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経皮的造影エコー ガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信

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Summary

心臓再生医療の新規治療戦略人間の使用を考慮することができます彼ら前に大規模な前臨床動物モデルで広範かつ詳細な研究が必要です。ここでは、このような新規薬剤の有効性の仮説のために貴重であるウサギでは、経皮的コントラスト心エコー法誘導心筋注入法を示す.

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Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

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Abstract

細胞、遺伝子療法はエキサイティングな設定での心不全の心筋再生の目的のための有望な作戦削減駆出分画 (原因の寄与について)。前に彼らの使用のために考慮し、人間に実装できます、広範な臨床研究は大規模な動物モデルで安全性、有効性、および心筋に一度配信 (例えば、幹細胞) の注入液の運命評価する必要があります。小型の齧歯動物モデル利点 (例えば、費用対効果、こうして遺伝的操作のため);但し、これらのモデルの制約を考えると、これらの調査結果はほとんどクリニックに翻訳の。逆に、ウサギなど大動物モデル (例えば人間や他の大型動物と比較して同じような心臓電気生理学) の利点がある費用対効果のバランスを維持しながら。ここでは、低侵襲、安全、忍容性および細胞を含む injectates のターゲットを絞った配信で非常に効果的である経皮的コントラスト心エコー法誘導心筋注入 (IMI) テクニックを実行する方法を示します家兎モデルの心筋内いくつかの場所。この手法の実装、私たちはまた広く利用可能な臨床心エコー検査システムの利用をしています。ここで説明したプロトコルを練習に入れ後、基本的な超音波の知識を持つ研究員にこの汎用性と低侵襲技術実験、仮説をテストの目的で日常的に使用のパフォーマンスで有能なる、家兎モデルにおける心筋再生治療の能力。一度能力を達成すると、全体の手順はあるウサギの後 25 分以内で実行できます。

Introduction

細胞、遺伝子療法はエキサイティングな今まで原因の寄与についてで負傷した心筋を再生する/修復するための戦略の開発。いくつかの研究は、IMI の冠動脈内注入または静脈内のルート1,2以上の優位性を実証している一貫して携帯配信の路線の有効性 (例えば、細胞保持率) を比較しています。,3,4,5しますしたがって、IMI、開胸手順6,7 で直視下実行を介して注入液を負傷した心筋幹細胞療法の並進モデルに関する研究の大部分に提供意外じゃない。.ただし、このアプローチは、ペリ手続き死亡 (多くの場合報告されたの下)8リスクを運ぶプロシージャの侵襲的な性質など、いくつかの制限をあります。さらに、直視下 IMI は不注意な心室キャビティ注入の可能性をしないわけです。臨床実習では開胸手術中に IMI が治療携帯配信などの適切な方法である、中に冠動脈バイパス術 (CABG);ただし、このアプローチ適さない場合があります携帯配信の非虚血性起源 (例えば、アントラサイクリン系誘発性心筋 (AICM) への二次原因の寄与について) のグローバルの心筋症。

その虚血性心疾患 (IHD) は原因の寄与についての最も一般的な原因は間違いない (〜 66%)9,10; ただし、AICM を含む、非虚血性心筋症も原因の寄与について (33%)9患者のかなりの割合に影響.確かに、臨床腫瘍学の最近の進歩をもたらしました11米国単独で、癌の生存者以上 1000 万12 のがん患者の生存率の改善傾向が全体で一貫性のあるヨーロッパで同様の数の見積もり ,13。したがって、新規治療法の利点を探検するなど幹細胞移植幹細胞配信の効果と低侵襲ルートの試用と同様、非虚血性心筋症が最も重要なは、患者数の増加を与えられる心毒性の抗がん剤に二次的影響を受けます。

注記のうち、よく負傷した心筋を修復/再生を目指して幹細胞療法を用いた研究の仮説は小さい齧歯動物 (例えば、マウスおよびラット) の使用を含みます。これらのモデルは、通常いくつかの固有の関連付けられている制限 (例えば残響)14のある線形アレイ探触子が装備されて、心機能の評価のため高価な高周波超音波診断装置を多くの場合必要。しかし、大規模な臨床モデルを表す、ウサギなどの他のモデルは原因の寄与についての幹細胞療法の仮説をテストするためのいくつかの利点にあります。したがって、ラット、マウスと対照をなしてウサギを維持 Ca+2輸送システムと似ている人間や他の大型動物 (例えば犬、豚)15,16,17 細胞の電気生理 ,18,19。もう一つの利点は、こうして心臓超音波イメージング比較的安価な使用およびなど比較的高周波位相アレイ探触子、例えば、12 MHz を搭載した広く利用可能な臨床心エコー検査システムこれらの新生児・小児循環器でよく使用されます。これらのシステムは、最先端の技術と優秀な心エコー画像をできるし、ハーモニック イメージング20の優位性を活用します。さらに、広範な仮説検定の心臓再生治療 (例えば、幹細胞療法) の可能性、安全性、有効性、cardiomyogenic 可能性と同様、一度、注入液の運命の評価に配信される、人間が使うのためにみなされ、彼らはウサギ17,19などの大規模な前臨床動物モデルの使用を必要とする前に、心筋は必須です。ここでは、非虚血性心筋症20 の幹細胞移植による治療を目指した臨床心エコー システムを用いた経皮的コントラスト エコー法ガイド IMI による携帯配信の低侵襲手法について述べる.家兎心臓に注入液の超音波コントラスト エージェントとその場でトレーサーとしてインドのインク (InI、中国インクとも呼ばれます) の利点を述べる。

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Protocol

記載実験はスペイン、ムルシア大学研究倫理委員会で承認され、ディレクティブ 2010年/63/EU 欧州委員会に従って行われました。仕事の計画の一部であったし、この用紙に添付のビデオを撮影目的が行われなかった標準動作のプロトコルの下で説明されている手順を行った。

1. 細胞と哺乳類発現ベクターの作製

注: ここでは、簡潔に述べる準備 (人間萌芽期の腎臓 293 (HEK 293)); セルラインの transfection のためのプロトコルただし、興味のセルのタイプに適切なセル特定のプロトコルが最適化された (例えば、幹細胞) にする必要があります。

  1. HEK 293 細胞高グルコース ダルベッコのイーグル培地 (DMEM) 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM グルタミン, ピルビン酸ナトリウム 1% 10% ウシ胎仔血清 (FCS) を添加した、加湿雰囲気 5% を含む 37 ° C で培養した、変更された維持 CO2.一度細胞が 1:3 の割合で分割サブ合流です。
  2. メディアを吸引して、細胞を分解し、洗浄一度滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を起動し、過剰な PBS を削除 2.5 ml のトリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (5 分、37 ° C) × 0.5、孵化させなさい。
    1. (上記のように補足) DMEM メディアの 1 つのボリュームを追加、反応を停止し、ゆっくりと優しく吸引電子ピペットと上下でセルをデタッチします。
  3. その後、細胞懸濁液を (例えば、15 50 mL 円錐形遠心分離機管) の適切なコンテナーに転送します。スイング バケツ (100 x g) 遠心分離機、上澄みを廃棄し、滅菌 PBS で 2 回餌を洗浄します。
  4. 培養フラスコまたはローカル研究所プラクティスに従って大きい料理で新鮮な DMEM メディアと (例えば、75 cm2フラスコで 1 x 10 の6セル) 適切な細胞密度で種子にペレットを再懸濁します。
    1. 2 日おき新鮮なメディアと既存メディアを交換します。
      注: 発現ベクターは pIRES1hyg から派生し、製造元の指示に従って前述21として使用します。p(EGFP) IRES1hyg は、東北大学から消化 pIRES1hyg21+ 病原 + ノッティ、病原 pEGFP N1 から挿入、EGFP cDNA を subcloning によって生成されました。
  5. 0.5 × 12 または 24 ウェル培養プレートの 10 の5セル/cm2の密度でシード HEK 293 細胞のトランスフェクション効率を促進する前に 1 日。
  6. トランスフェクションの日別 1.5 mL 遠心チューブ (1 管/ウェル) に DNA 脂質トランスフェクション試薬複合体を準備します。
    1. 各チューブに減らされた血清中の 250 μ L を追加することによって開始し、4 μ g の DNA を追加 (穏やかの組合せ)。
    2. その後、各チューブに 10 μ L 脂質トランスフェクション試薬の事前に準備されたミックスと減少血清中の 250 μ L から 250 μ L を追加 (ミックス再びそっと)。
    3. 最後に、DNA 脂質トランスフェクション試薬複合体 4 h の HEK 293 細胞を培養して、transfections を続行 DMEM 培 (手順 1.1)、上記のように置き換えて、インキュベートする別 48 h. 安定の行う医薬品の選択100 μ g/mL hygromycin b. と形質転換細胞
  7. トリプシン (ステップ 1.2) 上記 HEK 293 細胞をデタッチします。滅菌 PBS のセルを洗浄した後は、最後のセルが 5 x 106/mL 濃度を達成するために (例えば10 %v/v PBS で InI)、適切な手段で再懸濁します。

2. うさぎの準備

注: IMI のウサギとトランスデューサーの位置決めが動物の心臓の形態と機能の評価に最適ではないです。したがって、実験的なデザインで定義された IMI (下記参照) 前とその後の時点での完全な心エコー検査20を実行することをお勧めします。これは、解剖学的および機能のベースラインの特性動物の心、注射を受けるし、また心の機能で IMI の効果を評価を評価を目指します。

  1. 心血管イメージングの盲と家畜内科学心エコー/欧州協会のアメリカの社会のアメリカの大学の心エコー委員会のガイドラインにこの検査を実行します。22,23,24
  2. 全く心エコーの研究を通して同時 1 誘導心電図 (ECG) のトレースを取得します。
  3. 麻酔のケタミンを用いたウサギ 10 mg/kg、メデトミジン 200 μ g/kg、筋肉 (イオ ミン) 注射と組み合わせます。
  4. 麻酔の投与 10-20 分後に麻酔のレベルを確認します。
  5. 胸の毛を広く削除髪クリッパーを使用して (例えば、サブ剣の領域に首の下) (図 1 a)。
  6. 内部面 (mediocubital 領域) の右の前肢と両後肢 (mediotibial 領域) で 1-2 cm2の追加領域を剃る (図 1 b)。
  7. 同期プロシージャ (図 1) の中に心臓のリズムを監視する手足の坊主の領域に接着の心電図電極を配置します。
  8. テーブル (図 1) に接続されているサージカル テープを使用して伸ばした手足サーマル ブランケットの褥瘡仰臥位に動物を配置します。
    1. 耳はウサギのこのプロシージャ全体で動物の胸郭の正しい位置を維持することができますので、その前肢よりも低い位置にある頭/背中の後ろに後方に曲げていることを確認します。
  9. (100%、2-3 L/分) の全体の手順中顔マスクで酸素を投与しながら自発的に呼吸する動物を許可します。

Figure 1
図 1。IMI のウサギの準備。(A) 胸郭; から髪の毛をクリップ(B) 手足; から髪の毛をクリップ(C) 電極を付着し、熱毛布の上に大の字でウサギを配置。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

3 ウサギの経皮的コントラスト心エコー法ガイド IMI 技術

  1. きれいにし、クロルヘキシジン ベースのソリューションと胸部の皮膚を消毒します。
    1. 現在のベスト プラクティスによると、全体の手順全体の無菌技術を使用します。
    2. 、可能な限り、合理的に可能な場合は、ガウン、手袋、手術創のドレープ、滅菌ドレッシング テーブルとして滅菌超音波材料など滅菌材料の使用に限定されないなど、完全に無菌操作を実行します。トランスデューサーはカバーと滅菌された超音波ゲル。これは受信 IMI、動物に病原体を導入するリスクを最小限に抑えるが、臨床設定で (例えば、心臓穿刺中に) 標準的な方法です。
      注: 動物研究地方機関に適用される法規および練習の国に沿って常に続行することをお勧めします。
  2. 胸におよび/またはトランスデューサーと実験者の首に探触子ケーブルと超音波伝送ゲルを適用、解剖学を視覚化し、IMI を計画すると便利です、動物の心のウィンドウのクイック スキャンを実行します。
  3. 4th-6th肋間スペース、右傍胸骨の角を揃えてから 2-3 cm で探触子を手動で配置 〜 胸部の壁 (図 2 a) の右側にあるに関して 90 °。
  4. 肋間スペース前後、乳頭筋レベルでの変更の短い軸ビューを最適化する背の角度を基準にして探触子の位置を調整します。このビューで右心室 (RV)、左心室 (LV)、心室中隔 (IVS)、後壁 (PW) と同様、前外側 (AL) と後 (午後) 内側乳頭筋 (図 2 b) を特定します。
    1. (例えばボタン、ダイヤル) システムに適切なコントロールを使用して深さを大幅増広視野があります。
    2. 心内膜と心外膜の輪郭の適切な分化と同様に、このビューで対称的な画像を得るには特に注意を払うし、必要に応じて、画像最適化コントロール (例えばゲイン) を調整します。
  5. 最適な心エコー ビュー (図 2 b) を取得する、2 番目の演算子は、IMI (下記参照) を実行しながら、手順の残りの部分でこの位置を維持します。
    1. 探触子を抱っこしながらする必要があります常にある前方に直面して (図 2 aC) 以降の手順で針とその配置をできるように探触子のオリエンテーションの印を隠すことは避けてください。
  6. 1 mL の注射器に接続されている 24 G 針、探触子に関して対称なミラーリング位置に左胸腔の皮膚の近くに針を配置します。探触子オリエンテーションの印の角度で針を手動で調整し、~ 90 ° (図 2)、ゆっくりと皮膚を通してそして胸腔に針を進める。
    注: この位置と向きの経皮的穿刺が容易になります (図 2 D, E)、超音波ビームの平面に針の可視化リアルタイム監視できるようにと、必要な場合の調整(図 2 G, H) 心筋のターゲット領域の相対的な場所です。
  7. ターゲットの場所でヒントをゆっくりと、注入液を提供 (注射部位ごとに 0.25 mL) 10 30 s (図 2 e)、ゆっくりと優しく心筋の範囲を増加する注入時に針を取り消す処理しながら内。
    1. InI を使用して 10% (v/v) 希釈 PBS で標準化、技術のその場でトレーサーとしての心筋内のすべての 4 つの IMI サイトのターゲットに成功を確認、同様の能力を獲得しながら病理グロスと病理 (を参照してください代表の結果)。能力を達成すると、必要な場合適切な商業超音波造影剤によって、その InI を置き換えられます可能性があります。
      注: 10% (v/v) 注入 (図 2 e, F) のターゲット ・ サイトで細胞の有無、心筋を貫 hyperechogenicity (すなわち、エコー明るい外観) に PBS でに希釈した InI の配信。一時的な減速や加速心拍数は、期外収縮の (例えば、分離、対句と三つ子) に関連付けられているの心外と針の最初の接触からも観測頻繁と同様実行中または IMI の直後後。ただし、命にかかわる不整脈を開発しないと急性の副作用はめったに IMI 注射部位あたり 0.25 mL (10 の6セル × 1.25) まで注入液を使って観察 (代表結果考察を参照)。
  8. (左心室に 3 つの壁 (LVFW) と IV の 1 つ無料) 4 つのターゲット IMI サイトごとに 0.25 mL の注入を完了に必要な針の入射角度の微妙な変化を実行します。
  9. 経皮的コントラスト心エコー法による IMI 手順を完了すると、心臓のリズム (例えば、シリアル ECG トレースや 24 h ホルター心電図による) を評価し、シリアル窓の不在を確認する超音波スキャンを実行合併症、動物麻酔とだけを転送からライト ・ サイクル ルームに完治まで。
    1. ここでは、24 時間ホルター心電図を使用して 24 時間心臓のリズムに及ぼす InI で IMI を監視します。このため、正常の表現型 (正常群) と 6 兎の集団とドキソルビシン (心毒性アントラサイクリン系薬、癌の治療のために一般的に使用されるの静脈内投与を受けた 6 ウサギのグループを比較しました。DOX グループ) 2 mg/kg の用量で 8 週間とし、両方のコホートの週受け取った InI で IMI/。

Figure 2
図 2.ウサギの経皮的造影エコー ガイド心筋。(A) の角度で右胸腔に探触子の配置 〜 90 °。(B) ウサギ乳頭筋レベルで心の胸骨短軸ビュー (PSSX) の代表的なイメージ。(C) 配置の角度で針の ~ 探触子オリエンテーションの印を基準にして 90 °。(D) 心 (針は超音波ビームの平面で表現しにくいことに注意してください) の PSSX ビューのターゲット ・ サイトで針の場所です。(EおよびF) インドのインク (矢印は、貫壁性 hyperechogenicity を強調表示) と心筋内注入時にターゲット サイトに hyperechogenicity のデモ。(G) LV チャンバー内の針の偶発的な場所 (矢印は針の軸を強調表示)。左心室自由壁に針の (H) の位置変更 (矢印は針の軸を強調表示)。RV = 右心室。LV = 左心室;IV = 心室中隔。PW = 後部壁。アル = 前外側乳頭筋;午後後内側乳頭筋を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

4. ポスト IMI 解析

  1. ウサギから心臓組織サンプルの病理組織学的解析を実行します。
    1. 次のようにエタノール濃度の増加と脱水に続いて 10% ホルムアルデヒドで 24 h のための組織を修正します。
      • 1 x 70% (60 分)
      • 1 x 95 %ethanol/5% メタノール (60 分)
      • 1 x 100% (60 分)
      • 1 x 100% (90 分)
      • 1 x 100% (120 分)
      注: 上記のすべての孵化は室温 (RT) で行われます。その、二度 100% キシレン (RT 1 h) に置き換えるし、最後に 2 つのステップ (60 分、58 ° C)25でパラフィンに埋め込みます。
    2. 4-5 μ m の切片ミクロトーム25を実行します。スライド上のセクションをマウントします。
    3. ヘマトキシリン-エオシンとマッソンのヒアリン方法25,26,27染色を実行します。
  2. 移植心から組織のセクションで EGFP(+) HEK 293 細胞 (例えばアビジン-ビオチン複合 (ABC) メソッドを使用して) を簡単に検出する免疫を実行します。
    1. 脱ワックス 100% キシレン (RT では 10 分) で 4-5 μ m 厚い心セクション。エタノール濃度溶液 (100% (2 分) で 2 倍 95% (2 分) 2 x 70% (2 分) で 1 x; 50% (2 分) で 1 x; 30% (2 分) で 1 x; 1 x ddH2O (2 分)) 室温の低下とともに洗浄することにより組織を水分補給します。
    2. 100 μ L で 3% H2O2 (H2O2と追加メタノール 30% 原液 5 ml を 50 mL の合計容積に準備) メタノール (希釈部を覆うことによって内因性ペルオキシダーゼ阻害を実行します。孵化 30 分、RT)、トリス緩衝生理食塩水 (TBS; pH 7.6) を浸漬し、洗浄します。
    3. 0.1% の 100 μ L でセクションを覆うことによって酵素処理による抗原のアンマス キングを実行 (0.01 g プロナーゼ TBS 10 mL で希釈し調製する) プロナーゼ (12 分、RT を孵化させなさい)、tbs (5 min, RT) を洗います。
    4. ソリューション (ヤギ血清で 10%、TBS で) ブロックでインキュベートあたり 100 μ L を使用してスライド (RT 30 分) と TBS (5 min, RT) で洗います。
    5. (1 h、30 ° C)、一次抗体 (TBS の 1: 500) として鶏抗緑の蛍光蛋白質 (GFP) と孵化し、TBS (5 min, RT) で洗ってください。
    6. (1 h、30 ° C)、ビオチン化二次抗体ヤギ-反-鶏 IgG (tbs 1: 250) と孵化し、tbs (5 min, RT) 洗ってください。
    7. アビジン-ビオチン複合体 (20 分、30 ° C) と孵化、tetrahydrochloride 3, 30-ジアミノベンジジン (軽打) (RT、5-10 分) を使用してラベルを貼ります。
    8. 最後に、ヘマトキシリン-エオシン法25を使用して対比染色セクション常温では、エタノール濃度 (30% (2 分) で 1 x 1 x 50% (2 分) で 70% (2 分) で 1 x; 95% (2 分) 2 x; 100% (2 分) で 2 倍) の増加で洗濯して脱水し、カバーのスライドをマウントします。正、アイソタイプ コントロールだけでなく、負の値が含まれます。
      注: 上記で説明した簡単なプロトコルは一般的な免疫組織化学用; 意図されていません金利や条件のティッシュのための最適化が必要です。

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Representative Results

InI で経皮的コントラスト エコー ガイドの IMI:

上記で説明したプロトコルを使用して、貫壁性 hyperechogenicity が InI の配信中に観察された心エコー法と注入開始によって確認された針の先端の最適配置、一度 (PBS で 10 %v/v) (図 2 e)、対象地域 (図 2 f) に IMI 後まもなくと同様。IMI は、安楽死がすぐに続いた、中心部が削除されたとき、InI の預金された心 (図 3 a) の外部検査時に容易に目に見える。さらに、心臓ティッシュ セクション、例えば軸の短いセクションで乳頭筋 (図 3 b) のレベルではデモは成功し、効果的な配信、注射部位の InI 染料の貫壁性堆積物を明らかにしました。この手法を使用して心筋に注入液。注記のうち、貫壁性 hyperechogenicity は InI のex vivo試験片 (図 3 a, B) における貫壁性預金とよく相関した IMI (図 2 e, F) の中に体内の観察。これは明らかに InI が IMI の設定でデュアル プロパティを持っていることを実証:生体内超音波造影剤とvivoin 元場トレーサーとして。これらのプロパティの両方は、特にこの手法でコンピテンシーの取得中に訓練のための非常に汎用性と安価な超音波造影剤 InI を作る。InI の高エコー プロパティが IMIなどを監視し、する超音波のリアルタイム イメージング機能を与えられた成功した IMI 対誤って内商工会議所または心膜注入と、必要なときを判断するのに役立ちます、針の修正は、(図 2H) リアルタイムで追跡します。その一方で、InI の場でトレース機能がターゲット心筋標本前のヴィヴォ、注入液を検索する値。

経皮的コントラスト ini ファイルおよび EGFP(+) の HEK 293 細胞と心エコー検査ガイド IMI:

IMI 前、EGFP(+) HEK 293 の細胞の正常な遺伝子は体外培養条件 (図 3) の中に蛍光顕微鏡によって確認されました。InI 沈着を認め心組織切片の免疫組織化学分析による EGFP(+) HEK 293 の細胞の心筋に正常に配信を示した。したがって、アビジン-ビオチンの複雑な方法を使用して (手順 4.2 を参照)、豊富な EGFP(+) HEK 293 細胞が点在して InI 堆積物 (図 3 D) 心筋内で識別されました。InI のまだ認められた 24 h 後 IMI EGFP(+) HEK 293 細胞 (図 3E) との組み合わせで InI または InI だけで (図 3 f) のいずれかを受信したウサギからの心筋組織サンプルで。注記のうち、動物 EGFP(+) HEK 293 細胞 (図 3E)、急性細胞性拒絶反応を示唆からのサンプルで、優勢な好中球浸潤と、この時点で急性炎症反応を認めた.その一方で、マクロファージは、InI だけで (図 3 f) の動物で観察されました。

Figure 3
図 3.その場で肉眼および病理組織学的評価や注入液のトレース。(A) 次の (矢印は、注入部位を強調表示) InI で IMI 摘出心臓の外部審査に注入液の存在のデモンストレーション。(B) 貫次の心臓の乳頭筋レベルでの横断面の InI で IMI 注入液分布のデモ (青い矢印を強調貫 InI 預金; 白の矢印を強調表示物IV で InI)。(C) 蛍光体外蛍光顕微鏡を用いた EGFP(+) HEK 293 の細胞の。(D-F)挿入されたサイトの病理組織学的解析。EGFP(+) 細胞が目に見えて 0 h (D) 心筋内の InI 預金点在し、24 h (E) 投稿 IMI (青い矢印 EGFP(+) セルを強調表示; 好中球の存在を強調表示の赤い矢印)。24 h (F) 次の InI だけで IMI 心筋内で散在している InI の堆積物 (青い矢印は、マクロファージの存在を強調表示)。RV = 右心室。LV = 左心室;IV = 心室中隔。IMI = 心筋の注入;InI = インドのインク。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

詳細と良い動物処理とケアに細心の注意と手順は一般に、忍し、急性合併症は非常にまれと考えてこれまで以上 60 経皮的コントラスト心エコー法ガイド IMI プロシージャを行って、通常軽度。一般に、IMI の間に最も頻繁に観察を受ける手順の一時的な加速、あるいは減速心拍数の後まもなく分離早期心室錯体 (PVC) (図 4 a) に関連付けられている動物のしたがって、24 h ホルター心電図監視 IMI、によって単独で InI を受けた動物の最も頻繁に不整脈の検出 (24 時間以内のエピソードの合計数) があったことを明らかにした動物のエピソードの高い数値が検出されたにもかかわらず、PVC を分離以前 8 週間 (図 5 a) DOX と扱われます。対句と三つ子のフィギュアのように見える頻度が低い (図 4 bC図 5 bC) 三つ子は、大幅に少ないにもかかわらず頻繁に未処理通常ウサギ (図 5) で DOX 扱われるよりも。その一方で、非持続性心室頻拍 (NSVT) は、健常動物で観察されたより頻繁 (図 4および図 5).大幅に、InI だけで (図 5E) と IMI を受信した後の平均心拍数は DOX と通常のグループ間で異なるなかった、しながら通常の R-R 間隔 (SDNN) の標準偏差だったが大幅に削減 (< 100 ms) DOX グループ (図 5 階)。SDNN 非尺 - 心の健康状態は、したがって、この結果は DOX グループでは、その心臓の生理学的状態のグローバルな変化を示します。

Figure 4
図 424 h ホルターは InI で IMI を受信したウサギの監視中に心室性不整脈が観察。ホルター心電図橈から取得したスクリーン ショットを示したイメージ オフライン分析中に画面に表示され、24 時間監視中に検出された不整脈の最も一般的な種類の代表的な例を示します。(A) 絶縁 PVC。(B) 二行連句の完成品です。(C) 三つ子の完成品です。(D) NSVT。PVC = 早期の心室の収縮;NSVT 非持続性心室頻拍を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5.24 h ホルター心電図はウサギで以下の InI で IMI モニタリングで検出される不整脈イベント。絶縁 PVC (A) 対句 (B)、(C) 三つ子のフィギュアの PVC の合計数とドキソルビシン処理と未処理のウサギ (ノーマル + IMI) NSVT (D) (3 mg/kg/週 6 週間) InI で IMI 後ウサギ (DOX + IMI)。心拍数 (E) を意味して InI で IMI 後グループ通常 + IMI と DOX IMI からウサギ SDNN (F)。データは、平均 ± SEM. として表されます * p < 0.05; を示します# を示すp < 0.01、ノーマル + 対 DOX + IMI IMI を比較してtグループ-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

主な目的の使用を活用しながらウサギ (サイズ臨床大動物モデル)17,18, 心筋への幹細胞の配信に使用できる低侵襲技術を開発することでした、比較的安価なイメージング システムを容易に利用できる多くの臨床や研究センター。ここで、臨床心エコー システムを使用して、ことを示す、InI、トレース機能の in situと高エコー特性、成功した経皮的コントラスト心エコー法ガイド付きの広く利用可能なエージェントによって支援 IMI は非常に効果的ですウサギの対象地域に心の注入液を提供します。我々 の知る限り、これは経皮的コントラスト心エコー法ガイド IMI と携帯配信ウサギ18,19など大動物モデルでの最初の説明です。これが私たちの知る限り、このエージェントのデュアルのプロパティの最初の説明として生体内では InI は、組織7,28内注入液の場で局在の研究で以前使用されています、一方超音波造影剤注入液前のヴィヴォ場でトレーサーとして。確かに、造影剤とその場でトレース物質以前の複雑な混合物は、心筋29に injectates を提供することを目的としたマウスの研究に記載されています。ただし、InI とその場でトレース機能の高エコーのプロパティ、与えられたこの物質非常に役に立つかもしれない能力取得中にこの方法でトレーニングを受けながら。

同様に両方の InI を含む注入液の配信の確認 EGFP(+) HEK 293 細胞として免疫組織染色による幹細胞治療を目指した臨床研究に本手法の適用性を示します。IMI の InI 組み合わせて EGFP(+) HEK 293 とは、異種の細胞を (内 24 h) 急性細胞性拒絶反応の応答を示唆する優勢な好中球浸潤と急性炎症反応で起因しました。この応答は、おそらく免疫動物に驚くべきことではありません。その一方で、InI だけで IMI はまた優勢なマクロファージ浸潤を示した治療の心筋組織の (24 時間) 以内の急性炎症反応を引き出した。これに沿って急性炎症の観察に記載されて次の IMI では、開胸手順4,30,31,32,33直視下以前の研究。急性炎症は心筋の34,3536のラットの腓腹筋にも食塩水または PBS ソリューションの射出時に観察されているし、この応答がされているため注入液自体にではなく、直接組織の損傷に起因します。30,31,32,34,35,36確かに国際社会心血管トランスレーショナルリサーチ、IMI の設定における炎症の一般的な発生を認めているが、かどうかについてのコンセンサスがないか測定中にこのプロセスを減らすために、ペリ手続き時間は有用 (例えば、静脈内投与 (静脈) 副腎皮質ステロイド)37。にもかかわらず、組織の損傷を直接に本研究では炎症が見積もった、また示唆された InI、異物もマクロファージの数を提供, このプロセスで役割を果たす必要があります表示する InI (図 3 f) を貧食します。この急性炎症、心の中でイミにセカンダリの機能の効果を徹底的に分析またはこれらをコルチコステロイドなどの予防薬の投与で改善できるかどうかは本稿の範囲を超えています。それにもかかわらず、経皮的コントラスト心エコー法ガイドまで 0.25 mL (10 の6セル × 1.25) IMI サイトごとの注入液量と、心筋の 4 つのターゲット地域に IMI がウサギで容認された非常によく。

60 以上の手順は、実行する日と能力が達成された後、手順をセカンダリの死亡率は非常に低かった。たとえば、IMI 後 3.9 (通常、DOX グループ) の手順で説明した 2 つのコホートで死者は出ていないです。確かに、までに進行中の研究プログラムの一環として 67 IMI プロシージャが実行された後、2 人が死亡 (2.9% の死亡率) の手順に直接関係だけでしたが。これらの 1 つで、hemopericardium の存在を示した事後検査で他は臨床神経学的徴候、従って必要とする心原性脳イベントへの二次急性脳虚血と一致を開発しながら、人道的エンドポイント。この死亡率 (2.9%) は有意に低かった Luによって報告(11%)8および Muら (27%)38, 開胸の手順で直視下 IMI を受信したウサギ。したがって、安全であると現在の研究で説明されている手順を考えて、我々 は有望な結果39,40AICM の家兎モデルにおける幹細胞を用いた治療法を評価する進行中の研究でこの手法を使用しています。

経皮的成功のためのいくつか重要なポイント コントラスト心エコー法ガイド IMI があります。まず、乳頭筋レベル胸骨短軸ビューが心内膜と心外膜の輪郭の明確な描写を得られることを確認します。次に、これが胸腔と心筋心膜または LV の商工会議所に偶発的な配信を防ぐために入力した後、すべての回で針の先端が視野内にあるを確認します。これはこれらの構造と関連するリスクをローカル外傷 (例えば裂傷) の可能性を高めることができるので、胸腔や心膜と心筋の通路の数を最小限に維持することを確認します、hemopericardium。このため、針の入射角度の微妙な変化を慎重に実行 (と内臓膜 (例えば側壁) でエントリの同じ時点で、いくつかのターゲット サイトの) 胸腔に針を維持しながら。最後に、常に鈍針ベベルから心筋に入ると著しい損害を避けるため胸腔内に明確かつ簡単な皮膚通過には針を使用します。

本明細書で説明されている手順によりだけでなく、心筋内のいくつかのターゲット サイトへの注入液の信頼性と成功配信が、偶発的な intrachamber 配信 (を防いでリアルタイムで針軌道の補正も可能図 2, H)閉じながら胸 IMI プロシージャは、マウスで以前記載されている、この小さな動物モデルに固有いくつかの制限があります。これらの制限には、療法を受けやすい心筋のターゲット地域とターゲット サイト29,41あたり注入される細胞数/低ボリュームの数が含まれます。さらに、注入液の正確な配信がしばしば懸念、60-7042、近い成功率、したがってより少なく広く利用可能な高周波超音波診断装置の使用は通常必要な29,41 42。これらのシステムが線形アレイ探触子イメージングの固有の制限にも装備 (例えば残響は頻繁な人工物)14。マウスやラットなどの小型の齧歯動物モデルのもう一つの制限は、Ca+2輸送システムで、人間や犬、豚、ウサギなど大型サイズの動物モデルと異なる細胞の電気生理学の本質的な違い15,16,43。すべてのこれらの制限は、しばしば大動物モデルで事前に確認することがなくクリニックにこれらのモデルの調査結果を翻訳の難しさを作成します。

ペリ手続き期間での動物の注意深い監視は実験動物のケアのための現代的なガイドラインに従って必須です。下図のように、このすることができるシリアル エコー ウィンドウ スキャンと心電図心音によって少なくとも動物が麻酔から覚めるまで。また心臓のリズムに IMI の急性効果 24 h ホルター心電図によって監視することができます、私たちの標準的な練習に。注記のうち、最も頻繁に不整脈が分離された PVC、自然の中で比較的良性であると、InI で IMI 前にドキソルビシンと扱われている動物に多い (図 4 a図 5A参照)。比較的頻度が他の不整脈が含まれます:; 二行連句のフィギュア三つ子; のフィギュアNSVT のだけでなく、(図 4 b-D図 5B-Dを参照)。しかし、持続的な心室頻拍など生活脅かす不整脈は認められなかった。注記のうち、DOX グループ内のいくつかの心毒性症状がホルター心電図監視、SDNN など心拍変動 (HRV) の時間周波数領域の変数を使用して、検出することを分かったします。したがって、減らされた SDNN (図 5 eF) 非尺 - 心の健康状態の DOX グループが通常のグループと比較して観察されました。減らされた SDNN によって示されるように、これは減少 HRV の最初のレポートは、ウサギのコンテキストで SDNN 減少観測に沿ってである AICM のモデルは原因の寄与について44 患者の心臓死の強力な独立した予測因子、45,46。DOX グループ内における SDNN IMI のプロシージャに関連しておそらくいません。それにもかかわらず、ウサギ、IMI を受信しない普通の動物と同様、ドキソルビシン、受信におけるこれらの所見の確認が必要です。かどうか減らされた SDNN 原因の寄与についての可能性がありますされ、したがって使用による幹細胞療法の利点の測定値に代わる評価されるが、今後の研究の焦点になるだろうと。

細胞の中心に配信のいくつかのルートは、静脈内、冠動脈、心筋内配信などを検討されています。ただし、ここで使用される心筋内ルートは一貫して細胞保持率1,2,3,4,5,37の最大レベルを示しています。使用した方法論ではない堅牢なこの体内または体外研究の限界である量的に表わすような具体紹介、研究で細胞保持率は評価しなかったことはできません。代わりに、こうして成功心筋配信を示す EGFP(+) HEK 293 細胞表現型特性を持つ、心筋内でこれらの細胞の存在を簡単に判別することができましたを使用しました。しかし、主な目的は非虚血性心筋症の大きなサイズ、前臨床モデルの心筋に IMI と携帯配信を実施という低侵襲技術の開発だった。図 2および図 3に示されているようにこれは、経皮的で初めてコントラスト心エコー法ガイド IMI を実現されました。さらなる研究は、潜在的な幹細胞の有益な効果はここ; 説明されている手順を使用して心筋に配信と同様、細胞保持率を評価するために必要ですこれらの研究は現在進行中であります。マイクロソフトは最近、機能的効果39,40に関して有望な結果をお知らせ。

開胸の手順で IMI と比較して、エコー ガイド下経皮的コントラストとして大規模な前臨床モデルで IMI 本研究では大幅の迅速なリカバリ、手順に従って動物の自然界には低侵襲上記のように、またより低い死亡率率8,38があります。IMI に別のアプローチはまた前臨床モデルおよび複数の小さい臨床試験でテストされているカテーテル ベース IMI (レビュー、盛を参照してください)47。 このアプローチでは、カテーテルは LV キャビティ内に高度な、心内膜内のターゲット ・ サイトに配置します。これらのターゲット ・ サイトは、メカニカル心内マッピング (EEM) によってプロシージャ、例えば、時に前の例えば、コントラスト心臓磁気共鳴イメージ投射 (CMR)48, を使用して、手順を識別いずれか明らかに注射49の前に実行可能な心筋を区別します。この後者のアプローチは、胸から下の直接のビューの明確な利点である IMI を開くに比べて低侵襲です。また、人間の IHD に斑状の配布があるので EEM IHD の設定で特に重要である、心筋の実行可能なサイトに具体的に治療を直接に役立ちます。しかし、大きな欠点は心室性不整脈、IMI のアプローチはすべての共通の特徴である誘導です。その他の欠点には、EEM は広範なトレーニングと心臓穿孔のリスクを必要とする要求の厳しい技術を提供する、長い手続き時間が含まれます。対照的に、経皮的コントラスト心エコー法ガイドとして IMI がこの研究に記載されている技術的には少ないカテーテル ベース IMI よりも厳しい、麻酔後 25 分で安全に実行できる能力が達成されれば。同様に、針の短い部分だけは心筋に高度なので心臓穿孔のリスクが低いがある心臓裂傷がまだ可能であります。

結論としては、ウサギの16,43などの大動物モデルにおけるこの説明した経皮的コントラスト心エコー法ガイド IMI テクニックは、忍容性、安全かつに注入液を提供することで効果的な心。したがって、それは (例えばAICM)、非虚血性心筋症の心筋再生治療法の効果の前臨床仮説をテストするための有望な戦略を構成する含み、これに限定されない、幹細胞ベースの治療。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

著者は、シーラ モンフォート、ブレンダー ・ マルティネス、カルロス ・ Micó、アルベルト ・ ムニョス、マヌエル ・ モリーナを EGFP(+) HEK 293 細胞を提供するためのデータ、およびカルロス ・ ブエノのコレクション中に優れた支援ありがちましょう。この仕事だったの一部がサポートされている: フンダシオン Séneca、y Agencia de サイエンス テクノロジー、合衆国・ デ ・ ムルシア, スペイン (JT) (許可番号: 11935/PI/09);赤デ Terapia Celular、ISCIII-サブ。Gral。Redes、VI PN デ私 + D + 私 2008-2011 (付与なし。RD12/0019/0001) 欧州連合 (フェダー) (JMM); の資金調達構造との協調融資 (JMM)読書の大学、イギリス (AG、GB) (中央の資金)。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

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