas de la subunidad Hec1 del complejo Ndc80 (C). Barras de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.

Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión normal a través de la mitosis y la desregulación de este proceso puede llevado a tumorigenesis. En vivo la proyección de imagen celular de células HeLa estable expresando mCherry H2B y GFP-tubulina y liberado de la timidina doble bloque muestra que la mayoría de las células control segregar sus cromosomas en anafase dentro de aproximadamente 60 minutos después de NEB (figura 3B). Por otro lado, viven la proyección de imagen celular de células HeLa perturbadas con Hec1 función muestra que mayoría de las células permanecer en la fase mitótica durante un largo periodo con cromosomas desalineados seguidos del inicio de la anafase o apoptosis (figura 3).

Timidina exceso inhibe la síntesis de ADN durante la fase S, bloqueando así las células en G1/S fase11. Aunque la sincronización de bloque doble timidina es el más comúnmente utilizado método en el estudio del ciclo celular y progresión mitótica, uno debe ser crítico con algunas de las limitaciones de este método. Importante, debe garantizarse que el producto químico ha sido lavado fondo (para 7-8 h) para que el efecto es totalmente reversible y las células pueden proceder normalmente a través del resto del ciclo celular. Las células de lo contrario no podrán entrar en el segundo ciclo que causan progresión inadecuada aunque mitosis. La proporción de células sincronizadas puede no ser lo suficientemente alta con un bloque único de timidina y un bloque doble timidina puede ser necesario aumentar el número de células sincronizadas, sobre todo si uno está interesado en el estudio de una específica fase de la mitosis. La duración del tratamiento de timidina debe ser optimizada debido a la diferente sensibilidad entre tipos de la célula según el tiempo de generación. Por ejemplo, las células de hámster con 16 h de tiempo de generación y son tratadas con timidina h 11 para la sincronización óptima17. En este estudio, tratamos a las células HeLa durante 16-18 h. con timidina. Por otra parte, la timidina exceso no sólo impide la síntesis de ADN pero también puede matar a importantes fracciones de las células11,12,18 y cerrar las necesidades de atención a controlar esta pérdida. La solución madre de timidina utilizada en este estudio debe ser preparada en agua destilada estéril y se debe mezclar completamente en los medios de cultivo celular para evitar su precipitación después de agregar a los medios de comunicación de siRNA transfected las células y también para asegurar su homogénea distribución alrededor de las células cultivadas.

Para estudiar la función de una proteína mitótica de destino durante la progresión mitótica, las células serían idealmente tratados con siRNA a la caída en los niveles de la proteína de interés durante el bloque de timidina 1st o durante el lanzamiento de la 1ª bloque de timidina, según el tiempo requerido para obtener proteína eficiente precipitación19,20,21. Por otro lado, para estudiar el papel de proteínas multifuncionales como Cdt1 durante la mitosis, es necesario tratar las células con siCdt1 durante el lanzamiento del bloque de timidina 2nd obtener disminución específica de G2/M. Cdt1 es un jugador fundamental en la concesión de licencias de orígenes de replicación de ADN15. Para entender su papel especializado durante la mitosis sin interferir con su papel en la concesión de licencias, Cdt1 necesita agotar específicamente en la fase G2/M, que puede lograrse eficazmente mediante doble sincronización de timidina, evitando así la necesidad de recurrir a otros métodos de perturbación específica de la mitosis que son difíciles de ejecutar. Agotamiento de Cdt1 en culturas asincrónicas inducir respuesta de daño de ADN debido a la interrupción de la licencia de orígenes de replicación de ADN, que a su vez habría enturbia el análisis de una posible función para esta proteína durante la mitosis. Así, la técnica de sincronización de timidina doble ofrece un acercamiento experimental único para generar células que experimentaron una fase G1 y S normal pero carecían de Cdt1 función durante la fase G2 y M. El significado especial de nuestro protocolo de sincronización se encuentra en su inhibición de proteínas multifuncionales en la fase específica (G2/M) para estudiar sus funciones novela durante la mitosis. Por lo tanto, este método será útil no sólo para estudiar el papel de las proteínas que tienen funciones múltiples durante las etapas del ciclo celular diferentes sino también de cualquier proteína mitótica en el proceso de alineación del cromosoma, los accesorios de kMT y segregación cromosómica.

Para la proyección de imagen de células vivas, después del lanzamiento del bloque doble timidina, las células deben ser incubadas en Leibovitz precalentado (L-15) suplementado con 10-20% FBS hasta el comienzo de la proyección de imagen. Las células entrar en mitosis en puntos de tiempo variable después del lanzamiento del bloque de timidina dependiendo del tipo de célula. La hora de inicio de captura de imágenes o de fijación debe ser optimizado en función del tipo de célula. Para la proyección de imagen de células vivas, la utilización de la microscopía confocal convencional puede causar fotoblanqueo durante proyección de imagen a largo plazo. Por otro lado, la Microcopia confocal de alta resolución ofrece una imagen clara y de alta resolución con el grado mínimo de fotoblanqueo efectos.

Los pasos críticos en este protocolo son la duración del tratamiento de timidina, lavado adecuado de la timidina, la sincronización de la transfección de siRNA y el momento de inicio de la proyección de imagen.

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Disclosures

Los autores declaran que ellos no tienen ningún interés financiero competencia.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Kozo Tanaka de la Universidad de Tohoku, Japón para el intercambio de células HeLa expresando estable mCherry histona H2B y GFP-α-tubulina. Este trabajo fue financiado por una subvención NCI a DV (R00CA178188) y por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Northwestern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6, (1), E5 (2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21, (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42, (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52, (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285, (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8, (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72, (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60, (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13, (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14, (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116, (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68, (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12, (4), e0174819 (2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196, (5), 563-571 (2012).

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