Author Produced

Перкутанная контраст Intramyocardial эхокардиография руководствуясь инъекций и доставки клеток в большой доклинических модели

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Роман терапевтических стратегий в сердечной регенеративной медицины требуют обширные и подробные исследования в крупных доклинических моделях животных, прежде чем они могут рассматриваться для использования в организме человека. Здесь мы продемонстрировать технику инъекций intramyocardial эхокардиография руководствуясь перкутанная контраст в кроликов, который является ценным для гипотез эффективность такой роман терапии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Giraldo, A., Talavera López, J., Fernandez-Del-Palacio, M. J., García-Nicolás, O., Seva, J., Brooks, G., Moraleda, J. M. Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model. J. Vis. Exp. (131), e56699, doi:10.3791/56699 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Клеточной и генной терапии являются захватывающими и перспективных стратегий с целью регенерации сердца в параметре сердечной недостаточности с снижение фракции выброса (HFrEF). Прежде, чем они могут рассматриваться для использования и осуществляться в организме человека, обширные доклинические исследования требуются в больших животных моделей для оценки безопасности, эффективности и судьба injectate (например, стволовые клетки) раз доставлен в миокарде. Небольшой грызун модели предлагают преимущества (например, эффективность, ответственность за генетические манипуляции затрат); Однако учитывая присущие ограничения этих моделей, результаты в этих редко перевод в клинику. И наоборот, крупных животных моделей, таких как кролики, имеют преимущества (например, аналогичные сердечной электрофизиологии, по сравнению с человеком и других крупных животных), сохраняя хороший баланс экономически. Здесь мы демонстрируем как выполнить перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь intramyocardial инъекции (IMI) техника, которая является минимально инвазивной, безопасным, хорошо переносится и очень эффективны в целенаправленной доставки injectates, включая клетки, в нескольких местах в миокарде модели кролика. Для осуществления этой техники мы также воспользовались системы клинических эхокардиография широко доступны. После закапывания в практике протокол, описанные здесь, исследователя знания основных УЗИ станут компетентными в выполнении этой универсальный и минимально инвазивной техники для обычного использования в экспериментах, направленных на тестирование гипотезы возможностей сердечной регенеративной терапии в модели кролика. Как только достигается компетентности, вся процедура может быть выполнена в течение 25 мин после анестезировать кролика.

Introduction

Клеточной и генной терапии захватывающие и когда-нибудь разработки стратегий для регенерации/ремонта потерпевшего миокарда в HFrEF. В нескольких исследованиях сравнивали эффективность (например, коэффициент удержания клеток) различных маршрутов доставки клеток, которые последовательно продемонстрировали превосходство IMI над интракоронарой или внутривенного маршрутов1,2 , 3 , 4 , 5. Таким образом, это не удивительно, что большая часть исследований по трансляционной модели терапии стволовой клетки потерпевшего миокарда, доставить injectate через IMI, под видом в открытой груди процедуры6,7 . Однако этот подход имеет ряд ограничений, в том числе захватнический характер процедуры, которая несет в себе риск смертности Пери процессуального (часто занижены)8. Кроме того IMI под видом не устраняет возможность непреднамеренного введения в полость желудочков. В клинической практике IMI во время открытой грудной хирургии может быть соответствующий метод для доставки терапевтических клеток, например, при коронарной артерии трансплантата шунтирование (АКШ); Однако этот подход не может быть подходящим для доставки клеток в глобальной кардиомиопатия-ишемического происхождения (например, HFrEF, вторичные кардиотоксичности кардиомиопатия (AICM)).

Нет сомнений в том, что ишемическая болезнь сердца (ИБС) является наиболее распространенной причиной HFrEF (~ 66%)9,10; однако, не ишемическая кардиомиопатия, включая AICM, по-прежнему затрагивает значительную долю больных с9 HFrEF (33%) . Действительно последние достижения в клинической онкологии привели к более чем 10 миллионов выживших рака в США только11, с оценками аналогичное число в Европе, в соответствии с общей тенденцией к улучшение выживаемости больных раком12 ,13. Таким образом изучение преимущества Роман терапии, такие как трансплантация стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия, а также испытания той эффективной и минимально инвазивной маршрут доставки стволовых клеток имеет первостепенное значение, учитывая рост числа больных пострадавших от кардиотоксичности вторичных противоопухолевых препаратов.

Следует отметить гипотез исследования с использованием клеточной терапии, направленных на ремонт/регенерации потерпевшего миокард часто предполагает использование мелких грызунов (например, мышей и крыс). Эти модели часто требуют дорогих высокой частоты ультразвуковых систем для оценки функции миокарда, обычно оборудованы с линейного массива преобразователей, которые имеют некоторые присущие связанные ограничения (например, реверберации)14. Однако другие модели, такие как кролики, представляющие большой доклинических модели, имеют некоторые преимущества для проверки гипотез при терапии стволовой клетки в HFrEF. Таким образом в отличие от крыс и мышей, кроликов поддерживать Ca+ 2 транспортной системы и клеточной электрофизиологии, который напоминает людей и других крупных животных (например, собаки и свиньи)15,16,17 ,18,19. Еще одно преимущество, это их ответственность за сердца ультразвуковых изображений с помощью относительно недорогой и широко доступны клинических эхокардиография систем, оборудованных с относительно высокой частотой фазы массива преобразователей, например, 12 МГц, такие как те, которые часто используются в неонатальной и педиатрической кардиологии. Эти системы позволяют отличные Эхокардиографические изображений с современные технологии, и они воспользоваться превосходства гармоники20изображений. Кроме того, обширные гипотеза тестирование потенциал сердечной регенеративной терапии (например, терапия стволовой клетки), их безопасность, эффективность, cardiomyogenic потенциал, а также оценки судьбы injectate раз доставлен в миокарда, является обязательным, прежде чем они могут быть рассмотрены для использования человеком, и они требуют использования больших доклинических моделях животных, как кролик17,19. Здесь мы описываем минимально инвазивной техники для доставки клеток через перкутанная контраст эхокардиография руководствоваться IMI с помощью системы клинических эхокардиографии, которая направлена на терапии на основе трансплантации стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия20 . Мы также описывают преимущества чернил Индии (InI, также известный как Китай чернил) как УЗИ контраст агента и в situ трассирующими injectate в самом сердце кролика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты, описанные здесь, были утверждены Комитетом этических исследований Университета Мурсии, Испания и были проведены в соответствии с директивой 2010/63/ЕС Европейской Комиссии. Описанные шаги были выполнены под стандартные оперативные протоколы, которые являются частью плана работы и не были проведены исключительно для съемок сопровождающих видео к настоящему документу.

1. Подготовка клеток и млекопитающих выражение вектор

Примечание: Здесь, мы кратко описать протокол для подготовки и transfection клетки линии (человеческих эмбриональных почки 293 (ГЭС-293)); Однако конкретные протоколы соответствующие клетки для типа ячейки интереса должны быть оптимизированный (например, стволовые клетки).

  1. Поддерживать ГЭС-293 клетки в высокой глюкозы Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), пируват натрия 1%, 2 мм глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и инкубировали при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 . После того, как клетки югу вырожденная, раскол в соотношении 1:3.
  2. Начать разделения клетки, аспирационных СМИ, то мыть раз с стерильных фосфат буфер солевой раствор (PBS), удалить излишки PBS и затем инкубации с 2,5 мл 0,5 x трипсина-Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (5 мин., 37 ° C).
    1. Добавьте один объем DMEM СМИ (дополнить, как описано выше) чтобы остановить реакции и затем отсоединить клетки, медленно и осторожно аспирационных вверх и вниз с электронных дозаторов.
  3. Затем перенесите суспензию клеток в соответствующий контейнер (например, 15-50 мл конические пластиковых пробирок). Центрифуга в ведро качели (100 x g), удалить супернатант и помыть лепешка дважды с стерильных PBS.
  4. Ресуспензируйте Пелле в свежих DMEM СМИ и семян в соответствующей ячейке плотности (например, 1 x 106 клеток в колбе2 75 см) в свежих культуры колбы или большие блюда согласно местных лабораторной практики.
    1. Замените существующие средства массовой информации с свежими СМИ каждые 2 дня.
      Примечание: Выражение вектор был производным от pIRES1hyg и используются согласно инструкциям производителя как описано21. p(EGFP) IRES1hyg порожденных subcloning EGFP cDNA как BamHI + Ноти вставить в BamHI из pEGFP-N1 + Ноти переваривается pIRES1hyg21.
  5. за 1 день до трансфекции, семян ГЭС-293 клеток на плотность 0,5 x 105 клеток/см2 в 12 - или 24-ну культуры ткани пластины.
  6. В день трансфекции Подготовьте ДНК липидов трансфекции реагент комплексов в отдельных 1,5 мл microcentrifuge трубки (1 трубка/хорошо).
    1. Начните с добавления 250 мкл сокращение сыворотке среды в каждую пробирку, а затем добавить 4 мкг ДНК (осторожно перемешать).
    2. Впоследствии, добавить 250 мкл предварительно подготовленную смесь 10 мкл липидов трансфекции реагента и 250 мкл сокращение сыворотке среды, каждая трубка (снова осторожно перемешать).
    3. Наконец перейти с transfections, по инкубации клеток ГЭС-293 с ДНК липидов трансфекции реагент комплексы для 4 ч, затем замените среде DMEM дополнить как описано выше (шаг 1.1) и инкубировать еще 48 ч. Выбор наркотиков Perform стабильного transfectants с 100 мкг/мл hygromycin б.
  7. Отсоедините ГЭС-293 клетки с трипсином, как описано выше (шаг 1.2). После мытья клетки в стерильных PBS, Ресуспензируйте надлежащим средством (например, 10% v/v InI в PBS), для достижения окончательного ячейки концентрации 5 x 10-6/мл.

2. Подготовка кролика

Примечание: Позиционирование кролика и преобразователя для IMI не является оптимальным для оценки морфологии и функции сердца животного. Таким образом рекомендуется выполнять полное ультразвуковое обследование20 до IMI (см. ниже) и в последующее время точках, как определяется экспериментальный дизайн. Это будет стремиться оценивать базовые анатомические и функциональные характеристики сердца в животном которые будет получать инъекции, а также оценить последствия, IMI в функции сердца.

  1. Выполните этот экзамен в ослепленный моды и руководящими принципами Комитета по эхокардиографии американского Колледжа ветеринарной медицины внутренних и американского общества эхокардиография/Европейской ассоциации для сердечно-сосудистой системы визуализации 22 , 23 , 24.
  2. Получите одновременно 1-ведущий Электрокардиограмма (ЭКГ) трассировки на протяжении всей Эхокардиографическое исследование.
  3. Анестезировать кролика с Кетамин 10 мг/кг, в сочетании с medetomidine 200 мкг/кг внутримышечно (и.м.).
  4. Проверьте уровень анестезии после 10-20 мин после введения анестезии.
  5. С помощью машинки для стрижки волос удаление волос грудь широко (например, ниже шеи к югу xiphoid регион) (рис. 1A).
  6. Брить дополнительные регионы2 1-2 см в внутренней лицо правом передних конечностей (mediocubital район) и оба задних конечностей (mediotibial район) (рис. 1B).
  7. Место клейкие электроды ЭКГ на бритые регионах конечностей синхронно мониторинга сердечного ритма во время процедуры (рис. 1 c).
  8. Место животного в лежачем положении пролежни на Тепловая одеяло, с конечностей, протянутой с использованием хирургическая лента, присоединенные к таблице (рис. 1 c).
    1. Убедитесь, что уши являются согнута назад за спиной/головы кролика и на позиции, что меньше, чем его передние конечности, так как это помогает поддерживать правильное позиционирование грудной клетки животного на протяжении всей процедуры.
  9. Позвольте животным дышать спонтанно, в то время как управляющие кислород, маска для лица на протяжении всей процедуры (100%, 2-3 Л/мин).

Figure 1
Рисунок 1. Подготовка кролика IMI. (A) клип волос от грудной клетки; (B) клип волос от конечностей; (C) прикрепить электроды и положение кролика с ноги вытянутыми на термоодеялом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI технику в кролика

  1. Очистить и продезинфицировать кожу грудной клетки с раствором на основе хлоргексидина.
    1. Используйте асептические технику на протяжении всей процедуры, согласно текущей наилучшей практики.
    2. Когда это возможно и практически осуществимым, выполнять полностью стерильным процедуры, включая, но не ограничиваясь этим, использование стерильных материалов, таких как платья, перчатки, хирургические раны шторы, стерильные перевязочные материалы для таблицы, а также стерильные УЗИ крышка датчика и стерильные УЗИ гель. Это позволит сократить до минимума риск введения патогенные для животных, получение IMI и является стандартной практикой в клинических условиях (например, во время пункции сердца).
      Примечание: Рекомендуется всегда действовать в соответствии с местных и национальных положений применимых к местным учреждением исследований на животных и страны практики.
  2. Нанесите гель передачи УЗИ груди и/или датчика и с датчика шнур вокруг шеи экспериментатора, выполните проверку быстро окно сердца животного, который часто полезно для визуализации анатомии и планировать IMI.
  3. Поместите датчик вручную на 4th-6й межреберное пространство, 2-3 см от правой парастернальной линии с углом падения ~ 90 ° относительно правой стороне грудной стенки (рис. 2A).
  4. Настройте расположение датчика относительно межреберное пространство, а также его переднезаднем и dorsoventral угол, чтобы оптимизировать представление изменение короткой оси на уровне папиллярных мышц. Определите в этом представлении правого желудочка (RV), левого желудочка (LV), межжелудочковой перегородки (ИВС), задней стенки (PW), а также переднебоковой (AL) и задне (PM) папиллярных мышц (Рисунок 2Б).
    1. Имеют широкое поле зрения, значительно увеличивая глубину, используя соответствующий элемент управления в системе (например, кнопка, циферблат).
    2. Обратите особое внимание на получение симметричное изображение в этот вид, а также соответствующие дифференциация эндокарда и эпикардиальной контуров и, при необходимости, скорректировать путем оптимизации рисунков (например, прибыль).
  5. После получения оптимального эхокардиографические вид (рис. 2B), сохранить эту позицию в остальной части процедуры, в то время как второй оператор выполняет IMI (см. ниже).
    1. Удерживая датчик, Избегайте сокрытия знак ориентации датчика, который должен всегда лицом вперед, таким образом позволяя его выравнивания с иглой в последующих шагах (рисунок 2A, C).
  6. С 24-G иглой прилагается к 1 мл шприц место иглы близко к коже левой hemithorax симметричный зеркального отображения положение в отношении преобразователя. Затем вручную выравнивать иглой с Марк ориентации датчика на угол ~ 90° (рис. 2 c) и медленно вперед иглу через кожу и в грудной полости.
    Примечание: Чрезкожная иглы в этой позиции и ориентации облегчает визуализацию иглы в плоскость ультразвукового луча (Рисунок 2D, E), таким образом позволяя мониторинг в реальном времени и, при необходимости, корректировка Расположение иглы относительно целевого региона миокарда (Рисунок 2 G, H).
  7. С кончика в целевом расположении, медленно доставить injectate (до 0,25 мл в месте инъекции) в течение 10-30 s (Рисунок 2E), в то время как медленно и осторожно втягивания иглы во время инъекции для увеличения степени миокарда лечение.
    1. Использовать InI 10% (v/v) разводят в PBS для стандартизации техники и как трассировщик на месте во время приобретения компетентности, а также относительно подтверждения успешного нападения на всех четырех IMI сайты в миокарде грубой патологии и гистопатологии (см. Представитель результаты). Как только достигается компетентности, InI могут быть заменены подходящих коммерческих УЗИ контрастного вещества при желании.
      Примечание: Поставка 10% (v/v) InI, разбавленных в PBS с или без клетки в миокарде результаты Трансмуральное hyperechogenicity (то есть, эхо яркой внешний вид) на целевом сайте инъекции (Рисунок 2E, F). Даже от первого контакта иглы с epicardium часто наблюдаются переходных замедление или ускорение сердечного ритма, связанных с преждевременной желудочковых сокращений (например, изолированные, куплеты и тройни), а также во время или вскоре после IMI. Однако, не угрожающих жизни аритмий разрабатываются и острых неблагоприятных эффектов редко наблюдаются с использованием до 0,25 мл (1,25 х 106 клеток) injectate на месте инъекции IMI (см. Представитель результаты и обсуждение).
  8. Выполните тонкие изменения в угол падения иглы необходимо для выполнения инъекции 0,25 мл в каждую из четырех целевых IMI сайтов (три в левого желудочка свободных стен (LVFW) и один в ИВС).
  9. После завершения процедуры эхокардиографии руководствуясь IMI перкутанная контраст, оценивать сердечного ритма (например, через последовательный ЭКГ трассировки или 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ) и выполнять ультразвуковое сканирование серийный окно для проверки отсутствия осложнения, до тех пор, пока животное полностью оправился от наркоза и только затем передачи в комнате свет цикла.
    1. Здесь мы используем 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ для мониторинга воздействия IMI с InI на ритм сердца за 24 ч. Для этого мы сравнили группы 6 кроликов с нормального фенотипа (нормальная группа) и группа 6 кроликов, которые получили внутривенное доксорубицин (кардиотоксический кардиотоксичности препарата, обычно используется для лечения рака; Группа DOX) в дозе 2 мг/кг/неделю за 8 недель, а затем обеих когортах получил IMI с InI.

Figure 2
Рисунок 2 . Чрескожная контраст intramyocardial эхокардиография руководствуясь инъекций в кролика. (A) размещение датчика в правой hemithorax углом ~ 90 °. (B) представитель изображение парастернальной короткой оси зрения (PSSX) сердца на уровне папиллярных мышц в кролика. (C) выравнивание иглу под углом ~ 90 ° по отношению к Марк ориентации датчика. (D) расположение иглы на целевой сайт в представлении PSSX сердца (Обратите внимание, что иглы легко визуализируется в плоскость ультразвукового луча). (E и F) демонстрация hyperechogenicity на конечном сайте после инъекции intramyocardial с тушью (стрелок выделите Трансмуральное hyperechogenicity). (G) случайного расположения иглы в зале LV (стрелок выделите игольчатый вала). (H) репозиционирование иглы к стенке бесплатно LV (стрелок выделите игольчатый вала). РВ = правый желудочек; LV = левого желудочка; ИВС = межжелудочковой перегородки; PW = задняя стена; AL = переднебоковой папиллярных мышц; PM = задне папиллярных мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. пост IMI анализы

  1. Гистопатологические анализ образцов ткани сердца, от кроликов.
    1. Исправить ткани для 24 h в 10% формальдегида, следуют обезвоживания с увеличением концентрации этанола следующим образом:
      • 1 x 70% (60 мин)
      • 1 x в 95% метанола ethanol/5% (60 мин)
      • 1 x в 100% (60 мин)
      • 1 x в 100% (90 мин)
      • 1 x в 100% (120 мин)
      Примечание: Все выше инкубаций проводятся при комнатной температуре (RT). Затем замените дважды с 100% ксилола (1 h, RT) и наконец внедрить в парафин в два этапа (60 мин., 58 ° C)25.
    2. Выполните разделов ткани 4-5 мкм с микротом25. Смонтируйте разделы на слайдах.
    3. Выполняют окрашивание с применением окрасок гематоксилин эозином и Массон в trichrome методы25,,2627.
  2. В разделах ткани из пересаженных сердец выполняют иммуногистохимия обнаружить EGFP(+) ГЭС-293 клетки (например, с помощью метода авидин Биотин комплекс (ABC)), кратко:
    1. Де воск 4-5 микрон толщиной сердце секций в 100% ксилола (10 мин., на RT). Увлажняет ткань мыть с уменьшением растворы концентрации этанола (2 x в 100% (2 мин) 2 x в 95% (2 мин) 1 x 70% (2 min); 1 x в 50% (2 мин); 1 x на 30% (2 мин); 1 x ddH2O (2 мин)) на RT.
    2. Выполнять эндогенной пероксидазы ингибирование, охватывающих разделы с 100 µL 3% H2O2 разбавляют в метаноле (подготовленные с 5 мл 30% акций раствора H2O2, и добавление метанола до суммарный объем 50 мл) ( Инкубируйте 30 мин, RT), а затем вымыть путем погружения с трис-буфер солевой раствор (TBS; рН 7,6).
    3. Выполняют антигена разоблачения через Ферментативная обработка, покрывая разделы с 100 мкл 0,1% Проназа (подготовленных с 0,01 g Проназа, разводят в 10 мл TBS) (инкубировать 12 мин, RT), затем промыть TBS (5 мин., RT).
    4. Инкубировать в блокировании решение (нормальный козьего сыворотки на 10% в TBS) с использованием 100 мкл в слайд (30 мин., RT) и мыть с TBS (5 мин., RT).
    5. Проинкубируйте с курицей анти зеленый флуоресцентных белков (ГПУП) как первичное антитело (1: 500 в TBS) (1 час, 30 ° C) и мыть с TBS (5 мин., RT).
    6. Проинкубируйте с вторичное антитело биотинилированным коза анти курица IgG (1: 250 в TBS) (1 час, 30 ° C), а затем вымыть с TBS (5 мин., RT).
    7. Инкубировать авидин Биотин комплекс (20 мин., 30 ° C), а затем ярлык с помощью 3,30-Диаминобензидин tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 мин).
    8. Наконец обезвоживает промывкой в увеличении концентрации этанола (1 x на 30% (2 мин) 1 x в 50% (2 мин) 1 x 70% (2 min); 2 x в 95% (2 мин); 2 x в 100% (2 мин)) на RT, разделы изображение, используя метод гематоксилином эозином25, а затем смонтировать крышку слайды. Включать положительных, отрицательных, а также изотипа элементов управления.
      Примечание: Краткий протокол, описанные выше не предназначен для использования общего иммуногистохимия; Оптимизация для ткани интерес и условий является необходимым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI с InI:

Используя протокол описанных выше, и после того, как оптимальное расположение кончика иглы был подтвержден эхокардиографии и начало впрыска, Трансмуральное hyperechogenicity было отмечено во время доставки InI (10% v/v в PBS) (рис. 2е) , а также как вскоре после IMI к целевой области (Рисунок 2F). Когда IMI сразу же последовал эвтаназии и сердце удалены, месторождения InI были видны на внешний осмотр сердца (рис. 3A). Кроме того разделов ткани сердца, например, секции короткой оси на уровне папиллярных мышц (рис. 3B), выявило Трансмуральное месторождения InI краска на месте инъекции, продемонстрировав тем самым успешным и эффективной доставки injectate в миокарде, используя эту технику. Следует отметить hyperechogenicity Трансмуральное наблюдается в vivo во время IMI (Рисунок 2E, F), коррелирует с месторождения Трансмуральное InI в образцах ex vivo (Рисунок 3А, B). Это четко продемонстрировано, что InI имеет двойной свойства в параметре IMI: как агент контрастность УЗИ в естественных условиях , а также ex vivoin situ трассировщика. Оба эти свойства делают InI агент контраст очень универсальный и недорогой УЗИ, особенно для обучения во время приобретения компетентности в этой технике. Таким образом свойства эхогенная InI помогают контролировать IMI например, определить успешный IMI против случайного интра палата или впрыска перикард пространства и, при необходимости, учитывая изображений возможности реального времени УЗИ, чтобы сделать исправления иглы отслеживать в режиме реального времени (Рисунок 2 g, H). С другой стороны в situ трассировки возможности InI являются значения для обнаружения injectate в ex vivo образцы целевой миокарда.

Чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI с InI и EGFP(+) ГЭС-293 клетки:

До IMI успешное transfection клеток EGFP(+) ГЭС-293 был подтвержден микроскопии флуоресцирования в vitro условиях культуры (рис. 3 c). Успешной доставке EGFP(+) ГЭС-293 клеток в миокарде была продемонстрирована через иммуногистохимия анализ разделов ткани сердца, где наблюдались InI депозитов. Таким образом, с помощью метода авидин Биотин комплекс (см. шаг 4.2), обильные EGFP(+) ГЭС-293 клетки были определены в миокарде, перемежаются с InI отложений (рис. 3D). Месторождения InI по-прежнему наблюдались 24 ч после IMI в образцах ткани миокарда от кроликов, которые получили InI в сочетании с EGFP(+) ГЭС-293 клетки (Рисунок 3E), либо InI только (Рисунок 3F). Следует отметить в этот момент времени, с преобладающим нейтрофильных инфильтрата, в пробах из животных, получение EGFP(+) ГЭС-293 клетки (Рисунок 3E), таким образом предлагая острый сотовой неприятие было отмечено острой воспалительной реакции. С другой стороны макрофаги наблюдались в животных, получение InI только (Рисунок 3F).

Figure 3
Рисунок 3 . На месте макроскопические и гистопатологические оценки и отслеживания injectate. (A) демонстрация присутствие injectate на внешний осмотр подакцизным сердца, после IMI с InI (стрелок выделите сайтов инъекции). (B) демонстрация Трансмуральное распределения injectate, после IMI с InI в поперечном сечении сердца на уровне папиллярных мышц (синие стрелки подчеркнуть Трансмуральное InI депозит; белая стрелка подчеркивается видимый депозит InI в ИВС). (C) аутофлюоресценция в пробирке EGFP(+) ГЭС-293 клеток с помощью микроскопии флуоресцирования. (FD) Гистопатологические анализ вводят сайтов. EGFP(+) клетки заметно перемежаются с InI депозитов в миокарде в 0 ч (D), и 24 h (E) после IMI (синие стрелки выделите ячейки EGFP(+); красные стрелки подчеркнуть присутствие нейтрофилов). Месторождения InI перемежаются в миокарде на 24 ч (F) после IMI с InI только (синие стрелки подчеркнуть присутствие макрофагов). РВ = правый желудочек; LV = левого желудочка; ИВС = межжелудочковой перегородки; IMI = Intramyocardial инъекции; InI = чернил Индии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Совершив более 60 перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI процедуры на сегодняшний день, мы считаем, что с тщательным вниманием к деталям и хорошо животных обработки и ухода, процедура, как правило, хорошо переносится, и острые осложнения крайне редки и обычно незначительны. В целом в животных, которые проходят IMI, наиболее частое наблюдение во время и вскоре после того, как процедура является временным ускорение или замедление сердечного ритма, связанные с изолированных преждевременной желудочковых комплексов (ПВХ) (Рисунок 4A). Таким образом, 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ контроля животных, которые получили InI только через IMI, показало, что наиболее часто обнаружены аритмии (общее количество эпизодов в течение 24 ч) изолированные ПВХ, даже несмотря на то, что большее количество эпизодов были обнаружены в животных, которые были ранее лечение с DOX 8 недель (Рисунок 5A). ПВХ в куплеты и тройни, как представляется, быть менее частыми (рис. 4б, C и Рисунок 5B, C), даже несмотря на то, что тройни значительно меньше частые в DOX-лечение чем в необработанной обычных кроликов (рис. 5 c). С другой стороны,-поддерживается желудочковая тахикардия (НСВТ) чаще наблюдался в нормальных животных (Рисунок 4 d и Рисунок 5 d). Значительно в то время как Средняя ЧСС не отличалось между DOX и обычными группами после получения IMI с InI только (Рисунок 5E), стандартное отклонение нормального интервала R-R (SDNN), был значительно сокращен (< 100 мс) в группу (DOX Рисунок 5F). SDNN является не линейные измерения состояния здоровья сердца, и поэтому этот результат означает, что группе DOX глобальные изменения в свои сердца физиологического статуса.

Figure 4
Рисунок 4. Желудочковых аритмий, наблюдаемых в течение 24 h холтеровское мониторирование в кроликов, которые получили IMI с InI. Изображения, показаны скриншоты получены холтеровское мониторирование ЭКГ тахограмм отображается на экране во время автономный анализ и иллюстрируют типичные примеры наиболее распространенных видов аритмий, нашли в течение 24 ч мониторинга. (A) изолированные ПВХ. (B) ПВХ в куплеты. (C) ПВХ в тройни. (D) НСВТ. ПВХ = преждевременной желудочковых сокращений; НСВТ =-поддерживается желудочковая тахикардия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Аритмических явлений, обнаруживаемых 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ контроль после IMI с InI в кроликов. Общее количество изолированные ПВХ (A), ПВХ в куплеты (B), ПВХ в триплеты, (C) и (D), НСВТ в необработанной кроликов (нормальный + IMI) против доксорубицин лечение (3 мг/кг/неделя 6 недель) кроликов (DOX + IMI), после IMI с InI. Значит сердечного ритма (E) и (F), SDNN в кроликов от нормального + IMI и DOX + IMI групп после IMI с InI. Данные выражаются как среднее ± SEM. * указывает p < 0,05; и # указывает p < 0.01, сравнивая нормальный + IMI против DOX + IMI групп по t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основной целью было разработать минимально инвазивные техники, которые могут быть использованы для доставки стволовых клеток в миокарде кроликов (большого размера доклинические животных модель)17,18, наслаждаясь преимуществами использования относительно недорогой системы легко доступны во многих клинических и научных центрах. Здесь мы показывают, что, используя систему клинических эхокардиография, и помогали InI, широко доступных агента, на месте возможности трассировки и эхогенная свойствами, успешно перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI является очень эффективным в доставке injectate в целевых регионах кролик сердца. Насколько нам известно, это первое описание перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI и ячейки доставки в крупных животных модели как кролик18,19. Хотя InI был использован ранее в исследованиях в месте локализации injectate в тканях7,28, это наши знания, первое описание двойной свойств этого агента как в естественных условиях УЗИ контрастное вещество и как на месте трассирующими по injectate ex vivo. Действительно сложные смеси контрастного вещества и в situ трассировки веществ ранее были описаны в мышиных исследований, направленных на достижение injectates в миокарде29. Однако учитывая свойства эхогенная InI и его возможности в situ трассировки, это вещество может быть очень полезным во время приобретения компетенции пока проходят подготовку с этой техникой.

Подтверждение доставки injectate, содержащие оба InI как EGFP(+) ГЭС-293 клетки с помощью иммуногистохимия демонстрирует применимость этой техники для доклинических исследований, направленных на лечение стволовыми клетками. IMI InI в сочетании с EGFP(+) ГЭС-293 привело к острой воспалительной реакции с преобладающим нейтрофильных инфильтрата, предложив ответ острого клеточного отторжения (в течение 24 ч) культивированная клетки. Этот ответ, вероятно, не удивительно в иммунокомпетентных животного. С другой стороны IMI с InI только также вызвало острой воспалительной реакции (в течение 24 ч) в обработанных миокарда ткани, который exhibited преобладающим макрофагов инфильтрата. Это соответствует наблюдений острого воспаления описано в предыдущих исследованиях после IMI под видом в открытой груди процедуры4,30,,3132,33. Острое воспаление также наблюдается после инъекции физиологическим или PBS решений в миокарде34,35и даже в икроножных мышцах крыса36, и поэтому этот ответ был отнести травмы прямой ткани, а не injectate сама по себе. 30 , 31 , 32 , 34 , 35 , 36 в самом деле, международное общество для сердечно-сосудистых исследований трансляционного признает общие возникновения воспаления в параметре IMI, но нет консенсуса о том, следует ли или не меры по сокращению этот процесс во Пери процедурные время являются полезным (например, внутривенное (и.в.) кортикостероидов)37. Даже несмотря на то, что может также объясняться воспаления в этом исследовании прямой травмы тканей, результаты также показывают, что InI как инородное тело должны также играть роль в этом процессе, представила ряд макрофагов представляется phagocytizing InI (Рисунок 3F). Тщательный анализ функциональных последствий этого острого воспаления среднего IMI внутри сердца, или ли это можно было бы устранить посредством отправления профилактические препараты, такие как кортикостероиды выходит за рамки этой рукописи. Тем не менее, чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI для четырех целевых регионах миокарда, с объемом от injectate до 0,25 мл (1,25 х 106 клеток) в IMI сайт, очень хорошо переносится в кролика.

С более чем 60 процедур до настоящего времени, и после того, как была достигнута компетентность вторичной процедуре смертность была очень низкой. Например нет смерти произошли в двух когортных группах, описанные в шаге 3.9 (обычный и DOX группы) после IMI. Действительно на сегодняшний день после 67 IMI процедур в рамках программы текущих исследований, мы были только две смерти, непосредственно относящиеся к процедуре (2,9% смертности). В одном из них, наличие hemopericardium была продемонстрирована в посмертное обследование, в то время как другие разработали клинические признаки неврологических, в соответствии с острой церебральной ишемии, вторичные cardioembolic события, требующие гуманные конечной точки. Этот коэффициент смертности (2,9%) значительно ниже, чем сообщенные Lu et al. (11%)8 и му et al. (27%)38, в кроликов, которые получили IMI под прямой видимости в процедуре открытой груди. Таким образом мы считаем процедуры, описанные в рамках нынешнего исследования, чтобы быть безопасным, и мы используем этот метод в текущих исследований для оценки на основе стволовых клеток терапии в модели кролика AICM с многообещающие результаты39,40.

Есть несколько критических точек для успешного перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI. Во-первых убедитесь, что представление парастернальной короткой оси на уровне папиллярных мышц получается с четкого эндокарда и эпикардиальной контуров. Далее Убедитесь, что кончик иглы находится в поле зрения во все времена после этого вступления грудной полости и миокарде для предотвращения случайного доставки в перикард пространства или LV камеры. Затем убедитесь свести к минимуму количество проходов через грудной полости и в и перикард, миокард, поскольку это может увеличить вероятность возникновения местных травмы (например, терзания) для этих структур и связанного с этим риска hemopericardium. Для этого сохраняя при этом игла в грудной полости (и для некоторых целевых сайтов в той же точке входа в висцеральных перикарда (например, боковые стенки)), тщательно выполнять тонкие изменения в угол падения иглы. Наконец всегда используйте иглу, которая имеет четкий и простой проход через кожу в грудной полости, таким образом избегая тупой иглой скосы попадание миокарда и наносят значительный ущерб.

Процедуры, описанные здесь, не только позволяет надежная и успешная доставка injectate в несколько целевых объектов в миокарде, но она также позволяет коррекции траектории иглы в режиме реального времени, таким образом предотвращая случайное внутрикамерной доставки ( Рисунок 2 g, H). Хотя закрыт груди IMI процедуры были описаны ранее в мышей, существует несколько ограничений, присущих этой небольшой модели на животных. Эти ограничения включают в себя количество целевых регионов миокарда поддаются терапии и низкий объем/количество клеток, которые могут быть введены на целевой сайт29,41. Кроме того точная доставка injectate часто вызывает озабоченность, с успех ставке около 60-70%42, и поэтому менее широко доступны высокой частоты ультразвуковых систем используется обычно требуется29,41, 42. Эти системы оснащены линейного массива преобразователей, которые также имеют недостатки, присущие изображений (например, реверберации, частый артефакт)14. Еще одним ограничением мелких грызунов моделей, таких как мыши и крысы, является их внутренние различия в Ca+ 2 транспортной системы и клеточной электрофизиологии, который отличается от людей и большого размера животных моделей, таких как собаки, свиньи и кроликов 15,16,43. Все эти ограничения часто создают трудности в переводе выводов в этих моделях в клинику без предварительного подтверждения в большой модели на животных.

Тщательный мониторинг животного в период пери процедурные является обязательным согласно современным рекомендациям забота о лабораторных животных. Как показано здесь, это может быть сделано путем последовательного эхокардиография окно сканирования и ЭКГ Прориси, по крайней мере до тех пор, пока животное не спит от анестезии. Острого воздействия IMI на ритм сердца также может контролироваться 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ и является нашей стандартной практикой. Следует отметить, наиболее часто аритмий были изолированы из ПВХ, которые являются относительно доброкачественными, в природе, и которые были более распространены в животных, которые были обработаны с доксорубицином до IMI с InI (см. Рисунок 4A и Рисунок 5A). Другие аритмии, которые были относительно менее часто включают в себя: ПВХ в куплеты; ПВХ в триплеты; а также НСВТ (см. Рисунок 4BD иD Рисунок 5B). Однако не угрожая аритмий жизни таких устойчивых желудочковая тахикардия были замечены. Следует отметить мы также обнаружили, что некоторые кардиотоксический проявления в группе DOX могут быть обнаружены, холтеровское мониторирование ЭКГ, мониторинг, использование переменных времени-частотное вариабельности сердечного ритма (ВСР), например, SDNN. Таким образом в группе DOX, по сравнению с нормальной группе наблюдалось снижение SDNN (Рисунок 5E, F), линейные измерения состояния здоровья сердца. Это первый доклад снижение вариабельности сердечного ритма, как продемонстрировано снижение SDNN, в контексте кролика моделью AICM, которая согласуется с замечанием, что сокращение SDNN мощный независимым предиктором сердечной смерти у пациентов с HFrEF44 ,45,46. Изменения в SDNN в группе DOX вероятно не связаны с IMI процедуры Тем не менее требуется подтверждение этих выводов в кроликов, доксорубицин, а также обычных животных, которые не получают IMI. Ли снижение SDNN в HFrEF также может быть улучшена и поэтому используется как мера суррогатной преимущества терапии на основе стволовых клеток, остается быть оценены, и будет в центре внимания будущих исследований.

Были изучены несколько маршрутов доставки клеток в сердце, включая внутривенно, интракоронарой и intramyocardial доставки; Однако intramyocardial маршрут, используемый здесь, последовательно показал наибольший уровень клеток удержание ставок1,2,3,4,5,37. Мы сделали не оценить коэффициент удержания клеток в исследованиях, представленных здесь, как используемая методология не является надежной и достаточно конкретными, чтобы quantitate этот в естественных условиях или ex vivo, который является ограничение этого исследования. Вместо этого мы использовали EGFP(+) ГЭС-293 клетки фенотипические характеристики которого позволило нам легко различать присутствие этих клеток в миокарде, показывая тем самым, успешно intramyocardial доставки. Однако основной целью было разработать минимально инвазивной техники, которой мы могли бы выполнять IMI и клеток доставки в миокарде большого размера, доклинические модель не ишемическая кардиомиопатия. Как показано на рисунке 2 и на рисунке 3, это было сделано для в первый раз, чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI. Дальнейшие исследования необходимы оценить коэффициент удержания клеток, а также любых потенциальных благотворное воздействие стволовых клеток доставлены в миокарде, используя процедуру, описанную ниже; Эти исследования ведутся в настоящее время. Мы недавно общались многообещающие результаты в отношении функциональных эффектов39,40.

По сравнению с IMI в процедуре открытой груди, чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI в большой доклинических модели как описано в этом исследовании, значительно менее инвазивные, в природе с быстрого восстановления животного после процедуры и, как упомянутых выше, он также имеет ниже смертности показатель8,-38. Другой подход к IMI находится на основе катетер IMI, который также был протестирован в доклинических моделей и несколько небольших клинических исследований (для обзора, см Шэн и др.) 47. с этим подходом, катетер расширенный в полость LV и затем размещены на целевых объектах в пределах эндокарда. Эти целевые сайты являются либо определены до процедуры, например, с помощью контраста магнитно-резонансная томография сердца (CMR)48, или во время процедуры, например, путем сопоставления электромеханические эндокарда (EEM), чтобы четко дифференцировать жизнеспособного миокарда до инъекции49. Этот последний подход является менее инвазивным, по сравнению с открыть сундук IMI под видом, который является явным преимуществом. Кроме того поскольку ИХД в организме человека имеет неоднородное распределение, ВЕМ помогает направлять терапии специально для жизнеспособных сайты миокарда, который имеет особенно важное значение в параметре ИБС. Однако основным недостатком является индукция желудочковых аритмий, которые являются общей чертой всех IMI подходов. Другие недостатки включают длительное время процедурных, предоставление ВЕМ является весьма требовательных технику, которая требует обширной подготовки кадров и связанный с этим риск сердечных перфорации. В противоположность этому перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI как описано в этом исследовании, технически требуется меньше чем на основе катетер IMI, и, после достижения компетентности, она может быть выполнена безопасно в течение 25 мин после анестезии. Аналогично поскольку лишь короткий часть игла продвигается в миокарде, существует более низкий риск сердечных перфорации, хотя сердца рана все еще возможно.

В заключение, перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI метод, описанный в этом исследовании в большие животные модели, такие как кролик16,43, является безопасным, хорошо переносится и эффективным в предоставлении injectate в сердце. Таким образом, это является перспективной стратегией для доклинических гипотеза тестирования эффектов сердечных регенеративной терапии в не ишемическая кардиомиопатия (например, AICM), включая, но не ограничиваясь, основанного на стволовых клеток лечение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Авторы благодарят Шейла Monfort, бренда Мартинес, Карлос Мико, Альберто Муньос и Мануэль Молина за отличную поддержку, оказанную в ходе сбора данных и Карлос Буэно для обеспечения EGFP(+) ГЭС-293 клетки. Эта работа была поддержана частично: Фонд Séneca, научно-де-Agencia y Tecnología, регион-де-Мурсия, Испания (JT) (номер гранта: 11935/PI/09); Красный-де-Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Редес в Эль, VI PN де I + D + I 2008-2011 годы (Грант нет. RD12/0019/0001) (JMM), совместно финансируемых с структурного финансирования Европейского союза (ФЕДЕР) (JMM); и университет Рединг, Соединенное Королевство (AG, GB) (Центральный финансирование). Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HD11 XE Ultrasound System Philips 10670267 Echocardiography system.
S12-4 Philips B01YgG 4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) Parket laboratories Inc N 01-08
Vasovet 24G Braun REF 381212  over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe Braun 9161406V
Imalgene (Ketamine) Merial RN 9767 Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine) Esteve CN 570686.3 Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1 Faber-Castel 16 33 99 India (China) Ink
Holter Syneflash Ela medical SF0003044S 24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor® Ambu (NUMED) VLC-00-S Holter ECG electrodes.
Microtome Leica Biosystems RM2155
Microscope Olimpus CO11
ABC Vector Elite Vector Laboratories PK-6200 Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody Invitrogen A10262 Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody Vector Laboratories BA-9010 Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) DAKO (Agilent) S3000
Fluorescence Microscope Carl Zeiss
MicroImaging
Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG Elamedical Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  Fisher Scientific 11965084
10% fetal calf serum (FCS) Fisher Scientific 11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific 25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Fisher Scientific 31985070
Hygromycin B Calbiochem (MERCK) 400051
Xylene (histological) Fisher Scientific X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) Sigma H1009
Pronase Fisher Scientific 53-702-250KU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics