Studie von In Vivo Metabolismus von Glukose in fettreichen Diät gefüttert Mäuse mit oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT)

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Summary

Der aktuelle Artikel beschreibt die Erzeugung und metabolische Charakterisierung von fettreichen Diät gefütterten Mäusen als Modell für Diät-induzierten Insulinresistenz und Fettleibigkeit. Freuen Sie sich auf weitere detaillierte Protokolle, um die oralen Glukose-Toleranz-Test und die Insulin-Toleranz-Test, Ganzkörper-Veränderungen der Glukose Stoffwechsel in VivoÜberwachung durchführen.

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Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

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Abstract

Adipositas ist den wichtigste einzelnen Risikofaktor in der Pathogenese des Typ 2 Diabetes, eine Krankheit, die durch eine Resistenz gegen Insulin stimuliert Glukoseaufnahme und eine grobe Dekompensation der systemischen Glukosestoffwechsel auszeichnet. Trotz erheblicher Fortschritte im Verständnis der Glukose-Stoffwechsel bleiben die molekularen Mechanismen der seine Regelung in Gesundheit und Krankheit untersucht, während neue Ansätze zur Vorbeugung und Behandlung von Diabetes dringend benötigt werden. Abgeleitete Glukose die Bauchspeicheldrüse Sekretion von Insulin stimuliert, dient als der wichtigste Regulator der zellulären anabole Prozesse während der gefüttert-Zustand und damit den Blutzucker Ernährung Ebenen um systemische Energiestatus aufrecht zu erhalten. Chronische Überfütterung Auslöser Meta-Entzündung, führt zu Veränderungen im peripheren Insulin-Rezeptor-assoziierten Signal- und reduziert somit die Empfindlichkeit gegenüber Insulin-vermittelte Glukose zur Verfügung. Diese Ereignisse führen letztendlich zu erhöhten Nüchtern-Glukose und Insulinspiegel sowie eine Reduktion in Glukose-Toleranz, die wiederum als wichtige Indikatoren der Insulin-Resistenz dienen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erzeugung und metabolische Charakterisierung der fettreiche Diät (HFD)-gefüttert Mäuse als häufig verwendete Modell der Diät-induzierten Insulin-Resistenz. Wir zeigen im Detail die oralen Glukosetoleranztest (OGTT), die periphere entsorgen ein oral verabreichtes Glukose Belastung und Insulin-Sekretion im Laufe der Zeit überwacht. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll für die Insulin-Toleranz-Test (ITT), Ganzkörper-Insulinwirkung zu überwachen. Zusammen repräsentieren diese Methoden und ihre nachgelagerten Anwendungen leistungsstarke Tools zur Charakterisierung des allgemeine metabolische Phänotyps von Mäusen sowie, insbesondere Veränderungen im Metabolismus von Glukose zu beurteilen. Sie können besonders nützlich sein, in den breiten Forschungsfeld der Insulinresistenz, Diabetes und Fettleibigkeit, ein besseres Verständnis der Pathogenese sowie hinsichtlich der Auswirkungen der therapeutische Interventionen zu testen.

Introduction

In der entwickelten Welt erreicht Adipositas und Diabetes epidemische Dimensionen aufgrund von Bewegungsmangel und dem übermäßigen Konsum von verarbeiteten Lebensmitteln, Effekte, die durch schnelle Verstädterung, Industrialisierung, sowie Globalisierung getrieben werden. Obwohl Forschung auf Insulin-Resistenz und seine Komorbiditäten, wie z. B. Hyperlipidämie und Atherosklerose, hat erlangte Bekanntheit in den letzten Jahrzehnten die komplexen biologischen Mechanismen, die regulieren den Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit bleiben unvollständig verstanden und es gibt noch ein dringender Bedarf an neuen Behandlungsmethoden zur Prävention und Behandlung dieser Krankheiten1.

Insulin und seine counter-regulatory Hormon Glucagon dienen als die wichtigsten Regulatoren der zellulären Energie Versorgung und Makronährstoff Gleichgewicht, damit gleichzeitig die richtige systemische Blut Glukose Konzentrationen2. Glukose selbst fungiert als eines der wichtigsten Stimulatoren der Insulin-Sekretion von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, während andere Makronährstoffe, Humorale Faktoren sowie der neuronalen Input weiter diese Antwort ändern. Insulin löst folglich die anabolen Prozesse des Staates, genährt durch die Diffusion des überschüssigen Blutzuckers in Muskel- und Fettzellen zu erleichtern und weitere Aktivierung Glykolyse sowie Protein oder Fettsäure-Synthese bzw.. Darüber hinaus unterdrückt Insulin hepatische Glukose Ausgabe durch Hemmung der Glukoneogenese. Chronische überschüssige Energieverbrauch und Meta-Entzündung führen zu Hyperinsulinämie und periphere Insulinresistenz durch die Down-Regulierung der Insulin-Rezeptor-Expression sowie Änderungen im nachgeschalteten Signalwege, wodurch sich beeinträchtigt Empfindlichkeit gegenüber Insulin-vermittelte Glukose-Entsorgung sowie unzureichende Hemmung der hepatischen Glukose Produktion3,4,5,6.

Eine breite Palette von Tiermodellen mit genetischen, Ernährungs- oder experimentelle Induktion von Krankheit erwiesen sich als hervorragendes Werkzeug, um die molekularen Mechanismen der Insulin-Resistenz und verschiedene Formen von Diabetes sowie die begleitenden Erkrankungen7 studieren werden . Ein Paradebeispiel ist die weit verbreitete und etablierte HFD-induzierte Mausmodell, charakterisiert durch schnelle Gewichtszunahme durch erhöhte Nahrungsaufnahme in Kombination mit reduzierten Stoffwechseleffizienz, wodurch Insulin Widerstand8, 9. sowohl bei Tiermodellen und beim Menschen, eine Erhöhung der Fastende Glukose und Insulin Blutspiegel, sowie ein eingeschränkter Toleranz gegenüber Glukose Verwaltung sind häufig verwendete Indikatoren der Insulin-Resistenz und andere systemische Veränderungen der Glukose Stoffwechsel. Blut Glukose und Insulin Überwachungsstufen an den basalen Zustand oder nach der Stimulation sind daher bequem auslesen.

Dieses Protokoll beschreibt die Generation der HFD gefütterten Mäusen sowie zwei häufig verwendete Methoden, den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und der Insulin Resistenz-Test (ITT), die nützlich, die metabolische Phänotyp zu charakterisieren und zu untersuchen sind Veränderungen im Glukosestoffwechsel. Wir beschreiben den OGTT im Detail, die die Entsorgung von ein oral verabreichtes Glukose Belastung und Insulin-Sekretion im Laufe der Zeit bewertet. Darüber hinaus bieten wir Anweisungen darüber, wie die ITT zur Insulinwirkung Ganzkörper-Untersuchung durch die Überwachung der Konzentration im Blut Glukose als Reaktion auf einen Bolus Insulin führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle sind gut etabliert und wurden in mehreren Studien10,11,12verwendet. Neben geringfügigen Änderungen, die dazu beitragen können, um Erfolg zu erhöhen, bieten wir Richtlinien für experimentelles Design und Datenanalyse sowie nützliche Hinweise auf mögliche Fallstricke zu vermeiden. Die hier beschriebenen Protokolle kann sehr mächtige Werkzeuge, um den Einfluss von genetischen, pharmakologische, diätetische und andere Umweltfaktoren auf ganzen Körper Glukose-Stoffwechsel und seine assoziierten Erkrankungen wie z. B. Insulin-Resistenz zu untersuchen. Zusätzlich zur Stimulation mit Glukose oder Insulin kann eine Vielzahl von anderen Verbindungen zur Stimulation abhängig vom Zweck der einzelnen Forschung verwendet werden. Obwohl außerhalb des Geltungsbereichs dieser Handschrift, können viele andere downstream-Anwendungen auf den gezogenen Blutproben, wie die Analyse der Blutwerte als Glukose und Insulin (z.B., Lipid und Lipoprotein-Profile) sowie detaillierte durchgeführt werden Analyse der Stoffwechselmarker (z. B.durch quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR), Western-Blot Analyse und Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)). Weitere flow Cytometry und Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS) angewandt werden, um die Effekte in verschiedene einzelne Zellpopulationen zu untersuchen, während transkriptomischen, Proteomik und Metabolomic Ansätze auch für ungezielte Analyse genutzt werden können.

Alles in allem bieten wir ein einfaches Protokoll um HFD-induzierte Mausmodell zu generieren, bei der weiteren Beschreibung zwei leistungsstarke Ansätze zur Untersuchung Ganzkörper-Stoffwechselveränderungen, die OGTT und der ITT, die nützliche Werkzeuge für das Studium der Pathogenese der Krankheit sein kann und Entwicklung neuer Therapien, vor allem im Bereich der Stoffwechsel-assoziierten Erkrankungen wie Insulinresistenz und Diabetes.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die Animal Care and Use Committee der medizinischen Universität Wien genehmigt und nach der Föderation der Europäischen Labor Tier Wissenschaft Verbände (FELASA) durchgeführt. Bitte beachten Sie, dass alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren nur durchgeführt werden, sollte nach institutionellen und staatlichen Genehmigung sowie von Mitarbeitern, die technisch kompetent sind.

(1) HFD gefütterten Mäusen

Hinweis: Pflegen Sie alle C57BL/6J Mäuse auf einem 12-h-hell/dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.

  1. 6 Wochen alt, Ort Mäuse für 8-12 Wochen auf eine HFD (40-60 % Fettkalorien) induzieren Adipositas, bei der Fütterung der schlanke Kontrollgruppe einer fettarme Ernährung (LFD) (10 % Fettkalorien).
  2. Das Körpergewicht der Mäuse auf einer wöchentlichen Basis zu bestimmen. Die Gewichtungskurven sollten ähnliche Muster in beiden Gruppen mit einer höheren Neigung in der HFD gefütterten Gruppe zeigen.

(2) OGTT

Hinweis: Wenn alle 15 min Zeit Probenahmestellen Blut während OGTT ausgewählt werden, sollte das Experiment mit einem Maximum von 15 Mäuse parallel durchgeführt werden um mindestens 1 min Bearbeitungszeit pro Maus haben.

  1. Vorbereitungen am Vortag OGTT
    1. Übertragen Sie die Mäuse in einen Käfig mit frischer Bettwäsche und schnell sie über Nacht vor der Prüfung (14 h), gleichzeitig sicherzustellen, dass die Mäuse Zugang zu sauberem Trinkwasser haben (z.B., entfernen Sie das Essen zu 18:00 für eine Startzeit am nächsten Morgen um 08:00).
      Hinweis: Fasten Mäuse über Nacht ist die Standardtherapie, aber eine kürzere schnelle (5-6 h) mehr physiologische für Mäuse (Einzelheiten siehe Diskussion ).
  2. Vorbereitungen am Tag des Experiments (aber vor dem Experiment)
    1. 10 mL 20 % Glukoselösung vorbereiten (auflösen D-(+)-Glukose in destilliertem Wasser).
      Hinweis: Alle Reagenzien, die den Tieren verabreicht werden müssen pharmakologische Klasse und steril.
    2. Plasmagewinnung, eine 96-Well-Platte vorbereiten, indem Sie einen Brunnen für jeden Zeitpunkt der Probenahme und jede Maus mit 5 µL NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 in 0,9 % NaCl, Lagerung bei RT). Während des Experiments speichern Sie diese Platte auf dem Eis.
      Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung 1 für eine detaillierte Checkliste.
  3. Messen Sie das Körpergewicht von allen Mäusen und markieren Sie ihren Schwänzen mit einem wasserfesten Filzstift, um die Mäuse leicht zu unterscheiden (z.B., Maus 1 = 1 Dash, Maus 2 = 2 Bindestriche usw.)zu machen.
  4. Glukose-Messung und Blutabnahme (Abbildung 2)
    1. Schneiden Sie vorsichtig 1-2 mm von der Schwanzspitze mit einer scharfen Schere ("Variante A" in Abbildung 2). Wischen Sie immer den ersten Blutstropfen, Hämolyse oder Kontamination mit Gewebeflüssigkeit vor New Blutentnahme für Blut-Glucose-Bestimmung zu vermeiden. Zeichnen Sie eine kleine Blutprobe (~ 3 µL) für die Messung der basale Blutzuckerspiegel (= Zeitpunkt 0) mit dem Blutzuckermessgerät.
      Achtung: Überprüfen Sie und einstellen Sie der Chargennummer der Teststreifen auf ein Blutzuckermessgerät.
      Hinweis: Als eine alternative Blut-Sampling-Methode, nick die seitlichen Schweif Ader einer Maus mit einem scharfen Skalpell-Klinge ("Variante B" in Abbildung 2). Die seitlichen Schweif Vene ist in der Regel etwa ein Drittel über die Länge der Rute aus der Schwanzspitze, bewegt in Richtung zur Unterseite der Rute für mehrere Proben zugegriffen. Ein Lokalanästhetikum Creme wird empfohlen. Blutfluss zu stoppen, durch Finger Druck auf das Weichgewebe mindestens 30 s bevor das Tier an seinem Käfig zurückgegeben wird.
    2. Sammeln Sie eine Blutprobe (rund 30 µL) mit einer frischen Kapillarrohr (halten die Kapillarrohr-horizontale). Leeren Sie das Kapillarrohr mit einer Pipette indem man die Pipettenspitze an der Spitze des Kapillarrohr Ende und drücken vorsichtig das gesammelte Blut in einen Brunnen von 96-Well-Platte unter Vermeidung von Luftblasen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse - einzeln nacheinander.
      Hinweis: Als Alternative zur Blutentnahme über ein Kapillarrohr verwenden eine Pipette angepasst, um das korrekte Volumen (z.B. 30 µL) Blut sammeln oder sammeln Sie einen Tropfen Blut aus dem Schweif auf Paraffin Film- und Pipettieren es in die EDTA-Lösung. Unbedingt vermeiden Sie den Kontakt mit Blut oder Blutzuckermessgerät Teststreifen, Vaseline, da sie Glukose und Insulin Messungen beeinflussen kann.
      Achtung: Der OGTT ist sehr belastend für Mäuse: schlanke Mäuse können rund 15 % des Körpergewichts bei nächtlichem Fasten verlieren. Darüber hinaus führt die Blutabnahme zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu einem erheblichen Verlust an Blut. Für leichter Blutabnahme ist es möglich, Mouse-tail mit Vaseline vorsichtig zu massieren.
      Hinweis: Institutionelle Richtlinien können die zulässige Menge an Blut gesammelt innerhalb einer gesetzten Frist beschränkt. Die Probenahme Mengen und Zeitpunkte sollte angepasst werden, um die zulässigen Höchstwerte nicht überschreiten. Das Körpergewicht der Mäuse sollte verwendet werden, um die Summe berechnen Blut Rückzug erlaubt.
  5. Berechnen Sie die erforderliche Menge Glukose-Lösung auf Basis von Körpergewicht (1 g Glukose/kg Körpergewicht, dies kann bis zu 3 g/kg erhöht werden) durch orale Magensonde für jede Maus verabreicht werden. Zum Beispiel müsste eine Maus mit einem Körpergewicht von 30 g 150 µL einer 20 %-Glukose-Lösung, 30 mg von Glukose zu verwalten.
    Hinweis: Um die Dosis von Glukose auf das Gewicht der Maus zu erkunden ist das Standardverfahren. Wenn Körper Zusammensetzung Daten vorhanden sind, die Dosis von Glukose OGTT berechnet werden soll basierend auf den mageren Körpermasse (Einzelheiten siehe Diskussion ).
  6. Glukose-Verwaltung
    1. Bereiten Everythingthat ist während des gesamten Experiments im Voraus erforderlich (Timer, Experiment Schaublatt, Glukose-Monitor und Streifen, Kapillaren, Spritzen, Glukoselösung, 96-Well-Platte, Skalpell, Taschenrechner, Gleichgewicht, Permanentmarker, Bank Papiere, ein Pipette mit einer Spitze und Handschuhe).
    2. Für Glukose Anwendung zurückhalten der Maus fest greifen sie durch das Genick. Tragen Sie genügend Festigkeit auf die Haut um den Hals zu verhindern, dass die Maus aus dem Restrain verdrehen und richtig seinen Kopf nach hinten neigen. Auch dafür sorgen Sie, dass die Maus richtig atmen kann.
      Hinweis: Sobald Glukose-Verwaltung gestartet wird, ist gutes Zeitmanagement sehr wichtig.
    3. Verwalten Sie sorgfältig die Glukoselösung (basierend auf Schritt 2.5) direkt in den Magen mit einer Fütterung Nadel. Richten Sie vorsichtig die Fütterung Nadel durch den Mund in Richtung Speiseröhre. Lassen Sie die Maus, um die Nadel zu schlucken: die Nadel ganz versinkt in der unteren Speiseröhre/Magen der Maus. Dann Spritzen Sie die Glukoselösung verdünnt werden (Abb. 3a).
      1. Wenn jeder Widerstand erfüllt ist oder wenn das Tier sofort kämpft, ziehen Sie die Nadel heraus und neu zu positionieren. Der Timer gestartet wird unmittelbar nach der ersten Magensonde und Glukose an alle anderen Mäuse in Intervallen von 1 min zu verabreichen.
        Hinweis: Es kann hilfreich sein, einen Tropfen der Glukoselösung direkt von der Fütterung Nadel bis zur Mündung der Maus, gelten die anregen wird, lecken und schlucken, und erleichtert so einfacher einfügen der Fütterung Nadel. Wenden Sie Druck nicht an, wenn die Fütterung Nadel einsetzen, da dies das Tier ernsthaft verletzen kann.
  7. Messen Sie nach 15 min des Blutzuckerspiegels mit dem Blutzuckermessgerät und zusätzlich nehmen Sie Blutproben (~ 30 µL) (als detailliert beschrieben im Schritt 2.4) jede Maus in der gleichen Reihenfolge, wie sie injiziert wurden.
    Hinweis: Das Zeitmanagement ist sehr wichtig; so eng wie möglich mit der gleichen Zeiträume für die Magensonde zu folgen. Lassen Sie die Mäuse bewegen sich so frei wie möglich und Grenze einstweilige Verfügung auf ein Minimum, während des gesamten Verfahrens zur Verringerung der Belastung, die die Ergebnisse verändern kann. Melken Sie Rute mit einer Hand und sammeln Sie das Blut mit dem anderen.
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.7 zu ausgewählten Zeitpunkten abhängig von den erwarteten Ergebnissen (z. B.bei 30, 45, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach Gabe von Glukose). Wenn die ausgewählte Zeitpunkte länger als 120 min. sind, sicherzustellen Sie, dass die Mäuse Zugang zu sauberem Trinkwasser haben. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse immer Zugang zu sauberem Trinkwasser haben. Nach Abschluss des Experiments die Mäuse zurück in ihre Heimat Käfige mit Nahrung und Wasser ausgestattet.
    Achtung: Der OGTT ist sehr anstrengend für die Mäuse. Deshalb warten Sie mindestens 1 Woche vor Durchführung des nächsten metabolischen Tests, wie ein ITT.
  9. Zentrifugieren Sie nach dem Experiment Blutproben bei 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Übertragen Sie den überstand (Plasma) leeren Brunnen der Platte und speichern es bei-20 ° C bis zur Analyse.
    1. Hämolyse der Proben aufnehmen, falls vorhanden (siehe Abschnitt 3).
  10. Insulin-Plasmaspiegel mit einem kommerziell erhältlichen ELISA kit (siehe die Tabelle der Materialien) zu bestimmen nach den Anweisungen des Herstellers des Kit.
    Hinweis: Je nach dem Fasten Zustand sowie auf den Stoffwechsel der untersuchten Mäuse, Schwierigkeiten während dieser Assay können auftreten: Übernachtung Fasten Insulin Ebenen (Zeitpunkt 0) sind sehr niedrig und somit nahe an der Nachweisgrenze liegt. Um dieses Problem zu vermeiden, verdoppelt die Menge der empfohlenen Plasmavolumen und dementsprechend das Ergebnis des ELISA-Tests zu halbieren. Auf der anderen Seite, wenn Mäuse Insulin während OGTT, vor allem bei HFD gefütterten Mäusen erreicht, darf der Insulinspiegel die Nachweisgrenze: die Probe verdünnen (z.B.10-divisibel mit 0,9 % NaCl) und den ELISA-Test zu wiederholen. Hämolyse in Plasma-Proben führen zu den Abbau von Insulin, was zu einem Rückgang der Ablesewerte. Die Degradation hängt von Zeit, Temperatur und der Hämoglobin-Konzentration in der Probe. Halten Sie immer lipämischen Proben, kalt oder auf Eis, Insulin Abbau zu reduzieren.

3. ITT

Hinweis: Die gleichen Vorsichtsmaßnahmen für OGTT (Umgang mit Mäusen, Blut, Glucometer und Vaseline verwenden) beschrieben haben auch anzuwenden, wenn die ITT durchführen. Beispielsweise sollten alle Injektionen innerhalb von 15 Minuten in 1 min Abständen erfolgen, wenn 15 Mäuse parallel getestet werden. Für das ITT ist nachfolgende Sammlung von Blutproben mit Kapillarröhrchen optional.

  1. Vorbereitungen vor dem experiment
    1. Schnelle Mäuse für mindestens 2 Stunden vor Insulininjektion, gleichzeitig sicherzustellen, dass die Mäuse Zugang zu sauberem Trinkwasser haben (z. B.entfernen Essen am 08:00, testen Sie Mäuse 2-5 h später).
    2. Verdünnen Sie Insulin 1:1,000 in 0,9 % NaCl (Lager: 100 U/mL Insulin; arbeiten Konzentration 0,1 U/mL) und 20 % Glukose vorbereiten (D-(+)-Glukoselösung gelöst in destilliertem Wasser) verabreicht werden, wenn die Mäuse blutzuckersenkende geworden.
      Hinweis: Die ITT erfolgt in der Regel nach einer kurzen schnell die Hypoglykämie zu vermeiden, die sonst über Nacht auftreten Tiere gefastet. Alle Reagenzien, die den Tieren verabreicht werden müssen pharmakologische Klasse sein und steril.
  2. Messen Sie das Körpergewicht von Mäusen zu, markieren Sie Heck schneiden Sie die Schwanzspitze mit einer scharfen Schere und Messen Sie basale Blutzuckerspiegel zu, wie zuvor für den OGTT in Schritt 2.4 beschrieben.
  3. Insulininjektion
    1. Intraperitoneal Insulin injizieren (0,75 U Insulin/kg Körpergewicht, vorher berechnet), zurückhalten die Maus durch das Genick-Verfahren.
    2. Verwenden Sie ein frisches, steriles 27 oder 30 gauge Nadel für jedes Tier zur Vermeidung von Beschwerden und das Risiko einer Infektion der Injektionsstelle.
      Hinweis: Sterilisierung der Haut verlängere die Dauer der Insulinverabreichung und kann dadurch zusätzliche Störungen des Tieres. Daher ist es nicht empfohlen.
    3. Neigen Sie den Kopf der Maus nach unten, in einem leichten Winkel, die ventrale Seite des Tieres verfügbar zu machen. Legen Sie die sterile Nadel mit Abschrägung oben und in einem Winkel von 30° im unteren rechten Quadranten des Abdomens des Tieres (Abb. 3 b). Der Timer gestartet wird unmittelbar nach die ersten Maus injiziert wird.
      Hinweis: Niedrig dosierte ITTs (0,1 U/kg) kann durchgeführt werden, um speziell hepatische Insulinsensitivität beurteilen. Für den OGTT Berechnung der Einspritzmenge anhand des Körpergewichts ist das Standardverfahren und stützen die Dosis auf fettfreien Masse wird bevorzugt, wenn Körper Zusammensetzung Daten vorliegen.
  4. Messen des Blutzuckerspiegels zu ausgewählten Zeitpunkten (z. B.nach 15, 30, 45, 60 und 90 min).
    Hinweis: Da Insulin eine kurze Halbwertszeit von ~ 10 min in Mäusen13 hat, späten Unterschiede nach Insulinverabreichung (z. B.nach 2 h) entsprechen möglicherweise keine direkte Auswirkung der Insulinwirkung. 20 % Glukoselösung zu verwalten, für den Fall, dass eine Maus blutzuckersenkende wird (den Blutglukosespiegel unter 35 mg/dL) und befindet sich in Gefahr zu sterben.
  5. Nachdem die letzte Zeit zeigt, legen Sie die Mäuse zurück in ihre Heimat Käfige mit reichlich Futter und Wasser zubereitet.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Zeittabelle für metabolische Phänotypisierung von Mäusen auf Diäten. Im Alter von ca. 6 Wochen sollten Mäuse auf eine HFD platziert werden, während eine LFD-Gruppe als die Kontrollgruppe dienen kann. Wichtig ist, sollte wöchentlich Körpergewicht ermittelt werden, zu beobachten, ob es eine erwartete Zunahme des Körpergewichts. Jede Art von Stress (z.B., Lärm oder aggressive männliche Verhalten) Körpergewichtszunahme stören kann und sollten sofort beseitigt werden. Jede Kohorte von Mäusen für Ernährung Experimente sollten mindestens 10 Mäuse bestehen, weil diese Diät-Experimente zeitaufwendig sind und Ausreißer sind häufige (z.B.Mäuse nicht gewinnt an Gewicht oder Mäuse mit abnormen Glucose oder Insulinspiegel). Nach den ausgewählten Zeitraum (je nach Studie Hypothese und der Zeitpunkt der zu erwartenden Veränderungen) kann OGTT und ITT für die Bewertung der Glukose-Toleranz und Insulin-Aktion durchgeführt werden. In diesem Papier wurden die späten Zeitpunkte für die metabolische Test ausgewählt.

Wichtig ist, sollte eine Erholungszeit von mindestens 1 Woche zwischen dem OGTT und ITT da diese Experimente zu erheblichen Blutverlust führen und sind somit sehr anstrengend für Mäuse. Wenn Blut Sammlung Volumen verringert (z. B., wenn zuerst ein ITT ohne zusätzliche Blutentnahme durchführen) sind, kann dieser Erholungsphase auch gekürzt oder weggelassen, im Einklang mit den Richtlinien für mehrere Blut zieht in Tiere14, 15,16,17.

In dieser großen Studie mit 60 C57BL/6J Mäusen insgesamt, waren die Hälfte der Mäuse setzen auf HFD oder LFD im Alter von 6 Wochen (n = 30/Gruppe) und Körpergewichtszunahme wurde für 16 Wochen auf Diät überwacht. Der Verbrauch von HFD führte zu einer deutlichen Steigerung des Körpergewichts wie in Abbildung 4dargestellt. Im Alter von 6 Wochen war das Körpergewicht 20,2 g in beiden Gruppen. Während Mäuse auf LFD eine einheitliche, leicht ansteigende Körpergewicht (31,2 g ± 2,7) im beobachteten Zeitraum zeigten Mäuse auf HFD ihres Körpergewichts schnell, vor allem in den ersten Wochen erhöht und erreicht ihren Körper Gewicht maximal nach 16 Wochen auf die Ernährung. Obwohl die Gewichtungskurven ein ähnliches Muster während des Experiments zeigte, die Mäuse der HFD-Gruppe erreicht einen 1,5 - 2-fach höheren Körpergewicht (44,4 g ± 4,0) gegenüber LFD gefütterten Mäuse.

Um die metabolische Phänotyp der beiden Kohorten zu untersuchen, wurden ein OGTT (Abbildung 5) und ITT (Abbildung 6) durchgeführt. Wie kleine Nagetiere Blutvolumen begrenzt ist, wurde ein Point-of-Care (POC) Assay für den diabetischen Menschen (Blutzuckermessgerät) verwendet, um den Blutzuckerspiegel während dieser metabolische Phänotypisierung Experimente zu überwachen. Wie in Abbildung 2gezeigt, die Blut-Glukose-Monitore sind einfach zu bedienen, brauchen nur ein kleiner Tropfen Blut, und zeigt den Blutzuckerspiegel innerhalb von Sekunden für die Dokumentation. Abbildung 5 zeigt den zeitlichen Verlauf des absoluten Glukose (Abbildung 5ab) und absoluter Insulin (Abbildung 5 c) Ebenen während der OGTT. In der Regel ihren Höhepunkt erreichte eine gesunde Maus mit normaler Glukosetoleranz zeigt einen charakteristischen schnellen Anstieg in Blut Glukose, 15-30 min nach der Glukose-Herausforderung.

Nachfolgende Glukoseaufnahme, vor allem unter der Leitung von Muskel, Fett-Gewebe und Leber-Gewebe führt zu einem allmählichen Rückgang der Konzentration der Glukose im Blut. In allen versuchen, die LFD gefütterten Mäusen diente als der Glukose tolerant Kontrollgruppe und somit erfüllt die erwartete metabolischen Profils: der Höhepunkt des Blutzuckerspiegels von ~ 240 mg/dL wurde erreicht ca. 15 min nach der Verabreichung von Glukose, sofort gefolgt von einer Abnahme basalen Ebenen ca. 60 min nach der Glukose-Herausforderung, unter Angabe der korrekten Glukose Beseitigung zu erreichen. In scharfem Kontrast HFD-Mäusen erreichte etwa ~ 320 mg/dL Glukose und zeigten fast keine Entsorgung von Glucose, Glukose Widerstand angibt. Wenn Blutzuckerwerte zwischen beiden Gruppen bereits in den Fasten Zustand (wie in diesem repräsentativen Beispiel) unterscheiden, sollte eine Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC) oberhalb der Grundlinie Glukose durchgeführt werden, um überprüfen Sie die Ergebnisse (Abb. 5a ( b).

Ferner wurden der zirkulierenden Blut Insulinspiegel ermittelt mit Hilfe eines Insulin-ELISA-Tests (Abbildung 5 c) um weitere Informationen über die zugrunde liegende Pathophysiologie in diesem Modell bieten. Während der Insulinspiegel nahezu unverändert in der Kontrollgruppe waren, zeigten Mäuse einzogen eine HFD 16-fach erhöhte Ebenen im Vergleich zu der Kontrollgruppe sowie eine stark erhöhte Insulinantwort, HFD-induzierte kompensatorische Hyperinsulinämie als Fasten ein Versuch, verminderte Glucose Beseitigung Kapazität auszugleichen, die durch Insulinresistenz verursacht werden können. Beachten Sie jedoch, nicht auf die Ergebnisse der OGTT über zu interpretieren, wie dieser Test nicht direkt Insulinwirkung wertet und nicht verwendet werden, sollte um Aussagen über die Insulin-Resistenz zu schließen.

Zur Messung der Insulin-Empfindlichkeit bei den HFD gefütterten Mäusen wurde ein ITT 1 Woche nach OGTT (Abb. 6a) durchgeführt. In diesem Test der Grad, die das Blut Glukose Konzentrationen fallen nach der Insulinverabreichung repräsentieren die Effizienz der Ganzkörper-Insulinwirkung. Die HFD gefütterten Mäuse zeigten eine beeinträchtigt Senkung des Blutzuckerspiegels im Vergleich zu den LFD gefütterten Kontrollgruppe zu allen Zeitpunkten während der ITT Insulinresistenz hindeutet. Die ITT-Ergebnisse werden in der Regel als den zeitlichen Verlauf des Blutzuckerspiegels, sondern zusätzlich auch die Inverse AUC unter Baseline Glukose kann gezeigt werden, wie in Abbildung 6veranschaulicht dargestellt. Wenn die Gruppen die verglichen werden, haben ähnliche Fasten Blutzuckerspiegel (was nicht der Fall in diesem Experiment ist), können der Blutzuckerspiegel bei ITT auch als Prozentsatz der basalen Glukose vorgelegt werden. Wie Mäuse, eine counter-regulatory Reaktion auf Insulin wird aktiviert, wenn der Blutzuckerspiegel unter ~ 80 mg/dL18fallen: Mängel in dieser counter-regulatory Antwort in einem speziellen Mausmodell können als Erhöhung in Insulin-Empfindlichkeit fehlinterpretiert werden. Während HFDs und anschließende metabolischen phänotypischer Experimente können Ausreißer häufig auftreten. Mäuse, die nicht gewinnen Gewicht auf HFD oder zeigen abnorme Nüchtern-Glukose und/oder Insulinspiegel sollte aus der Analyse ausgeschlossen werden. Für die beiden letztgenannten ein Ausreißer-Test kann separat für jede Versuchsgruppe durchgeführt werden (z.B., Grubbs-test)

In dieser Studie als Beispiel wir zeigte Daten der metabolischen Experimente in Vivointerpretiert, mit Diät-induzierten Adipositas, Glukoseintoleranz und Insulinresistenz an Mäusen durchgeführt und im Vergleich zu einer Kontrollgruppe mit normalem Körpergewicht. Wie erwartet, gab es beeinträchtigte Glukosetoleranz und Hyperinsulinämie bei fettleibigen Mäusen mit Insulin-Resistenz gegenüber dem Alter abgestimmt Kontrollmäusen; Dies wurde entdeckt, mit etablierten, zuverlässig, Zeit und Budget-freundliche Methoden, die relativ einfach durchzuführen sind. Unterschiede in der Glukosetoleranz, Insulinspiegel ebenso wie Insulin-Empfindlichkeit, die alle durch die vorgestellten Methoden der OGTT und ITT gewonnen werden, können oft helfen, die nächsten Schritte einer Studie zu planen, die komplexere Experimente wie enthalten können Hyperglykämie oder Hyperinsulinemic Klemmen sowie Experimente mit isolierten pankreatischen kleinen Inseln.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Fahrplan für eine empfohlene Diät-Regime und metabolische Experimente in Vivo. Um die metabolischen Effekte von HFD bei Mäusen zu untersuchen, die Tiere der Versuchsgruppe liegen auf HFD ca. 6 Wochen alt, während die Kontrollgruppe ein LFD erhält. Das Körpergewicht der Mäuse sollte auf einer wöchentlichen Basis bestimmt werden, richtige Gewichtszunahme zu beurteilen. Nach ca. 12 Wochen auf Diät (oder einen ausgewählten Zeitpunkt abhängig von der Forschung-Hypothese) wird der metabolische Phänotyp der Mäuse durch einen OGTT, gefolgt von 1 Woche nach der Recovery-Zeit und in der Folge eine ITT ausgewertet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Methoden zur Blutabnahme bei metabolischen Experimenten. Für den OGTT sowie für die ITT, denen wiederholte Blutentnahmen erforderlich ist, empfehlen wir, Blutentnahme über sorgfältig schneiden ein 1-2 mm Stück die Schwanzspitze mit einer scharfen Schere (Variante A), gefolgt von der Bestimmung des Blutzuckerspiegels mit einem Blutzuckermessgerät und weitere Sammlung von Blut mit einer Kapillare, Insulinspiegel und anderen relevanten Blutwerte zu bestimmen. Blut kann alternativ auch über die Rute Vene (Variante B) oder durch arterielle Katheterisierung (nicht dargestellt) entnommen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Orale Magensonde von Glukose (a) und intraperitoneale Insulin Injektion (b). Repräsentative Bilder der orale Glukose-Administration mit einer Fütterung Nadel während OGTT (ein) und die intraperitoneale Injektion von Insulin bei ITT (b). Protokoll für eine detaillierte Beschreibung zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Körper Gewichtszunahme von HFD gefüttert und LFD gefüttert C57BL/6J Mäuse. C57BL/6J Mäuse wurden beide Sätze auf 60 % HFD oder 10 % LFD, für einen Zeitraum von 20 Wochen als Kontrolle dienen. Während Mäuse auf HFD eine zu erwartende Zunahme des Körpergewichts, vor allem in den ersten Wochen auf Diät zeigte, LFD gefütterten Mäusen zeigte nahezu konstanten Körpergewicht während der beobachteten Periode. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM. *p < 0,05 ** p < 0,01, *** p < 0,001. n = 30 pro Gruppe. ANOVA und Tukey post Hoc Test wurden verwendet, um Unterschiede zu testen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. OGTT durchgeführt bei HFD gefüttert und LFD gefüttert C57BL/6J Tieren. (ein) Glukose Niveaus während OGTT. Nach nächtlichem Fasten wurden Blutzuckerspiegel (mg/dL) im Fasten Stand und 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Verabreichung von Glukoselösung oral über Magensonde (1 g Glukose/kg) gemessen. Blutzuckerspiegel in der HFD-Gruppe waren in den Fasten Zustand sowie nach Glukose Herausforderung erhöht. Die Zunahme erreichte ihren Höhepunkt, nach 15 min durch eine verzögerte und langsam zu verringern. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. n = 30 pro Gruppe. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test. (b) Glucose Fläche unter der Kurve (AUC) während OGTT. Zur Berechnung die Grundlinie korrigiert AUC Ebenen basalen Glukose (Zeitpunkt 0) wurden alle später den Blutzuckerspiegel für jede Maus einzeln gewonnen, gefolgt von der Berechnung der individuellen AUCs abgezogen. Die AUC oberhalb der Grundlinie Glukose veranschaulicht den Glukose-Widerstand bei den HFD gefütterten Mäusen. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test (Blutzuckerspiegel) oder Schülers zwei tailed t-Test (AUC). (c) Insulinspiegel während OGTT. Insulinspiegel (ng/mL) wurden nach einer Fastenzeit von 4 h und 15, 30 und 60 Minuten nach der Verabreichung von Glukoselösung oral über Magensonde (1 g Glukose/kg) gemessen. HFD gefütterten Mäusen nicht nur kompensiert die Glukose-Injektion mit einem höheren Anstieg der Insulin-Blutspiegel, sie auch begann und endete der OGTT mit erhöhten Insulinspiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. n = 30 pro Gruppe. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. ITTs in HFD gefüttert und LFD gefüttert C57BL/6J Tiere durchgeführt. (ein) Glukose Niveaus während ITT. Der Blutzuckerspiegel (mg/dL) wurden in Fasten Stand und 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Injektion von Insulin gemessen intraperitoneal (0,75 U Insulin/kg). Während ITT HFD gefütterten Mäusen zeigten erhöhte Blutzuckerspiegel. Der Blutzuckerwerte wurden nicht ausreichend bei den HFD gefütterten Mäusen nach Insulininjektion gesenkt. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. n = 30 pro Gruppe. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test. (b) Glucose Fläche unter der Kurve (AUC) bei ITT. Um die Basislinie korrigierte Inverse AUC zu berechnen, basalen Glukose Niveaus (Zeitpunkt 0) wurden alle später ermittelten Blutzuckerwerte für jede Maus einzeln abgezogen. Die Werte waren invertiert (Multiplikation mit -1), gefolgt von der Berechnung der individuellen AUCs. Als Folge der höheren Glukose im HFD gefütterten Mäusen während OGTT korrigiert die Grundlinie Inverse, die AUC lag bei den HFD gefütterten Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, die verminderte Insulinempfindlichkeit weiter vorgeschlagen. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test (Blutzuckerspiegel) oder Schülers zwei tailed t-Test (Inverse AUC). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 1. Checkliste für die Vorbereitung der Experiment. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Abbildung 2. Insulinspiegel während ITTs. Plasma-Insulin Niveaus während der ITT in der gefütterten LFD gegenüber der HFD gefütterten Gruppen zeigten ähnliche Dynamik in der Plasma-Insulinspiegel nach Insulininjektion in beiden Gruppen. Wie erwartet, stellte die HFD-Mäuse stark erhöhten basalen Insulinspiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe. Darüber hinaus war die Zunahme der Insulinspiegel bei den HFD gefütterten Mäusen stärker, kann teilweise verursacht werden durch die Überschätzung der fettfreien Körpermasse wenn die Menge des injizierten Insulins ist die Ganzkörper-Masse (konventionelle Normalisierung Ansatz) berechnet als in diesem Experiment durchgeführt. Aber die Insulin-Reaktion wurde in der Gruppe HFD gefüttert (unzureichende Reduktion der Plasma-Glukose-Spiegel) beeinträchtigt, damit weitere Betonung des Insulin resistenten Staates in diesen Tieren. Ergebnisse sind Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. Statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA und Tukey post Hoc Test. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Mit der hohen Prävalenz von Diabetes und Folgeerkrankungen der Weltbevölkerung ist eine starke Voraussetzung für Forschung Adressierung der molekulare Mechanismus, Prävention und Behandlung von Krankheiten19. Die vorgestellte Protokoll beschreibt bewährte Methoden für die Erzeugung von HFD Mäuse, ein robustes Tiermodell zur metabolischen Forschung sowie die Durchführung des OGTT und ITT, die mächtige Werkzeuge für die Bewertung der Ganzkörper-Stoffwechselveränderungen sind wie Insulin-Resistenz. In diesem Whitepaper vorgestellten Methoden nützlich zur Untersuchung der Rolle von vermuteten Gene sowie Umweltfaktoren und pharmakologische, Ernährung, körperliche oder genetische Therapien am ganzen Körper Glukose-Stoffwechsel9,10. Während Glukose als die wichtigsten Impulse für die Insulin-Sekretion in einen OGTT dient, die vorgestellte Protokoll veränderbar von (mit-) Anwendung von anderen Substanzen wie andere Makronährstoffe und Hormone, die bekannt sind, um die Insulin-Reaktion-2modifizieren. Ebenso kann die Abgastemperatur Protokoll durch die (mit-) Anwendung von anderen Substanzen (z.B., Glukagon oder Katecholamine) entsprechend der individuellen Fragestellung geändert werden. Die wichtigsten Anzeigen der beschriebenen OGTT und ITT Protokolle sind Blut-Glukose und Insulin-Konzentrationen; die Messung der andere Blutparameter wie Glukagon, Fettsäure und Lipoprotein Ebenen sowie der verschiedenen Stoffwechselmarker auf der mRNA und Protein-Ebene kann jedoch je nach Ziel der Studie auch nützlich.

Die Ermittler sollten beachten, dass die neuroendokrinen Reaktionen auf Hypoglykämie, Insulin-Sekretion, Insulinwirkung, sowie den gesamten Stoffwechsel Phänotyp stark von den genetischen Hintergrund der Mäuse10abhängen. Hier genutzt wir Mäuse innerhalb der C57BL/6J genetische Hintergrund als HFD-induzierte Modell von Diabetes, die eine partielle Beeinträchtigung in Glukose-vermittelten Insulinsekretion durch ein natürlich vorkommendes löschen in das Nicotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase-gen haben 20, so dass sie ein geeignetes Modell für das Studium der Fettleibigkeit verbundenen Insulin Widerstand8,9. Die Protokolle hier beschriebenen Mai aber auch genutzt werden, um metabolisch charakterisieren alternative Maus-Modellen von Insulinresistenz und Diabetes, die in der Regel auf monogenen Erkrankungen oder die chemische Zerstörung der β-Zellen21, basieren 22 , 23. Vorsichtsmaßnahmen während experimentelles Design gehören Prüfungen Alter abgestimmt Mäuse, während Insulin Empfindlichkeit sinkt mit Alter24und weiter nach Durchführung der Experimente an Mäusen von gleichgeschlechtlichen. Da genetische Mutationen und Behandlungen in verschiedenen Phänotypen je nach Geschlecht25,26führen können, kann es auch ratsam, beide Geschlechter getrennt voneinander zu untersuchen sein.

Die Blut-Sampling-Methode beschrieben, die in diesem Protokoll erfordert keine Anästhesie, die Herzfrequenz, Blutfluss und Metabolismus von Glukose, nachgeben nicht physiologischen Ergebnisse10beeinflussen kann. Alternativ kann ein arterieller Katheter implantiert werden, die ermöglicht, vaskuläre Probenahme ohne Umgang mit Stress während des Experiments, sondern fügt auch Aufwand, Kosten, sowie das Verlustrisiko Tier zum Experiment. Der OGTT Mäuse sind in der Regel fastete über Nacht (14-18 h), die einen katabolen Zustand bei Mäusen, stark abbauenden Leber Glykogenspeicher provoziert. Obwohl dadurch die Variabilität der Basislinie des Blutzuckerspiegels längeren Fastens verringert sich die metabolische Rate und verbessert die Glucoseverwertung in den Mäusen, die im Gegensatz zu Menschen10,27. Da die Ernährungsgewohnheiten bei Mäusen auch nicht menschliche Verhalten nachahmen, kann es somit mehr physiologische einen OGTT nach einem kurzen schnellen ausführen sein. Wie Biorhythmen eine starke Wirkung auf systemische Glukose-Stoffwechsel-28haben, ist es wichtig zu überlegen, zu welcher Tageszeit die hier beschriebenen Experimente durchgeführt werden. Um den Stoffwechsel von Mäusen in ihrer aktiven Zeit (Dunkelphase) zu untersuchen, möglicherweise ein umgekehrter hell-dunkel-Zyklus wertvolle weitere physiologische Ergebnisse zu generieren.

Die beschriebene Art der Verabreichung kann auch je nach der spezifischen Hypothese getestet variiert werden. Oraler Verabreichung von Glukose während einer Glucose-Toleranz-Test führt zu mehr Variable Insulinsekretion wie Magenentleerung, Magen-Darm-Motilität, Hormone (Inkretine) und neuronale Eingabe ändern und verlängern die Insulin-Reaktion-2, 10. während der gut beschriebenen "Incretin-Effekt", die Aufnahme von Glucose aus dem Darm führt zur Freisetzung von gastrointestinale Hormone wie GLP1, die orale Glukose geliefert Insulin Release29potenziert. Um diese Effekte zu umgehen, kann ein Glukose-Bolus auch intravenös verabreicht werden (IVGTT) oder intraperitoneal (IPGTT). Glukose und Insulin Ausflüge unterscheiden sich deutlich je nach der gewählten Tour. Im Vergleich zu den OGTT, führt intraperitoneale Gabe von Glukose zu einer erhöhten und verlängerten Gipfel im Plasma-Glukose-Spiegel, während Insulin-Plasmaspiegel in eine verzögerte, aber mehr nachhaltig30steigen. Ebenso zeichnet sich intravenös Glukose Verwaltung durch eine verzögerte Insulin-Antwort-31. Den deutlichen Anstieg der Insulinspiegel sowie robuster AUC Insulin während der OGTT Daten lassen vermuten, dass mündliche Lieferung von Glukose empfindlicher auf Veränderungen im Metabolismus von Glukose in erkennen kann Chow-fed versus HFD gefütterten Mäusen30, 31. eines- und intraperitoneale Lieferung sind ähnlich in Bezug auf den Schweregrad für die tierische und technische Schwierigkeit, während die intravenöse Gabe ist in der Regel schwieriger als auch mehr Stress für die Mäuse-32. Oraler Verabreichung weiter eliminiert die 10-20 % bei Fehler während intraperitoneale Injektionen in das Darmlumen oder am Bauch, der die Rate der Glukose Lieferung und Umverteilung33,34auswirken können.

Obwohl es die meisten physiologischen Strecke der Glukose-Lieferung ist, ist der OGTT bei der Bilanzierung nur Glucose-Absorption, begrenzt, während eine volle Mahlzeit auch Proteine, komplexe Kohlenhydrate, Fette, Fasern und Mikronährstoffen enthält. Der Standardansatz während OGTT ist, die Glukose-Dosis auf das Körpergewicht der Maus, zwar in der Regel 1-3 g Glukose/kg Körpergewicht verabreicht35,36. In bestimmten Fällen kann eine höhere Glukose Belastung als 1 g/kg erforderlich sein, um eine wertgemindert Glukose-Toleranz-30zu offenbaren. Viele Mausmodelle von Fettleibigkeit und Diabetes zeichnen sich durch Veränderungen in der Körperzusammensetzung, vor allem eine massive Zunahme der Fettmasse, während die fettfreie Körpermasse (Muskeln, Gehirn und Leber), die die Haupt-Website der Glukose-Entsorgung ist nicht proportional ändert. Die herkömmliche Normalisierung Annäherung an Körpergewicht wird somit eine überproportional höhere Dosis von Glukose, denen die magere Gewebe in einer fettleibigen Maus ausgesetzt ist, im Vergleich zu der nicht adipösen Maus. Diese Tendenz steigt mit einem höheren Glukose Dosis30. Daher sollten optimal die Dosis von Glukose (OGTT) sowie Insulin (ITT) basierend auf der fettfreien Körpermasse berechnet werden wenn Körper Zusammensetzung Daten verfügbar37sind. Wenn die Beurteilung der Körperzusammensetzung nicht aufgrund technischer Einschränkungen möglich ist, sollte die Dosierung durchgeführt werden, je nach Körpergewicht (ergänzende Abbildung2), während Anwendung einer festen Dosis, wie z. B. in einem menschlichen OGTT der letzte Ausweg wenn sein sollte Durchführung dieser Tests bei Mäusen10,35,36. Im vorliegenden Protokoll diente ein Handheld Vollblut Monitor zur Messung des Blutzuckerspiegels, was vorteilhaft in Tests wie OGTT und ITT, die mehrere Probenahme von kleinen Blut Volumen erforderlich ist. Allerdings sind diese Geräte für menschliches Blut, mit einer geringeren Dynamikumfang konzipiert. Alternativ die Glukose Niveaus in den gesammelten Plasmaproben, z. B.durch voll gemessen werden automatisiert Chemie Analysatoren im Routine-Labor. Neben Insulin kann C-Peptid in den beschriebenen Protokollen als ein direkter Indikator für die sekretorischen Funktion der β-Zellen gemessen werden die nicht durch die Leber im Gegensatz zu Insulin38,39extrahiert wird. Wenn Glukoneogenese werden beurteilt muss, kann die Pyruvat-Toleranz-Test (PTT) angewendet werden, das ist eine andere Variante der hier beschriebenen Protokolle, Überwachung glykämischen Exkursionen nach der Verabreichung eines Pyruvat Bolus40.

Die hier beschriebenen Ansätze der OGTT und ITT kann oft beobachteten Unterschiede in Glukose-Toleranz zu erklären und kann weiter dazu dienen, deuten darauf hin, welche weitere, komplexere Experimente weiter durchgeführt werden soll (z.B., hyperglykämischen Klammern oder Studien auf isolierte Inseln). Zusammenfassend lässt sich sagen wir präsentieren ein einfaches Protokoll für die Erzeugung von einem HFD-induzierte Mausmodell und weiteren Beschreibung der OGTT und ITT, die leistungsfähige Werkzeuge zu Veränderungen des Stoffwechsels Phänotyp in Vivo zu beurteilen und kann nützlich sein, um zu studieren Stoffwechsel-assoziierten Krankheitsmechanismen sowie neue therapeutische Ansätze.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der medizinischen wissenschaftlichen Fonds des Bürgermeisters der Stadt Wien und der Österreichische Gesellschaft Für Laboratoriumsmedizin Und Klinische Chemie unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

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