Beyin omurilik sıvısı imzalat fareler gelen topluluğu için geliştirilmiş bir yöntem

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu iletişim kuralı beyin-omurilik sıvısı (bos) kan yok kirlenme ile bol topluluğu için geliştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır. Daha fazla örnek toplama ve saflık ile daha fazla analiz anlayışımız beyin ve omurilik etkileyen hastalıkların daha fazla için CSF kullanarak gerçekleştirilebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyin-omurilik sıvısı (bos) nörolojik araştırma analizi için değerli bir vücut sıvısı var. Bu sıvılar merkezi sinir sistemi ile yakın temas biridir ve böylece, doğrudan bu dokuların erişmeden beyin ya da omurilik hastalıklı durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Ancak, kan damarlarının Sisterna magna yakınlığı nedeniyle elde etmek zordur farelerde, hangi sık sık örnekleri kontamine. Fareleri koleksiyonunda CSF için alan da için incelemek zordur ve genellikle sadece küçük örnekleri (5-7 µL en fazla veya daha az) elde edilir. Bu protokol üzerinde toplama kan kirlenme en aza indirmek ve bol koleksiyonda CSF (on ortalama 10-15 µL toplanan) izin vermek için geçerli yöntemleri geliştirir bir teknik ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. CSF çekme sırasında herhangi bir doku etkilemez gibi bu tekniği fareler, doku koleksiyonundan için diğer diseksiyon yöntemleri ile kullanılabilir. Böylece, beyin ve omurilik bu tekniği ile etkilenmez ve sağlam kalır. Büyük CSF örnek toplama ve saflık ile daha fazla analizler bu sıvı daha fazla yardım nörolojik araştırma ile kullanılabilir ve daha iyi anlamak beyin ve omurilik etkileyen hastalıklar.

Introduction

Bos analizi nörolojik araştırma için değerli bir vücut sıvısı var. Bos öncelikle kan plazma kaç hücre (hiçbir kırmızı kan hücreleri ve sadece bir kaç beyaz kan hücreleri) içeren yapılır ve neredeyse protein ücretsizdir. Sıvılar merkezi sinir sistemi (MSS) ile yakın temas içinde biridir ve birçok elektrolit beyin ve omurilik periferik sisteme geçmek. İnsanlarda, CSF örnekleri hastalık teşhis yardım toplanabilir veya klinik araştırma amaçlı bir omurilik sıvısı (veya lomber ponksiyon) olarak bu küçük, invaziv bir işlemdir: CSF sıvı bunlar doğrudan erişmek zorunda kalmadan MSS değişiklikleri yansıtabilir doku. Böylece, klinikte, araştırma amacıyla son yıllarda CSF örnekleri nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı ve diğer demans1,2,3gibi hastalardan elde edilmiştir. Orada potansiyel olarak hastalıkları Kliniği2,3' te tanılamada yardımcı olmak için CSF numuneleri kullanılarak geliştirilen birçok biyomarker deneyleri. Ancak, özellikle hastalık4,5tanılamak için tutarlı, hassas sonuçlar üretmek için bu deneyleri güvenilirliğini çok tartışma var. Standart bir teknik üretiminde daha fazla duyarlılık ve özgüllük ile nörodejeneratif hastalıkları teşhis etmek için yardım etmek için daha iyi deneyleri ve bos içinde bulunabilir, hedefler geliştirilmesi için büyük bir ihtiyaç vardır. Potansiyel insan CSF örnekleri hastalık nedeniyle, nörolojik araştırma kemirgen CSF koleksiyonundan da ilgi önemlidir.

Fareler önemli hayvan biyolojik ve tıbbi araştırma ve potansiyel terapötik bileşiklerin ve prototip, çalışmaların insan klinik çalışmalarda önce test için izin. Sisterna magna, beyincik ve medulla oblongata dorsal yüzeyi arasında bir açıklık ile elde etmek için her zamanki yöntem CSF koleksiyon farelerde olduğu gibi Ancak, farelerde bu CSF örnekleri için küçük bir hayvan, beyinde yakınlığı nedeniyle elde etmek zordur. Bu zorluk bu alan için incelemek zor olduğu gibi CSF örnekleri toplama ve kan damarları, kan hücreleri kirlenme riski artan yakın neden olur. Bu zorluklar nedeniyle çoğu araştırmacı sadece CSF az miktarda (genellikle 5-7 µL belirtilen) analiz için elde edebilirsiniz ve kan hücreleri tarafından CSF örnekleri kirlenme analizleri6,7,8 için birincil bir sorundur , 9. kan kirlenme karanlık sonuçları ve değil gerçekten MSS durumunu yansıtır. Fareler toplanan zamanki miktar (içinde yinelenen ya da nüsha) tek bir ölçüm için yeterli Ayrıca, sınırlı örnek toplanan araştırma olabilir etkisi enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak. Böylece, CSF örnekleri genellikle birden çok fare birden çok testleri çalıştırmak için yeterli örnek için havuza. Bir iletişim kuralı için bol geliştirmek, kirlenmemiş CSF koleksiyonundan fareler büyük ölçüde istenen ve kemirgenler kullanarak nörolojik araştırma geliştirmeye faydalı olacaktır.

Bu protokol, bol bir tekniği (ortalama 10-15 µL) imzalat fareler CSF koleksiyonundan ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve kan10kirlenme en aza indirmek için CSF koleksiyonunun karşılaşabileceği bilinen bir yöntem geliştirir. CSF koleksiyonu için sağlam bir protokol yanı sıra hastalığı teşhis yardım araştırma MSS etkileyen hastalıkların altında yatan mekanizmaları geliştirmek için kullanılan olabilir CSF tabanlı biyomarker deneyleri, geliştirilmesinde yardımcı olacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Neuroscience (ABD) ve Bund'a Üniversitesi (Shanghai, Çin) etik Komiteler için toplum ilkelerine uygun olarak yapıldı. Bu yordam için bir hayatta kalma sigara cerrahidir.

1. Kurulum bos toplama aparatı

  1. Cam kapiller çekin (iç çap 0,75 mm, dış çap 1.0 mm) (Liu ve ark. içinde gösterildiği gibi bir micropipette çektirmenin kullanarak 10; bilenmiş kılcal şekil 1' de gösterilen).
  2. Yer bilenmiş cam kapiller yuvasına kapiller sıkıca bir micromanipulator (şekil 1A) monte.
  3. Böylece ucu kırık iç çapını hakkında bir diseksiyon mikroskop altında düz Forseps ile bilenmiş kılcal ucunu kırmak 10-20 µm (şekil 1 c).
  4. İnce bir tüp ve bir şırınga kapiller sahibi diğer ucunu takın ve ince bir tüp ve şırınga üç yollu vana ile bağlayın.
  5. Açmak ve şırınga cama herhangi bir kirletici uzaklaştırdığını ve pozitif basınç kapiller tüpünde Kılcal Boru aracılığıyla şırıngadan blow hava atılmak için üç yollu vana kaydır.
  6. Bunu bir kaç kez dis bağlanma ve üç yollu vana şırınga yeniden bağlanma ve şırınga çizim tarafından tekrar ~ 100-200 µL üç yollu vana (şekil 1B) şırınga son yeniden bağlantı önce.
  7. Micromanipulator kılcal cam tarafında fare diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için hareket.

Figure 1
Şekil 1. Mikroskop, micromanipulator ve kapiller Kur. (A)mikroskop micromanipulator bağlı kılcal ile kurulum ve, (B) daha yakın bir görüntü yanı sıra bağlı şırınga ve açmak için üç yollu vana (burada gösterilen) veya yakın boru ve (C) bir kırılmamış (sağ) ve (sol) kırık Kapiler uç CSF koleksiyonu için hazır. Kırık sonra kılcal ucu var bir 0,75 mm iç çap, dış çap 1.0 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. fare diseksiyon

  1. Fare anestezi.
    Not: Bu iletişim kuralı, C57BL/6 ve amiloid precursor protein/presenilin 1 (APP/PS1) transgenik için (Alzheimer hastalığı fare modeli) fare kullanılan ve 10 µL/g mayi ile fare ağırlık itibariyle % 4 kloral hidrat (dH20)'ile anestezi enjeksiyon.
  2. Tam anestezi, fare yeterli anestezi sağlamak. Çimdik, biraz arka bacaklarda uzanan ve ayak parmakları pinching ve para çekme yanıt için izlerken tarafından baştan aşağı çekilmesi yanıt yeterli anestezi sağlamak için gerçekleştirilir. Tüm dört bacaklarda pinching tarafından kontrol edin; herhangi bir tepki ise fare düzgün anestezi. Kesme ve fareyi gözler, kulaklar diseksiyon makası (şekil 2A) kullanarak boyun altına arasında yukarıda başkanı arkasında saç kesme. Alternatif olarak, makas veya depilatory krem saç kaldırma yardım etmek için kullanılabilir.
  3. Fare fare bağdaştırıcısı kullanılarak başkanı güvenli (baş aşağı yöne Burnu yukarı dönük olacak şekilde geri ~ 45 °, şekil 2A). Kulak barlar arasında kulakları ve gözleri fare düzeltmek ve sıkın. Baş taşıyamazsınız ve sıkıca'deki bağdaştırıcı fare baş hafifçe iterek tarafından güvenlik altına alınır emin olun.
  4. Para Çekme yanıt çimdik cerrahi kesi yapmadan önce baştan aşağı yeniden denetleyin ve düzenli olarak bundan sonra cerrahi anestezi boyutunda sağlamak için. Görsel olarak solunum hızı herhangi bir değişiklik değişiklikler anestezi uçaklarda belirtmek için bu yordamı sırasında dikkat edin. Temiz, aseptik non-teknik bu kısa hayatta kalma ameliyat için kullanılabilir. Kafatasının sadece kas ince bir tabaka ile maruz kadar makas ve eğri forseps kullanarak, cilt ve kas ilk katman kesilmiş.
    Not: fare deri yoluyla boyun sırtına kesin ve sonra kulakları ve gözleri fare arasında kafatasının ikiye deriyi kesme. Sonra cilt ve doku üzerinde Sisterna magna apart ve bölgeden ayrılabilir.
  5. Görüntüleme diseksiyon mikroskop aracılığıyla dikkatle incelemek iken uzakta son katmanları kas forseps kullanarak kafatası tabanı üzerinde ince ve bu katmanları kas tarafa ve ilgi alanı dışına taşıyabilirsiniz. Orada kanıyor, pamuk tomurcukları kaldırmak ve kanamayı durdurmak yardımcı olmak için kullanın.
  6. Dura Sisterna magna üzerinden maruz bir kez (üçgen şekli ile genellikle 1-2 büyük kan damarları alan; çalışan iki tarafında veya kan damarları arasına kapiller ekleme ve CSF koleksiyonu, şekil 2Biçin en iyi yöntemdir), ıslak kullanın membran silmek için pamuk bud temiz ve kuru pamuklu bud alan kuru için kullanın.

Figure 2
Şekil 2. Fare ve diseksiyon Kur kapiller ekleme CSF koleksiyonu için temsil edici görüntülerle. Fare CSF çekme(a)için hazır kurulum traş diseksiyon ve (B) görüntü Sisterna magna kapsayan bir disseke fare dura (10 x görünümü) ayrıntılı için yere sabitlenmiş kafa (Kesikli ok gösterir alanı üzerinden çalışan bir kan damarı ve katı ok alanı için ideal kapiller ekleme gösterir). Detaylı resimleri (10 x görünümü) (C) cam kapiller Sisterna magna, (D) nokta hangi kılcal deliyor neredeyse dura dura ve (E) Kapiler uç vurdu bazı direnç ile dura karşı uyumlu ucu bilenmiş CSF toplamak için beyin zarı. CSF berrak bir sıvı cam kapiller (noktalı ok) toplanan olmalıdır. Tüm ölçek her mikroskop görüntünün sağ alt 100 µm. Çubuklarõn Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. bos koleksiyonundan imzalat fare

  1. Şekilde hemen arkasında membran bilenmiş noktasıdır fare kafasının arkasına için cam kılcal hizalayın bir ~ 30-45 derecelik açıyla (şekil 2C).
  2. Dalma şırınga bir kez veya birkaç kez ve şırınga çizmek ~ (orada hiçbir kirletici ve orada negatif basınç bardakta kapiller emin olmak için) 100-200 µL.
  3. Micromanipulator kılcal hareket kullanarak direnç görülebilir kadar yakın membran için ipucu, ama bu (şekil 2B) Delme değil.
  4. Bir kez direnç kapiller ucu ve membran arasında görülür, yavaşça micromanipulator denetimlere çalıyor tarafından kapiller membran tüpten dokunun. Mikroskop kapiller ponksiyon bilenmiş turistik Sisterna magna görmek için kullanın. CSF otomatik olarak çizilmiş kılcal tüpe açılış delinmiş bir kez (şekil 2E).
  5. Yavaş yavaş CSF toplamak için kılcal bırakın. Bos çizim durdurulmuşsa, yavaş yavaş şırınga küçük bir miktar yukarı çizmek (~ 50 µL) daha negatif basınç kapiller CSF çıkarmak için oluşturmak için.
    Not: Alternatif olarak, kılcal nazikçe ve yavaşça tekrar kılcal damar akmaya CSF izin vermek için iyi micromanipulator denetimlerini kullanarak beyin dışarı çekilebilir. Toplam miktarı ~ 10-15 µL CSF, (~ kılcal 3-4 cm) alır ~ 10-30 dakika ve zaman zaman 20 µL veya daha fazla toplanan. Kesinlikle gerekli olmasa da, bir ısı yastık CSF toplama sırasında kullanılması önerilir. CSF koleksiyonu oda sıcaklığında gerçekleştirilen (~ 23 ° C).
  6. İstenen CSF miktarı toplanır sonra tüp (CSF çizim önlemek için) kapatmak için üç yollu vana ilerletmeniz kapatın.
  7. Kablo kanalları için bağlı şırınga çıkarmak ve açın ve boru (kılcal, boru ve alanının dışında kılcal equalized basınç oluşturmak için) kapatın. Üç yollu vana şırınga yeniden, ama belgili tanımlık tenkıye Dalma değil.
  8. Yavaşça cam kılcal micromanipulator kullanarak fare çıkarın.
  9. Toplama tüp (20 x proteaz inhibitörü 1 µL ile 1.5 mL mikrotüpler) altında camın üzerine bilenmiş kapiller getirin.
  10. Tüp aç ve yavaşça şırınga Dalma: bos kılcal ve toplama tüp içine akışı gerekir.
  11. Toplandıktan sonra hızlı bir şekilde santrifüj kapasitesi (pulse tur 5 mini santrifüj kullanarak maksimum hızda s) örnek toplama tüp alt proteaz inhibitörü ile karıştırmak için bos.
    Not: CSF örnekleri bölünmemeli olabilir ve daha fazla analiz-80 ° C'de depolanan Fare geri kalanı için beyin ve omurilik gibi diğer dokulara disseke. Fare bu aşamada hala yaşıyor ve böylece kan da, gerekirse toplanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada özetlenen yordamı (Resim 1 ve Şekil 2) kullanarak, hemen kılcal içinde toplanan CSF açık (şekil 2E), değil pembe ya da kırmızı olmalıdır. Bir pembe kılcal içinde toplanan sıvı için kırmızı renklendirmek için ise, o zaman kan ile kirlenme vardı.

Bu yöntemle CSF örnek uygulamalara örnek olarak toplanan gibi protein amiloid beta (Aβ) düzeyde ölçülen ELISA kullanarak. CSF Aβ düzeyde yaygın olarak Alzheimer hastalığı araştırma7' ölçülür. CSF çoğunlukla protein ücretsizdir. Bu fareler insan APP overexpress gibi bir fare modeli Alzheimer hastalığı (APP/PS1 fareler) insan Aβ42 düzeyleri önemli ölçüde, artmıştır. Bu 12-ay-yaşlı fareler burada açıklanan yöntemleri (0 pg/mL 1303 pg/mL bos APP/PS1 farelerde, şekil 3ile karşılaştırıldığında (WT) farelerde vahşi-tip CSF) kullanarak toplanan CSF örnekleri ile görülebilmektedir.

Figure 3
Şekil 3. CSF örnek için temsil edici sonuçlar toplanan. CSF örnek toplanan ELISA analizi. Alzheimer hastalığı (APP/PS1) bir fare modelinde, var ki insan Aβ42 CSF düzeyde önemli bir artış bu fareler insan Aβ42 (1303 pg/mL) overexpress. Vahşi türü (WT) orada fareler tespit yok insan Aβ42 (0 pg/mL) olmalıdır. Bir unpaired t-testi önemi, ölçmek için kullanılan ** p < 0,01, SEM temsil hata çubukları n 12 ayda sırasıyla 3 ve 4 fare =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı ayrıntılı olarak geçerli yöntemleri10 kan kirlenme en aza indirmek ve CSF bol koleksiyonu için izin vermek için CSF koleksiyonunun artıran bir teknik anlatılmaktadır (ortalama ~ 10-15 µL elde edilebilir) fare üzerinden. Kapiler uç kırma zaman kılcal ucu (sonra da bos hulâsa çok yavaş) çok küçük olmamalı veya (çok büyük-ecek değil var olmak yeterli bos toplamak için ince ve doku içinde kılcal teslim olmak). CSF koleksiyonu için alan dissekan zaman bakım alınmalıdır: herhangi bir kanama durdu olmalıdır ve alan ekleme kapiller cam için temizlenmiş dH2örnekle kirlenmesini önlemek için 0 ile kandan. Her fare anatomisi farklıdır, ancak 1-2 büyük kan damarları nerede kılcal CSF koleksiyonu için eklenmesi gereken alan üzerinden çalışan çoğu fare var. Fazla ekleme olarak önemli kılcal yerleştirilmesi için doğru yer seçimi büyük kan damarları CSF kan ile kontamine. Şekil 2' de gösterildiği gibi bir alan olarak arasında ya da iki yanındaki büyük kan damarlarının kan damarlarının açık kirlenmesini önlemek kılcal sokmak için en uygunudur. Bir süre sonra bos dışarı sabit bir oran ve durur akmaz, şırınga biraz çizim (~ 50 µL) kılcal CSF akışına yeniden başlatmak için yardımcı olabilir. Alternatif olarak, kılcal kendisi nazikçe ve yavaşça içine veya dışına fare micromanipulator ile CSF çekme akışını yeniden başlatmak için taşınabilir. Aşağıdaki adımları kan yapıyor kılcal damar de akabilir bakım alınmalıdır. Bu teknik de beyin ve cam CSF fare çizmek için kapiller basınç farklılıkları nedeniyle çalışır. Böylece, fare sadece bir kez, yeniden eklenirse kılcal fare eklenen ve çıkartılır, beyindeki basınç kaybı olduğunu CSF artık sonra ve kılcal damar otomatik olarak çizilmesi gibi delinmiş. Bu nedenle, uygulama hiçbir kan kirletici maddeleri üretmek ve kılcal fare içine ilk ekleme üzerinde yeterli CSF koleksiyon elde etmek için bu tekniği mükemmel (--dan deneyim, 10-20 pratik fareler bu sahne ulaşmak için yeterli olacaktır).

Bu iletişim kuralı CSF fareler ayıklamak için bir gelişmiş ve etkili bir yöntemdir ve doğru olarak yapılması halinde kan (Resim 1, Resim 2, şekil 3) kirlenme en aza indirir. Bu teknik tahsil edilecek CSF için geçen süre ile sınırlıdır. Normalde, 30 dk toplamak için gereklidir ~ 15 µL veya daha fazla oda sıcaklığında CSF (~ 23 ° C). Bu sırada, fare Pamuk yün veya doku ile sıcak tutulabilir ama bir kaplama veya ısı yastık, CSF hala başarıyla toplanabilir. Bir ısı yastık veya yordamı CSF akış beyin dışına artırarak bu tekniği geliştirmek ve diğer yöntemleri10,11' açıklandığı gibi koleksiyon için gereken süreyi azaltmak için önce fare ısınma eklenmesi. Ancak burada açıklanan kuralında yok ısı yüzey veya fare ısınma kullanıldı ve fareler arasında toplanan CSF miktarında hiçbir zorluk vardı. Bu teknik-ebilmek var kullanılmış için uygulama örneği olarak, ELISA kullanarak insan Aβ42 düzeyleri ölçüldü. Aβ yapışkan olarak bilinir ve cam ve koleksiyon tüpler için uygun. Bu protokol için bos fareler toplamak için borosilikat cam kılcal ve polipropilen borular kullanıldı. Bazı Aβ cam kapiller ve duvarlar koleksiyonu tüplerinin yapışabilir ELISA Aβ seviyeleri olabilir gösteri sonuçları (şekil 3) ölçülür. Yine de, bu protokol için toplanan CSF üzerinden ölçülen Aβ düzeyleri diğer çalışmaları tarafından açıklanan düşüktür ama cam kılcal bos toplamak için fareyi dura ponksiyon için gerekli olan bir olasılık var. Aβ ölçme yanı sıra, diğer proteinler ilgi aynı zamanda toplanan CSF kullanarak ölçmek.

Süre CSF koleksiyonu daha önce yayımlanmış yöntemi tarafından Liu vd. 10 içindir CSF sürekli toplama için yaşam fare, burada açıklanan yöntemi CSF koleksiyonundan doku toplama ve analiz için kurban fareler için. Böylece, bu teknik ile birlikte diğer diseksiyon yöntemleri fare doku koleksiyonu için beyin ve omurilik etkilemez ve CSF koleksiyonu sonra kullanılabilir (örneğin, 10-30 dakika sonra ~ CSF 10-15 µL), fare hala nefes ve anestezi altında. Bu nedenle, diğer dokulara kan, beyin, omurilik ve karaciğer gibi toplama ve biyokimyasal analiz için hala geçerli. Her ne kadar Liu vd. yöntemi CSF çok hızlı bir şekilde (için 3-7 µL CSF, fare başına 10 dk) toplanan, burada açıklanan yöntemi daha uzun bir zaman alır ama daha fazla CSF10toplayabilirsiniz. CSF koleksiyonu için başka bir yöntem de Maia vd tarafından açıklanan 11 her iki Liu vd. ve bilenden cam kılcal veya jel yükleyici ipuçları ve Sisterna magna delinme fareler CSF toplama Maia ve ark. yöntemleri açıklanmaktadır. Burada anlatılan yöntem kılcal bir micromanipulator için düzelterek farklıdır. Bu kılcal hareketsiz tutulur ve kan kirlenme CSF toplama sırasında azaltır sağlar. Micromanipulator da büyük hassasiyet ve doğruluk Sisterna magna Delme içinde CSF elde etmek için izin verir. Maia ve ark. yöntemi da CSF fare başına 15-20 µL almak mümkün olmasına rağmen Sisterna magna art arda kan veya doku bulaşma riskini artırabilir jel yükleyici ipuçları ile elle delinme gerektirir. Ayrıca, et al. yöntemi böylece az her ardışık Sisterna magna Delme ile beyindeki basıncı azaltabilir Maia CSF her zaman toplanan. Burada anlatılan yöntem tek bir delik ve kılcal fare anestezi altında iken CSF ile yenilenir olarak daha fazla CSF toplamak için Sisterna magna bırakarak içerir. Böylece, burada sürekli olarak açıklanan protokol CSF toplar ve tekrarlanan delikler mümkün kirlenme içine Sisterna magna yanı sıra çevreleyen doku bozulması en aza indirir.

Büyük CSF örnek toplama ve saflık ile daha fazla analizler bu sıvı nörolojik araştırma daha fazla yardım için kullanılabilir. CSF koleksiyonundan fareler sıkıcı ve tek olabilir araştırmacılar arasında bilinen sınırlı bir örnek (genellikle 5-7 µL6,7,8,9maksimum belirtilen) elde edilebilir. Literatürde, orada değil birçok ayrıntılı CSF çekme için yayınlanan protokolleri ve kan, kirlenme CSF bol topluluğu koruyarak en aza indirmek için daha önce yayımlanmış yöntemi10 bu protokol geliştirir. CSF nörolojik araştırma ve MSS dokulara yakın sıvı biri olarak birçok uygulama, araştırma için değerli bir örnektir. Daha önce bir yetişkin fare CSF1240 µL bir hacmi vardır belirlenmiştir. Böylece, bu iletişim kuralı % 25 ve muhtemelen bir yetişkin Mouse CSF toplam miktarın daha fazla elde etmek mümkün olmuştur. Belgili tanımlık doğuştan suşları C57BL/6 ve APP/PS1 mice yanı sıra denetim bölge (ICR) basma outbred zorlanma fareler de başarıyla bu iletişim kuralını kullanan CSF toplamak için kullanılmaktadır. CSF fareler çeşitli yaş (4-18 ay) üzerinden başarıyla bu protokolü kullanılarak toplanmış. Böylece, hiçbir zorluk CSF farklı suşları veya fareler yaşları bu yöntemle toplamak olmalıdır. Bu ayrıntılı Protokolü Umarım birçok kişi tarafından kalkınma CSF deneyleri ve beyin ve omurilik etkiler nörodejeneratif hastalıkları anlamak için araştırma yardımcı olmak için diğer analiz teknikleri geliştirmek için kullanılır.

Diseksiyon ve CSF koleksiyon (Bölüm 3 iletişim kuralı) sırasında hareket etmez bu yüzden fare başkanı sıkıca tutturulmuş önemlidir. Site içine Sisterna magna ilk ponksiyon için bol, Sigara-kirlenmiş CSF elde etmek için önemlidir. Kılcal çok yakın toplanan örnek kirlenmesini önlemek için herhangi bir kan damarları eklenmesi gereken değil. Ayrıca, kılcal düzeltilmesi için en uygun CSF koleksiyonu önemlidir. Micromanipulator kullanımını büyük ölçüde çevreleyen doku engellemeden ve bos bulaşıcı olmadan yapılacak ince ayar sağlar. Micromanipulator iyi denetimlerini kullanarak, kılcal yavaş yavaş girip CSF fare ve kılcal koleksiyonu için içine dışarı akmasını sağlamak için taşınabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81650110527, 81371400) ve ulusal anahtar temel araştırma programı Çin (2013CB530900) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
  2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6, (3), 131-144 (2010).
  3. Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78, (1), 47-54 (2012).
  4. Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10, (6), 808-817 (2014).
  5. Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404, (10), 2895-2900 (2012).
  7. Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17, (3), 516-523 (2004).
  8. Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. (2016).
  9. You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5, (1), 290-296 (2005).
  10. Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
  11. Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5, (194), 194re2 (2013).
  12. Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics