Visualisera intracellulära SNARA människohandel genom fluorescens livstid Imaging mikroskopi

Immunology and Infection
 

Summary

Det här protokollet beskriver en ny metod som möjliggör kvantitativa visualisering av komplexa bildandet av SNARE proteiner, baserat på Förster resonans energiöverföring och fluorescens livstid imaging mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Verboogen, D. R., Baranov, M. V., ter Beest, M., van den Bogaart, G. Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (130), e56745, doi:10.3791/56745 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lösliga N- ethylmaleimide känslig fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARA) proteiner är nyckel för membran människohandel, som de katalyserar membran fusion inom eukaryota celler. Familjen SNARA protein består av cirka 36 olika medlemmar. Specifika intracellulära transportvägar är katalyseras av specifika uppsättningar av 3 eller 4 SNARE proteiner som därmed bidrar till specificitet och trohet för membran människohandel. Dock studera funktionen exakt SNARE proteiner tekniskt utmanande, eftersom snaror är mycket rikligt och funktionellt överflödig, med de flesta snaror att ha flera och överlappande funktioner. I detta protokoll beskrivs en ny metod för visualisering av SNARA komplexa bildande i levande celler. Denna metod är baserad på uttrycka SNARE proteiner C-obotligt smält till fluorescerande proteiner och mäta deras interaktion av Förster resonans energi överföring (bandet) anställa fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM). Genom att montera fluorescens livstid histogram med en flerkomponents decay modell, tillåter bandet-FLIM (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen SNARA komplexa bildandet på olika blåsor. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt för att visualisera SNARA komplexa bildande vid plasmamembranet och endosomal fack i däggdjursceller linjer och primära immunceller, och lätt kan förlängas för att studera SNARA funktioner på andra organeller i djur, växt och svampceller.

Introduction

Membranet människohandel är en central del av eukaryota celler, där membranet blåsor knoppas av från en donator organell och sedan flytta till och säkring med en target organell1,2. Förutom mitokondrierna, är alla dessa membran fusion steg katalyseras av medlemmar av SNARA protein familj1,2. Familjen SNARA protein består av cirka 36 medlemmar i däggdjursceller och ca 20 medlemmar i jäst2. SNARE proteiner innehåller en eller två ~ 52 rester-lång, inbyggt ostrukturerade regioner, kallade SNARA-motiv. SNARE proteiner är ofta bundna till membran med en C-terminal transmembrana helix1,2. Snaror kan kategoriseras utifrån de centrala restsubstanser som de bidrar till den komplexa SNARAN till arginin (R) och glutamin (Q) snaror1,2. Membranet fusion drivs av samspelet mellan 3 eller 4 cognate snaror som tillsammans bidrar 4 SNARA-motiv och är fördelade över både givare och acceptor membran1,2. En SNARE-komplexet består av en R-SNARA motiv och tre Q-SNARA motiv (kallas Qa, Qb och Qc). Komplexa bildande startar på N-termini av SNARA-motiven, bildar en så kallad trans-SNARA-komplex, och fortsätter mot C-termini, bildar en tät α-spiralformade dubbeltvinnade bunt kallas en cis-SNARA-komplex. Komplexa bildandet av ens en enda SNARA komplexa drar givare och acceptor membran tillsammans och övervinner energibarriären för membran fusion3.

Tilldela särskilda transportvägar inom celler distinkta SNARA komplex ofta tekniskt utmanande. Även om snaror bidrar klart till specificiteten av membran som människohandel, de är promiskuösa, funktionellt överflödig, och deras funktioner överlappar1,2. På grund av detta leder störning experiment inriktning snaror, som av genen knockout, RNA-interferens, införandet av blockering antikroppar eller med lösliga SNARA fragment egenskap av dominerande negativ, ofta inte till tydliga fenotyper som andra Snaror kompensera2,4. Dessutom är det svårt att skilja specifika membran fusion steg från uppströms människohandel händelser, eftersom snaror kan vara inblandade i flera transport rutter2. Lokaliseringsutredningar av snaror av mikroskopi metoder, använda immunolabeling eller genetisk fusion fluorescerande reporter proteiner, lida av problem som: (i) snaror hitta till flera organeller som de förmedlar ofta flera människohandel steg, och (ii) deras lokaliseringar menar inte automatiskt de funktionellt bedriver SNARA komplexa bildande. Slutligen, SNARA komplex kan identifieras med hjälp av immunoprecipitation experiment med en av snaror som bete och andra snaror som mål, men detta tillåter inte överlåtelse av dessa komplex till särskilda organeller eller handelsvägar. Således, för närvarande finns det inga alternativ teknik för att visualisera SNARA komplex med organellar upplösning. Immunofluorescens är inte kunna bevisa SNARA interaktioner men kan visa endast av närvaro eller frånvaro av samtidig lokalisering, medan immunoprecipitation endast kan visa SNARA interaktioner i hela cellen befolkningen men inte tilldela organeller där dessa interaktioner förekomma.

För att övervinna dessa begränsningar, har en ny metod som möjliggör kvantitativa visualisering av SNARA komplex inom levande celler med organellar upplösning nyligen utvecklats av Verboogen et al. 5 denna metod är baserad på uttrycket av par snaror med spektralt skiftade fluorescerande proteiner smält C-obotligt till sin transmembrana spiraler. Efter slutförandet av membran fusion och bildandet av en cis-SNÄRJA komplexa, dessa fluorophores på C-termini av de transmembrana spiraler är omedelbart kontrasteras till varandra. Fluorophores är då väl inom Förster avståndet (vanligtvis < 5 nm), vilket resulterar i bandet från grön-skiftat givare fluorophore till röd-skiftat acceptor fluorophore5,6. FRET resultat i snabbkylning av givare fluorophore och ökade utsläpp av acceptor fluorophore som kan mätas från nyckeltalen av givare och acceptor utsläpp (proportionerlig bandet). Dock proportionerlig bandet mellan två olika molekyler är utmanande, på grund av fluorescens överhörning och olika nivåer av givare och acceptor snaror på olika organeller och bland celler7,8. BANDET kan också mätas från fluorescens livstid, vilket är tiden mellan excitation och utsläpp av en foton. Om givaren fluorophore kan släppa sin energi av bandet, denna konkurrerande processen resultatet i en skenbar förkortning av fluorescens livstid. Detta kan mätas genom FLIM7,8. Livstid bandet är mycket mer robust än proportionerlig bandet för att mäta interaktionen mellan två olika molekyler, som fluorescens livstid är en inneboende egenskap hos en fluorophore och är okänslig för dess koncentration. Dessutom är bandet tillnärmning kvantitativa, eftersom effektiviteten i bandet är omvänt proportionell mot avståndet mellan den givaren och acceptor fluorophores (i huvudsak en step-funktionen) sjätte makt. Därför, genom att montera fluorescens livstid histogrammen inspelad av FLIM med en dubbel-komponent decay modell, bandet-FLIM möjliggör (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen SNARA molekyler bedriver SNARA komplexa bildande5.

Nyligen användes denna bandet-FLIM metod av Verboogen et al. att visualisera SNARA komplexa bildande i primära dendritiska celler i immunsystemet5. Det visades att dendritiska celler vid möter en patogena stimulans, omdirigera sina membran handel åtföljs av en ökad komplexbildande av de R-SNARA vesikler-associerade membranprotein (VAMP) 3 med den Qa-SNARA syntaxin 4 specifikt på den plasmamembranet. Detta ökade SNARA komplexa bildande krävs sannolikt att möta den ökade sekretoriska kapaciteten för utsöndringen av inflammatoriska cytokiner såsom interleukin-65. Det här protokollet beskriver de experimentella steg som behövs för förvärvet av bandet-FLIM data för visualisering och (semi-) kvantitativ mätning av SNARA komplex.Det förklaras hur passar hela-cell fluorescens livstid histogram med mono - och bi-decay exponentialfunktioner, vilket resulterar i skenbara fluorescens livstid som en kvantitativ uppskattning att SNARA interaktioner. I detta protokoll, den utbredda HeLa cellinje används som ett exempel, men metoden kan lätt utvidgas studera SNARA komplex i andra eukaryota celler.

Protocol

1. beredning av proverna som mikroskopet

  1. Uttryck för Qa-SNARA syntaxin 4 smält till mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; givare fluorophore) och den R-SNARA VAMP3 smält till mCherry (VAMP3-mCherry)
    Obs: Andra snaror med fluorescerande proteiner smält till deras C-terminal transmembrana spiraler kan också användas. I stället för mCitrine-mCherry kan andra givare-acceptor par spektralt separerade fluorophores också användas (t.ex., GFP-YFP).
    1. Växer HeLa cells och dela 900.000 HeLa cells över tre 35 mm diameter glas botten rätter passar för mikroskopi.
      Obs: I princip detta protokoll kan anpassas för andra typer av eukaryota celler och mikroskopi rätter.
      1. Underhåll HeLa cellkulturer i T75 kolvar med 10 mL hög glukos Dulbecco's modifierade örnens medium (DMEM), kompletterad med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 1% antibiotika-antimycotic (som innehåller amfotericin B, penicillin och streptomycin) vid 37 ° C och 5% CO 2 i en cell kultur inkubator.
      2. Fylla på medellång två gånger i veckan och dela celler 1:10 en gång i veckan eller när cellerna når 85-90% confluency till nya T75 kolvar (500 000 celler/kolv, i genomsnitt).
      3. Ta bort DMEM och tvätta de HeLa enskiktslager två gånger med 8 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för 3 min.
      4. Ta bort PBS och tillsätt 2 mL PBS med 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
      5. Inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C och 5% CO2 i cell kultur inkubator och därefter försiktigt skaka kolven för att separera HeLa celler från botten av kolven.
      6. Spola cellerna ut med 10 mL medium, överför till en 15 mL tub och ta bort en 10 µL alikvot för inventering.
      7. Späd alikvoten 1:1 med 0,4% trypan blå fläck och räkna cellerna med en Bürker hemocytometer9.
        Obs: Räkna två 4 x 4 rutor och flera cell nummer av 10.000 för antalet celler/mL.
      8. Efter cell räkna, ta 900.000 celler från 15 mL röret, dela upp dem över 3 glas botten rätter (se steg 1.1.1), och förbereda för transfection.
    2. Transfect cellerna av elektroporation10 (se Tabell för material) med syntaxin 4-mCitrine konstruktion (givare endast prov #1), syntaxin 4-mCitrine tillsammans med VAMP3-mCherry (prov nr 2) och syntaxin 3 smält till både mCitrine och mCherry () Prov nr 3).
      Obs: Andra cell transfection metoder kan också använda11. Den tandem construct i prov #3 är en positiv kontroll för att uppskatta den kortaste livslängden expectable (dvs.maximal expectable bandet).
  2. Kultur cellerna med övernattning i hög glukos DMEM medföljer 10% FCS och 1% antibiotika-antimycotic vid 37 ° C med 5% CO2 i en cell kultur inkubator.
  3. Aspirera DMEM och tvätta cellerna en gång med levande cell imaging medium (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES pH = 7.4, mOsm = 300; se Tabell för material) i 2 min och därefter placera cellerna i färska imaging medium.

2. registrering av FLIM Data

  1. Plats prov #2 i tidsplanet FLIM confocal Mikroskop med en pulsad exciteringskälla för givare fluorophore (dvs., mCitrine) och tid-lösas datainsamling. Hålla cellerna vid 37 ° C med en uppvärmd scen.
    Obs: Mikroskopet confocal används i detta protokoll är utrustad med ett 63 X 1,20 NA vatten nedsänkning mål, en pulserande vitt ljus laser (80 MHz pulserande, < 100 ps pulslängd), en photon multiplikator tube (PMT) och en Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) system (se Tabell av material för specifika inställningar används). Andra FLIM Mikroskop kan också användas (t.ex., singel-photon avalanche dioder (SPAD) i stället för PMTs, single-våglängd pulsade lasrar i stället för en vitt ljus pulsade lasrar).
  2. Markera en cell med synliga uttryck av mCitrine och mCherry-märkt SNARE proteiner och spela in en confocal bild av 256 × 256 pixlar med samtidiga excitation av båda fluorophores före varje FLIM mätning. En pixel steg ca 2 gånger mindre än diffraktion begränsad rumsliga upplösningen i mikroskopet (~ 200 nm) kan användas. För mCitrine, excitera på 516 nm och samla utsläpp från 521-565 nm. för mCherry, excitera på 610 nm och samla utsläpp från 613-668 nm.
    Obs: Använd inte ställning bildplanen för nära botten av skålen (inom ~ 2 µm avstånd), eftersom detta kommer att resultera i en reflektion topp i fluorescens livstid histogrammet. Samtidiga excitation av den givaren och acceptor fluorophores är att föredra, eftersom detta tillåter för att övervinna det potentiella problemet prov rörlighet. Sekventiell magnetisering kan dock användas också.
  3. Post en FLIM bilden genom att klicka på Kör FLIM med FLIM bilden som spelas in med samma mått och rumslig upplösning som confocal bilden registreras vid steg 2.2. Spela in bild minst 50.000 fotonerna för hela-cell FLIM analys, eller åtminstone 400 fotoner/pixel. Endast excitera mCitrine givare fluorophore och inte mCherry acceptor fluorophore, och därmed väcka på 516 nm och samla utsläpp från 521-565 nm.
  4. Upprepa steg 2.1-2.3 för flera celler och andra prov #1 (endast givare) och prov nr 3 (den mCitrine-mCherry tandem bygga).
  5. Spela in ett instrument svar funktion (IRF). Finjustera monokromator utsläpp detektorns till magnetiseringen våglängden (t.ex., spela in utsläpp från 510-550 nm) och sedan spela in en FLIM-bild med den tillbaka spridning från ett rent glas täckglas genom att klicka på knappen Kör FLIM. Använda samma excitation våglängd (516 nm) och laser power som används för inspelning celldata steg 2.1-2.4.
    Obs: Om flera toppar syns i IRF eller om de utsläpp monochromators inte kan stämmas, IRF kan också mätas med en lösning av fluorescerande färgämne med ultrasnabb livstid, exempelvis av fluorescens kylning av en organiskt färgämne i en mättad vattenlösning lösning av kaliumjodid. Det är dessutom inte måste du registrera en IRF, eftersom decay slutta av fluorescens histogram kan även monteras utan deconvolution av IRF. Dock en IRF gör det möjligt för att korrigera för timing egenskaper hos fotonen detektorn används och gör därmed anfall av livstid histogrammen mer exakt.

3.Konvertering av Photon inspelningarna till FLIM bilder

  1. Hämta och installera den PT32ICS konvertering programvara5.
    Obs: Livstid data kan också analyseras av andra program, inklusive programvara från flera Mikroskop leverantörer.
  2. Konfigurera programvaran PT32ICS.
    1. Ange storlek för 256 × 256 pixlar bildstorlek via Inställningar | Storlek.
    2. Ställ in kanal 2 via Inställningar | Storlek.
      Obs: Kanalen av mCitrine utsläpp är uteslutande beroende på konfigurationen av mikroskopet. En fel kanal kommer att resultera i en FLIM bild med inga fotoner (dvssvart bild) och som ett resultat av en tom 'LifetimeTable.txt'-fil. Korrekt kanal kan identifieras genom trial-and-error.
    3. Ställ in utgång till ImageJ (xyz) (eller TRI2 (xyt)) för att generera FLIM bilder (steg 3,4).
  3. Tryck konvertera och läsa in en eller flera photon spår (.pt3 filer). För att välja flera photon spår, håll Ctrl -tangenten nedtryckt.
    Obs: Den nya 64 bit .ptu formatet kan även konverteras.
  4. Säkerställa att PT32ICS programvaran genererar följande filer i samma mapp som där pt3 filer sparas: en photon stack per .pt3 photon spår i bilden flödescytometri standardformat (.ics), en bitmappsfil per .pt3 photon trace (.bmp), en textfil per konvertering (_Report.txt) som innehåller information om fotonen statistiken (dvs, det totala antalet fotoner i varje .pt3 photon trace, tidsupplösningen av detektor), och en andra textfil per konvertering (_LifetimeTable.txt) som innehåller totalen fluorescens livstid histogram i tabbavgränsat format för varje .pt3 photon trace.
    Obs: Den .ics-filen kan användas för enstaka pixel passande för att generera FLIM bilder, till exempel med TRI2 programvara12,13 eller SLIM kurvan passande bibliotek i FIJI ImageJ14,15. Denna fil kan också användas för Phasor analys16, till exempel med tiden Gated Phasor plugin för FIJI från Spechron. Bitmappsfilen innehåller ingen livstid information. Den andra textfilen används för hela-cell FLIM analys i steg 4.

4. montering av fluorescens livstid histogram för hela-cell FLIM analys

Obs: Detta steg (deconvoluted montering av IRF) kräver programvara som kan deconvoluted montering. Passande sluttningarna av fluorescens histogrammen utan deconvolution av IRF kan göras med andra program också.

  1. Öppna data analys programmet kan montering med deconvolution (Tabell av material) och importera textfilen som innehåller histogrammet för varje photon trace (_LifetimeTable.txt) via fil | Importera | Enstaka ASCII.
  2. Omorganisera tabellen så att IRF är i den andra kolumnen i tabellen (med Kopiera och Klistra in). Placera IRF i den andra kolumnen B bredvid tidsvärden i tabellens första kolumn A.
  3. Bestämma kvaliteten på inspelade photon spår genom att välja alla kolumner genom att trycka på Ctrl + A och välja tomt | Multi-panel | 9 panelen. Inte analysera photon spår med en hög reflektion topp (figur 4F).
  4. Markera alla kolumner som innehåller kvalitetskontrollerade livstid histogram som kommer monteras samt IRF i kolumn B använda Ctrl nyckel och ladda icke-linjär montering via analys | Montering | Ickelinjär kurva Fit | Öppna dialogrutan.
  5. Ladda deconvoluted fit funktion (finns i den kompletterande fil 1) genom att lägga till denna funktion i programvaran analys (via kategori | Användardefinierade | Funktion | Lägg till). Välj fit funktion filen 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Denna funktion passar fluorescens livstid histogram med mono-exponentiell förruttnelse funktion deconvoluted med IRF (dvs, den andra kolumnen B i tabellen) (ekvation 1):
    Equation 1(Ekvation 1)
    med t tiden, τ uppenbara fluorescens livstid, A amplituden och y0 offset.
    Obs: Ett annat alternativ är att passa livstid histogram med en bi-fit exponentialfunktionen (ekvation 2):
    Equation 2(Ekvation 2)
    Genom att fastställa livslängden för komponenten långsam (τ1) till det enda villkoret för givare (steg 1.1.2: prov #1) och att för snabb komponenten (τ2) till den tandem konstruktion (prov nr 3), Detta tillåter skattning av andelen SNARE proteiner i komplex (F) från amplituderna av långsam (A1) och snabb komponenter (A2, se diskussion; Ekvation 3):
    Equation 3(Ekvation 3)
    Filen fit funktion för deconvoluted bi-exponentiell montering 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' finns i kompletterande fil 2.
  6. Välj försedda kurvor | X datatyp som samma som indata.
    Obs: Detta kommer att resultera i lämpliga x-axeln skalning av monterade kurvor.
  7. Passa kurvor genom att trycka på Anpassa.
    Obs: Detta konverterar passformen och generera en 'rapportblad' i matrisen med en tabell som innehåller den fluorescens livstider, förskjutningar och amplituder. Det kommer också att generera ett datablad med de monterade kurvorna och resterna av passformen.

Representative Results

Syftet med analysen för mäta SNARA interaktion av bandet-FLIM visas i figur 1. C-termini av de transmembrana spiraler av cognate SNARE proteiner är smält ett par spektralt skiftade fluorescerande proteiner (t.ex., mCitrine och mCherry). Bildandet av en cis-SNÄRJA komplexa på membran fusion resultat i dessa fluorescerande proteiner blir omedelbart kontrasteras till varandra och GRÄMA. Figur 2 visar representativa confocal bilder av HeLa-celler som uttrycker fluorescently-märkt SNARE proteiner. Visat en cell uttrycker syntaxin 4-mCitrine (givare fluorophore) med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore), samt villkor för kontroll av celler som uttrycker endast syntaxin 4-mCitrine konstruktion (givaren endast; ingen bandet) och syntaxin 3 smält till båda mCitrine och mCherry i tandem (maximal expectable bandet). Figur 3 visar medföljande fluorescens livstid och FLIM bilder som genereras av passande livstid histogrammen för varje bildpunkt med mono-exponentiell förruttnelse funktioner (figur 3AB) och bi-exponentiell förruttnelse funktioner ( Figur 3 c - D). figur 4A visar IRF av våra setup mätt tillbaka spridning av en Mikroskop skyddsglaset. I figur 4BE, representativa fluorescens livstid histogrammen för hela cellen FLIM analys tillsammans med tillhörande passform visas kurvor för mono-exponentiell förruttnelse funktioner. Figur 4F visar ett fluorescerande livstid histogram av ett experiment som avbildas för nära på ytan av mikroskopet täcka glaset, vilket resulterar i en framträdande reflektion topp. Figur 4 g visar en livstid histogram med företrädare som passar med en bi-exponentiell förruttnelse funktion.

Figure 1
Figur 1: systemet av den logiska grunden för att visualisera SNARA komplex av FRET. (A) strukturell modell av den neuronala snaror (protein databas 3HD717) vesikel-associerade membranprotein (VAMP) 2 (blå; R), syntaxin 1 (röd; Qa-SNARE), och SNAP25 (grön, innehåller både ett Qb - och Qc-SNARA motiv). C-terminus de transmembrana Helix syntaxin-1 är konjugerat till mCitrine (givare fluorophore; protein databas 3DQ118). C-terminus de transmembrana Helix av VAMP2 är konjugerat till mCherry (acceptor fluorophore; protein databas 2H5Q19). (B) stödordningen för SNARA medierad membran fusion resulterar i bandet. Efter membran fusion av bildandet av en cis-SNARA komplexa, snaror är omedelbart kontrasteras till varandra vilket resulterar i bandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: uttryck av SNARE proteiner smält till fluorescerande proteiner. Första kolumnen: givare fluorophore, upphetsad på 516 nm. Andra kolumnen: acceptor fluorophore, upphetsad på 610 nm. (A) givaren endast villkor. Representativa confocal bilden av en HeLa cellen uttrycker syntaxin 4-mCitrine (givare fluorophore; grön i merge). Acceptor kanalen (andra kolumnen) visar fluorescens överhörning. (B) negativ kontroll (ingen bandet). Representativa confocal bilden av en HeLa cellen uttrycker både syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore; magenta i merge). (C) positiv kontroll (maximal expectable bandet). Representativa confocal bilden av en HeLa cellen uttrycker den syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem konstruera. Observera att fluorescens signalen av mCitrine och mCherry signaler gör inte fullständigt överlappning, sannolikt på grund av en lägre motstånd av mCitrine till lysosomal degradering jämfört med mCherry (se diskussion avsnitt). BF: ljusa fält. Skala barer, 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: FLIM bilder av SNARA komplexa bildande. (A) representativa fluorescens livstid bilder av de celler som visas i figur 2. Bilderna genererades av först konverterar photon spåren spelades in av ett TCSPC system (.pt3) till den bilden flödescytometri standard (.ics) med programvaran PT32ICS. Enstaka pixel utrustade fluorescens livstid bilder genererades sedan använda TRI2 programvara12,13 med tröskelvärde från 15-100% intensitet, 7 pixel cirkulär binning och monoexponentiellt montering algoritm (Marquardt). Färgen anger den genomsnittliga skenbara fluorescerande livstiden. (B), FLIM bilder där fluorescens livstid bilder (visas i panel A) var invecklad med fluorescens stödnivåerna mCitrine givare fluorophore (visas i figur 2). Faltningen utfördes med FIJI ImageJ använder en skräddarsydd makro (se Tabell för material). (C) fluorescens livstid och FLIM bilder av HeLa cellen uttrycker både syntaxin 4-mCitrine och VAMP3-mCherry från paneler A-B, men nu med montering med bi-exponentiell förruttnelse kurvor (med livstider fast kontroll villkor; se steg 4,4 i protokoll). Pixel färgerna anger de uppskattade fraktionerna F av syntaxin 4 i komplex med VAMP3 (ekvation 3). (D) samma som panel B, men för den bi-exponentiell passform. Faltningen utfördes med FIJI ImageJ använder en skräddarsydd makro (se Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: hela cellen FLIM analys. (A) instrument svar funktion (IRF) setup. IRF mättes med den tillbaka spridning i glas-vatten-gränssnittet (med en rent glas mikroskopi maträtt innehållande vatten).(BE) Hela cell livstid histogram för cellerna visas i figur 2 och figur 3. Alla fotoner förekommer i bilderna var poolade. Kurvorna var deconvoluted med IRF och utrustad med mono-exponentiell förruttnelse funktioner (ekvation 1). För dessa celler, fluorescens livstider erhölls av 2,82 ns (celler som uttrycker bara syntaxin 4-mCitrine; givare endast; panel B), 2,09 ns (celler som tillsammans uttrycker syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry; panel C), och 2,08 ns (celler som uttrycker syntaxin 3 - mCitrine-mCherry tandem konstruera; maximal expectable bandet kontroll; panelen D). Inlays visar samma grafer, men nu med logaritmisk skala på y-axeln. Panelen E visar en överlagring av förfall kurvorna av paneler B-D. (F) exempel på en fluorescerande livstid histogrammet registreras för nära ytan av det Mikroskop täckglaset. Detta resulterar i en stor reflektion topp (avbildad av det gula skuggade området). (G) samma som panel C, men nu montering med en bi-exponentiell förruttnelse kurva med livstider fast kontroll villkoren (se steg 4.4 i protokollet). Amplituderna för snabb (A1) och långsamma (A2) komponenter var 14,42 0,01, respektive, vilket resulterar i en beräknad bråkdel av snaror i komplexa F till 0,99 (ekvation 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Funktion fil FLIM_convoluted_IRF vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2. Funktion fil FLIM_convoluted_IRF_biexp vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Detta protokoll visar användningen av bandet-FLIM för visualisering av SNARA interaktioner mellan syntaxin 4 och VAMP3 i live HeLa cells. Syntaxin 4 är en Qa-SNARA protein huvudsakligen att lokalisera på plasmamembranet där det förmedlar exocytos1,2,20,21. VAMP3 är en R-SNARA som huvudsakligen beskrivs för att leta reda på återvinning endosomal fack och medlar människohandel till andra endosomes samt att plasmamembranet1,2,20. Men kan bandet-FLIM analysen lätt anpassas för att studera andra SNARE proteiner. Det enda villkoret är att dessa snaror innehåller en C-terminal transmembrana helix, vilket är fallet för de flesta SNARE proteiner av långt1,2. Protokollet beskrivs här kan dessutom anpassas för visualisering av SNARA komplex i någon eukaryot celltyp, inklusive växter och jäst. I detta protokoll använde vi förkortningen av givare fluorophore fluorescens livstid som ett mått på bandet. Som en kompletterande strategi, livstid acceptor fluorophore kunde undersökas, eftersom sensibiliserade utsläpp orsakar en distinkt upphov fas som ger otvetydiga bevis att resonans energiöverföring sker.

För närvarande kanske bandet-FLIM tekniken inte att visualisera SNARA komplex i lysosomala facken. För den syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem bygga, kan mCherry fluorescensen ofta hittas mer ackumulerade i ett juxtanuclear område, som sannolikt motsvarar lysosomala fack, medan mCitrine signalen är rikligare i cellulära periferin5. En liknande juxtanuclear ansamling av mCherry jämfört med mCitrine observerades, när samma SNARE proteiner smält till dessa fluorescerande proteiner var samtidig uttryckt5. Lysosomer kännetecknas av en extremt lågt pH (< 4) och en hög aktivitet av proteolytiska enzymer. Juxtanuclear ansamling av mCherry orsakas sannolikt av ett högre motstånd av mCherry fluorophore till lysosomal degradering jämfört med mCitrine fluorophore. Det är inte på grund av pH-kylning av mCitrine, som juxtanuclear ansamling av mCherry uppstår även vid fixering av celler5. Således, bandet-FLIM tekniken underskattar mängden bandet i juxtanuclear (lysosomala) regioner och detta skulle kräva andra fluorescerande reporter proteiner som överlever hårda villkoren inom Lumina i lysosomer.

BANDET-FLIM i princip tillåter för att få en (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen av snaror i komplexa5. Som vi förklarat i detta protokoll, kräver detta montering av fluorescens livstid histogram med dubbel-exponentiell förruttnelse funktioner (ekvation 2), där amplituden av snabb komponenten är proportionell mot andelen av snaror i komplexa ( Ekvation 3). Sådan koppling med en två-komponent modell är dock tekniskt utmanande. Montering med flera gratis fit parametrar (två fluorescens livstider och två amplituder) kräver ett mycket stort antal fotoner, särskilt eftersom parametrarna påverkar varandra och små fel i livstid kommer att påverka amplituder och vice versa. För att övervinna dessa montering problem, fluorescens livstidar av komponenten långsam kan fastställas att livslängden på det enda villkoret för givare (dvs, inte FRET, endast mCitrine närvarande) och som av snabb komponenten att tandem livstid konstruera) maximal expectable bandet). Detta bör dock också tolkas med försiktighet, eftersom fluorescens livstider kanske inte samma som dessa kontroll stater, och skulle kunna avvika på grund av flera skäl (själv släcka, dipol orientering, variationer i närmiljön). Flera SNARA komplex i närheten (< 10 nm) kan resultera i distansera-anhörig bandet, samma princip som gör att bandet ska användas som en ”molekylär härskare”, men i det här fallet döljer kvantifiering av SNARA komplex. Dessutom är en kvantitativ uppskattning inte alltid meningsfullt, eftersom märkta snaror konkurrera med endogena (omärkt) snaror. Som en följd är uttryck mCherry-märkt SNARA en viktigaste faktor för bandet5i procent. På grund av alla dessa varningar rekommenderas det att passa fluorescerande livstid histogram med mono-exponentiell förruttnelse funktion (ekvation 1). Detta har fördelen att det inte kräver någon förhand kunskap om livstiderna och den resulterande uppenbara fluorescerande medellivslängd ger ett fast mått för SNARA komplexbildande5.

Det förväntas dock att kvantitativa bandet-FLIM imaging av tvåkomponents passande modeller kommer att ha potent framtida tillämpningar. SNARA-encoding gener inom kromosomen kan vara smält med fluorescerande reporter proteiner, till exempel av CRISPR/CAS9. Detta resulterar i den fluorescerande märkning av endogena SNARE proteiner, med endogen proteinnivåer och ingen bakgrund av omärkta snaror, och möjliggör därmed en meningsfull kvantitativ uppskattning av andelen av SNARA komplex av bandet-FLIM. Medan uttrycksnivåerna av endogena snaror kan vara ganska låg och ger låga relativt fluorescerande signaler, det förväntas att ett tillräckligt antal fotoner kan erhållas, särskilt för hela cellen FLIM (som kräver endast några 1,000s av fotoner). Dessutom kan dessa bandet-FLIM mätningar utföras med känsligare lavin fotodiod vilket också resulterar i högre fluorescens signaler och bättre photon statistik.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av en Hypatia stipendium från Radboud University Medical Center, en karriär Development Award från Human Frontier Science Program, den Gravitation programmet 2013 från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI bevilja från NWO (ALW VIDI 864.14.001) och en Starting Grant från det Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s sjunde ramprogram (Grant avtal nummer 336479).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' Addgene ID 92422 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' Addgene ID 92423 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' Addgene ID 92426 Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes  Willco Wells HBST-3522 Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco, Life Technologies 31966-021
Fetal calf serum Greiner Bio-one 758093
Antibiotic-antimycotic solution Gibco, Life Technologies 15240-062 Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium Thermo Fisher Scientific A14291DJ Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective Leica SP8 Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser Leica SP8 Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system PicoQuant PicoHarp 300
PT32ICS conversion software Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution Originlabs OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity Fiji ImageJ Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer VWR 630-1541
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
PBS B Braun Melsungen  AG 362 3140
EDTA 2 mM Merck 108417 CAS: 60-00-4
15 mL tubes Greiner Bio-one 188271
Trypan blue Sigma Aldrich 93595 CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device Thermo Fisher Scientific MPK5000S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (9), 631-643 (2006).
  2. Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744, (2), 120-144 (2005).
  3. van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3, (4), 204-205 (2011).
  4. Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10, (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
  5. Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
  6. Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33, (13), 5507-5523 (2013).
  7. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21, (11), 1387-1395 (2003).
  8. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  9. JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. (2017).
  10. Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. (2017).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  12. Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).
  13. Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6, (Suppl 1), S93-S105 (2009).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 271-281 (2012).
  17. Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460, (7254), 525-528 (2009).
  18. Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105, (36), 13362-13366 (2008).
  19. Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45, (32), 9639-9647 (2006).
  20. Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317, (13), 1817-1829 (2011).
  21. Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95, (2), 305-312 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics