SwarmSight: Echtzeit-Tracking von Insekten Antenne Bewegungen und Rüssel Erweiterung Reflex mit einem gemeinsamen Vorbereitung und konventioneller Hardware

Published 12/25/2017
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Neuroscience
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Nutzung der neuartigen Software, SwarmSight, für Frame-by-Frame-Tracking von Insekt Antenne und Rüssel Positionen von herkömmlichen Web Kamera Videos mit konventionellen Computern. Die kostenlose, Open-Source-Software verarbeitet Bilder etwa 120 Mal schneller als Menschen und führt zu besser als menschliche Genauigkeit.

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Birgiolas, J., Jernigan, C. M., Gerkin, R. C., Smith, B. H., Crook, S. M. SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware. J. Vis. Exp. (130), e56803, doi:10.3791/56803 (2017).

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Abstract

Viele wissenschaftlich und landwirtschaftlich wichtige Insekten verwenden Antennen, um das Vorhandensein von flüchtigen chemischen Verbindungen erkennen und erweitern ihre Rüssel während der Fütterung. Die Fähigkeit, schnell erhalten hochauflösende Messungen von natürlichen Bewegungen der Antenne und Rüssel und beurteilen, wie sie in Reaktion auf chemische, Entwicklungs- und genetische Manipulationen verändern kann helfen, das Verständnis der Insekten Verhalten. Durch die Erweiterung unserer bisherigen Arbeiten zur Bewertung der aggregierten Insekten Schwarm oder Tiergruppe Bewegungen aus natürlichen und Labor-Videos, die mit Hilfe der Videoanalyse-Software SwarmSight, entwickelten wir eine neuartige, freie und Open-Source Software-Modul SwarmSight Anhängsel Tracking (SwarmSight.org) für Frame-by-Frame-Tracking von Insekten Antenne und Rüssel Positionen von herkömmlichen Web Kamera Videos mit konventionellen Computern. Die Software verarbeitet Bilder etwa 120 Mal schneller als Menschen, führt zu besser als menschliche Genauigkeit und, mit 30 Frames pro zweite (fps) Videos können erfassen Riechzentrum Dynamik bis zu 15 Hz. Die Software wurde verwendet, um das Riechzentrum Antwort von Honigbienen auf zwei Gerüche zu verfolgen und fand bedeutende mittlere Riechzentrum Einziehungen Weg von der Geruch Quelle etwa 1 s nach Geruch Präsentation. Wir beobachteten Antenne Position Dichte Wärme Karte Clusterbildung und Cluster und meine Abhängigkeit Winkel von Geruch Konzentration.

Introduction

Die meisten Arthropoden bewegen Antennen oder andere Anhängsel, ökologische Hinweise und Signale in Raum und Zeit zu probieren. Die Antennen können die Tiere ihrer Umgebung navigieren durch das Erkennen von sensorischen Signale wie flüchtigen chemischen Stoffen und geschmackliche und mechanische Reize1,2,3,4. Bei Insekten enthalten die Antennen sensorische Rezeptoren, die an flüchtigen chemischen Stoffen4,5,6 binden und übertragen dieses Signal über olfaktorischen sensorischen Neuronen auf zentrales Gehirn Regionen1,7 ,8,9. Die Insekten können um Informationen zu eingehenden Gerüche4,10,11modulieren Antennen Positionen anpassen. Diese Modulation ermöglicht aktiv informierte Verhaltensreaktionen auf Gerüche und ihre Federn12,13.

Viele Insekten, darunter Hautflügler (z. B. Honigbienen und Hummeln), Schmetterlinge (z. B. Schmetterlinge) und Dipteren (z.B., fliegen und Mücken), unter anderem feed durch die Ausweitung ihrer Rüssel14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Rüssel Erweiterung zuverlässig betätigt wurde in der Vergangenheit für eine Vielzahl von lernen und Gedächtnis Aufgaben22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31. Quantitative Bewertung der Antennen-Bewegung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung könnte in ähnlicher Weise Einblick in die Beziehung zwischen der Reiz, das Verhalten und die inneren Zustand des Tieres ergeben. In der Tat Vorarbeiten hat gezeigt, wie die Riechzentrum Bewegungen enthalten eine reiche Menge von Informationen über Honig Biene-Tracking der Umwelt und wie die Bewegungen ändern mit32,33,34lernen, 35,36,37,38.

In den letzten zehn Jahren wurden Methoden zur Beobachtung von Verhaltens der Tieren stark durch Fortschritte in der hochauflösenden Video-Kameras, Computer, Verarbeitungsgeschwindigkeit und Machine-Vision-Algorithmen, beschleunigt. Aufgaben wie das Tier erkennen, zählen, Tracking und Standortanalysen Präferenz haben mit ausgeklügelte Software, die Videos des Tierverhaltens verarbeiten kann gefördert worden und Extrakt relevanten misst39,40, 41,42,43,44,45,46,47.

Diese Technologien haben auch Verfolgung von Insekten Antenne und Rüssel Bewegungen gefördert. Es ist möglich, dass menschliche Rater einen Mauscursor verwenden, um manuell die Position der Antennen zu verfolgen. Während dieser Methode genau sein kann, die Aufgabe ist jedoch zeitaufwendig, und menschliche Unaufmerksamkeit und Müdigkeit unzuverlässigen Ergebnissen führen können. Spezielle Ausrüstung und Vorbereitung können verwendet werden, um die Notwendigkeit für komplexe Software zu reduzieren. Zum Beispiel ein Setup verwendet eine Hochgeschwindigkeitskamera und malte die Spitzen der Antennen, die Antenne Bewegung48zu verfolgen. Benutzer können auch Schlüssel-Frames des Videos, die Software zu unterstützen, bei der Aufdeckung von der Antenne und Rüssel Standort49auswählen aufgefordert. Ein weiterer Ansatz erkannt die zwei größten Bewegung Cluster um Antennen zu identifizieren, aber es erkennt nicht den Rüssel Lage50. Ein anderes Softwarepaket kann Antenne und Rüssel Standorte erkennen, aber erfordert ca. 7,5 s von Bearbeitungszeit pro Frame51, die unerschwinglich für Echtzeit- oder langfristige Beobachtung Studien sein könnte. Schließlich, es könnte möglich sein, kommerzielle Software-Pakete (z. B. EthoVision) zum Ausführen der Aufgabe46anpassen, ihre Kosten für Lizenzierung und Ausbildung können jedoch unerschwinglich.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren verlängern wir unsere bisherige Arbeit auf Bewegung Analyse Software41 , die Standorte der Insekten Antennen und Rüssel mit den folgenden Zielen zu verfolgen: (1) keine Notwendigkeit, spezielle Hardware oder komplexe tierische Vorbereitung (2). Frame-Verarbeitung in Echtzeit (30 fps oder schneller) auf einem herkömmlichen Computer (3) einfache Verwendung und (4) Open-Source, leicht erweiterbar Code.

Die daraus resultierende neue Methode und Open Source Software, SwarmSight Anhängsel Tracking, erfordert keine Malerei der Antennen-Tipps, kann eine Verbraucher-Web-Kamera verwenden, um Videos und Prozesse video-Frames mit 30-60 fps auf einem herkömmlichen Computer (erfassen ( Abbildung 1). Die Software übernimmt die video-Dateien als Eingabe. Der Benutzer lokalisiert die Position des Kopfes Insekten in dem Video, und nach der Verarbeitung entsteht eine durch Komma getrennte Werte (CSV) Datei mit den Standorten der Antennen und Rüssel. Die Software ist in der Lage Hunderte von verschiedene video-Formate (einschließlich der Formate, die von den meisten Digitalkameras produziert) durch den Einsatz von FFmpeg Bibliothek52lesen.

Figure 1
Abbildung 1: tierische Setup und Software Ausgabe. (A) A Honig Biene Sammler mit seinem Kopf und Körper in einem Kabelbaum zurückgehalten. (B) Geruch Quelle sich vor dem Tier, eine Videokamera befindet befindet sich oben, und eine Vakuumquelle befindet sich hinter dem Tier. (C) die Antenne Tip und Rüssel Variablen erkannt durch die SwarmSight-Software aus dem Video. (D) der Benutzer Positionen den Antenne Sensor über das Tier und passt die Filterparameter. Die Software erkennt die Antenne und Rüssel Positionen (gelbe Ringe).Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Erstens sind ein Insekt Körper und den Kopf in einem Kabelbaum Verhalten, so dass die Antenne und Rüssel Bewegungen leicht (Abbildung 1A) eingehalten werden. Eine Geruch-Quelle wird vor das Insekt mit einer Vakuumquelle platziert hinter, die Gerüche aus der Luft entfernen und minimieren potenzielle Auswirkungen der sensorischen Adaption (Abbildung 1 b) aufgestellt. Eine herkömmliche Webkamera wird über das Insekt Kopf auf einem Stativ platziert. Eine LED kann positioniert werden, innerhalb der Kamera-Ansicht, um anzuzeigen, wenn der Geruch präsentiert wird.

Figure 2
Abbildung 2: Antenne Koordinatensystem. X, Y-Werte der video Koordinatensystem verwenden, wo ist oben links den Ursprung und die X- und Y-Werte erhöhen, wenn in Richtung der unteren rechten Ecke. Winkel werden in Grad in Bezug auf die Vorderseite des Kopfes (in der Regel die Geruch-Quelle) ausgedrückt. Dem Wert "0" bedeutet, dass die Linie gebildet durch die Antenne Flagellum direkt vor das Tier weist. Alle Winkel sind positiv, außer wenn eine Antenne weist auf die entgegengesetzte Richtung (z. B. richtige Flagellum Punkte auf der linken Seite). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Nach den Dreharbeiten, wird die Videodatei mit der SwarmSight-Software geöffnet, wo der Benutzer Positionen der Antenne Sensor Widget (Abbildung 1, schwarzes Quadrat) über den Kopf des Insekts und beginnt die Videowiedergabe. Wenn die Ergebnisse gespeichert werden, die CSV-Datei enthält die X-und Y-Positionen der Antenne-Tipps, die Antenne Winkel im Verhältnis zu der Vorderseite des Kopfes (Abbildung 2) und den Rüssel X, Y-Position. Darüber hinaus wird eine dominierende Sektor Metrik für jede Antenne berechnet. Die metrische zeigt, die welche der fünf 36-Grad-Sektoren rund um jede Antenne die meisten Punkte enthalten als wahrscheinlich die Antennen und können nützlich sein, wenn die Antenne Positionswinkel/Metriken nicht zuverlässig durch laute oder anderweitig problematische Videos sind.

Kurz gesagt, funktioniert die Software mithilfe eines Satzes von Bewegung Filter53 und eine entspannte Flut Füllung Algorithmus54. Zwei Filter werden verwendet, um wahrscheinlich Antenne Punkte zu finden: eine 3-Mal in Folge-Frame Unterschied Filter41,55 und Median Hintergrundabzug56 Filter. Schwelle Farbfilter Abstand dient zur Erkennung Rüssel. Die oberste 10 % der Punkte der einzelnen Filter kombiniert, und ein Flut-Füllung-Algorithmus, der zusammenhängenden Punkte mit Lücken bis zu 2 Pixel (px) inspiziert lokalisiert Extrempunkte. Parallele Dekodierung Frame, Verarbeitung, und Rendering-Pipelines und optimierte Speicher Zuweisung des Datenflusses Filter hohen Leistung erreicht. Die rohen x und y Koordinatenwerte produziert von der Software sind nach der Verarbeitung mit einem 3-Frame rollenden Medianfilter57 (siehe Diskussion). Die Anweisungen, um den vollständigen Quellcode herunterzuladen finden Sie Online-58.

Unten ist ein Protokoll zur Antenne tracking ein Honig Biene Forager Vorbereitung. Ein ähnliches Protokoll könnte verwendet werden, um die Antenne/Rüssel Bewegungen des anderen Insekts zu verfolgen. Im Abschnitt "Ergebnisse" beschreiben wir eine Probe Antenne Trace-Ausgabe, die von der Software, der Vergleich der Software-Ausgabe auf Tracking durchgeführt durch menschliche Rater und Bewertung des Antennen-Bewegung als Reaktion auf fünf Geruchsstoffe erkannt wird.

Protocol

(1) fangen Sie und nutzen Sie der Honigbienen

  1. Die Schritte Protokoll 1 bis 3.1.1 von Smith und Last59.

2. Vorbereitung der tierischen Kabelbaum und Videokamera

  1. Verstecken Sie die Beine mittels Klebeband über der Oberseite des Rohres Kabelbaum, visuell inspizieren, dass Beine bewegt sich von oben gesehen werden können.
  2. Zurückhalten des Kopfes durch Auftragen von beheizten Wachs auf der Rückseite des Kopfes Insekt. Überprüfen Sie, dass der Kopf fest und nicht bewegen. Die Antennen und die Mandibeln sollte zu diesem Zeitpunkt die einzige Gliedmaßen frei bewegen.
  3. Maximieren Sie Kontrast zwischen den Antennen und die video-Hintergründe, indem man ein weißes Blatt Papier unter den Insekten Kabelbaum. Um die Notwendigkeit einer Anpassung später die Kamera zu minimieren, das Insekt Gurtzeug auf dem Papier eine Markierung, und platzieren Sie neue Personen an der gleichen Stelle.
  4. Befestigen Sie die Kamera-Position mit einem Stativ oder einer Webcam-Halterung die Kamera über das Insekt Kopf platzieren. Mit Hilfe der Kamerasoftware, das Video, und vergrößern Sie das Kopf Bild, so dass für einen Abstand von ~ 20-30 % auf allen Seiten des Videos vergrößern.
    1. Sicherstellen Sie, dass die einzige bewegte Objekte in der Kameraansicht die Antennen oder Rüssel/Mandibeln sind und positionieren Sie die Kamera oder das Tier, wenn nötig.
      Hinweis: SwarmSight sucht nach Bewegung in Pixel um den Kopf. Irrelevante Bewegungen in unmittelbarer Nähe des Kopfes verursacht durch Objekte wie Beine, Schatten, Fans oder Menschen kann verwirren, die Software und stellen zusätzliches Rauschen.
  5. Minimieren Sie Antenne Schatten durch Umgebungslicht anpassen.
    Hinweis: Die Software kann einige Schatten vertragen, aber die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten sie auf ein Minimum gehalten werden.
  6. Verhindern Sie Automatikkamera Belichtungskorrekturen durch Shutter Geschwindigkeit Kamerasoftware, um die Belichtungszeit der Kamera in den Video konstant zu halten. Passen Sie mithilfe der Software die Verschlusszeit um Kontrast (video Szene nicht zu hell oder zu dunkel), zu maximieren durch Anpassen der "Regler"Belichtung "" unter "Webcam Einstellungen."
    Hinweis: Die oben genannten Anweisungen beziehen sich auf die Webcam und Software verwendet. Diese müssen angepasst werden, wenn andere Webcams verwendet werden.
  7. Legen Sie die Geruch-Lieferung-Quelle und sicherzustellen Sie, dass es die Kamera-Ansicht nicht behindert wird, durch die Überprüfung der Kamera video-Feed. Sicherstellen Sie, dass eine Vakuumquelle sich auf der gegenüberliegenden Seite befindet, die Impulse Gerüche entfernen.
  8. Legen Sie eine LED oder einige andere visuelle Anzeige, die Helligkeitsänderungen um Geruch Lieferung innerhalb der Kamera-Ansicht anzuzeigen.
    Hinweis: Die LED-Helligkeit-Wert wird von der Software gespeichert und kann verwendet werden, um die genauen Rahmen zu bestimmen, wann die Geruch Lieferung beginnt und endet.

3. film jeden einzelnen unter experimentellen Bedingungen

  1. Film, den jeder einzelne Insekt und Test Bedingung in anderen Video Dateien durch Aufnahme jedes einzelnen Tests Kombination separat oder über video editing-Software, eine lange video-Datei in kleinere Dateien aufteilen.
    Hinweis: Die Software benötigt den Benutzer die Position des Kopfes in jedem Video, und der Kopf fixiert bleiben zu finden. Wenn der Kopf bewegt, wird zusätzliches Rauschen eingeführt werden. Die Batch-Verarbeitung-Funktion des SwarmSight ermöglicht dem Benutzer, schnell die Position des Kopfes für mehrere Videos eingestellt und wird davon ausgegangen, dass das Insekt Kopf für die Dauer der einzelnen video-Datei fest bleibt. Online-60finden Sie Anweisungen zur lange video Dateien aufgeteilt.

4. video-Analyse

  1. Downloaden Sie und installieren Sie das Modul "Antenne Tracking" anhand der Schritte zur Verfügung gestellt Online-58.
    Hinweis: Video-Tutorials beschrieben wird, wie zur Nutzung der Software sind auf der Website sowie zur Verfügung.
  2. Öffnen Sie eine video-Datei zeigt eine gefilmte Tier mithilfe der Schaltfläche "Durchsuchen".
  3. Positionierung der Antenne Sensor und Behandlung sensor
    1. Sobald das Video geladen wird, positionieren Sie das rechteckige "Antenne-Sensor"-Widget über den Kopf des Tieres, indem Sie die Rotation und Skalierung Symbole das Widget mit dem Kopf ausrichten (siehe Abbildung 1 zum Beispiel).
    2. Positionieren Sie das kreisförmige "Behandlung Sensor"-Widget über die LED, die anzeigt, wenn der Geruch oder Reiz präsentiert wird.
      Hinweis: Die Behandlung-Sensor zeichnet den Helligkeitswert des Pixels in der Mitte des Widgets für jeden Frame.
  4. Starten video-Verarbeitung
    1. Drücken Sie die Taste "Play" (schwarzes Dreieck) in der unteren linken Ecke auf die Analyse der Bilder zu starten.
      Hinweis: Die erkannten wahrscheinlich Antenne und Rüssel Punkte werden gelb markiert. Die gelbe Ringe zeigen die Lage der Tipps der Gliedmaßen. Die Winkel (wo 0 befindet sich direkt vor dem Tier) der Antenne und der Rüssel Auszugslänge in das "Modell"-Widget in der unteren linken Ecke angezeigt werden (siehe Abbildung 1). "Dominante Sektoren" Widget in der rechten unteren Ecke zeigt die relative Intensität der fünf Sektoren, 36 Grad wo die meisten Punkte der Antenne wurden erkannt. Die dunkelsten Bereiche enthalten die meisten Punkte, während die leichteste die wenigsten haben. Die Sektornummer (1-5) mit den meisten Punkten wird in den unteren Ecken des Widgets angezeigt (siehe Abbildung 1).
  5. Anpassung der Schwellenwerte der Filter und das Hinzufügen von Sperrzonen
    1. Um die Empfindlichkeit der Filter ändern, passen Sie die Schieberegler im Abschnitt "Filter" auf der rechten Seite.
      Hinweis: Je nach Lichtverhältnissen und allgemeine Bewegungsgeschwindigkeit der Gliedmaßen, verschiedene Filter Empfindlichkeiten optimal werden. Der Benutzer kann die optimalen Werte gefunden, durch Anpassen der Werte und beobachten die hervorgehobenen Bereiche in der Antenne Sensor Widget. Wenn ein idealer Satz von Empfindlichkeiten gefunden wird, werden nur das Anhängsel hervorgehoben. Es wird empfohlen, auf andere Teile des Videos vorspulen um sicherzustellen, dass die Filter-Empfindlichkeiten optimal, auch gibt es.
    2. Optional, um irrelevante Objekte auf der rechten Seite zu ignorieren erweitern die "Antenne" Sondenteil, klicken Sie auf "Add Sperrzone" button (siehe Abbildung 1), und klicken Sie auf eine Reihe von Punkten eine rote Polygon bilden den Inhalt, indem ignoriert werden die Software.
      Hinweis: Wenn das Video überflüssige Bewegung enthält und die Bewegung innerhalb der Antenne Sensor Widget Zone (z. B. bewegte Beine, starke Schatten, Laborgeräte, etc.), kann die Software es Anhängsel Bewegung verwechselt.
Die irrelevante Objekte können ignoriert werden, indem man rote Polygone oder "Sperrzonen". Alles in einem roten Polygon wird nicht für die Verfolgung verwendet werden.
  • Speichern der Ergebnisse
    1. Sobald die Filter und Widgets eingerichtet haben, das Video stoppen, starten Sie es von Anfang an und bis zum Ende spielen.
      Hinweis: Wenn das ganze Video abgespielt wurde, werden die Positionen der Gliedmaßen für alle video-Frames im Speicher gespeichert.
    2. Um die Anhängsel Positionsdaten in einer Datei speichern, erweitern Sie den Abschnitt "Speichern" auf der rechten Seite, und klicken Sie auf "Speichern auf." CSV"-Taste. Dann wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datei.
      Hinweis: Die "speichern. CSV"Taste wird die Verarbeitungsergebnisse in eine CSV-Datei speichern. Standardmäßig der Benutzer die CSV-Datei in demselben Ordner wie die Videodatei speichern angeboten werden und muss ein Datum und eine Uhrzeit als Teil des Dateinamens. Die daraus resultierende CSV-Datei enthält einen Satz von Spalten, die Informationen über die Position der Gliedmaßen, einschließlich der Antenne Winkel und dominierenden Sektoren sowie die Ausrichtung und Position des Kopfes enthalten. Die Beschreibung der einzelnen Spalten Online-61.
    3. Optional, verwenden Sie die Wert(e) Felder und Spalten (s) im Abschnitt speichern um eine zusätzliche Spalte (oder mehr, wenn durch Kommas getrennt) in der CSV-Datei zum Aufzeichnen von Informationen, wie z. B. Betreff-ID oder der Name einer experimentellen Bedingung zu erstellen.
      Hinweis: Der Wert im Feld Spalten erscheint in der Kopfzeile der ersten Spalte und der Wert im Feld Wert(e) in allen Zeilen der ersten Spalte wiederholt wird.
  • Batch-Verarbeitung
    Hinweis: Die Software kann mehrere video-Dateien in einem Batch verarbeiten. Allerdings muss der Benutzer die Kopf Standortinformationen für jedes Video vor dem Start des Batchs angeben.
    1. Klicken Sie auf "Batch Processing" um ein Fenster zu öffnen, in dem Erstellen einer Liste von video-Dateien nacheinander von der Software verarbeitet werden, auf der rechten Seite, im Abschnitt "Video-Dateien".
    2. Die Schaltfläche "Hinzufügen mehr Video Dateien zu Charge", wählen Sie eine oder mehrere video-Dateien in der Batch-Liste aufgenommen werden.
    3. Optional, die Tasten Sie "Strg" oder "SHIFT", mehrere Videos auszuwählen, die den gleichen Satz von Widget-Parameter verwendet werden.
      Hinweis: Gute Kandidaten für die Parameter Wiederverwendung sind Sätze von Videos von das gleiche Tier, das nicht zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen verschoben wurde.
    4. Parametrierung der Widget für die ausgewählten Videos verwendet werden, durch Anklicken des Buttons "Set Sensor Positionen für ausgewählte" zu starten.
    5. Stellen Sie die Parameter in der Antenne Sensor, Behandlung Sensor, Filter, oder speichern Sie Abschnitte zu, und klicken Sie auf "Speichern Parameter zu Charge" Wenn fertig.
    6. Nachdem Sie die Parameter für jedes Video ausgewählt haben, starten Sie die Batch-Verarbeitung durch Anklicken der Schaltfläche "Start Processing".
      Hinweis: Die Software wird die video-Dateien in der Reihenfolge geladen, in dem sie erscheinen in der Batch-Liste, verarbeiten und speichern ihre entsprechenden CSV-Dateien im selben Ordner befinden sich die video-Dateien. Ein Fortschrittsbalken an der Spitze bieten eine geschätzte Zielzeit, nachdem das erste Video abgeschlossen ist.
  • Representative Results

    In den folgenden Abschnitten werden beispielhaft Grundstück von Antennen Winkel erzeugt aus den Daten der Software, Vergleich der Software Genauigkeit und Geschwindigkeit mit menschlichen Rater und die Ergebnisse eines Experiments, wo Honig Biene Antenne Bewegung sich nach Vorstellung des richtet, verschiedene Gerüche. R Software62,63 wurde verwendet, um die Analyse durchführen und die Figuren zu erzeugen. R-Code für Analyse und Abbildung Generation sowie video-Tutorials finden Sie Online-58.

    Software-Ausgabe:

    Abbildung 3 zeigt fünf zufällig ausgewählte Spuren der Antenne Winkel erkannt durch die Software von Videos von Honigbienen präsentiert mit rein und 35 X Mineral Öl verdünnt Versionen von heptanal und Heptanol sowie saubere Luft.

    Figure 3
    Abbildung 3: fünf Probe Spuren von Antennen Winkel erkannt durch SwarmSight. Y-Achse zeigt Antenne Winkel in Grad, wo "0" direkt vor dem Tier, in Richtung der Quelle Geruch mit größeren Werten, von der Quelle der Geruch Weg ist. 3.600 ms Windows zu einzelnen Honig Biene Sammlerinnen wurden während der grau 0 - Heptanol, heptanal, und ihre 35 x Mineral Öl verdünnt Versionen sowie saubere Luft angewandt. Linken Antenne ist rot, rechts blau markiert markiert. In den fünf Parzellen sind fünf zufällige Bienen, eins von jedem Zustand dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Software-Validierung:

    Um zu überprüfen, dass die Software zuverlässig, die Standorte der Antennen erkennen wurden Antennenpositionen befindet sich vom Menschen mit den Positionen von der Software verglichen. Zwei menschliche Rater wurden gebeten, die Antenne und Rüssel Tipps in 425 Videoframes zu finden (~ 14 s Video). Eine benutzerdefinierte Software-Modul aufgenommen die Anhängsel Standorte, markiert durch die Rater, automatisch erweiterte video-Frames, und der Zeitaufwand für den Vorgang. Als ein Beispiel der Korrespondenz zwischen Mensch und Software liegt Werten überlagert vertikale Koordinate Spuren von einer Antenne für die Software und die beiden menschlichen erkannten Standorte sind in Abbildung 4Adargestellt. Der Abstand zwischen die zwei Rater markierten Antennenpositionen wurde berechnet und "Zwischenmenschliche Distanz." Der Abstand zwischen den Antennenstandort von der Software erkannt und der nächstgelegene Ort erkannt durch die menschliche Rater wurde berechnet und "Software-nächste menschliche Distanz" (Abbildung 4 b).

    Figure 4
    Abbildung 4: Vergleich mit menschlichen Rater. (A) zwei menschliche Rater und SwarmSight gelegen Antenne Tipps in 425 Videoframes. Die Frame-by-Frame linken Antenne Tipp Y Koordinaten gefunden, indem die menschliche Rater und Software überlagert. (B) Frame-by-Frame Meinungsverschiedenheiten (Abstand im video Pixel) zwischen menschlichen Rater (orange) und die Uneinigkeit zwischen Software und engsten menschlichen Rater Wert (schwarz) überlagert. (C) Mensch vs. menschliche Antenne Tipp Standorte (orange) und Software vs. menschliche Standorte (schwarz). (D) Histogramme und kumulative Verteilungen (gestrichelt) von Menschen gegen Menschen und Software vs. menschliche Frame-by-Frame Uneinigkeit Entfernungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Zwischenmenschlichen Abstand betrug 10,9 px im Durchschnitt innerhalb von 55,2 px in 95 % der Rahmen, und hatte einen maximalen Wert von 81,6 px. Die Software-nächste menschliche Distanz war 8.0 px im Durchschnitt innerhalb von 18,3 px in 95 % der Rahmen, und hatte einen maximalen Wert von 49,0 px (siehe Entfernung Histogramme in Abbildung 4und Abbildung 4). 5 px war etwa die Breite einer Antenne. Insgesamt die zwischenmenschlichen Distanz war klein für die Frames am Anfang des Vorgangs, und stieg in der zweiten Hälfte der Aufgabe. Wir vermuten, dass dies aufgrund von Ermüdung Rater war. Unterdessen blieb Software am nächsten menschlichen Abstand Ebenen während der Aufgabe konstant.

    Software-Geschwindigkeit und Genauigkeit Vergleich mit menschlichen Rater:

    Menschen mit Antenne Tipp und Rüssel Standorten mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,52 Frames pro Sekunde (fps) bewertet. Um menschliche fps abschätzen zu können, war die Gesamtzahl der Frames bewertet von Menschen (425) dividiert durch den gesamten Zeitaufwand für die Aufgabe (873 s und 761 s). Die Software bewertet die Frames bei 65 fps im Durchschnitt auf einem Dual-Core Windows 7 PC. Zusammen mit hoher Prozessgeschwindigkeit und Genauigkeit vergleichbar oder besser als menschliche Rater rechnen die Software die Arbeit etwa 125 Menschen Rater pro Zeiteinheit auszuführen.

    Erkennung der Antenne Reaktion auf Gerüche:

    Um zu demonstrieren, dass das Protokoll verwendet werden kann, um erhebliche Verhaltensunterschiede in Insekten Bewegung zu erkennen, unterzogen wir 23 weiblichen Honigbienen zu zwei unterschiedlichen Gerüchen. Pure heptanal und Heptanol, 35 x Mineralöl Verdünnungen der beiden Gerüche und saubere Luft als das Steuerelement präsentierten sich jeweils für 4 s (fünf Bedingungen insgesamt). Videos, wie im obigen Protokoll beschrieben mit SwarmSight Software verarbeitet wurden und die Antenne Winkel analysiert (Abbildung 5).

    Figure 5
    Abbildung 5: Antenne Winkel bedeutet und Dichte Wärme Karten für fünf Geruch Bedingungen. (A) Heat Karten zeigen Antenne Winkel Dichte vor, während (dunkler Mittenbereich), und nach der Verabreichung von Heptanol, Luft und heptanal Geruchsstoffe zu weiblichen Honigbienen (n = 23). Schwarzen Kurven sind pro Frame durchschnittliche Antenne Winkel (beide Antennen). Horizontale Linien sind Pre-Geruch bedeuten (Baseline) Winkel. Merken Sie den Block der bevorzugte Antenne Standorte (rote Cluster im unteren Grundstück) Weg von der Geruch Quelle reiner Geruch Bedingungen, auch entsprechende Änderungen auf die mittlere Antenne Winkel.Beachten Sie auch die "Rebound"-Cluster nach Abschluss der Geruch und die scheinbare Beginn Abhängigkeit Geruch Konzentration (siehe Cluster-Standort in den anderen vier Parzellen). Dichte Wärme Kartenfarbskala ist willkürlich aber einheitlich über alle Bedingungen. (B) mittlere Winkeländerung von Pre-Geruch Mittelwert (Fehler bars S.E.M). Außer Luft, alle meine Änderungen waren signifikant (t-test p < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Video-Frames aus 9 s-Segmente von Video bestehend aus 3 s vor dem Geruch auftreten, 3.6 s Geruch Präsentation und 2,4 s nach Geruch Abschluss für alle Einzelpersonen und Bedingungen (300 Frames/Segment) ausgerichtet waren. Die pro-Frame beide Antenne Winkel aller Individuen wurden berechnet für jede Bedingung und genannt "Meine Seiten" (Abbildung 5A, schwarzen Kurven). Die mittlere Antenne Winkel von Frames vor dem Geruch auftreten über Einzelpersonen für jede Bedingung waren berechnet und nannte "Pre-Geruch Baselines" (Abbildung 5A, dünne horizontale Linien).

    Unter allen Bedingungen, außer Kontrolle stieg die mittlere Winkel von Baselines, jede erreichte einmal 750-1.050 ms nach dem Geruch einsetzen (Abb. 5A, schwarzen Kurven 0 - 3.600 ms-Region). Der mittlere von Basislinien wurden getestet auf Signifikanz (Abbildung 5 b) durch den Vergleich der zwei-Antennen-Mittel von Individuen auf dem Höhepunkt Geruch-Präsentation mittlere Winkel jeder Bedingung der Grundlinie Mittelwert mit einer Reihe von 1-Sample t-tests () Shapiro Normalität testet nicht signifikant unter allen Bedingungen). Die mittlere Winkeländerung gegenüber dem Ausgangswert betrug 26,9 ° für reine heptanal (Mittelwert Spitze bei 750 ms nach Geruch auftreten), 21,1 ° heptanal (bei 990 ms), 0,2 m 19,6 ° für reine Heptanol (bei 1.050 ms), 19,3 ° für 0,2 M Heptanol (bei 780 ms) und 3,45 ° für Air Control (ohne Spitze). Unter allen Bedingungen, außer Kontrolle, war die mittlere Winkeländerung gegenüber dem Ausgangswert signifikant (Holm eingestellt p < 0,05). Wir stellen fest, dass der mittlere Winkel zurück zum Grundlinie als Reaktion auf reine Geruchsstoffe als zu verdünnten Geruchsstoffe länger dauert (Tiefpass-gefilterten Mittelwert zurück zu Baseline 3.690 ms nach Geruch auftreten für reine und bei 2.940 ms für verdünnte Heptanol; für heptanal, Rückkehr Zeiten waren 4.260 ms für rein und 3.000 ms für verdünnten Versionen).

    Visualisierung mit Heatmaps:

    Für jede Bedingung waren zu visualisieren, die Antenne Antworten, Antenne Winkel Dichte Heatmaps erzeugt (Abb. 5A, Blau-roter Hintergrund). Antenne-Winkel über die 10 s-video-Segmente für jeden einzelnen pro Zustand wurden mit einem "glockenförmig" Kernel (R-Paket Masse, kde2d Funktion64) gefaltet. Blaue Bereiche zeigen niedrige dichten Antenne Winkel, während rote Bereiche hohe Dichten von Antenne Winkel anzeigen. Die Heatmap in der unteren Handlung des Abbildung 5A für den reinen heptanal Zustand zeigt das Verhalten der Antenne.

    Die Karte zeigt, dass bevor der Geruch dargestellt wird (t < 0), die Antenne Winkel Dichte relativ gleichmäßig verteilt in allen Winkeln. Etwa 1 s nach dem Geruch auftreten (t ~ 1.000 ms), ein paar blaue und rote Cluster erscheint. In schattigen Bereichen rot, fanden sich die Antennen mehr häufig als in schattigen Bereichen blau. Die blauen Cluster zeigt, dass Antennen kleinere Winkel tendenziell (Geruch Quelle befand sich in Richtung 0 Grad), während die rote vermeiden Cluster weist darauf hin, dass Antennen größere Winkel (vom Geruch Quelle bevorzugt). Der rote Cluster verschwindet allmählich wie die Geruch Präsentation beibehalten wird. Ein anderes rot, wenn auch weniger intensiv, Cluster erscheint etwa 1 s nach Abschluss der Geruch. Wir nennen die zweite rote Cluster "Rebound-Cluster". In Übereinstimmung mit der mittlere Winkel-Recovery-Zeiten oben, wir beachten Sie, dass die Rebound-Cluster scheinen früher erscheinen und sind weniger intensiv für verdünnte Gerüche als für reine Gerüche.

    Discussion

    Die hier vorgestellte Methode ermöglicht Echtzeit-Verfolgung von Insekten Antenne und Rüssel Bewegungen ohne besondere Tierpräparate oder Hardware.

    Einschränkungen:

    Trotz dieser Vorteile gibt es einige Einschränkungen der Methode. Dazu gehören die Anforderung, dass der Kopf des Tieres aus Bewegung, muss der Benutzer die Position und Ausrichtung des Tieres für jedes Video auswählen eingeschränkt ist die Forderung nach Zugang zu einem Windows-Computer und die Software Unfähigkeit zu verfolgen Bewegung in drei Dimensionen (3D) und in einigen visuell mehrdeutige Anhängsel Positionen beschrieben.

    Die Software erfordert, dass der Kopf des Tieres fixiert ist und sich nicht während des Videos bewegt. Dies ist vergleichbar mit den Vorbereitungen der vorherigen Arbeit48,49,50,51. Es ist möglich, die automatische Erkennung von Kopfdrehungen ermöglichen anzupassen, dies würde verbrauchen zusätzliche Bearbeitungszeit und eine neue Fehlerquelle vorstellen. Würden die modifizierte Software die Rotation des Kopfes nicht richtig erkennen, würde dies die Antennen-Winkel beeinträchtigen, da ihre Berechnung im Verhältnis zu den Kopf Drehwinkel ist. Derzeit, wählt der Benutzer die Ausrichtung des Kopfes einmal pro Video. Dieser Ansatz minimiert während nicht ohne menschliches Versagen, Winkel Berechnungsfehler, wenn der Kopf nicht zulässig ist, während das Video bewegen.

    Die Software erfordert auch ein Windows 7 (oder höher) Operating System (OS). Ziel war es, machen die Software einfach zu installieren, einrichten und verwenden von Benutzern ohne Programmier- oder anspruchsvolle EDV-Verwaltung-Kenntnisse. Wir beschlossen, Ziel Windows, denn es weit verbreitet ist, und in Fällen, wo Zugriff darauf beschränkt ist, virtuelle Maschinen (z. B. VirtualBox, VMware, Parallels) mit Windows leicht erstellt werden können. Diese Wahl der OS stark vereinfacht die Software-Installation durch eine einfach zu bedienende, command-line-freie Installer und vermeidet Fehler, die spezifisch für verschiedene Betriebssysteme.

    Die Software verfolgt nur die Position der Gliedmaßen im 2D-Raum. Insekten sind dafür bekannt, ihre Antenne bewegen in 3D, was bedeuten könnte, dass wichtige Informationen verloren geht, wenn nur 2D Koordinaten gemessen werden. Während die Verwendung von mehreren Kameras oder Spiegel helfen konnte, die zusätzliche benötigte Angaben für 3D Lokalisierung zu sammeln, ist es möglich, mit dem Einsatz von trigonometrischen Beziehungen, eine geschätzte Out-of-Plane-Position durch Berechnung geht man davon aus, dass die Antennen sind einzelne Liniensegmente konstanter Länge und nur auf einer Seite der Kameraebene bewegen. Für Honigbienen diese Annahme gilt, grobe Schätzungen für die Position in 3D zu erhalten, aber nicht notwendigerweise der Fall wäre für andere Arten und Situationen.

    Die Software wird nicht korrekt erkennen, die Antennen und Rüssel Tipp Standorte in einige unklare Situationen. Wenn ein Tier eine Antenne bewegt sich so, dass in dem Video, es einen längeren Rüssel überlappt, erkennt die Software wahrscheinlich die Spitze der Antenne als die Spitze der Rüssel. Der Antenne Winkel wird jedoch nach wie vor wahrscheinlich richtig (aus dem nicht-überlappende Teil) berechnet werden. In ähnlicher Weise bewegt sich die Antenne Tipps direkt über dem Kopf des Tieres (d. h. nicht an den Seiten) könnte dann die Software nur erkennen, die Teil der Antenne, die außerhalb der Kopf sichtbar ist übernehmen die früheren Standort der Antenne oder unechte zu erkennen Bildrauschen als Antennenstandort. In beiden Fällen haben auch die menschliche Rater Schwierigkeit anspruchsvolle die Antenne aus dem Rüssel oder den Kopf. Um dieses Problem zu umgehen, empfehlen wir, Anwenden eines 3-Frame, symmetrischen rollenden Median57 Filters auf die rohen X und Y Koordinaten durch die Software produziert. Dieser Filter entfernt große transient (Einzelbild) Position Schwankungen und längere Antenne Position Bewegungen bewahrt. Wir haben festgestellt, dass der 3-Frame-Filter entwickelten sich besser als kein Filter, während die breitere Filter (z. B. 5, 11 oder 15 Frames) Genauigkeit reduziert. R-Beispielcode, der Filter und ein video-Tutorial verwendet, finden Sie Online-58.

    Wert als ein wissenschaftliches Instrument:

    Die Verfügbarkeit einer Methode schnell genaue Insekt Anhängsel Bewegungen in einer kosteneffektiven Weise zu erhalten, hat das Potenzial, Erschließung neuer Untersuchung.

    Rüssel Erweiterung Reflex (PER) ist eine häufig verwendete Verhaltensreaktion, lernen und Gedächtnis einer Vielzahl von Insekten59zu untersuchen. Frühere Studien haben in der Regel auf eine binäre verlängert oder nicht-Maßnahme von PER, verlassen, obwohl Video- und elektromyographische Untersuchungen, viel komplexere Topologien Rüssel Bewegungen65,66 gezeigt haben. Die Methode hier ermöglicht schnelle Quantifizierung der Rüssel Bewegungen in hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

    Insekt Antenne Bewegungen als Reaktion auf Gerüche sind kaum erforscht. Ein Grund dafür ist, dass die Antennen sind in der Regel so schnell bewegen, dass kostengünstige, automatisierte Mittel zur Antenne Bewegungsdaten zu erhalten nicht verfügbar ist. Die hier vorgestellte Methode ließe sich schnell Antenne Bewegungsdaten für eine große Anzahl von Insekten in eine große Anzahl von Bedingungen zu erhalten. Dies könnte zum Beispiel Forscher untersuchen die Zuordnung zwischen Antenne Bewegungen in Reaktion auf verschiedene Reize, insbesondere flüchtige Gerüche Beihilfen. Mit Kameras, die Bilder bei 30 Hz zu erfassen, die Software kann verwendet werden, um Riechzentrum Bewegungsdynamik charakterisieren bis zu 15 Hz (Nyquist-Grenze). Bei Bedarf Charakterisierung in höheren Frequenzen könnten Kameras mit höheren Datenerfassungsraten (z. B. 60 oder 120 fps) genutzt werden. Jedoch möglicherweise ein schneller Rechner müssen höhere fps-Videos in Echtzeit zu verarbeiten. Wir spekulieren, dass Klassen von Gerüchen und vielleicht sogar einige einzelne Gerüche charakteristischen angeborene Riechzentrum Bewegungen haben. Wäre diese Klassen oder Verbindungen entdeckt, unbekannte konnte Gerüche oder ihrer Klasse aus Riechzentrum Bewegung der ungeübte Insekten nachgewiesen werden. Wenn solch eine Zuordnung vorhanden ist, sollte die Kombination von ausreichend Antenne Bewegungsdaten und State-Of-The-Art Machine learning Algorithmen beginnen, um es zu entdecken. Auch, wie diese Zuordnung als Reaktion auf Lernformen im Laufe der Entwicklung verändert oder gestört ist mit könnten genetische Interventionen Einblick in die Funktionen des olfaktorischen Systems anbieten.Schließlich könnte diese Arbeit geben Einblick in künstliche Erkennung von Gerüchen, wenn es optimale Probenahmeverfahren für Gerüche in komplexen Umgebungen zeigt.

    Zukünftige Arbeit:

    Hier zeigten wir, dass die Antenne Bewegungsdaten schnell gewonnen und analysiert werden können: bedeutende Verhalten Antworten aus den Daten generiert durch unsere Software erkannt werden, und mehrere Bereiche der weiteren Untersuchung ermittelt wurden.

    Die Zeit Kurse der Reiz ausgelöst Antenne Winkel Abweichungen und Wiederherstellung zur Grundlinie und Reiz-Abschluss Rebound-Effekte und seine Abhängigkeit auf Geruch Konzentration untersucht und mathematisch modelliert werden können. Darüber hinaus Änderungen der Antenne Bewegungen induziert durch begehrliche oder aversive Konditionierung auch mit der Software beurteilt werden kann.

    Bessere Differenzierung von Gerüchen zu erkunden. In dieser Studie, Gerüche, in reiner und 35 x verdünnten Versionen entlockte ähnliche Reaktionen: die Antennen im Durchschnitt schien schnell weg von der Quelle Geruch zurückziehen und vor Geruch Basislinien nach ein paar Sekunden zurück. Wir spekulieren, dass sogar die verdünnten Versionen sehr starke olfaktorische Reize für die Honigbienen gewesen sein mag. Wenn "true", könnte eine breitere Palette von Konzentrationen verwendet werden, um festzustellen, ob die Riechzentrum Antworten die Gerüche unterscheiden. Darüber hinaus kann komplexere Analyse Unterschiede im Riechzentrum Bewegungen als Reaktion auf verschiedene Gerüche besser offenbaren. Wir haben die Datendateien verwendet, um Zahlen in diesem Manuskript zur Verfügung, um interessierten Forscher auf der SwarmSight Webseite67generieren.

    Darüber hinaus konnte zwar nicht in den Anwendungsbereich dieser Handschrift, die Software erweitert werden um Videos von Tieren platziert in Kammern mit zwei Spiegeln, die Winkel von 45° (siehe Abbildung 1 zum Beispiel) zu verarbeiten. Dies könnte verwendet werden, um genau zu lokalisieren und zu verfolgen, die Gliedmaßen und ihre Bewegung im 3D-Raum. Jedoch die Algorithmen für 3D-Tracking wäre erforderlich, um effizient: (a) zu unterscheiden zwischen mehreren Antennen, wenn sie in einer der die Seitenspiegel, (b) für Mängel im Spiegel Winkel korrekt sichtbar und (c) Verzerrungen durch Kamera entfallen Positionierung.

    Zu guter Letzt zusätzliche Gewinne in der Positionsgenauigkeit könnte durch den Einsatz von einem Kalman Filter68, welche Modelle realisiert werden und nutzt Aggregatzustand Informationen wie Anhängsel Geschwindigkeits- und Beschleunigungswerte vorhergesagten Standorte beschränken. Allerdings sollte keine Gewinne in der Genauigkeit gegen Kürzungen in der Geschwindigkeit durch zusätzliche Berechnungen ausgewertet werden.

    Fazit:

    Viele Insekten nutzen Antennen, um flüchtige Verbindungen in ihrem lokalen Umfeld aktiv zu probieren. Muster im Riechzentrum Bewegungen können Einblick in die Insekten Geruch Wahrnehmung und wie es Klimaanlage, toxische Verbindungen und genetische Veränderungen betroffen ist. In ähnlicher Weise wurden Rüssel Bewegungen zur Wahrnehmung der Geruch und der Modulation zu beurteilen. Jedoch ist es schwierig gewesen, schnell große Mengen an hochauflösenden Anhängsel Bewegungsdaten zu erhalten. Hier wird ein Protokoll und Software beschrieben, die diese Aufgabe automatisiert. Zusammenfassend haben wir erstellt und gezeigt, wie die Kombination von preiswerte Hardware, eine gemeinsame tierische Vorbereitung und die Open-Source-Software verwendet werden, um schnell hochauflösende Insekt Anhängsel Bewegungsdaten zu erhalten. Die Ausgabe der Software, wie es menschliche Rater in Geschwindigkeit und Genauigkeit übertrifft, und wie seine Ausgabedaten analysiert und visualisiert werden können wurden gezeigt.

    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

    Acknowledgements

    JB, SMC und RCG wurden von NIH R01MH1006674 SMC und NIH R01EB021711, RCG unterstützt. CMJ und BHS wurden unterstützt durch NSF Ideen Laborprojekt auf "Cracking the olfaktorischen Code" zu BHS. Kyle Steinmetz, Taryn Oboyle und Rachael Halby danken wir für ihre Unterstützung bei der Durchführung dieser Forschung.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Insect harness N/A N/A Use materials needed for Protocol sections 1-3.1.1 of Smith & Burden (2014)
    Odor delivery source N/A N/A Use materials needed for Protocol section 3 of Smith & Burden (2014)
    Vacuum source N/A N/A Use materials needed for Protocol section 3 of Smith & Burden (2014)
    LED connected to odor delivery source N/A N/A Use materials needed for Protocol section 3 of Smith & Burden (2014)
    Low Voltage Soldering Iron Stannol Low Voltage Micro Soldering Iron 12V, 8W
    DC Power Supply Tekpower HY152A
    Tripod AmazonBasics 50-Inch Lightweight Tripod Optional
    Camera Genius WideCam F100 FLIR Flea3 or another camera with manual focus can be used.
    Camera software Genius N/A Software comes with camera. On MacOS, Photo Booth app can be used to record videos.
    Camera shutter speed software Genius N/A Genius camera software allows shutter speed setting. In Mac OS, iGlasses by ecamm can be used instead: http://www.ecamm.com/mac/iglasses/
    Windows Operating System Microsoft Windows 7 Professional Versions 7 or later are compatible. Oracle VirtualBox, Parallels Desktop, or VMWare Fusion can be used to create a Windows virtual machine in MacOS environments.
    SwarmSight software SwarmSight Appendage Tracking Download from http://SwarmSight.org
    R software R Project R 3.4.0 Download from: https://cran.r-project.org/bin/windows/base/
    R Studio software RStudio RStudio Desktop Download from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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