Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

Neuroscience

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Summary

Questo protocollo descrive una tecnica migliore per la raccolta abbondante di liquido cerebrospinale (CSF) senza contaminazione da sangue. Con una maggiore raccolta di campioni e purezza, altre analisi possono essere eseguite utilizzando CSF per avanzare la nostra comprensione delle malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

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Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

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Abstract

Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. È uno dei fluidi in più stretto contatto con il sistema nervoso centrale così, può essere utilizzato per analizzare lo stato di malato del cervello o del midollo spinale senza accedere direttamente a questi tessuti. Tuttavia, nei topi che è difficile da ottenere dalla cisterna magna grazie alla sua vicinanza ai vasi sanguigni, che spesso contaminare i campioni. La zona per accumulazione di CSF in topi è anche difficile da sezionare per e spesso solo piccoli campioni sono ottenuti (massimo di 5-7 µ l o meno). Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora sugli attuali metodi di raccolta per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media che 10-15 µ l possono essere raccolti). Questa tecnica può essere utilizzata con altri metodi di dissezione per raccolta di tessuto dai topi, come non impatto eventuali tessuti durante l'estrazione di CSF. Così, il cervello e il midollo spinale non sono interessati con questa tecnica e rimangono intatti. Con una maggiore raccolta di campioni di CSF e purezza, ulteriori analisi possono essere utilizzati con questa ricerca in neuroscienza fluido ad ulteriori aiuti e comprendere meglio le malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

Introduction

Il CSF è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. Il CSF è principalmente fatta da plasma sanguigno, contenente alcune cellule (non di globuli rossi e pochi globuli bianchi) ed è quasi privo di proteine. È uno dei fluidi a stretto contatto con il sistema nervoso centrale (SNC) e può passare molti elettroliti dal cervello e il midollo spinale al sistema periferico. In esseri umani, i campioni di CSF possono essere raccolti per aiutare nella diagnosi di malattia o per scopi di ricerca negli studi clinici, come una puntura lombare (o puntura lombare) è una procedura invasiva, minore: il fluido di CSF può riflettere le modifiche nel SNC senza dover accedere direttamente a queste tessuti. Così, negli ultimi anni, per scopi di ricerca in clinica, i campioni di CSF sono stati ottenuti da pazienti di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e altre demenze1,2,3. Ci sono molti saggi di biomarcatore che sono stati sviluppati utilizzando campioni di liquor per potenzialmente diagnosticare malattie in clinica2,3. Tuttavia, c'è molto dibattito sull'affidabilità di questi test per produrre risultati coerenti e sensibili per specificamente diagnosticare malattia4,5. Così, c'è un grande bisogno per lo sviluppo migliore nei test di obiettivi, che possono essere trovati nel CSF, per aiutare nella produzione di una tecnica standard per diagnosticare malattie neurodegenerative con maggiore sensibilità e specificità. A causa dell'importanza potenziale di campioni di CSF umano nella malattia, la collezione di CSF dai roditori in ricerca in neuroscienza è anche di interesse.

I topi sono animali importanti nella ricerca biologica e medica e consentono per la prova dei composti terapeutici potenziali e studi di prova prima di test clinici umani. Tuttavia, nei topi è difficile ottenere campioni di CSF grazie alla sua vicinanza al cervello in un piccolo animale, come il metodo usuale di accumulazione di CSF in topi è ottenerlo via della cisterna, un'apertura tra il cervelletto e superficie dorsale del oblongata del midollo. Questo provoca difficoltà nella raccolta dei campioni di CSF come questa zona è difficile da sezionare per e in prossimità di vasi sanguigni, aumentando il rischio di contaminazione da parte di cellule del sangue. A causa di queste difficoltà, la maggior parte dei ricercatori possono ottenere solo una piccola quantità di CSF per analisi (solitamente indicato come µ l 5-7) e la contaminazione dei campioni di CSF dalle cellule del sangue è una preoccupazione primaria per analisi6,7,8 , 9. contaminazione sanguigna può oscurare i risultati e non veramente riflettere lo stato del SNC. Inoltre, limitato campione raccolto può influire la ricerca come la solita quantità raccolte da topi è sufficiente per la sola misura (in doppio o triplice copia) utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Così, campioni di liquor sono solitamente in pool da topi multipli al fine di avere abbastanza campione per eseguire saggi multipli. Sviluppo di un protocollo per l'abbondante, collezione incontaminato di CSF dai topi è fortemente desiderato e sarà utile nel miglioramento della ricerca neuroscientifica utilizzando roditori.

In questo protocollo, una tecnica per l'abbondante (una media di 10-15 µ l) insieme di CSF da topi anestetizzati è descritta dettagliatamente e migliora il metodo attualmente conosciuto di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue10. Un protocollo robusto per accumulazione di CSF sarà di aiuto nello sviluppo di analisi di biomarker basati su CSF, che potrebbero essere utilizzati per diagnosticare la malattia, come pure di migliorare la ricerca dei meccanismi che sono alla base di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le politiche della società per le neuroscienze (USA) e comitati etici Fudan University (Shanghai, Cina). Questa procedura è per un intervento chirurgico non-sopravvivenza.

1. installazione dell'apparecchiatura di raccolta di CSF

  1. Tirare il vetro capillare (diametro interno 0,75 mm, diametro esterno mm 1,0) usando un estrattore micropipetta (come mostrato in Liu et al. 10; affilata capillare è illustrato nella Figura 1).
  2. Posto un capillare nel supporto capillare in vetro affilato saldamente montato su un micromanipolatore (Figura 1A).
  3. Rompere la punta del capillare affilata con il forcipe dritto sotto un microscopio per dissezione, in modo che il diametro interno della punta rotta è di circa 10-20 µm (Figura 1).
  4. Collegare un tubo sottile e una siringa a altra estremità del capillare titolare e collegare il tubo sottile e la siringa con una valvola a tre vie.
  5. Spostare la valvola a tre vie per aprire e immergere la siringa per soffiare aria dalla siringa attraverso del tubo di vetro capillare per espellere eventuali contaminanti e creare pressione positiva nel tubo capillare.
  6. Ripetere un paio di volte da dis-collegamento e ricollegare la siringa alla valvola tre vie e redigere la siringa ~ 100-200 µ l prima l'ultima ri-connessione della siringa con la valvola a tre vie (Figura 1B).
  7. Spostare il micromanipolatore con il vaso capillare di vetro al lato per evitare danni durante la dissezione del mouse.

Figure 1
Figura 1. Microscopio, micromanipolatore e capillare setup. (A) microscopio e micromanipolatore con capillare associata installazione, così come un'immagine più da vicino di (B) la siringa collegata e la valvola a tre vie per aprire (mostrato qui) o chiudere la tubazione e (C), un'ininterrotta (destra) e rotto (a sinistra) Punta capillare pronto per accumulazione di CSF. Una volta rotto, la punta del capillare deve avere un diametro interno di 0,75 mm, diametro esterno di 1,0 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. dissezione di Mouse

  1. Anestetizzare il mouse.
    Nota: per questo protocollo, C57BL/6 e amiloide precursore della proteina/presenilina 1 (APP/PS1) transgenici (modello murino di malattia di Alzheimer) topi sono stati utilizzati e anestetizzati con 4% cloralio idrato (in dH20) a 10 µ l/g di peso del mouse via intraperitoneale iniezione.
  2. Quando completamente anestetizzato, assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato. La risposta di ritiro alla punta pizzico, leggermente estendendo gli arti posteriori e pizzicare le dita dei piedi e guardando per una risposta di ritiro, viene eseguita per assicurare un'anestesia adeguata. Verifica di pizzicare tutte e quattro le membra; Se non c'è nessuna reazione il mouse correttamente è anestetizzato. Tagliare e tagliare i capelli sul retro della testa del mouse da sopra gli occhi, tra le orecchie alla parte inferiore del collo con le forbici per dissezione (Figura 2A). In alternativa, i clippers o crema depilatoria può essere utilizzata per aiutare nella rimozione dei capelli.
  3. Fissare la testa del mouse utilizzando un adattatore mouse (dietro la testa rivolta verso l'alto con il naso puntato verso il basso a ~ 45 °, Figura 2A). Difficoltà bar orecchio tra le orecchie e gli occhi del mouse e stringere. Assicurarsi che la testa non può muoversi ed è fissata saldamente l'adattatore spingendo delicatamente verso il basso sulla testa del mouse.
  4. Ricontrollare la risposta di ritiro per punta pizzico prima di effettuare l'incisione chirurgica e regolarmente da allora in poi per assicurare aereo chirurgica di anestesia. Visivamente notare qualsiasi cambiamento nella frequenza respiratoria durante la procedura per indicare cambiamenti nei piani di anestesia. Una tecnica pulita, non asettici, può essere utilizzata per questo breve intervento non-sopravvivenza. Con delle forbici, pinzetta, tagliare attraverso la pelle e il primo strato del muscolo finché la base del cranio è esposto con solo un sottile strato di muscolo.
    Nota: Tagliare attraverso la pelle del mouse attraverso la parte posteriore del collo e quindi tagliare la pelle giù la metà del cranio tra le orecchie e gli occhi del mouse. Pelle e tessuto può essere tirati quindi apart e fuori dalla zona sopra la cisterna magna.
  5. Mentre la visione attraverso il microscopio per dissezione, accuratamente sezionare distanza l'ultimo sottili strati del muscolo sopra la base del cranio usando il forcipe e spostare questi strati del muscolo al lato e fuori dell'area di interesse. Se c'è sanguinamento, utilizzare bastoncini di cotone per rimuovere e aiutare a fermare l'emorragia.
  6. Una volta che il dura sopra la cisterna magna è esposto (forma triangolare con solitamente 1-2 grandi vasi sanguigni che attraversa la zona; entrambi i lati della o tra i vasi sanguigni sono ottimali per inserimento capillare e accumulazione di CSF, Figura 2B), utilizzare un bagnato Cotton fioc per pulire la membrana e quindi utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per asciugare la zona.

Figure 2
Figura 2. Configurazione del mouse e dissezione con immagini rappresentative di inserimento capillare per accumulazione di CSF. Installazione del mouse pronto per l'estrazione di CSF con (A) rasato la testa bloccata nel posto per dissezione e (B) una dettagliata immagine (10 x view) di un mouse dissecata dura che copre la cisterna magna (freccia tratteggiata indica un vaso sanguigno che attraversa la zona e solida freccia Mostra la zona ottimale per inserimento capillare). Immagini dettagliate (vista x 10) (C) affilata punta del capillare di vetro allineato contro dura della cisterna magna, (D), il punto in cui il capillare punture quasi dura, con una certa resistenza da dura e (E), la punta capillare con attacco filettato con il dura per raccogliere CSF. CSF dovrebbe essere un liquido limpido, raccolto nel vetro capillare (freccia tratteggiata). Tutte le barre della scala nella parte inferiore destra di ogni immagine al microscopio indicano 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. CSF collezione da Mouse anestetizzato

  1. Allineare il capillare di vetro alla parte posteriore della testa del mouse in modo che il punto affilato è proprio dietro la membrana a un ~ angolo di 30-45 ° (Figura 2).
  2. Immergere la siringa una volta o poche volte e redige la siringa ~ 100-200 µ l (per assicurarsi che non ci sono nessun contaminanti e non c'è pressione negativa nel vetro capillare).
  3. Utilizzando il micromanipolatore, spostare il capillare punta più vicino alla membrana fino a resistenza può essere visto, ma non puntura (Figura 2D).
  4. Una volta che la resistenza è visto tra la punta del capillare e la membrana, picchiettare delicatamente il tubo capillare attraverso la membrana battendo sui controlli micromanipolatore. Usare il microscopio per vedere il punto affilato della puntura capillare della cisterna. CSF automaticamente deve essere disegnato nel tubo capillare, una volta che l'apertura sia stato punto (Figura 2E).
  5. Lasciare il capillare per raccogliere lentamente CSF. Se il CSF ha smesso di disegno, disegnare lentamente la siringa una piccola quantità (~ 50 µ l) per creare la pressione negativa nel capillare per estrarre fuori il CSF.
    Nota: In alternativa, il capillare può essere delicatamente e lentamente tirato fuori del cervello utilizzando i controlli bene micromanipolatore per consentire CSF di fluire nuovamente nel capillare. Un importo totale di ~ 10-15 µ l di CSF (~ 3-4 cm nel capillare) prende ~ 10-30min e occasionalmente 20 µ l o più possono essere raccolti. Anche se non assolutamente necessario, si consiglia di utilizzare un pad termico durante l'accumulazione di CSF. Accumulazione di CSF è stata eseguita a temperatura ambiente (~ 23 ° C).
  6. Una volta raccolti la quantità di CSF desiderata, chiudere il tubo spostando la valvola a tre vie per chiudere (per interrompere il disegno fuori il CSF).
  7. Estrarre la siringa collegata ai tubi e aprire e chiudere la tubazione (per creare pressione equalizzato in capillare, tubature e l'area esterna del capillare). Ricollegare la siringa con la valvola a tre vie, ma non immergere la siringa.
  8. Rimuovere delicatamente il capillare di vetro dal mouse utilizzando il micromanipolatore.
  9. Posizionare il tubo di raccolta (microprovette da 1,5 mL con 1 µ l di 20x inibitore della proteasi) sotto il punto di affilata del vetro capillare.
  10. Aprire il tubo e immergere delicatamente la siringa: il CSF dovrebbe fluire fuori del vaso capillare e nel tubo di raccolta.
  11. Dopo la raccolta, rapidamente centrifugare (impulsi spin per 5 s alla velocità massima utilizzando una mini centrifuga) CSF per mescolare il campione con l'inibitore della proteasi nella parte inferiore del tubo di raccolta.
    Nota: I campioni di CSF possono essere aliquotati e poi conservati per un'ulteriore analisi a-80 ° C. Il resto del mouse può essere sezionato per altri tessuti, quali il cervello e il midollo spinale. Il mouse è ancora vivo in questa fase e così il sangue anche può essere raccolto, se necessario.

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Representative Results

Utilizzando la procedura descritta qui (Figura 1 e Figura 2), il CSF immediatamente raccolti nel capillare dovrebbe essere chiaro (Figura 2E), non rosa o rosso. Se c'è una rosa a tinta rossa al fluido raccolto nel capillare, poi c'era contaminazione con il sangue.

Come un esempio di applicazione del campione di CSF raccolti con questo metodo, i livelli della proteina beta-amiloide (Aβ) è stata misurata usando ELISA. Livelli di Aβ in CSF viene comunemente misurata nel morbo di Alzheimer ricerca7. CSF è per lo più privo di proteine. In un modello murino di malattia di Alzheimer (APP/PS1 topi), i livelli di umano Aβ42 sono aumentati significativamente, come questi topi dei overexpress umana APP. Questo può essere osservato con i campioni di liquor raccolti da topi di 12 mesi utilizzando i metodi descritti qui (0 pg/mL nel CSF di topi di wild-type (WT) rispetto a 1.303 pg/mL nei topi di CSF di APP/PS1, Figura 3).

Figure 3
Figura 3. Risultati rappresentativi per campione di CSF raccolti. ELISA analisi del campione di CSF raccolti. In un modello murino di malattia di Alzheimer (APP/PS1), c'è un aumento significativo nei livelli di Aβ umano42 nel CSF, come questi topi dei overexpress umano Aβ42 (1.303 pg/mL). Nel selvaggio-tipo (peso) topi ci dovrebbero essere nessun umano Aβ42 rilevato (0 pg/mL). Un spaiati t-test è stato utilizzato per misurare il significato, * * p < 0.01, barre di errore rappresentati come SEM, n = 3 e 4 topi a 12 mesi di età, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora il corrente metodi10 di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media ~ 10-15 µ l può essere ottenuta) dai topi. Rompendosi la punta capillare, la punta del capillare non deve essere troppo piccola (è come allora verranno estratti molto lentamente il CSF) o troppo grande (non sarà abbastanza per raccogliere il CSF bello e tessuto può rimanere incastrato nel capillare). Prestare attenzione quando l'area per accumulazione di CSF di dissezione: qualsiasi sanguinamento deve essere interrotto e l'area per l'inserimento del vetro capillare pulita dal sangue con dH20 per evitare la contaminazione con il campione. L'anatomia di ogni mouse è diverso, ma la maggior parte dei topi hanno 1-2 principali vasi sanguigni che attraversa la zona dove il capillare deve essere inserito per accumulazione di CSF. Scegliendo che il posto giusto per l'inserimento del capillare è importante, come l'inserimento di troppo vicino a vasi sanguigni principali possono contaminare il CSF con il sangue. Come illustrato nella Figura 2, un'area chiara dei vasi sanguigni, così come tra o su entrambi i lati dei principali vasi sanguigni, è ottima per inserimento capillare evitare la contaminazione. Se il CSF non esce a una velocità costante e si ferma dopo un certo tempo, disegno un po' la siringa (~ 50 µ l) può aiutare a riavviare il flusso di CSF in capillare. In alternativa, il capillare stesso può essere spostato delicatamente e lentamente dentro o fuori il mouse con il micromanipolatore di riavviare il flusso di estrazione di CSF. Deve prestare attenzione quando facendo questi passaggi come il sangue può fluire in capillare pure. Questa tecnica funziona bene a causa delle differenze nella pressione del cervello e vetro capillare per disegnare fuori CSF dal mouse. Così, il mouse può solo essere perforato una volta, come dopo il capillare è inserito nel mouse e portato fuori, c'è una perdita di pressione nel cervello e CSF non sarà più essere disegnata in capillare automaticamente se viene inserito nuovamente. Pertanto, la pratica sarà perfetto questa tecnica per non produrre nessun contaminanti di sangue e ottenere adeguata CSF insieme il primo inserimento del capillare nel mouse (da esperienza, topi di 10-20 pratica sarà sufficiente per raggiungere questa fase).

Questo protocollo è un metodo migliore ed efficiente per l'estrazione di CSF da topi e se fatto correttamente, riduce al minimo la contaminazione da sangue (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Questa tecnica è limitata con il tempo preso per CSF essere raccolti. Normalmente, 30 min è necessaria per raccogliere ~ 15 µ l o più di CSF a temperatura ambiente (~ 23 ° C). Durante questo periodo, il mouse può essere tenuto in caldo con cotone o tessuto, ma senza una copertura o un termoforo, CSF può ancora essere correttamente raccolti. Aggiunta di una piastra di calore o riscaldamento il mouse prima che la procedura può migliorare questa tecnica aumentando il flusso di CSF dal cervello e ridurre il tempo necessario per la raccolta, come descritto in altri metodi10,11. Ma nel protocollo descritto qui, è stato utilizzato nessun rilievo di calore o riscaldamento del mouse e fra i topi non c'era alcuna difficoltà per un importo di CSF che potrebbero essere raccolti. Come un esempio dell'applicazione di, che questa tecnica può essere utilizzata, livelli di umano Aβ42 sono stati misurati usando ELISA. Aβ è conosciuto per essere appiccicosa e può aderire al vetro ed i tubi di raccolta. In questo protocollo, tubi capillari in vetro borosilicato e tubi in polipropilene sono stati utilizzati per raccogliere il CSF dai topi. Mentre alcuni Aβ potrebbero aderire al capillare in vetro e le pareti dei tubi di raccolta, ELISA risultati mostrano che i livelli Aβ possono essere misurata (Figura 3). Tuttavia, è una possibilità che Aβ livelli misurati dal CSF raccolti in questo protocollo sono meno rispetto a quanto descritto da altri studi, ma i capillari di vetro sono necessari per perforare attraverso la dura madre del mouse per raccogliere il CSF. Oltre a misurare Aβ, di altre proteine di interesse possono anche essere misurate utilizzando il CSF raccolti.

Mentre il metodo precedentemente pubblicato dell'accumulazione di CSF da Liu et al. 10 è stato significato per la raccolta continua di CSF da topi vivi, il metodo descritto qui è per la raccolta di CSF dai topi per essere sacrificato per analisi e raccolta del tessuto. Così, questa tecnica può essere utilizzata insieme ad altri metodi di dissezione per accumulazione del tessuto del mouse come non influenza il cervello e il midollo spinale e dopo la raccolta di CSF (vale a dire, dopo 10-30 min per ~ 10-15 µ l di CSF), il mouse dovrebbe essere ancora vivo e nell'ambito dell'anestesia. Di conseguenza, altri tessuti quali fegato, cervello, midollo spinale e sangue sono ancora vitali per la raccolta e l'analisi biochimica. Anche se il Liu et al. Metodo raccolti CSF molto rapidamente (10 min per topo per 3-7 µ l di CSF), il metodo qui descritto richiede più tempo, ma può raccogliere più CSF10. Un altro metodo per accumulazione di CSF è stata descritta anche da Maia et al. 11 entrambi il Liu et al. e Maia et al. metodi descrivono raccolta CSF da topi di mano tubi capillari in vetro o gel caricatore consigli e perforatura della cisterna. Il metodo qui descritto si differenzia fissando il capillare di un micromanipolatore. Questo assicura che il capillare è mantenuto immobile e diminuisce la contaminazione da sangue durante l'accumulazione di CSF. Il micromanipolatore, inoltre permette di maggiore precisione e accuratezza nella perforatura della cisterna per ottenere CSF. Sebbene il metodo et al Maia era anche in grado di ottenere 15-20 µ l di CSF per topo, richiede perforatura della cisterna ripetutamente a mano con punte di caricatore di gel, che può aumentare il rischio di contaminazione da sangue o tessuto. Inoltre, il Maia et al metodo può diminuire la pressione nel cervello con ogni sequenziale perforatura cisterna magna, affinché ci sia meno CSF raccolto ogni volta. Il metodo qui descritto comporta solo una puntura e lasciando il capillare della cisterna per raccogliere ulteriori CSF come ricariche con CSF mentre il mouse è sotto anestesia. Così, il protocollo descritto qui continuamente raccoglie CSF e riduce al minimo la possibile contaminazione da punture ripetute nella cisterna magna così come la rottura del tessuto circostante.

Con una maggiore raccolta di campioni di CSF e purezza, ulteriori analisi può essere utilizzata con questo fluido per ulteriori aiuti nella ricerca in neuroscienza. È ben noto tra i ricercatori che la raccolta di CSF da topi può essere noioso e solo un campione limitato può essere ottenuto (solitamente indicato come un massimo di 5-7 µ l6,7,8,9). Nella letteratura, non esistono molti dettagliati protocolli pubblicati per l'estrazione di CSF e questo protocollo migliora su un metodo precedentemente pubblicato10 per minimizzare la contaminazione da sangue, pur mantenendo la raccolta abbondante di CSF. CSF ha molte applicazioni in ricerca in neuroscienza e come uno dei fluidi più vicini ai tessuti del sistema nervoso centrale, è un prezioso esempio per la ricerca. Precedentemente è stato identificato che un topo adulto ha un volume totale di 40 µ l di CSF12. Così, questo protocollo è in grado di ottenere il 25% e forse più della quantità totale di CSF in un topo adulto. Oltre i topi C57BL/6 e APP/PS1 di ceppi inbred, il ceppo nazionali imprinting regione di controllo (ICR) topi sono stati utilizzati anche per raccogliere con successo CSF usando questo protocollo. CSF da topi di varie età (da 4 a 18 mesi) è stato raccolto con successo utilizzando questo protocollo. Così, non ci dovrebbe essere alcuna difficoltà nel raccogliere CSF da diversi ceppi o età dei topi con questo metodo. Questo protocollo dettagliato serviranno si spera da molti per migliorare lo sviluppo di analisi di CSF e altre tecniche di analisi di aiuto nella ricerca per comprendere le malattie neurodegenerative che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

È fondamentale che la testa del mouse essere fissata saldamente, quindi non si muove durante la dissezione e l'accumulazione di CSF (sezione 3 del protocollo). Il sito per la puntura iniziale della cisterna è importante per l'ottenimento di CSF, abbondante e non contaminati. Il capillare non deve essere inserito troppo vicino ai vasi sanguigni per evitare la contaminazione del campione raccolto. Inoltre, la regolazione del capillare è importante per accumulazione di CSF ottimale. L'uso del micromanipolatore consente regolazioni fini essere fatte senza notevolmente interrompendo il tessuto circostante e contaminando il CSF. Utilizzando i controlli bene del micromanipolatore, capillare può essere lentamente spostato in o out per consentire CSF di defluire dal mouse e nel capillare per la raccolta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) e nazionali chiave base ricerca programma della Cina (2013CB530900).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

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References

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