النهج الخلفي نصف دائري قناة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الماوس الأطفال حديثي الولادة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

في هذه الدراسة، يصف لنا النهج الخلفي نصف دائري القناة كوسيلة موثوق بها لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الفئران حديثي الولادة. ونحن تبين أن إيصال الجينات عبر قناة نصف دائري الخلفي قادرة على نتخلل الإذن الداخلية كاملة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isgrig, K., Chien, W. W. Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse. J. Vis. Exp. (133), e56648, doi:10.3791/56648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويوفر العلاج الجيني الإذن الداخلية وعدا كبيرا كعلاج محتمل لفقدان السمع، والدوخة. واحدة من العوامل الحاسمة في نجاح العلاج الجيني الإذن الداخلية هو إيجاد طريقة تسليم التي تؤدي إلى الكفاءة توصيل متسقة من أنواع الخلايا المستهدفة مع التقليل من فقدان السمع. أننا في هذه الدراسة، وصف النهج الخلفي نصف دائري قناة كوسيلة فعالة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الفئران حديثي الولادة. ونحن تبين أن إيصال الجينات عبر قناة نصف دائري الخلفي قادرة على نتخلل الإذن الداخلية كاملة. تحديد القناة نصف دائري الخلفي التشريحية سهلة، فضلا عن التلاعب بالحد الأدنى من العظم الصدغي المطلوبة، نهج جعل هذه الجراحة خياراً جذاباً لإيصال الجينات الإذن الداخلية.

Introduction

العلاج الجيني الإذن الداخلية حقل التطور السريع للتحقيق. أنه طبق في نماذج مختلفة من الحيوانات لمكافحة مؤقت والصدمة الضوضاء و فقدان السمع الوراثي1. أظهرت دراسات أجريت مؤخرا عدة الانتعاش وظيفية للسمع وتوازن وظائف في الفئران المسخ بعد الإذن الداخلية الجينات العلاج تسليم2،3،4،،من56، 7-من أهم العوامل في تحديد نجاح العلاج الجيني الإذن الداخلية هو النهج الجراحية المستخدمة للوصول إلى الإذن الداخلية. ومن الناحية المثالية، سيكون من السهل لتنفيذ النهج الجراحية والمعالم التشريحية التي ستكون متسقة وسهلة لتحديد وتوصيل الناتجة من أنواع الخلايا المستهدفة ستكون مرتفعة.

في دراسة أجريت مؤخرا، واظهرنا أن عندما تم حقن العلاج الجيني الفيروسي من خلال قناة نصف دائري الخلفي الماوس مركزتين المسخ (نموذج من فقدان السمع، واختلال وظيفي الدهليزية)، كفاءة توصيل لخلايا الشعر حسية كان ينظر إليه في الدهليزية الأجهزة، وكذلك كما هو الحال في القوقعة5. كفاءة عالية لتوصيل الحسية الشعر خلية أسفر عن تحسن الوظائف السمعية والدهليزيه في هذه الفئران المسخ.

في هذه المقالة، يصف لنا بالتفصيل النهج الخلفي نصف دائري قناة الوصول إلى الإذن الداخلية الماوس الولدان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافق جميع الإجراءات الحيوان بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة في المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى NIDCD (ASP1378-15).

1-إجراءات الإعداد والتحضير

  1. تعقيم جميع الصكوك بأكسيد الإيثيلين في بداية التجربة. بين الحيوانات، وتنظيف أدوات لاستخدام التعقيم حبة.
  2. تحميل الحل الذي يحتوي على العلاج الجيني الفيروسي في ميكروبيبيتي في مايكرو-الحاقن. النواقل الفيروسية المستخدمة في هذه الدراسة كان AAV2/8-ويرلين (1 × 1013 الجينوم نسخاً في المليلتر، انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: عادة، يتم تحميل 1.1 ميليلتر الحجم الإجمالي إلى ميكروبيبيتي.

2-التخدير

ملاحظة: الضغط الماوس المستخدمة في هذه الدراسة هو الماوس مركزتين. طفرات متماثل (أي/أيمن Whrn) وليتيرماتيس متخالف (Whrn/+ أي) واستخدمت.

  1. تضع الأم في قفص منفصل (منفصلة من القمامة).
  2. ضع القفص الصفحة الرئيسية التي تحتوي على القمامة (P0-الجراء P5) على لوح حرارة مغلق (مجموعة عند 37.5 درجة مئوية) الدفء في الفئران.
  3. قطع الجزء الإبهام من قفاز مطاط، ووضع جرو فيه.
  4. ضع ألجرو في الإبهام قفاز مطاط في دلو من الجليد ل ~ 2 دقيقة.
  5. ضع ألجرو أنيسثيتيزيد على حزمة تجميد بلاستيك ساحة تجارية كبيرة مع شاش 4 "4" بين ألجرو والسطح حزمة على.
  6. ملء قفاز مطاط ثقيلة مع الثلج المجروش، والقفازات الجليد حول ألجرو.
  7. تحقق لمعرفة إذا كان ألجرو هو تخديره على نحو كاف بغياب كامل لأي استجابة للمنبهات المختلفة (بما في ذلك قرصه إصبع ثابتة). اترك ألجرو في كيس من الثلج لمدة الجراحة (حوالي 5-10 دقيقة).
    ملاحظة: نوصي بترك الجراء في كيس من الثلج لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة أثناء الجراحة.

3-العمليات الجراحية نهج (الشكل 1)

  1. تنظيف الجلد خلف الإذن بمسح اليود ويمسح الكحول مرة واحدة تم تخديره من الحيوان.
  2. شق بوستاوريكولار ~ 2 مم خلف الإذن باستخدام مقص الصغرى، وتقسيم العضلات الترقوية مع المقص الصغير.
  3. تحديد العصب الوجهي والفقاعة. الفقاعة عنقية وشبه شفافة في هذا العمر وهو يكذب الآنسي للعصب الوجهي. يمكن رؤية الشريان ستابيديال من خلال الفقاعة في هذا العصر، مما يشكل معلما مفيداً.
  4. اتبع العصب الوجهي ﻷسلحته وجيدة لتحديد موقع القناة نصف دائري الخلفي (المركز). إزالة ألياف العضلات والأنسجة اللينة التي تغمر القناة نصف دائري الخلفي باستخدام مقص الصغرى.
    ملاحظة: بحثتها عنقية في هذا العصر.
  5. اختراق بحثتها استخدام زجاج ميكروبيبيتي (~ 10 ميكرومتر في القطر) على مايكرو-الحاقن.
  6. حقن العلاج الجيني الفيروسي في الإذن الداخلية.
    ملاحظة: عادة، مجموعة حقن 20 من 49 nL العلاج الجيني يتم تسليمها إلى القناة نصف دائري الخلفي ما يزيد على 40 ~ s (إجمالي حجم ~ 1 ميليلتر). وكان عيار الفيروسية المستخدمة 1 × 1013 الجينوم نسخ كل مل.
  7. إغلاق شق الجلد باستخدام خياطة بوليجلاكتين 5-0.

4-بعد العملية الجراحية الرعاية

  1. ضع ألجرو على لوح الاحترار لاستعادة درجة حرارة جسم طبيعية أثناء الاسترداد من التخدير مع المستمر دليل التحفيز/المتداول مع القفاز الأصابع البشرية.
  2. مجرد ألجرو مستيقظا، وضعه مرة أخرى في قفصة المنزل.
  3. عناق كل ألجرو مع مسحه القطن التي تعرضت للفراش القفص المنزل.
    ملاحظة: الغرض من هذا هو أن الفئران رائحة كما فعلوا قبل الجراحة، مما يزيد من احتمال الأم إعادة قبول لها القمامة ما بعد الجراحة. إذا كان ذلك ممكناً، يمكن جمع البول من الأم ودعكهما الجراء استخدام مسحه القطن إلى مواصلة تخفيض احتمال الرفض.
  4. تطبيق الزيوت المعدنية للأنف الأم توعي لها8، ويعيد الأم في قفص المنزل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أدى حقن العلاج الجيني ويرلين AAV8 في الفئران مركزتين الأطفال حديثي الولادة من خلال القناة نصف دائري الخلفي ويرلين التعبير (الأخضر) في خلايا الشعر أوتريكولار (الشكل 2)، مع كفاءة الإصابة عموما 53.1 في المائة (SD 38.1، n = 28)5 . كان ممدود ترانسدوسيد الشعر الخلايا ستيريوسيليا (أحمر) مقارنة بخلايا الشعر من آذان غير حقن كونترالاتيرال (5.35 ميكرومتر ± 2.11 مقابل 3.20 ± 0.34 ميكرومتر، على التوالي)5.

حقن مؤخرة نصف دائري قناة ويرلين AAV8 أدى أيضا إلى توصيل cochlear خلايا الشعر في الفئران مركزتين (الشكل 3). خلية الشعر الداخلية متوسط كفاءة الإصابة كان 77.1% (SD 12.7، n = 8)5. خلايا الشعر ترانسدوسيد وأعرب ويرلين (الأخضر) في نصائح ستيريوسيليا وكان ممدود ستيريوسيليا (أحمر) مقارنة بخلايا الشعر من آذان غير حقن كونترالاتيرال (5.04 ميكرومتر ± 0.72 مقابل 1.01 ± 0.08 ميكرومتر في ذروة cochlear، على التوالي)5.

Figure 1
الشكل 1 : الصور الموضعية.
صور المضاعفات تظهر الوصول الجراحي للقناة نصف دائري الخلفي (المركز) في ماوس P0. ويرد الإذن اليسرى. ويرد في الخطوط السوداء المتقطعة بحثتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : هي ترانسدوسيد الدهليزية خلايا الشعر باستخدام إيصال الجينات بحثتها.
AAV8 ويرلين تسليمها عبر بحثتها النهج أدى إلى ارتفاع مستويات الإصابة أوتريكولار الشعر خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : هي ترانسدوسيد cochlear الشعر الخلايا باستخدام إيصال الجينات بحثتها.
AAV8 ويرلين تسليمها عبر بحثتها النهج أدى إلى ارتفاع مستويات الإصابة cochlear الشعر خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وصف العديد من الطرق الجراحية الوصول إلى القوارض الداخلية الأذنين. كوتشليوستومي والنهج في إطار جولة هي الأكثر استخداماً للوصول إلى القوقعة، حين الخلفي نصف دائري القناة والنهج endolymphatic sac تستخدم عادة للوصول إلى أجهزة الدهليزية1. في دراسة أجريت مؤخرا، واظهرنا أن القناة نصف دائري الخلفي حقن العلاج بالجينات فيروسية أدت إلى كفاءة عالية لتوصيل خلية الشعر في أجهزة الدهليزية و القوقعة5. في الواقع، كان توصيل cochlear الشعر الخلية أعلى من خلال الحقن اللاحق نصف دائري القناة، بالمقارنة مع الحقن نافذة جولة في نفس الطراز الماوس من فقدان السمع الوراثي وخلل الدهليزية5،9. نظراً لقرب التشريحية بين الإطار جولة والقوقعة، يبدو من المفارقات أن إطار جولة الحقن قد يؤدي إلى توصيل cochlear الشعر خلية أقل مقارنة بحقن مؤخرة نصف دائري قناة. ويمكن تفسير هذه النتيجة بحقيقة أن الإطار جولة يقع بالقرب من قناة cochlear. ولذلك، عندما يتم حقن العلاج الجيني الفيروسي من خلال نافذة جولة، قد تضعف تركيزه بالسائل الدماغي النخاعي قادمة من قناة cochlear10.

كما أبلغ استنتاج مفاده أن نتائج حقن مؤخرة نصف دائري القناة في توصيل خلية الشعر cochlear والدهليزيه ب الدراسات الأخرى11،12. في دراسة أجراها أوكادا et al., ذكر توصيل خلايا الشعر cochlear والدهليزيه من إف-التجارة والنقل. ومع ذلك، لم يتم إجراء القياس الكمي العددي. أفادت دراسة سوزوكي وآخرون، مستويات عالية من توصيل خلية الشعر cochlear والدهليزيه مع إف-Anc80-التجارة والنقل باستخدام النهج الخلفي نصف دائري القناة في الفئران الكبار. في الفئران الكبار، cannulation قناة نصف دائري الخلفي مع قسطرة صغيرة الأفضل، حيث تغطي عظمى لقناة نصف دائري الخلفي تماما المتحجرة12. يمكن أن تساعد قسطرة القناة نصف دائري الخلفي في الفئران الكبار إلى أدنى حد من الدفق الحقن، التي يمكن أن تقلل من كفاءة توصيل. هذه الخطوة غير مطلوب في الفئران حديثي الولادة، نظراً لما زال عنقية عظمى تغطية القناة نصف دائري الخلفي في هذه السن.

واحدة من عيوب حقن مؤخرة نصف دائري القناة هو حقيقة أن المرء لا يمكن أن يكون بعض ما إذا كان يتم تسليم العلاج الجيني حقن في بيريليمف أو في اندولمف. وعلى الرغم من هذا النقص، تشريحيا سهلة لتحديد موقع القناة نصف دائري الخلفي ويتطلب معالجة الحد الأدنى من العظم الصدغي لهويتها. وهذا يقلل من فرصة للإذن الداخلية الأضرار الناجمة عن الصدمات الجراحية. حقن مؤخرة نصف دائري القناة خياراً جذاباً لإيصال العلاج الجيني الإذن الداخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا الكشف عن البيانات ذات الصلة لجعل.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل الأموال من نيدكد شعبة من داخلية البحوث/NIH (DC000082-02 إلى W.W.C.)، وكذلك DC000081 للتصوير الأساسية والمتقدمة. ونحن ممتنون لموظفي مرفق الحيوان نيدكد لرعاية الحيوانات لدينا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating microscope Zeiss OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts Fine Science Tools 11251-10, 11295-51 #5 and #55 Dumont
Micro-scissors Fine Science Tools 15002-08
Nanoliter2000 microinjector World Precision Instruments
Heating pad Mastex Model 500/600
5-0 vicryl sutures Ethicon
AAV8-whirlin Vector Biolabs
Glass pipette Sutter Instruments B100-75-10 Borosilicate glass

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics