자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

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Summary

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

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Crosby, P., Hoyle, N. P., O'Neill, J. S. Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR). J. Vis. Exp. (130), e56623, doi:10.3791/56623 (2017).

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Abstract

세포 유전자 발현의 기자 luciferase 기반 둘 다 경도 대 한 광범위 한 사용에 있고 끝점 생물 학적 활동의 분석 실험. Circadian 리듬 연구, 예를 들어 반딧불 luciferase와 시계 유전자 융해 일으키 강력한 리듬에 많은 일 동안 유지 세포 생물 발광. 광 전 증폭 관 관 (PMT)와 관련 된 기술 제한 또는 생물 발광 정량화에 대 한 기존의 현미경-기반 방법 일반적으로 세포와 조직 중 아주 비 생리 적 조건 하에서 유지 될 요구 했다 녹음, 감도 처리량 사이 교환. 여기, 우리 수 있도록 장기적인 생물 발광 영상 높은 감도와 처리량을 문화 조건, 습도 제어, 가변 가스 등의 광범위 한 범위를 지원 하 고 많은 종류를 원하는 다른 이전 방법의 상세 보고 조직 문화 접시 그리고 요리입니다. 또한 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징이 자동화 경도 luciferase 셀 단층 또는 전통에 의해 쉽게 관찰 될 수 없습니다. 있는 조직, luciferase 식 공간 변이의 관측 수 방법입니다. 우리는 악어 기존의 방법에 비해 luciferase 활동의 탐지에 대 한 대폭 증가 유연성을 제공 하는 방법을 강조 표시 합니다.

Introduction

유전자 발현 및 단백질 활동의 기자로 luciferases 사용 하 여 분자 및 세포 생물학 연구에서 인기 있는 기술 되고있다. 이것은 사실이 circadian 필드, 반딧불 luciferase 합성 및 촉매 비활성화의 속도 약 24 h circadian 주기 동안 발생 하는 유전자 발현의 경도 변화를 보고 하는 데 특히 적합. 이와 같이, luciferase 생물, 균 류, 식물, 파리, 그리고 포유류1,2,,34를 포함 하 여의 넓은 범위에 걸쳐 circadian 기자로 채택 된다.

Circadian 유전자 식에 체 외에서측정 될 때 광 전 증폭 관 관 (PMT) 발광 신호를 기록 하는 데 주로 사용 됩니다. 그러나 PMT 기반 측정 제한 유연성, 일반적으로 미리 정해진된 접시 또는 접시 크기에 제한 되 고. 그것은 불가능도 luciferase 식에서 공간 변화를 보여 주는 샘플을 이미징 하는 경우 정보의 손실에 지도할 수 있는 PMT를 사용 하 여 모니터링 샘플에서 공간 정보를 수집 합니다. 또한, PMT와 관련된 전자는 표준 셀 문화 인큐베이터의 습도 환경에 노출 되 면 오작동 하는 경향이, Pmt를 사용 하 여 경도 luciferase 녹음은 항상 비 습도 인큐베이터에서 수행 됩니다. 결과, 셀 문화 요리 공기 증발을 통해 수 분 손실을 방지 하기 위해 꽉 밀봉 해야 합니다 및 3-따라서 문화 미디어를 버퍼링 해야 합니다 (N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 또는 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), vivo 기능 그리고 포유류 조직 문화에서 일상적으로 사용 하는 시스템을 버퍼링 CO2/bicarbonate 보다는.

이러한 제한의 결과로 Pmt에 의해 생물 발광의 측정은 일반적으로 세포 실험 동안 유지 되는 조건에 꽉 제한을 장소. 이러한 문제를 극복 하 고 또한 가능한 실험 조건의 범위를 증가, 우리는 표준 공동2/N2 170 L 조직 문화 인큐베이터는 물 냉장 전자-멀티의 추가 의해 적응 되었습니다 사용 하 여 전 하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 anti-mist 광학 및 디지털 제어 온도 가스 레벨의. 이 가스 이미징 Luciferase 자동 경도 및 Temperature-Optimized 레코더, 또는 악어 별명은. 악어 발광 이미징, 모두 표준 조직 배양 플레이트의 높은 처리량 이미징의 유연성을 크게 증가 수 있습니다 (동시에 최대 6 x 96-또는 384-잘 접시)와 또한 비표준 조직 문화 시스템에 대 한 이러한 끼얹는다 셀으로 미세 장치에서 성장. 이 악기는 또한 가변 제어 모두 CO2 와 O2 부분 압력으로 온도 습도 조건 하에서 발생 하는 화상 진 찰에 대 한 수 있습니다.

프로토콜 아래 포유류 세포와 악어 (이제부터 '생물 발광 인큐베이터' 라고도 함)를 사용 하 여 조직 문화 시스템의 발광 녹음 하는 방법을 설명 합니다. 그러나 그것은,, 시스템 발광 영상 하 고 또한, 일부 수정, 형광 이미징, 다른 생물 학적 시스템 및 컨텍스트 수에 적합 될 것 이라고 주목 한다.

Protocol

1. 시드 및 셀의 온도 유입

참고:이 프로토콜은 엄격 하 게 테스트 되었습니다 PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) 융합 단백질4를 표현 하는 기본 및 불멸 하 게 마우스 fibroblasts을 사용 하 여. 실험 다른 셀 라인을 사용 하 여 만들 수 조정 해야 합니다.

  1. 세포 배양을 시작 하기 전에 따뜻한 37 ° C 물 목욕으로 다음 장소: 0.68 m m ethylenediaminetetraacetic 산, pH 7.2 (PBS + EDTA), 적절 한 세포 배양, 예를 들면, 보충 식 염 수 (PBS) (pH 7.4), PBS 인산 염 버퍼 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 µ g/mL 스와 0.25 %trypsin 용액 보충.
  2. 트립 신 1:3 미리 데워 공영 + EDTA 솔루션을 희석 하 고 물 목욕을 반환 합니다.
  3. 70-90%는 luciferase 표현 셀의 125 cm2 플라스 크 confluent 가져가 라. 미디어 발음 10 mL 미리 데워 공영을 추가 합니다.
  4. PBS 발음 2.5 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 반환 합니다.
  5. 인큐베이터와 현미경 아래 보기에서 셀을 제거 합니다. 대부분 세포의 플라스 크 바닥에서 분리 했으면, 다음 단계를 계속. 대부분의 세포는 플라스 크의 하단에 연결 된 남아, 반환 그것 인큐베이터에 대부분의 세포에에서까지.
  6. 플라스 크를 표준 세포 배양 매체의 더 7.5 mL를 추가 합니다. 필요한 경우, 추가 필요에 따라 셀의 통과 위해 이것의 1 mL를 제거 합니다.
  7. Hemocytometer 고 trypan blue를 사용 하 여 나머지 셀의 밀도 계산. 또한, 셀 라인에 대 한 적절 한 셀을 희석.
    참고: 아래 실험에 대 한 PERIOD2::LUC fibroblasts 6 x 103 셀/c m2 와 1 x 104 셀/cm2 96 잘 접시, 35mm 요리, 또는 채널 슬라이드 사이 시드 했다.
  8. 씨 셀 조직 문화 요리 또는 기록을 위해 사용 될 판에.
    참고: 블랙 양면, 분명 바닥 플레이트의 사용은 권장이 녹음 하는 동안 우물 사이 방해를 감소 하는 동안 녹음 시작 전에 평가 문화 건강 수 있습니다. 생물 발광 수준은 매우 낮은, 흰색 접시/접시 인광 이어질 수는 몇 시간 동안 지속 되는 배경 신호를 증가 하는 하십시오 빛 검출을 극대화 하기 위해 사용 되어야 한다.
  9. 인큐베이터에 접시를 반환 하 고 100% 합류 (약 7 일)에 도달 하는 monolayers를 허용 합니다.
    참고: 일단 confluent, 접촉을 억제 하는 세포 선 유지 될 수 최대 3 주 전에 실험에 대 한 미디어 정기적으로 새로 고치는 (매 5-7 일).
  10. 일단 confluent, 동기화 실험5,6 직전 72 h의 최소 적용된 온도 사이클 (12 h 12 h 37 ° C에서 32 ° C에서)를 사용 하 여 셀룰러 리듬 (미리 프로그램 된 자전거 인큐베이터를 사용 하 여 의해 제어 되는 컴퓨터에 연결 되어 직렬 rs-232 포트를 통해 인큐베이터).
    참고: 셀룰러 리듬의 동기화에 필요한 온도 사이클 수 셀 라인 사이 다를 수 있습니다 그리고 그러므로 다른 셀 라인에 대 한 최적화를 할 수 있습니다. 급성 약물 자극 산림 또는 dexamethasone을 사용 하 여 또한 사용 되었습니다 이전 동기화 셀룰러 리듬7,8.

2. NS21 준비

참고: NS21 신경 및 기타 세포 배양의 유지 보수에 대 한 혈 청 무료 보충 이다. B27 상용 이며 circadian 생물 발광 녹음9동안 혈 청 교체로 사용할 수 있습니다로 알려진 비슷한 보충의 상세입니다. 어느 보충 교재를 번갈아 기록 매체에서 아래 설명 된 실험 프로토콜에 대 한 사용할 수 있습니다. 그것은 확실히 가능 하 고 비용 효율적인 NS21 첸 외. 마찬가지로 사내 수 있도록 10, 그리고 여기에 설명 된 대로.

  1. 시작 하기 전에 1 시간 실 온에서 표 1 에 설명 된 모든 구성 요소 equilibrate
  2. 얼음에 324 mL 기저 매체 (, neurobasal)에서 50 g 소 알 부 민을 디졸브. 가능 한 한 작은 혼합물을 저 어.
  3. 다른 모든 구성 요소, 각 구성 요소 후 최소한 감동 하지만 여전히 철저 하 게 혼합을 추가 합니다. 시작의 90 분 이내에 모든 구성 요소를 분해 하는 것을 목표로.
  4. 약 최종 혼합물 수 고가 필요할 때까지-20 ° C에서. 반복적인된 동결-해 동 주기를 하지 마십시오.
    참고: 혼합물이 너무 점성이 단계에서 필터링 하지만 살 균 필터링 됩니다 때 셀에 추가 하기 전에 미디어로 희석.

3. 기록 미디어 준비

참고: 경도 bioluminescence를 기록 하기 위한 다른 장비를 통해 생물 발광 인큐베이터의 주요 장점은 그것이, 인큐베이터 축이다 O2 와 CO2의 부분 압력을 변화 있게 되 고, 덕 녹음 생물 발광에 대 한 미디어 조건의 넓은 범위를 사용 하 여- vivo에서유형 더 밀접 하 게 다른 세포에 의해 점유 하는 생리 적 틈새를 대략적인 조건을 포함 한. 아래 기록 매체에서 헤이스팅스 외. 적응의 공식 설명 9, 우리가 일상적으로 배양된 섬유 아 세포와 다른 세포 유형 사용. 첫 번째는 (가스 교환) 없이 봉인된 문화 조건 그리고 두 번째 순수 관련 조건에 대 한 5% CO2습도 조건 하에서 사용 해야 합니다.다른 많은 변이 모두 가능한 어플리케이션 및 셀 형식에 따라 권장 합니다.

  1. 높은 포도 당 MOPS 버퍼 미디어 준비
    참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L) 0.35 mg/mL 탄산, 5 mg/mL 포도 당, 0.02 M MOPS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.
    1. 8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.
    2. 포도 당 솔루션 (100 g/L), MOPS (1 M, pH 7.6)의 20 mL 50 mL 펜/strep 솔루션, x 100의 10 mL을 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.
    3. 4.7 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.
    4. 미디어 pH 7.6 (경우 실내 온도에) 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C)를 조정 합니다.
    5. 1000 mL의 최종 볼륨을 생산 초순 물을 추가 합니다.
    6. 0.22 μ m 필터 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소를 통해 여과 하 여 소독.
    7. 실험, 이전 10% 혈 청, 2 mM L-alanyl-L-글루타민, NS21, 2% 및 1mm 소 일 주식을 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.
    8. osmometer을 사용 하 여 미디어의 osmolality를 측정 합니다.
      1. osmometer을 켭니다.
      2. Osmometer 초순 물으로 먼저 보정. 50 µ L 물 측정 그릇의 바닥에 추가 합니다. 액체에 있는 아무 거품을 확인 합니다. 조사를 통해 배를 클립. '0'을 눌러 및 신중 하 게 가장 낮은 지점에 osmometer 팔. 읽기 완료 되 고 팔을 제기 하 고 배를 제거 하기 전에 녹색 '결과' 빛이 켜질 때까지 기다립니다.
      3. 50 µ L 교정 표준을 사용 하 여 300 mOsmol/kg osmometer 보정을 반복 합니다. 팔을 낮추기 전에 '칼'을 누릅니다.
      4. 샘플 osmolality 측정 용기와 위와 같이 측정의 하단에 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 측정 합니다. Osmometer 팔을 낮추기 전에 ' 샘플'을 누릅니다.
    9. 5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol osmolality를 조정 합니다.
  2. HCO3-버퍼링 낮은 포도 당 미디어 (매체 관류) 준비
    참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L), 3.7 mg/mL 나트륨 중 탄산염, 1 mg/mL 포도 당, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.
    1. 8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.
    2. 포도 당 솔루션 (100 g/L), 100 x 펜/strep 솔루션의 10 mL 50 mL를 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.
    3. 49.4 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.
    4. (실 온)에서 7.6 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C) 미디어 pH를 조정 합니다.
    5. 1000 mL의 최종 볼륨을 주고 초순 물을 추가 합니다.
    6. 사용까지 0.22 μ m 살 균 필터와 4 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.
    7. 실험, 이전 2% 혈 청, 2 m m L-alanyl-L-글루타민, 2 %NS21 및 작업 주식을 1 mM 소 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.
    8. 측정 하 고 osmolality MOPS 버퍼 미디어에 관해서는 5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol 조정 합니다.

참고: 소 농도 각 세포 유형 및 상황에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 자세한 내용은 참조 피 니 외. 11 혈 청 및 NS21 (또는 사용 하는 경우에, B27) 농도 응용 프로그램에 따라 다양 한 수 있습니다. 그러나, 우리 조언 한다, 그렇지 않으면 표시를 경험적으로 테스트 하지 않는 한 혈 청 및 NS21 (또는 다른 혈 청 자유로운 보충) 사용으로 이러한 홍보 세포 생존 및 첨부 파일. 연락 하지 않는 셀 라인에서 잘 억제, 그것은 또한 혈 청에 의해 추진 확산의 혼란 효과 방지 하기 위해 기록 미디어에서 혈 청 농도 낮출 필요가 있을 수 있습니다.

4입니다. 기록

  1. 녹음 하기, 따뜻한 37 ° C 물 목욕에 (단계 3.1 또는 3.2 실험에 따라)에서 적절 한 작업 미디어 주식을 배치 합니다.
  2. 동안 미디어 온난화, 생물 발광 인큐베이터에서 카메라 초점.
    1. 물 불 침투성, 온수 중립 밀도 필터를 나사 하 고 따로 설정 합니다.
    2. 높은 수집 속도와 비디오 기록 소프트웨어를 설정 합니다. 클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다. 0.2 s와 운동 시간 0.3 초를 '노출 시간'을 설정 합니다. 그들 이득 꺼져 있는지 확인 합니다.
    3. ' 수집 설정 ' 창을 닫고 "비디오 걸릴" 아이콘을 클릭 합니다.
    4. 항목 기록 높이에서 선반에는 비디오에 초점에 명확 하 게 때까지 초점 실린더를 사용 하 여 카메라 렌즈를 회전 합니다.
    5. '비디오 중지' 아이콘을 클릭 하 여 비디오를 중지 합니다.
    6. 나사 온수 중립 밀도 필터 위치로 다시; 이렇게 하지 않으면 EM-CCD 카메라 / 결로 인해 목표의 안개 손상 될 것 이다.
  3. 생물 발광 인큐베이터의 전면에 컨트롤 패널을 사용 하 여 원하는 실험 조건에 O2, CO2, 그리고 온도 설정 합니다.
    참고: perfused 수행 하는 경우 세포 배양 진행 섹션 5에 직접이 단계에서.
  4. 조직 문화 인큐베이터 및 미디어에서 aspirate에서 셀을 제거 합니다. 미디어를 미리 데워 작동 주식 바꿉니다.
  5. 생물 발광 인큐베이터 실험 기간 동안 습도 하지 않습니다, 경우 다음 봉인 요리와 플레이트 가스 불 침투성 물개와 함께.
생물 발광 인큐베이터 습도 수 번 창 하 고 있다면, 다음 필요는 없습니다 엄격 하 게 요리, 인감 인감 96 잘 접시, 작은 양의 증발 할 수 있는 그렇지 않으면 가스 침투성 물개를 사용 하 여 같은 작은 볼륨으로 요리 하는 것이 좋습니다 있지만 여전히 습도 incubators에도 발생 합니다.
참고: 습기 인큐베이터의 기지에서 물 트레이 작성 하 여 이루어집니다.
  • 생물 발광 인큐베이터, 가까운 인큐베이터 문과 보안 인큐베이터 빛 단단한 물개를 형성 하는 자리에 커버를 셀을 전송 합니다.
  • 응용 프로그램에 대 한 적절 한 녹화 매개 변수를 선택 합니다.
    1. 클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다.
    2. ' 카메라 설치 ' 패널에서 설정: '수집 모드' '운동'; '노출 시간'을 원하는 노출 시간에서 초 (아래 참고 참조); ' 축적 ' 1; '운동 시리즈 길이' 취득 주기의 수를 원하는; '운동 주기 시간'을 원하는 이미지 간격 (이것은 노출 시간 보다 큰 수 있도록); ' 이동 속도 ' 4.33 µsecs; 1. ' 이득 ' 그리고 그들 이득 '을 원하는 레벨 (아래 참고 참조)
    3. '자동 저장' 패널에서.sif 또는.tif 파일 타입을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한.
    4. '스풀링' 패널에서 티파니에 파일 형식을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한. 인수 설정 창을 닫습니다.
  • '받아 신호' 버튼을 클릭 하 여 녹음을 시작 합니다.
    참고: 생물 발광 인큐베이터는 다른 세포와 조직 유형, 모두는 생물 발광의 다른 수준을 것입니다의 많은 수를 위해 사용할 수 있는 적절 한 발광 신호를 수집 하는 데 필요한 노출 시간 달라 집니다 사이 실험입니다. 그것은 또한 신호 수집의 크기를 늘리기 위해 이미징의 전자 멀티 (EM) 이득 다 수 있습니다. 알 수 없는 밝기의 새로운 애플 리 케이 션에 대 한 것이 좋습니다 먼저 EM 이득 없이 비교적 짧은 노출 시간 (약 10 분)와 함께 하나의 이미지를 복용 하 고 이후 노출 시간 및 그들을 조정 얻을 원하는 녹음 조건 되었습니다 때까지 에 도달 했습니다. 대부분의 경우, 카메라에 대 한 최대 가능한 화소 강렬의 10-20%의 평균 신호를 목표로 좋은 수준입니다. 위에서 설명한 대로 녹음 매개 변수 집합에 도달 하면 일단 이미지의 경도 수집을 시작 합니다.
  • 5. 끼얹는다 조직 문화 (선택 사항)

    참고: 소개에 설명 된 대로 생물 발광 인큐베이터 비표준 조직 문화 시스템의 이미징에 적합 하다. 이것은 끼얹는다 세포 배양에 대 한 시스템의 개발에서 궁 행.

    1. 섹션 1에서 설명한 대로 시드 단일 채널에 셀 루어 커넥터 0.6 이나 0.8 m m, 10 %FBS 펜/strep, DMEM의 채널 깊이와 슬라이드. 3.2 단계에서 설명한 대로 관류 미디어를 확인 합니다.
    2. 이전에 녹음, 배관 1 m m 내부 직경 (아이디)를 사용 하 여 필요한 관류 시스템에 대 한 준비 ETFE 튜브 1mm 아이디 실리콘 튜브, 팔꿈치, 남성과 여성의 Luer 피팅, 그림 2A와 같이.
      참고: 대부분의 튜브의 길이 ETFE 튜브, 이후 채널 슬라이드에 링크 Luer 피팅 ETFE 배관 연결에 사용 된 실리콘 튜브의 2 cm 섹션.
    3. 70% 에탄올, 무 균 PBS 뒤 홍 조 하 여 튜브를 소독.
    4. 인큐베이터에서 채널 슬라이드에 세포 배양을 제거 합니다. 미디어를 발음 하 고 미리 예 열된 관류 미디어 바꿉니다.
    5. 미리 예 열된 관류 미디어로 20 mL 주사기를 채우십시오.
    6. 버퍼에 튜브를 연결 ( 그림 2참조) 슬라이드 하지만 셀이 포함 된 슬라이드와 튜브 및 관류 미디어 (3-5 mL)와 슬라이드.
    7. 셀이 포함 된 슬라이드를 연결 하 고 모든 기포를 제거 하는 미디어의 더 1 mL와 함께 전체 시스템을 플러시.
    8. 생물 발광 인큐베이터에 전체 시스템을 전송.
    9. 맞는 미디어 채워진 주사기는 주사기를 배관에서 분리 하지 않고 펌프와 거기 보장 하는 펌프를 사용 하 여 전체 시스템을 통해 미디어의 추가 1 mL를 플러시 시스템에 없는 기포는.
    10. 사용 되는 주사기의 펌프에 직경을 설정 합니다.
      참고: 여기에 사용 된 20 mL 주사기에 대 한 직경 19.13 m m입니다.
    11. 50 µ L/h는 펌프의 유량을 설정 하 고 실행을 시작 합니다.
    12. 이러한 영향을 미칠 것 luciferase 식 세포 단층에 걸쳐 전달 하는 때로 모든 슬라이드 또는 녹음을 시작 하기 전에 튜브에 없는 거품 인지 확인 합니다. 필요한 경우 플러시 추가 미디어가 셀에서.
    13. 생물 발광 인큐베이터 문 닫고 녹음을 시작 하려면 단계 4.7에서 계속 합니다.

    6입니다. 기록 하는 동안 치료

    참고: 가끔은 녹음, 중간 세포를 치료 하는 것이 좋습니다 약리학 또는 호르몬 작용 될입니다. 이러한 경우, 그것은 절대적 세포 주의 치료 기간 동안 리셋에서 셀룰러 발진을 방지 하기 위해 처리 됩니다. 이러한 이유로, 그것은 특별 한 중요성의 세포는 일정 한 온도에서 유지 됩니다 이것이 셀룰러 circadian 리듬5,6에 대 한 주요 연행 큐.

    1. 녹음을 중지 하기 전에 처리의 모든 구성 요소를 준비 합니다.
    2. 37 ° c.에 화학 등온선 패드를 준비
    3. 장치 녹음 중지, 제거 처리를 요리 등온 열 패드에.
    4. 전에 동일한 위치에 생물 발광 인큐베이터에 필요 하 고 반환으로 문화를 처리 합니다.
    5. 다시 녹음을 시작 합니다.

    7입니다. 분석

    참고: 생물 발광 인큐베이터는 개별 이미지의 일련의 형태로 데이터를 생성합니다.우리는 주로 피지12 를 사용 하 여 이러한 이미지를 관리 하 고 각 지역-의-(ROI)에 대 한 관심 추가 분석에 대 한 평균 픽셀 강도 데이터 내보냅니다.

    1. 이미지 스택 피지 열고 클릭 하 여 밝기 및 대비를 조정 "이미지 | 조정 | 밝기/명암 대비 "하 고 이미지까지 슬라이딩 막대를 조정 발광 신호를 보기 위한 적절 한 범위 내에 있습니다.
    2. 투자 수익 관리자에서 사용할 수를 사용 하 여 관심 분야 선택 "분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 "입니다.
    3. 클릭 하 여 선택된 영역에 대 한 수출 평균 신호 "ROI 관리자 | 더 | Multimeasure "입니다.
    4. 분석 소프트웨어에 결과 데이터를 복사 합니다.
    5. 수동으로 데이터를 이미징, (, 15, 30 또는 60 분 간격, 0.25, 0.5, 또는 h 1)의 시간 간격의 시간 기준 조정 보다는 이미지 번호 피지에서 제공.
      참고: 추가 분석 이제 수행할 수 있습니다, 기간의 결정 등. 이 위해, 다음 방정식 비 선형 회귀 분석을 수행 하는 데 사용 됩니다.
      Equation
      y 는 신호, x 해당 시간, m 은 추세 선의 그라데이션, c 는 추세선의 y 절편, 진폭은 추세 라인 위에 파형의 피크의 높이, k 붕괴 상수는 또는 댐핑의 속도 (같은 1 /k 는 반감기), 단계는 x의 코사인 웨이브에 변화 및13를 완전 한 사이클에 대 한 시간을 기간은. R2 값은 적합의 미 덕의 지시자로 사용 됩니다.  다른 분석 방법을 수 있습니다. 세포질 bioluminesence이이 시간 동안에 과도, 비 circadian 변화를 전시 수 있습니다로 취득의 첫 24 시간 분석에서 제외 한다. 이것은 미디어 변화에 급성 반응의 결과 이다.

    Representative Results

    이 문서는 악어 (생물 발광 인큐베이터)를 사용 하 여 포유류 세포의 발광 영상에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 발광 시스템 이미징 extracellular 조건과 실제 설치의 유연성에 대 한 수 있습니다. 간단한 정적 조직 문화 (그림 1, 보조 비디오 1) 및 (그림 2, 보조 비디오 2) 끼얹는다 세포 배양 방법을 설명 하지만 다른 많은 설정을이 시스템을 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 모든 데이터 섹션 7에 설명 된 방법을 사용 하 여 정량 했다.

    그림 1A PER2::LUC fibroblasts4를 포함 하는 6 x 96 잘 접시에서 녹음 하는 생물 발광의 비디오는 예를 보여 줍니다. 이들은이 실험에 필요한으로 바깥쪽 웰 스 셀을 포함 하지 않습니다. 녹음에 대 한 지속적인 37 ° C에서 개최 되 고 전에 셀 차동 온도 유입, 그것에 의하여 그들은 32 ° C 12 h 72 h 또는 대화 (12 h, 12 h 72 h에 32 ° C에 뒤 37 ° C에서), 37 ° C에 의해 다음에 12 h의 어느 온도 사이클을 받게 받은 합니다. 60 분 노출 매 시간을 촬영 했다. 이러한 조건 중 두 개는 그림 1B에서 정량.

    그림 2A 끼얹는다 조직 문화에 대 한 시스템의 설치의 회로도 보여준다. 배관으로 연결 하는 두 개의 채널 슬라이드 이것에 의하여 이루어져 있다. 미디어 셀에 걸쳐 주사기 펌프에 의해 구동 됩니다. 이 슬라이드의 첫 번째 가스 투과성 거품 트랩 (버퍼 슬라이드) 역할을 하며, 두 번째 셀 포함 생물 발광은 기록 하는 셀을 포함 하. 이 시스템에서 비디오를 녹화 하는 대표는 그림 2B에 표시 됩니다. 15 분 노출 매 15 분을 촬영 했다. 표준 관류 조건 또는 카 세 인 키 니 아 제 억제 물 PF670462, 이전 circadian 기간을 길게 하 고 경작에 시계 유전자 식 리듬의 진폭을 감소를 보여왔다 존재 셀의 유지 관리 하는 자, 포유류 세포14. PER2::LUC 식에 미치는 영향의 정량화와 그림 2C (하단 패널)에 표시 된 표준 정적 셀 문화 조건 하에서 약물의 동일한 농도로 처리 하는 셀에 대 한 그림 2C (상단 패널)에 표시 됩니다. 그림 2D에 나와 있습니다. 그것은 이것에서 PF670462 치료 조건의 두 세트에서 PER2::LUC 식 영향입니다. 그러나, 동안 셀 끼얹는다 조건 표시 기간 길어 약 3 h (3 ±0.9 h)에서 PF670462로 치료, 약물으로 치료 하는 정적 조건에서 셀 표시의 기간에 실질적으로 더 큰 기간 길이 > 48 h. 이 섹션 7에 설명 된 대로 감쇠 코사인으로 들어갈 수 있는 (사각형의 여분 합계 F 직선 p 테스트 < 0.0001). 흥미롭게도, 관류에서 기간 연장의 진도 훨씬 vivo에서14관찰에 가까운 이다.

    Figure 1
    그림 1: 데이터 예제. (A) 예를 들어 6 x 96에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷 잘 생물 발광 인큐베이터에 접시. 웰 스를 측정할 수 있다 보조 비디오 1에서 노란색으로 강조 되었다. A.에서 생물 발광의 부 량 (B) 두 셀의 3 판 서로 반대 PER2 단백질 식의 단계 생산을 반대로 phasic 했다 온도 사이클 (32 ° c h 12; 12 h, 37 ° C에서)를 사용 하 여 개입 했다 (n = 6, ± SEM을 의미). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2: CK1δ 억제제와 관류. 관류 시스템의 (A) 회로도 (B) 예를 들어 PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 비디오 스냅샷 관류에서 세포. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. PER2::LUC 섬유 아 세포 관류에서 고 3 µ M CK1 억제제 PF670462 없이 정적 조건에서의 생물 발광의 (C) 정량화 (n = 3, ± SEM을 의미). 생물 발광은 최소 및 최대 값을 정규화 되었습니다. (D) 분석 기간 (양방향 ANOVA, Holm Sidak 여러 비교 테스트).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    구성 요소 최종 중간 농도 (μ M) 주식 (mg/mL) 400 mL NS21에 대 한
    소 민 37 - 50 g
    카 탈 라 제 0.01 - 50 mg
    3.2 - 20 mg
    인슐린 0.6 10 8 mL
    Superoxide dismutase 0.077 - 50 mg
    홀로 처리가 0.062 - 100 mg
    T3 (triiodo-L-thyronine) 0.0026 2 20 Μ L
    L-카 르 니 틴 12 - 40 mg
    방법 16 액체 (1 g/ml) 20 Μ L
    D (+)-갈 락 토스 83 - 300 밀리 그램
    Putrescine 183 - 322 밀리 그램
    나트륨 Selenite 0.083 1 280 Μ L
    Corticosterone 0.058 2 0.2 mL
    리 놀 레 산 3.5 100 0.2 mL
    리 놀 렌 산 3.5 100 0.2 mL
    리 포 산 0.2 4.7 0.2 mL
    황 체 호르몬 0.02 3.2 0.04 mL
    레 티 놀 아세테이트 0.2 20 0.1 mL
    Retinol, 모든 트랜스 0.3 10 0.2 mL
    D, L-알파-토 코 페 롤 2.3 100 0. 2 mL
    D, L-알파-토 코 페 롤 아세테이트 2.1 100 0.2 mL

    표 1: NS21 준비입니다.

    보충 비디오 1: 예제 비디오 잘 플레이트에서 생물 발광의. 예를 들어 생물 발광 인큐베이터에서 6 x 96 잘 접시에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷. 웰 스 측정할 수를 노란색으로 강조 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

    보충 비디오 2: PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 예제 비디오 스냅샷 세포 관류에서. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

    Discussion

    여기에 설명 된 프로토콜 끼얹는다 고 정적 조건 모두 포유류 세포 배양입니다. 그러나, 악어 쉽게 다른 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 실제로, 그것은 이미 표시 되었습니다 동시 운동, 수 면, 그리고 주변 유전자 초파리 melanogaster 상수 어둠15. 유지에 식 리듬의 모니터링을 위한 뛰어난 플랫폼을 제공 하 그것은 또한 응용 프로그램에 따라 여기에 언급 된 그 외 카메라 유형을 적절 한 있을 수 있습니다, 지적 했다. 우리는 적절 한 필터와 함께 현재 설치의 수정된 된 버전 보안 주체에 사용 될 수 형광 정량화 정시.

    악어 적절 한 않을 수 있습니다 유일한 응용 프로그램은 특히 높은 공간 해상도 필요할는 포유류의 organotypic 조각에 PER2::LUC 식의 spatiotemporal 조직의 이미징 suprachiasmatic 핵, 또는 다른 작은 조직 조각입니다.

    악어는 지금 까지는 되지 않은 기존의 레코딩 기술에 의해 쉽게 달성 많은 실험을을 수행할 수 있습니다. 생물 발광의 측정을 위한 현재 방법과 비교해, 악어 셀 문화 접시 또는 사용할 수 있는 슬라이드, 외부 미디어 조건, 감도, 및 processivity 두 유형의 증가 유연성을 제공 합니다.

    이것은 특히 적합 한 번에 3D organoid 문화 시스템이 향해 문화 모델은 표준 2D 셀에서 이동이 있을 때. 이와 같이, 악어는 생물 발광은 많은 일 및 광범위 한 조건 아래 주에 측정 될 수 있다 적응 방법을 제공할 것입니다 예상 된다.

    Disclosures

    아니 이해 충돌 존재 한다.

    Acknowledgments

    우리는 케 른 연구 특히 마크 헨 슨, 제레미 그레이엄과 호 코 레이 아에서에서이 시스템을 개발 하기 위해 우리와 함께 작업 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 감사 데이비드 웨일스어 및 Akhilesh 레디 (하 마)의 이전 피터 Laskey 뿐 아니라 설계 단계 동안 귀중 한 토론에 대 한 원고를 그의 중요 한 입력에 대 한 데모 카메라와 데이비드 웡의 대출을 정리.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021
    Hyclone FetalClone III Serum GE Healthcare SH30109.03
    Neurobasal medium Thermofisher 21103049 basal medium
    Bovine Serum Albumin Sigma A4919
    Catalase Sigma C40
    Glutathione Sigma G6013
    Insulin Sigma I1882
    Superoxide Dismutase Sigma S5395
    Holo-transferrin Calbiochem 616424
    T3 (triiodo-L-thyronine Sigma T6397
    L-Carnitine Sigma C7518
    Ethanolamine Sigma E9508
    D (+)-Galactose Sigma G0625
    Putrescine Sigma P5780
    Sodium Selenite Sigma S9133
    Corticosterone Sigma C2505
    Linoleic Acid Sigma L1012
    Linolenic Acid Sigma L2376
    Lipoic Acid Sigma T1395
    Progesterone Sigma P8783
    Retinol Acetate Sigma R7882
    Retinol, all trans Sigma 95144
    D,L-alpha-Tocopherol Sigma 95240
    D,L-alpha-Tocopherol acetate Sigma T3001
    Sodium Bicarbonate Solution Sigma S8761-100ML
    GlutaMAX (100x) Gibco 35050-038
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
    Galaxy 170R incubator  Eppendorf CO17301001
    Luciferin Biosynth L-8220
    D -(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML
    DMEM powder Sigma D5030
    MOPS Sigma PHG0007
    1 mm I.D. silicone tubing  GE Healthcare 19-4692-01
    Elbow luer connector Ibidi 10802
    Male luer fittings Ibidi 10826
    Female luer fittings Ibidi 10825
    µ-slide luer I 0.6 Ibidi 80196
    BD plastipak 20ml syringe Becton Dickinson 300613
    1mm I.D. ETFE tubing GE Healthcare 18-1142-38
    PF670462 Sigma SML0795
    B27 Supplement (50x) ThermoFisher 17504044
    iXon Ultra EMCCD camera Andor iXon 888
    Fiji ImageJ N/A
    Prism 7.0 Graphpad Software N/A
    Trypan blue Sigma T8154
    Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
    Heated neutral density filter  Cairn Research Custom item
    Osmomat 030 Gonotech Discontinued
    300 mOsmol/kg calibration standard Gonotech 30.9.0020
    Measuring vessel Gonotech 30.9.0010
    Focusing cylinder Cairn Research Custom item
    NE-1600 programmable syringe pump Pump Systems inc. NE-1600
    Andor Solis Software Andor N/A

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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