מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מערבון רגיל סופג פרוטוקול היה אופטימיזציה עבור ניתוח גם 500 hematopoietic גזע או ובתאים בהיקף. אופטימיזציה כרוך זהיר טיפול המדגם תא, הגבלת העברות בין צינורות ו ישירות lysing התאים במאגר מדגם Laemmli.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים נדירה, עם מח העצם העכבר המכיל רק ~ 25,000 פנוטיפי ארוך המונח לאכלס מחדש HSCs. פרוטוקול blotting המערבי היה ממוטבת ומתאים הניתוח של מספר קטן של HSCs (500-15,000 תאים). HSCs פנוטיפי מטוהרים, לספור במדויק, ולא ישירות lysed במאגר מדגם Laemmli. Lysates המכיל מספר שווה של תאים נותחו על ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), האבן החשופה היה מוכן ומעובד בעקבות מערבי רגיל סופג פרוטוקולים. באמצעות פרוטוקול זה, $2,000-5,000 HSCs ניתן לנתח באופן שגרתי, במקרים מסוימים נתונים ניתן להשיג גם 500 תאים, לעומת התאים 20,000 עד 40,000 דיווחו רוב הפרסומים בהיקף. פרוטוקול זה צריך להיות חלים באופן כללי לתאים אחרים hematopoietic, המאפשרת ניתוח שגרתי של מספר קטן של תאים באמצעות הליכים מעבדה סטנדרטיים.

Introduction

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים עצמי המתחדש יכולים להצמיח כל דם שושלות. הם נדירים יחסית תאים במח העצם, עיבוד ביוכימי ניתוחים קשים. גישות מתאימים לניתוח תאים נדירים, כמו cytometry זרימה, היה מאוד שימושי עבור לכימות כמויות יחסיות של סמני פני שטח התא, חלבונים תאיים. עם זאת, הניתוח של חלבונים תאיים מחייבת את השימוש בטכניקות permeabilization תא כדי לאפשר גישה נוגדן, ולשרוד לא כל epitopes משטח תאים אלה הליכים1,2. בנוסף, נוגדנים מפלים בין מוצרי איזופורמים או ביקוע חלבונים שונים לעיתים קרובות אינם זמינים עבור cytometry זרימה, ולכן החוקרים עדיין מסתמכים על שהכלים המערבי בוודאות סוגים של ניתוחים.

תספיג חלבון ניתוח של תא lysates הוא הליך שגרתי במעבדות רוב. התאים יכולים להיטהר בתנאים מקומיים המשמרים את epitopes של מולקולות על פני התא, תא lysates לאחר מכן ניתן להכין, מנותח. עם זאת, הניתוח של חלבונים בתא יסודי נדיר אוכלוסיות על-ידי המערב כתם תוכל לדרוש המתות חסד מספרים גדולים של בעלי חיים כדי להשיג מספיק תאים. על ידי ביצוע שינויים קטנים במספר שלבים, פרוטוקול blotting המערבית המקובלת היה מסוגל לזהות חלבונים מספר קטן יחסית של HSCs (500-15,000, בהתאם החלבון עניין). ההתאמות כוללים במדויק ספירת תאי, בזהירות הטיפול בגדר תא, הפחתת העברות של תאים בין צינורות כדי למזער את אובדן התא, ו lysing מספר מוגדר של תאים עם טעינה מרוכז מאגר המכיל פרוטאוזום ו מעכבי פוספטאז. דיווחים שפורסמו רבים כוללים שהכלים המערבי שהושג עם 20,000 או יותר HSCs3,4,5,6,7; נוהל פשוט זה יקטין את מספר התאים ואת חיות ניסוי הדרושה להפקת נתונים שווה ערך לפי בין קיפול 4 ו- 40. הפרוטוקול נועד לנרמל את התוצאות על בסיס לכל תא, במקום של בקרה פנימית. פעולה זו מאפשרת זיהוי של הכללית הפחתות רמות חלבון אשר ניתן להתעלם אם הנתונים הם מנורמל לפקד פנימי. החשיבות של נרמול על בסיס לכל תא תוארה לניתוח של ג'ין ביטוי נתונים8, אותו העיקרון חל לכימות חלבונים על ידי תספיג חלבון. פרוטוקול ממוטבת זה צריך להיות שימושי עבור כל מי שזקוק לנתח מספר קטן של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים חייב להתבצע על פי הנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים. ההליך פותחה עבור הניתוח של מאתר hematopoietic גזע תאים וקדמון (HSCs ו HPs), אך ניתן להתאים לניתוח של אוכלוסיות תאים אחרים.

1. לזרום Cytometry בידוד HSCs מאתר ו HPs

  1. קציר תאים במח העצם מאתר כמתואר ב-6ספרות.
    הערה: בנתונים המוצגים באיור 1 ו- 2 איור, מח העצם היה נקצרו מ C57BL/6J עכברים.
  2. לבצע דלדול שושלת היוחסין של תאים במח העצם באמצעות ערכת דלדול של שושלת היוחסין העכבר ההוראות של היצרן.
  3. דגירה התאים עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא עניין כמו שמתואר7. בניסויים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, הנוגדנים Sca-1, קיט, Flt3 של שושלת (לין) סמנים Mac1 Gr1, CD3e, B220, Ter119 משמשים.
  4. למיין 2,000-20,000 ליןSca1+ערכת+ Flt3 תאים (HSCs) או ליןSca1ערכת+ תאים (HPs) לתוך צינורות גלאים 1.5 mL המכיל 0.1 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) עם 2% שור עוברית סרום (FBS).
    הערה: עבור הנתונים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, התאים היו מיון באמצעות Cytometer לזרום עם זרבובית 70 מיקרומטר. אמצעי האחסון המרבי אוסף נמצא 1.4 מ.

2. הכנת הדוגמא

הערה: השלב זה קריטי. תהליך הדגימה בזהירות רבה. בעת הסרת את תגובת שיקוע, להיזהר מאוד שלא להפריע בגדר התא.

  1. צנטריפוגה 1.5 mL צינורות המכיל תאים ממוינים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, g x 500, עבור 5 דק הסר הכל אלא כ- 100 µL של תגובת שיקוע מהתא הצניפה בעדינות באמצעות פיפטה וטיפ pipet 20 µL. נא לא להפריע בגדר.
    1. אם המדגם מכיל תאים פחות מ-5,000 הנפח הכולל של המדגם ממוינים הוא פחות מ 0.2 מ"ל, להעביר את התאים קודם מחייב נמוכים 0.2 מ"ל המבחנות לפני צנטריפוגה.
    2. אם לדוגמה מכיל תאים פחות מ-5,000 אחסון הוא יותר מ- 0.2 מ"ל, לסובב התאים למטה באמצעות צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות, ולהסיר הכל חוץ µL 200 של תגובת שיקוע. מחדש להשעות את התאים pelleted µL 200 הנותרים של תגובת שיקוע, ולאחר מכן להעביר את התאים המבחנות 0.2 מ"ל, ספין למטה שוב. להסיר µL כל 20-30 אבל בגדר אחרי שהימרת בסיבוב השני והשהה מחדש את התאים.
  2. Resuspend לתאים משמאל supernatant בצינור. אם יש צורך, להוסיף PBS נוספים ב- 2% FBS/PBS (ניתן להשתמש גם 2% אלבומין שור (BSA) / PBS, או PBS לבד) בריכוז 5 x104 5 x 105 תאים/מ ל....
    הערה: שימוש התא נחשב שנאספו על ידי cytometry כדי להעריך את עוצמת הקול משמש להשעות את התאים.
  3. להשתמש 2-5 µL של התאים מחדש על תנאי לקביעת ריכוז של התא מדויק באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (בעקבות הוראות היצרן) או hemocytometer9.
  4. העברת נפח של מתיחה מחדש תאים המכילים מספר תאים צינורות 1.5 mL החדש הרצוי. לניסוי באיור1, הועברו 2,000, 1,000 או 500 HSCs או HPs. מספר התאים הרצוי תלוי עוצמת האות מתקבל על ידי תספיג, והוא נקבע מדעית. ביצוע ההעברה באמצעות µL 20 או 100 µL גלאים פיפטה עצה.
  5. Centrifuge התאים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות.
  6. כדי להפיק 100 x פתרונות מניות, להמיס מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז ב דימתיל סולפוקסיד בהתאם להוראות היצרן.
  7. להכין מאגר מדגם ' x Laemmli 2 ' על-ידי דילול המאגר מדגם x Laemmli 4 המסופקים על ידי היצרן עם כמות שווה של מים מזוקקים. להוסיף את הכמות המתאימה של המניה 100 x של מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז בריכוז הסופי של מעכבי 2 x 2 מאגר מדגם x Laemmli.
    הערה: המאגר 2 מדגם x Laemmli יכול להתבצע מראש, אך מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז אמור להתווסף מיד לפני הוספת את 2 x Laemmli דוגמת המאגר (בתוספת מעכבי) כדי בגדר תא כדי lyse התאים, כמתואר בשלב הבא.
  8. בזהירות להסיר חלק תגובת שיקוע בגדר תא, וכדי את תגובת שיקוע שנותרו בצינור עם בגדר תא, להוסיף אמצעי שווה 2 מאגר מדגם x Laemmli בתוספת מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז להשגת ריכוז סופי של 500 תאים/µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
    הערה: לדוגמה, אם אתה מעביר 2,000 תאים הנפח הכולל של 20 µL את µL 2 של תגובת שיקוע שנותר צינור 2.5 שלב, לאחר צריך שתוציאו את התאים (שלב 2.6) אתה צריך להסיר µL 18 של תגובת שיקוע של בגדר, וכדי להוסיף אמצעי שווה (2 µL) של 2x Laemmli מאגר מדגם להשגת ריכוז סופי של 500 תאים µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
  9. Resuspend בגדר כדי ליצור את lysate בהקדם האפשרי. בשלב זה, הדגימות ניתן electrophoresed מיד דרך עמוד מרחביות ג'לים או יכולה להיות snap קפוא נוזלי N2 המאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. אלקטרופורזה

  1. מחממים את lysates בתוך גוש חום ב 95 ° C או במים רותחים במשך 5 דקות.
  2. Electrophorese 1-40 µL של lysates (מכיל בין 500 עד 20,000 ושווי תא) דרך ג'לים מרחביות-דף-100V באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים10.
    הערה: הנפח של lysate הטעונות בג'ל נקבע לפי מספר התאים הדרושים כדי ליצור את האות רצוי, יהיה תלוי השפע של החלבון של עניין, האיכות של הנוגדן. הנתונים באיור 1 התקבלו עם 2,000, 1,000 500 תאים המקבילים lysate. הרוחב של הבאר צריך להיות בטווח של 3 מ מ עד 1.5 מ מ. 1.5 מ מ שיניים יכול להיות חתוך מ מסרק זמינים מסחרית עם השיניים רחב יותר באמצעות מספריים.

4. העברת וחסום

הערה: בצע את תספיג בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11. השלבים מתוארים בקצרה כאן:

  1. Pretreat polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור s 10 ולאחר מכן לשטוף הקרום בקצרה עם מים מזוקקים.
  2. להעביר את החלבון הג'ל מרחביות-דף קרום ועקוב אחר ההוראות במדריך המסופקים על ידי היצרן של מנגנון העברה.
  3. בעקבות העברה, לחסום את הקרום עם 2 מיליליטר 5% שור אלבומין (BSA) ב PBST (PBS עם 0.1% Tween) לילה ב 4 ° C בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11.

5. נוגדן תיוג

  1. דגירה הקרום עם נוגדנים על מטרף בן לילה ב 4 ° C באמצעות נוגדן דילולים המומלץ על ידי הספק.
    הערה: את הטבלה של החומרים, נוגדנים, הבדיקה והאימות עבור HSCs ו HPs ו של דילולים נוגדנים המתאימים, מוצגות. לבצע תיוג נוגדן באמצעות הליכים סטנדרטיים8.

6. זיהוי

  1. לשטוף את הקרום 3 פעמים, 5 דקות עבור כל כביסה ב PBST בטמפרטורת החדר.
  2. דגירה הקרום עם 2 מ של מאגר chemiluminescence משופרת עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. לזהות את הסימנים באמצעות מערכת הדמיה בעקבות הוראות, של היצרן או autoradiography הסרט ומעבד הסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות נציג מ 500-2000 מטוהרים HSCs ו HPs מוצגים באיור 1 ו- 2 איור. האות β-אקטין באיור 1 ניתן להבחין בין מעטים כמו 500 HSCs וטיהרו HPs ממח העצם של עכבר אחד. שימו לב כי להעמיס את lysates לתוך בארות 1.5 מ מ המיוצר אות חזק הרבה יותר מ- 500 HPs מאשר טעינה אל בארות 3.0 מ מ. איור 2 היא אבן חשופה המערבי של EIF4G זירחון של Rps6 (p-Rps6), אשר שניהם מעורבים בוויסות של חלבון תרגום12, ב- HSCs, וב-HPs עם וללא גירוי על ידי תאי גזע פקטור (SCF) במבחנה.

Figure 1
איור 1: תספיג עבור β-אקטין הופיעה עם lysates מ מאתר HSCs ו HPs. HSCs היו הממוינת מתאי מח עצם מאתר שושלת דלה ליןSca1+ערכת+ Flt3 תאים , HPs היו Sca1 ליןערכת+. Lysates שהוכנו מספרים שונים של תאים היו electrophoresed דרך מרחביות-דף 12% ג'ל המוכנים על צלחות זכוכית מיני עם מפרידי 1 מ מ. האבן החשופה נבדקה עם נוגדן לβ-אקטין. האבן החשופה מראה את האותות β-אקטין השוואתי בין 500 ל 2,000 HPs כאשר lysates היו נטען לתוך בארות 1.5 מ מ (נתיבים 4-6) לעומת 3 מ מ בארות (מסלולים 1 - 2). Lysates מ- 2,000 לתאים 500 היו מועמסים על מסלולים 7 עד 9. M סמני משקל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תספיג ניתוח של HSCs טרי מבודד, HPs מגורה במבחנה עם ציטוקין תאי הגזע מקדם (SCF). HPs היו מטוהרת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS), centrifuged, resuspended 2% FBS/PBS, ספרתי, ואז לפצל שני צינורות. HPs בצינור הראשון היו מגורה עם SCF (10 ng/mL) עבור 5 דקות 37 ° C (+ SCF), ו HPs השנייה צינור היו תרבותי עבור 5 דקות בהיעדרו של SCF (-SCF). התאים היו אז centrifuged, בגדר תא lysed עם מאגר מדגם Laemmli. HSCs היו מטוהרים, lysed ישירות באמצעות מאגר מדגם Laemmli ללא culturing. Lysates הועלו על 1.5 מ מ בארות, electrophoresed דרך ג'לים מרחביות-דף 12%. האבן החשופה פותחה עם נוגדנים לגורם ייזום התארכות 4G (EIF4G), β-אקטין, ריבוזום קטן phosphorylated יחידה משנית S6 (p-Rps6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סופג המערבי הוא שיטה מקובלת לגילוי חלבונים ספציפיים והפעלה של איתות המסלולים רקמות או תאים. על ידי הצגת שינויים קטנים הליך נפוץ, היינו מסוגלים לזהות באופן שגרתי חלבונים שונים 15 (טבלה של חומרים) ב- 15,000 HSCs, ובחלק מן המקרים תוך 500 HSCs. The most השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם: ספירת התאים במדויק 1), 2) צמצום מספר העברות בין צינורות ו 3) lysing את התאים ישירות עם מאגר מדגם Laemmli. כאשר lysing בגדר תא עם מאגר מדגם Laemmli, מצאנו כי הסרת כל תגובת שיקוע בגדר תא ולא מחדש השעיית זה במאגר מדגם Laemmli, אם אנחנו במקום עזב נפח קטן של תגובת שיקוע בצינור והוסיף מקבילה נפח של 2 x מאגר מדגם Laemmli, למנוע איבוד תאים. צריך שתוציאו התאים רוטור דלי מתנדנדים ירד גם את הסיכון של אובדן התא. הפחתת הרוחב של הבאר על ידי קיצוץ השיניים מסרק שיפור הרגישות של זיהוי.

עם כוונונים פשוטים אלו להליך, הצלחנו להשיג תוצאות לשחזור מקבילה לאלו מאמרים שפורסמו היו בשימוש עוד 10 - 20 פעמים תאים3,4,5,6, 7. עוד יותר, שהכלים יכול הברקה עבור מחדש סופג בעקבות הליכים סטנדרטיים13, להגדיל את כמות המידע ניתן להשיג מספר קטן של תאים. היכולת לזהות חלבונים עניין תוגבל על פי האיכות של הנוגדן ושפע של חלבון. טכניקה זו שונה מאוד צריך להפחית את המספר של צורך לקבל נתונים חלבון מן התא נדיר אוכלוסיות בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

Acknowledgments

מכוני הבריאות הלאומיים הענק R01 CA149976 (גיל חזן) נתמך עבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175, (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30, (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509, (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148, (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122, (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30, (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151, (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics