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应用新型磁吻合技术 Suprahepatic 腔静脉重建大鼠原位肝移植模型的研究

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Summary

suprahepatic 腔静脉 (SHVC) 的重建仍是大鼠原位肝移植的难点。本文介绍了一种新型的磁吻合技术在大鼠 SHVC 重建中的应用。

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Yang, L., Lu, J., Wang, Y., Zhang, M., Shi, Y., Wei, S., Liu, P., Wu, Z., Lv, Y., Wu, R. A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction. J. Vis. Exp. (133), e56933, doi:10.3791/56933 (2018).

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Abstract

大鼠原位肝移植模型是移植研究的基础。这是一个非常复杂的动物模型, 需要一个陡峭的学习曲线。采用袖套技术对门静脉 (PV) 和 infrahepatic 腔静脉 (IHVC) 进行吻合, 大大简化了大鼠移植过程。然而, 由于接受者的 suprahepatic 腔静脉 (SHVC) 的前壁短, 袖套技术很难用于重建 SHVC。该领域的大多数研究人员仍然使用手缝合技术进行 SHVC 重建, 这使得它成为大鼠原位肝移植的瓶颈步骤。磁吻合技术 (, magnamosis) 是一种用两个磁体之间的引力来连接两个容器的方法。我们最近的研究表明, 磁吻合技术优于手缝合技术的 SHVC 重建的大鼠。在本文中, 我们展示了一个逐步的协议, SHVC 重建的大鼠使用新的磁性吻合技术。在该模型中, 采用标准袖套技术对 PV 和 IHVC 进行重建, 采用支架技术进行胆管重建。肝脏再动脉没有执行。磁吻合技术使 SHVC 重建更容易, 大大缩短了 anphepatic 期。经过合理的学习曲线, 即使没有先进的显微外科技术的研究人员也能用这种大鼠肝移植模型产生可靠和可重复的结果。

Introduction

大鼠原位肝移植模型是移植研究的关键1,2。在1973年的3中, 第一个老鼠肝移植是由李et . 描述的。在该模型中, 所有的血管都是用手缝技术重建的。手工缝合技术需要先进的显微外科技术, 这大大限制了它的使用。从那时起, 对原《大鼠肝移植术》的各种修改进行了报道。其中, 1979年卡玛et. 报告的门静脉 (PV) 和 infrahepatic 腔静脉 (IHVC) 吻合的袖套技术被认为是这一模型的一个重大改进, 因为它大大简化了重建程序4.然而, 由于接受者的 suprahepatic 腔静脉 (SHVC) 的前壁短, 袖套技术很难用于重建 SHVC。该领域的大多数研究人员仍然使用手工缝合技术进行 SHVC 重建, 这使得它成为大鼠肝移植的瓶颈步骤5,6,7

磁吻合技术 (, magnamosis) 是一种连接两个容器或其他管状结构的方法, 使用两个磁体891011之间的吸引力。磁力逐渐压缩和改造组织成一个强有力的, 无缝线切口吻合12, 13.这种压缩吻合已被证明是有效的人14,15。我们设计了一双磁性环, 专门用于 SHVC 的大鼠的吻合。我们最近的研究表明, 磁吻合技术优于手缝合技术的 SHVC 重建的大鼠肝移植术16。本文的目的是提供一个详细的, 循序渐进的协议, 为 SHVC 重建的大鼠使用新的磁性吻合技术。

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Protocol

该议定书是按照《护理和使用实验动物准则》进行的, 并获得了西安交通大学动物实验伦理学委员会的批准。

注意: 本协议中的任何程序都没有在手术显微镜下进行。

1. 术前准备

  1. 磁环的设计和形状 (图 1)
    1. 通过匹配一对钕铁硼磁环来组装磁吻合装置。
    2. 根据大直径、小轴直径、厚度和重量8毫米、5.5 毫米、1毫米、0.5 克等参数, 设计 SHVC 的环。
    3. 用线电极切割技术将环按所需形状曲线, 然后用钛氧化物喷枪将所获得的环涂上, 用500毫克/升乙烯氧化物在55-60 摄氏度上消毒6小时。
  2. 袖口 (图 2)
    1. 通过切割聚乙烯管, 准备 IHVC 和 PV 吻合的袖口。确保袖口的身体是5毫米长, 2 毫米袖口延长。
      注: PV 袖口的内外直径为1.8 和2.1 毫米, 而 IHVC 袖口的内径和外径分别为2.6 和2.8 毫米。
  3. 支架 (图 2)
    1. 通过切割24克长5毫米的静脉插管, 在两端产生倾斜, 准备用于吻合的支架。
  4. 实验动物
    1. 使用雄性大大鼠体重在250和 280 g 之间作为捐助者和受援国。确保接收人的体重与捐献者的重量相同或稍重 (< 10 克)。
    2. 把老鼠留在气候控制的房间里, 在手术前可以免费获得食物和水。

2. 捐助者的行动

  1. 术前1小时注射丁丙诺啡 (0.05 毫克/千克) 止痛。
  2. 异氟醚吸入麻醉供体鼠。使用5体积% 异氟醚, 在1.5 升/分钟的一个有机玻璃盒中的流量, 用于诱导麻醉和2体积% 异氟醚的流速 0.6-0.8 升/分钟在一个锥面具, 以维持麻醉。通过执行脚趾捏和皮肤捏来确认麻醉深度。
  3. 使用电动剃须刀剃去老鼠的整个腹部皮肤, 以允许更清洁的暴露。用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。
  4. 从从纵切口中点延伸到 midaxillary 线的1厘米以上的 xiphisternum 沿linea, 通过十字切口打开腹腔。将胃肠道向左 Exteriorize, 用湿纱布盖住。
  5. 用止血钳将 xiphisternum 向头部拉紧。解剖镰韧带和肝周围的结缔组织。用6-0 丝缝线分离和结扎左下膈静脉。
  6. 将支架插入胆管。
    1. 将 BD 钳在胃十二指肠静脉加入门静脉的点上方, 并将其拉紧, 用 microforceps 维持少许张力。然后执行一个 "V" 切口1毫米长度在前壁约5毫米近到胆道汇合由一个微型剪刀。
    2. 用弯曲的 microforceps 将支架插入胆管腔内。确保至少有一半的支架位于胆管外。
    3. 用6-0 丝缝线固定支架。切开缝合的一端。在以后的吻合过程中保持另一条。在支架下面横断面胆管, 确保胆汁能从支架中出来。
  7. 将 IHVC 分离到左肾静脉水平。用棉花芽夹层从前后周围组织中释放 IHVC, 直到 IHVC 骷髅。用6-0 丝缝线分离和结扎右肾上腺静脉和右肾静脉。
  8. Heparinize 注射 50 U 肝素稀释2毫升的正常盐水溶液通过该鸡的背静脉。
  9. 灌注肝脏。
    1. 将腹主动脉隔离在左肾静脉下方。将22克导管插入主动脉。
    2. 执行开胸术, 用 microforceps 钳住胸主动脉。
    3. 灌注通过导管在主动脉中, 用20毫升的生理盐水溶液, 含有 25 U 肝素 (4 °c), 以3毫升/分钟的速度与输液泵。同时, 在右肾静脉下切开腔静脉, 使灌注液流出肝脏。
    4. 当供肝变苍白时, 将 SHVC 与部分隔膜和 IHVC 在左肾静脉的水平上进行横断面。
  10. 用两个微钳解剖 PV 周围的结缔组织。结扎和分裂的幽门静脉与8-0 普理灵缝合。将 PV 在脾脏静脉的水平上进行样带。将供肝切除, 用冷生理盐水冲洗。安置它在一个冷的盐水浴4°c。

3. 接枝制剂

注: 所有肝移植制剂的手术步骤均在4摄氏度的冷盐水浴中进行。

  1. 将袖口附加到捐赠者的 IHVC (图 3)。
    1. 将 IHVC 插入袖口, 袖伸指向肝脏。将袖伸放在 IHVC 后壁上。修复袖口扩展和 IHVC 与弯曲 microforceps 本身附加使用文件剪辑到浴缸容器。
    2. 用两个微钳将 IHVC 的远端埃弗特在袖体上。
    3. 用6-0 丝缝线保护边缘。确保在过程中 IHVC 不扭曲。
  2. 重复步骤3.1 在 pv 上附加一个袖口的捐助者的 pv。
  3. 将磁环连接到捐赠者的 SHVC (图 4)。
    1. 拉隔膜通过四钳和修剪 SHVC。
    2. 采用钛合金微钳, 通过磁环 SHVC。
    3. 埃弗特在环上 SHVC 的远端。
    4. 用6-0 丝缝线把戒指固定起来。确保在过程中 SHVC 不扭曲。
    5. 清除肝脏周围的多余隔膜。
  4. 将供肝浸入冷生理盐水浴中, 贮存在摄氏4摄氏度。

4. 收件人操作

注意: 接收鼠移植植入的模式显示在图 5中。

  1. 术前1小时注射丁丙诺啡 (0.05 毫克/千克) 止痛。异氟醚吸入麻醉供体鼠。使用5体积% 异氟醚, 在1.5 升/分钟的一个有机玻璃盒中的流量, 用于诱导麻醉和2体积% 异氟醚的流速 0.6-0.8 升/分钟在一个锥面具, 以维持麻醉。
  2. 剃掉老鼠的整个腹部皮肤。用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。
  3. 通过4厘米中线切口打开腹腔。把腹部拉钩。把肋骨从中线尽可能地分开。
  4. 用止血钳将 xiphisternum 向头部拉紧。解剖肝脏周围的结缔组织和韧带。结扎和分裂肝-食管韧带。结扎和分肝动脉8-0 普理灵缝合。
  5. 从第一个肝门处分离出胆总管。将6-0 丝缝合周围的胆总管在其分裂和结扎的普通胆管。
  6. 解剖 IHVC 到右肾静脉。结扎和分裂右肾上腺静脉。在肝脏的 SHVC 上放一条带子。
  7. 用微血管夹子钳住右肾静脉的 IHVC。在幽门静脉的水平上用微血管夹钳住 PV。
    1. 将血液从肝脏中冲洗出来, 慢慢地通过 PV 注入2毫升生理盐水。拉下原来放置的皮带, 拖下肝脏。用 Satinsky 钳夹住 SHVC 和部分隔膜。
    2. 横断面的 IHVC 接近的实质和 PV 在门肝。transecting 肝上方的 SHVC, 将肝脏切除。快速取出受体肝。
  8. 将磁环连接到接收者的 SHVC。
    1. 将收件人剩余的 SHVC 插入磁环中。
    2. 用磁吸引固定 Satinsky 钳上的磁环。
    3. 埃弗特 SHVC 在磁环上, 直到容器覆盖环的边缘。
  9. 将供肝移植原位, 用冷湿纱布盖住。
  10. 用正常的盐水溶液填充捐献者的腔体和受体的 SHVCs。彻底清除气泡以防止空气栓塞。通过磁力耦合在供体和接收器 SHVC 中嵌入的磁环, 完成 SHVC 重建。
  11. 重建光伏。
    1. 通过拉动8-0 普理灵缝合以保持 pv 的张力, 对接收者的 pv 的右、左分支进行插拔。
    2. 将接受者的 PV 钳从幽门静脉移至脾静脉, 以充分暴露静脉。
    3. 切开接受者的前壁。用正常的盐水溶液填充 PV 的流明。
    4. 用弯曲钳握住捐赠者 PV 的袖口。
    5. 将捐赠者的 pv 的袖口体插入接收者的 pv, 同时保持正常生理盐水冲洗 pv 腔。
    6. 用圆周6-0 的丝结扎保护它。通过在 PV 和 SHVC 上释放钳位, 重新建立移植肝的血流。
  12. 在 IHVC 上重复步骤4.11 以重建 IHVC。
  13. 用支架技术重建胆管。
    1. 在接受者胆总管前壁切开 "V"。
    2. 将供体支架插入受体 BD 的腔内, 并用6-0 丝环缝固定。将两个胆管的缝线拉在一起, 并系上缝合线, 使 BD 靠近对方。
    3. 包裹在吻合部位的网膜组织, 以防止胆漏。
  14. 用温热生理盐水溶液冲洗腹腔。用连续3-0 个不可吸收的手术缝合在两层闭合腹部切口。
  15. 术后立即皮下注射16毫克/千克头孢呋辛 (抗生素) 和0.05 毫克/千克丁丙诺啡 (止痛药)。
  16. 把老鼠放在干净的笼子里, 让食物和水广告随意
  17. 每12小时向腹腔注射头孢呋辛 (16 毫克/千克) 和丁丙诺啡 (0.05 毫克/千克) 3 天。

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Representative Results

经过大约10次尝试, SHVC 重建的磁吻合技术成功地掌握在一个没有事先进行显微外科训练的研究员身上。SHVC 的重建花费不到2分钟。无肝期阶段为接受者老鼠大约10分钟。再灌注后1、5、30天 SHVC 吻合口无血栓、出血或 angiostegnosis。下腔 cavography 在移植后2周进行。如图 6所示, 磁环完好无损, 血液流动是通过 SHVC 吻合的专利。移植后存活率为95% 天 1, 90% 天 3, 85% 天7至 30 (图 7)。

Figure 1
图 1:用于吻合 SHVC 的磁环的设计 (A) 和照片 (B)。
SHVC: suprahepatic 腔静脉。 请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:IHVC (A)、PV (B) 和 BD (C) 的吻合的袖口和支架。
IHVC: infrahepatic 腔静脉;光伏: 门静脉;胆管。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:IHVC 和 PV 的袖套吻合模式。将 IHVC 或 PV 插入袖口 (a);使用两个 microforceps (B) 将 IHVC 的远端或 PV 埃弗特在袖口体上;用6-0 丝缝线固定边缘 (C);将捐赠者的 IHVC 或 pv 的袖口体插入收件人的 IHVC 或 pv (D)。
IHVC: infrahepatic 腔静脉;PV: 门静脉。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:SHVC 的磁性吻合模式。使用钛合金 microforceps (a) 通过磁环 SHVC;埃弗特环上 SHVC 的远端 (B);用6-0 丝缝线固定环 (C)。通过磁力 (D) 将在捐赠者和接收者的 SHVC 中嵌入的磁环耦合在一起。
SHVC: suprahepatic 腔静脉。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:受体大鼠移植植入的模式。SHVC 的重建: 磁性吻合术;IHVC 与 PV 的重建: 袖套吻合术;重建的 BD: 支架吻合术。重建 HA: 未执行。
SHVC: suprahepatic 腔静脉;IHVC: infrahepatic 腔静脉;光伏: 门静脉;胆管: 胆道;肝动脉。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6:移植后2周大鼠下腔 cavography。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7:有代表性的生存治疗后移植。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

许多临床进展在肝脏移植可以归因于动物研究。大鼠肝移植是在器官保存、移植免疫学、生理学和病理学研究中广泛应用和公认的模型。然而, 这也是一个非常复杂的过程, 需要先进的显微外科技术。尽管在大鼠肝移植手术过程中有许多改进, SHVC 吻合仍然是一个具有挑战性的步骤。本文介绍了一种新的大鼠肝移植 SHVC 重建的磁性吻合技术。该技术的应用减少了 SHVC 重建到2分钟以下的时间, 并将大鼠肝移植的无肝期期缩短到约10分钟。我们认为这种技术在移植研究中具有重要的意义。

使用这种磁吻合技术重建 SHVC 的关键步骤是将磁环连接到捐献者和接收者的 SHVC。每次小心都应该被用来避免扭曲 SHVC。此外, 在连接两个磁环时, SHVC 中的气泡应彻底去除。

使用此技术有一些限制。Fischer-344 大鼠和水牛大鼠等几株大鼠的 SHVC 非常短。将磁环连接到它们的 SHVC 是不可能的。因此, 它们不适合这种技术。然而, 该技术可以很容易地应用于大多数品系的大鼠肝移植, 包括大大鼠、路易斯大鼠和棕色挪威大鼠。磁环可以干扰磁共振成像 (MRI) 扫描。因此, 如果实验需要核磁共振检查, 就不能使用这种磁吻合技术。

总之, 磁吻合技术使大鼠容易快速 SHVC 重建成为可能。经过合理的学习曲线, 即使没有先进的显微外科技术的研究人员也能用这种大鼠肝移植模型产生可靠和可重复的结果。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项工作得到教育部创新团队发展项目资助的支持 (no。IRT16R57), 中国国家自然科学基金 (81470896 号), 西安交通大学青年人才招聘计划研究基金 (cd-rw)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Machine Harvard  tabletop Animal anaesthesia
PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System Perlong Medical PLX7000B It is mainly used for the angiography and photography of various operations
Syringe Pump Mindray BeneFusion SP5 intravenous infusion
Isoflurane RWD life Science Co. anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia
iohexol Shanghai General Pharmaceutical Co  intravascular contrast media  
heparin sodium injection SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD   prevent the formation of thrombosis 
cefuroxime  Glaxo Operations UK Limited  an antibiotic
buprenorphine  TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd an analgesic
curved microforceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. W40350 surgical tool
hemostatic forceps(straight) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31010 surgical tool
hemostatic forceps(curved) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J31020 surgical tool
Satinsky clamp Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC050 surgical tool
needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J32010 surgical tool
microneedle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WBA040 surgical tool
notched forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J42010 surgical tool
tissue forceps(with hook) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. J41010 surgical tool
tissue scissor Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00040 surgical tool
surgical scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Y00030 surgical tool
micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. MR-S121T surgical tool
microvessel clips Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. XEC240 surgical tool
straight microforceps(titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC010 surgical tool
curved microforceps  (titanium alloy) Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. WCC020 surgical tool

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References

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