Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

At opnå høj kvalitet genomisk DNA fra tumor væv er et vigtigt første skridt til at analysere genetiske ændringer ved hjælp af næste generation sequencing. I denne artikel præsenterer vi en enkel og hurtig metode til at berige tumorceller og få intakt DNA fra touch aftryk cytologi prøver.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det er afgørende for at bestemme den mutationsmønstre status i kræft før administration og behandling af specifikke molekylære målrettede lægemidler til kræftpatienter. I de kliniske omgivelser, er formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) væv almindeligt brugt til gentest. FFPE DNA er dog generelt beskadiget og fragmenteret under optagelsen processen med formalin. Derfor er FFPE DNA undertiden ikke hensigtsmæssige, gentest på grund af lav kvalitet og kvantitet af DNA. Her vil vi præsentere en metode til touch aftryk cytologi (TIC) at opnå genomisk DNA fra kræftceller, som kan overholdes under et mikroskop. Celle morfologi og kræft celle tal kan evalueres ved hjælp af TIC prøver. Derudover kan udvinding af genomisk DNA fra TIC prøver være afsluttet inden to dage. Det samlede beløb og kvaliteten af TIC DNA opnået med denne metode var højere end i FFPE DNA. Denne hurtige og enkle metode gør det muligt for forskere at opnå høj kvalitet DNA for genetisk testning (fx, næste generation sequencing analyse, digital PCR og kvantitative realtid PCR) og forkorte ekspeditionstid for rapportering af resultater.

Introduction

Næste generation sequencing technology har givet forskere betydelige fremskridt i analyse af genom oplysninger i genetiske variationer, mendelske sygdom, arvelig disposition og kræft 1,2,3 . Kræft genom Atlas (TCGA) og International kræft genom Consortium (ICGC) har forfulgt identifikation af genetiske ændringer i flere typer af almindelige kræftformer4. Hundredvis af væsentlige kræft driver gener er blevet identificeret, og nogle af disse molekyler er at være målrettet til lægemiddel udvikling1,5,6.

I de kliniske omgivelser, er FFPE enheder almindeligt anvendt til patologiske diagnose og molekylære test for forskellige sygdomme, herunder kræft. Men under optagelsen processen med formalin, DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking opstår og DNA fragmentering er induceret. Således er FFPE DNA-prøver ikke altid egnet til genetisk analyse på grund af lav kvalitet og kvantitet af DNA7,8,9. Derudover tager flere dage at forberede FFPE prøver, og tekniske dygtighed er nødvendigt at præcist forberede sektionerne. Derfor er det ønskeligt at udvikle en enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet intakt DNA.

Cytologi er en alternativ metode til patologiske diagnose. Forberedelse af cytologiske prøver er en enklere, mindre dyrt og mere hurtig fremgangsmåde sammenlignet med FFPE forberedelse10. TIC teknik er blevet udført på sentinel lymfeknuder og marginale væv fra brystkræftpatienter for intraoperativ hurtig diagnose for nogle år11,12. Men der er få betænkninger, der har undersøgt, om høj kvalitet genomisk DNA kan udvindes fra TIC prøver og bruges til efterfølgende genetisk analyse. Cytologiske prøver farves almindeligt med Papanicolaou (Pap) eller Giemsa farvning, og vi tidligere rapporteret, at mængden og kvaliteten af DNA ekstraheret fra TIC prøver (især Giemsa-farvede prøver) er overlegen i forhold til prøver fra FFPE væv13. Sammenlignet med Pap farvning, har Giemsa farvning en fordel i at kræve mindre farvning procedurer. I Pap farvning, når prøverne har været fast og farves, skal de være monteret med montering medium (f.eks.Malinol) for at adskille udsnit indhold, såsom tumorceller, normale celler og inflammatoriske celler under et mikroskop. Hvis Pap-modellen er udarbejdet uden montering skridt, er det næsten umuligt at iagttage cellerne under et mikroskop, fordi modellen er tørret. I sammenligning, Giemsa farvning kan observeres i tørret tilstand, montering trin er derfor ikke nødvendigt for hurtig cellulære evaluering. For microdissection er Giemsa farvning mere egnet fordi det kræver tørre prøver.

I denne betænkning, vi indføre en enkel og hurtig metode til forberedelse af TIC prøver med Giemsa farvning og vise, at TIC er en bedre kilde til DNA sammenlignet med FFPE prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TIC forberedelse for Quick mikroskopiske vurdering ved hjælp af normale glas dias

  1. Udføre TIC forberedelse hurtigst muligt efter klinisk patologisk væv materialerne er tilgængelige. Hvis TIC prøver ikke kan umiddelbart forberedes, holde væv materialer dækket med saltvand fugtet steril gaze og opbevar i køleskabet til at forhindre udtørring af væv.
  2. Forberede 5 mm3 væv materiale såsom solide tumorer (fx, leveren, lungen og bryst væv) klinisk fremstillet ved kirurgi eller endoskopi.
    1. Forsigtigt tørre vævet med steril-gaze belagt med fysiologisk saltvand og fjerne blod, hvis væv overflade har en masse blod.
    2. For mikroskopiske prøver såsom biopsi materiale, holde prøven fugtet med steril gaze gennemblødt i fysiologisk kogsaltopløsning.
  3. Klip og trim den normale væv med en trimning kniv og udsætte overfladen af tumor læsion, hvis tumor masserne ikke er synlige groft.
  4. Skærmoverfladen tumor resektion prøver på en normal glas dias flere gange med behandskede hænder. Bekræft visuelt området rørt er over 80% af det normale glas dias.
  5. Let tryk på det normale glas dias mod en polyethylen poly(ethylennaphthalat) (PEN) membran dias og Gnid forsigtigt 2 - 3 gange med behandskede hænder. Bekræft visuelt cellerne er overført fra det normale glas dias til PEN membran dias.
  6. Lufttørre både glas og PEN membran dias i 5 min ved stuetemperatur.
  7. Pletten normale glas dias for direkte cytologiske undersøgelse. Dyp glas dias med Fikseringsvæske løsning for 5 s og derefter pletten med Giemsa farvning løsning for 15 s.
  8. Vurdere og skærm tumor indholdet og celleforandringer på diasset normale glas helt med et mikroskop for hurtig vurdering. Evaluere tumorceller baseret på flere kriterier; nukleare udvidelsen, unormal karyotype, rigelige kromatin, ulige fordeling af celler, forholdet mellem nuklear komponent/cytoplasmatisk komponent, Cellestørrelse og celle polaritet.

2. forberedelse af PEN membran dias Film til gentest

  1. Hvis prøven viser tumor celleforandringer over 60% af hurtig mikroskopiske vurdering (trin 1.8), skåret tumor-rørt filmen PEN membran dias til DNA-ekstraktion med en kniv og behandskede hænder. Overføre klippe filmen til en steril microcentrifuge rør med en pincette og behandskede hænder.
  2. Hvis tumor celleforandringer blev fastsat så lavt (mindre end 60% af tumor indholdet) ved hurtig mikroskopiske vurdering (trin 1.8), bruge laser fange microdissection og få tumor prøver.
    1. Udføre Giemsa farvning for at vurdere de tumorceller ved hjælp af standardprotokoller.
    2. Klippe filmen af PEM membran dias ved passende laser fange microdissection.
    3. Overføre klippe filmen til en steril microcentrifuge rør med en pincette og behandskede hænder.
    4. Gemme film-holdige microcentrifuge røret ved 4 ° C indtil DNA-ekstraktion (protokollen kan blive standset her).

3. DNA-ekstraktion

  1. Udføre DNA-ekstraktion fra TIC eller FFPE vævsprøver ved hjælp af en FFPE DNA udvinding kit ifølge producentens anvisninger med mindre ændringer. En tilsvarende kit er tilgængelig for ekstraktionstrinet FFPE DNA.
  2. Tilføj 180 µL af væv lysisbuffer (pH = 8.3) til film-holdige microcentrifuge rør med en manuel 200 µL pipette. Tilføj 20 µL af proteinase K med en manuel 20-µL pipette og bland ved vortexing med en vortex mixer ved maksimal hastighed (ca 2500 rpm) for 5 s.
  3. Inkuber prøver ved 56 ° C natten over med en air inkubator.
  4. Inkuber FFPE og TIC prøverne ved 90 ° C i en varme blok for 1 timer og 10 min, henholdsvis. Kort spin ned microcentrifuge røret på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur med en mini centrifuge.
  5. Tilføje 200 µL af lysisbuffer at prøve med en 200 µL pipette og bland grundigt ved vortexing ved maksimal hastighed for 5 s.
  6. Tilsæt 200 µL af ethanol (96-100%) med en 200 µL pipette og bland grundigt ved vortexing ved maksimal hastighed for 5 s. kort spin ned microcentrifuge røret på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur med en mini centrifuge.
  7. Omhyggeligt overføre hele lysate til kolonnen spin med en 1.000-µL pipette og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 minut ved 25 ° C.
  8. Placer kolonnen spin i en ren 2-mL collection tube med behandskede hænder, og kassér collection tube indeholdende gennemstrømnings-i en plast bortskaffelse boks.
  9. Tilføje 500 µL af wash buffer til kolonnen spin med en 1.000-µL pipette og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 minut ved 25 ° C.
  10. Placer kolonnen spin i en ren 2-mL collection tube med behandskede hænder, og kassér collection tube indeholdende gennemstrømnings-i en plast bortskaffelse boks.
  11. Tilføje 500 µL af wash buffer til kolonnen spin med en 1.000-µL pipette og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 minut ved 25 ° C.
  12. Kassér collection tube indeholdende gennemstrømnings-i en plast bortskaffelse boks. Kolonnen spin i en ren 1,5 mL microcentrifuge tube med behandskede hænder og centrifugeres ved 20.000 x g i 3 minutter ved 25 ° C til tørre membranen.
  13. Marker kolonnen spin en DNA-lav bindende tube med behandskede hænder.
    1. Tilføje 40-50 µL af eluering buffer til midten af membran med 100 µL pipette.
    2. Inkuber ved stuetemperatur til 5 min og centrifugeres ved 20.000 x g i 1 minut ved 25 ° C.
    3. Gemme DNA-prøver ved-20 ° C indtil næste trin (protokollen kan blive standset her).

4. vurdering af DNA kvalitet af kvantitative Real Time PCR

  1. Forberede den master mix i en steril microcentrifuge rør med pipette, som følger: 10 µL af 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µL af 20 x RNase P Primer-sonde Mix (amplikon størrelse: 87 bp), og 8 µL sterilt nukleasen-gratis vand.
  2. Forberede den anden master mix i en steril microcentrifuge tube som følger: 10 µL af 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µL af 20 x RNase P Primer-sonde Mix (amplikon størrelse: 268 bp), og 8 µL sterilt nukleasen-gratis vand.
  3. Udføre serielle fortyndinger af menneskelig kontrol genomisk DNA (medfølger i sættet) 4 gange for en fem-punkts standardkurve og bestemme den absolutte DNA koncentrationer13.
  4. Tilføje 19 µL af de to rede master blandinger (udarbejdet i trin 4.1 og 4.2) i separate brønde af en optisk 96-brønd reaktion plade med en 20-µL pipette.
  5. Tilføj 1 µL af FFPE DNA eller TIC DNA til at adskille wells indeholdende mastermix med en 2-µL pipette. Tilføj 1 µL af nukleasen-frit vand i en separat brønd indeholdende mastermix for kontrolelementet ingen skabelon.
  6. Hold ikke-klæbende side af en optisk selvklæbende folie og skrælle den beskyttende opbakning fra midten af filmen. Forsigtigt trække applikator over filmen og forsegle filmen over 96-brønd pladen.
  7. Forsigtigt blandes den 96-brønd plade ved hjælp af en 96-brønd plade mixer til 10 s ved stuetemperatur ved 2.000 omdrejninger i minuttet. Der centrifugeres plade kort på 1000 x g i 3 min. ved stuetemperatur.
  8. Tænd for real-time PCR instrument og Indsæt den 96-brønd plade. Køre PCR reaktioner ved hjælp af følgende protokol: 95 ° C til 20 s, efterfulgt af 45 cyklusser af 95 ° C for 1 s og 60 ° C i 20 s. brug "standardkurven" og "hurtigt tilstand."
  9. Vurdere DNA opsplitning med forholdet af DNA (relative kvantificering; RQ) opnået for lang-amplikon (268 bp) at kort-amplikon (87 bp). RQ er gennemsnitsværdien af lange amplikon/the gennemsnitsværdien af de korte amplikon13.

5. forberedelse af den næste Generation Sequencing bibliotek

  1. Forberede sekventering bibliotek for næste generation sequencing ifølge producentens anvisninger.
  2. Forberede den multiplex PCR master mix i en steril microcentrifuge tube pr. sample som følger: 4 µL af 5 x Multiplex PCR reaktion løsning, 4 µL af 5 x primer pool, ≤6 µL TIC eller FFPE DNA (1-100 ng), og tilføje nukleasen-gratis vand op til 20 µL.
    1. Tilføje multiplex PCR master mix til en PCR rør og bland forsigtigt ved at trykke på røret.
    2. Kort spin ned microcentrifuge røret på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur med en mini centrifuge.
  3. Køre PCR reaktioner ved hjælp af følgende protokol: 99 ° C i 2 min., efterfulgt af 20 cyklusser af 99 ° C til 15 s og 60 ° C i 4 min og bedrift trin 10 ° C. Kort spin ned PCR rør med en mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur.
    Bemærk: Bestem antallet af cyklusser baseret på antallet af primer par.
  4. Åbn låget af PCR rør, og Tilføj 2 µL af begrænsning enzymet med en 2-µL pipette. Luk låget PCR rør og bland forsigtigt ved at trykke på PCR rør. Kort spin ned PCR rør med en mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur.
  5. Køre PCR reaktioner ved hjælp af følgende protokol: 50 ° C i 10 min, 55 ° C i 10 min, 60 ° C i 20 min., og bedriften trin 10 ° C. Kort spin ned PCR rør med en mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur.
  6. Tilføje adapter ligatur master mix i den hver godt indeholder den fordøjede PCR-amplikoner med en pipette som følger: 4 µL af adapter ligatur løsning, 0,5 µL af stregkode, 0,5 µL af adapter, 2 µL af nukleasen-gratis vand og 2 µL af DNA ligase. Luk låget af PCR rør og bland forsigtigt ved at trykke. Kort spin ned PCR rør med en mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur.
  7. Køre PCR reaktioner ved hjælp af følgende protokol: 22 ° C i 30 min, 68 ° C i 5 min, 72 ° C i 5 min, og bedriften trin 10 ° C.
  8. Rense sekventering bibliotek med magnetiske perler ifølge producentens anvisninger.
  9. Oploesningen adapter-forbundet bibliotek til 1,5 mL DNA lav-bindende tube. Tilføje 45 µL af magnetiske perler ind i DNA lav-bindende rør til 1st rensning. Bland forsigtigt ved at trykke på røret og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
  10. DNA-lav bindende røret anbringes i en magnetisk rack, derefter inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur indtil løsningen er klar. Omhyggeligt supernatanten med 200 µL pipette uden at forstyrre de magnetiske perler.
  11. Tilsæt 150 µL af frisklavede 70% ethanol med 200 µL pipette, derefter flytte tube side-til-side af magnet at vaske perlerne. Omhyggeligt supernatanten uden at forstyrre de magnetiske perler.
  12. Gentag trin 5.11 for en anden vask.
  13. Kort spin ned røret med mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur. DNA lav-bindende røret anbringes i en magnetisk rack, og omhyggeligt kassér ethanol dråber med en 10 µL pipette.
  14. Tilsæt 50 µL af lav TE ind i DNA lav-bindende rør indeholdende den magnetiske perler pellet for at sprede perlerne. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
  15. DNA lav-bindende røret anbringes i en magnetisk rack, og Inkuber ved stuetemperatur i 2 min., indtil løsningen er klar.
  16. Overføre de 50 µL af supernatanten til nye DNA lav-bindende røret og tilføje 75 µL af magnetiske perler med 100 µL pipette til 2nd rensning. Bland forsigtigt ved at trykke på røret og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
  17. DNA lav-bindende røret anbringes i en magnetisk rack, derefter inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur indtil løsningen er klar. Omhyggeligt supernatanten med 200 µL pipette uden at forstyrre de magnetiske perler.
  18. Tilsæt 150 µL af frisklavede 70% ethanol med 200 µL pipette, derefter flytte tube side-til-side af magnet at vaske perlerne. Omhyggeligt supernatanten uden at forstyrre de magnetiske perler.
  19. Gentag trin 5,18 for en anden vask.
  20. Kort spin ned røret med en mini centrifuge på 1.500 x g for 5 s ved stuetemperatur. DNA lav-bindende røret anbringes i en magnetisk rack, og omhyggeligt kassér ethanol dråber med en 10 µL pipette.
  21. Tilføje 50 µL af lave TE ind i DNA lav-bindende rør indeholdende den magnetiske perler pellet for at sprede perlerne. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
  22. DNA lav-bindende røret anbringes i en magnetisk rack, og Inkuber ved stuetemperatur i 2 min., indtil løsningen er klar.
  23. Overføre de 45 µL af supernatanten indeholdende renset biblioteket ind i nye DNA lav-bindende rør med 100 µL pipette.

6. kvantificere bibliotek koncentration af kvantitative Real Time PCR

  1. Bestemmes koncentrationen af hver bibliotek ifølge producentens instruktioner13.
    1. Forberede en 20-fold fortynding løsning som følger: Bland 2 µL af renset bibliotek og 38 µL nukleasen-frit vand i et DNA lav-bindende rør med en 2-µL og 100 µL pipette.
    2. Opbevares ufortyndet bibliotekerne ved-20 ° C indtil trin 7.3.
  2. Forberede en 200-fold fortynding løsning som følger: Bland 5 µL af 20-fold fortyndet renset bibliotek (udarbejdet i trin 6.1) og 45 µL nukleasen-frit vand i et DNA lav-bindende rør.
  3. Forberede en 2,000-fold fortynding løsning som følger: Bland 5 µL af 200-fold fortyndet renset bibliotek (udarbejdet i trin 6.2) og 45 µL nukleasen-frit vand i et DNA lav-bindende rør.
  4. Forberede reaktion master mix som følger: Bland 10 µL af 2 x master mix løsning og 1 µL af 20 x primer-sonde assay løsning i sterile microcentrifuge rør med pipette, hvorefter der blandes ved at trykke på røret. Tilføje 11 µL af master-mastermix i brønde på en optisk 96-brønd reaktion.
  5. Tilføje 9 µL 2,000-fold fortyndet bibliotek, 9 µL af hver standard kontrol eller 9 µL nukleasen-gratis vand til hver brønd med en 10 µL pipette.
  6. Hold ikke-klæbende side af optiske selvklæbende film og skrælle den beskyttende opbakning fra midten af filmen.
    1. Forsigtigt trække applikator over filmen og forsegle filmen over 96-brønd pladen.
    2. Forsigtigt blandes den 96-brønd plade ved hjælp af en 96-brønd plade mixer til 10 s ved stuetemperatur.
    3. Der centrifugeres plade kort på 1000 x g i 3 min. ved stuetemperatur.
  7. Tænd for real-time PCR instrument og Indsæt den 96-brønd plade. Køre PCR reaktioner ved hjælp af følgende protokol: 50 ° C i 2 min., 95 ° C til 20 s, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C for 1 s og 60 ° C i 20 s. brug "standardkurven" og "hurtigt tilstand."
  8. Beregne ufortyndet bibliotek koncentrationen ganges koncentrationen bestemmes med qPCR af 2.000.

7. næste Generation Sequencing

  1. Planlægger at køre tilstand og indstille parameteren køre i softwaren.
    1. Klik på [Plan tab] og [skabelon], og vælg den passende opstille metode.
    2. Vælg program og teknik type, og klik på [næste].
    3. Vælg instrument, prøve forberedelse kit (valgfri), type dokumentbibliotek kit, skabelon kit, sekventering kit, basere kalibreringsmåde, chip type, styre sekvens (valgfrit), og stregkode sæt, og klik på [næste].
    4. Vælg plugins og klik på [næste].
    5. Vælg projekt, og klik på [næste].
    6. Vælg standard reference og BED filer af den målrettede region.
    7. Skriv navnet på prøve, Vælg stregkoden, og klik på [planlægge Kør].
  2. Udføre skabelon forberedelse og chip lastning i en automatiseret instrument i henhold til fabrikantens anvisninger. Tø reagens patron ved stuetemperatur i 45 min før brug.
  3. Fortynd ufortyndet biblioteket med nukleasen-gratis vand ifølge bibliotek koncentrationen beregnet i trin 6,8 og gøre 20 pM biblioteker.
    1. Forberede et fælles bibliotek til sekvensering og opbevares på is.
    2. Tilføj 25 µL af poolede biblioteket med 100 µL pipette til bunden af prøveglas. Brug biblioteket poolede inden for 48 timer.
  4. Tænd, og Åbn dækslet af den automatiserede instrument.
    1. Placer sekventering chip, chip adapter, berigelse patron, tip patron, PCR plade, PCR ramme seal, recovery tube, løsning patron, og reagens patron til passende positionen for den automatiske instrument.
    2. Tryk på [sæt op køre] og [trin for trin] på skærmen.
    3. Luk låget og tryk [Start check] på skærmen.
    4. Efter bunken scan proces, tryk [næste] på skærmen.
    5. Kontrollere display indholdet (kit typen, chip, chip ID, sample ID, planer), indstille tiden og tryk på [OK] på skærmen.
  5. Efter endt chip indlæsning:
    1. Tryk på [næste] på skærmen og Åbn dækslet.
    2. Losses sekventering chip fra chip adapter med behandskede hænder.
    3. Placerer chippen i objektbeholderen chip rap med parafilm og opbevares ved 4 ° C indtil sekventering reaktion.
    4. Fjernet berigelse patron, PCR plade, PCR ramme segl, recovery tube, løsning patron og reagens patron fra den passende holdning af den automatiserede instrument med behandskede hænder.
    5. Overføre en tom-tip patron til affald tip placeringen af den automatiske instrument med behandskede hænder.
    6. Tryk på [næste] og Luk dækslet.
    7. Tryk på [Start] og rense den automatiserede instrument af ultraviolette stråler i 4 min.
  6. Opløses en natrium chlorit tablet i 1.000 mL i ultrarent vand og filter løsning med et 0,22 µm filter flow filterenhed.
    1. Tænd sekventering instrument.
    2. Tryk på [Ryd] og [næste] på skærmen af sekventering instrument.
    3. Ren sekventering instrument med 250 mL filter-steriliseret natrium chlorit løsning og efterfølgende 250 mL i ultrarent vand.
  7. Tryk [Initialiser] og vælg den passende sekventering kit på skærmen.
    1. Installere en grå afsender på den korrekte placering med behandskede hænder.
    2. Initialisere sekventering instrument med vaskeopløsning (medfølger i sættet), pH justering løsning (som indeholder 350 µL natriumhydroxidopløsning, 100 mM), og pH standardopløsningen (medfølger i sættet).
  8. Tilføj 20 µL af dATP, dGTP, dCTP og dTTP nukleotider (medfølger i sættet) i 50 mL rør (medfølger i sættet) med 100 µL pipette.
    1. Installere en grå afsender på den korrekte placering med behandskede hænder.
    2. Indlæse 50 mL tube og skrue på sekventering instrument.
    3. Tryk på [næste] på skærmen for at starte initialisering skridt, som tager ca 25 min.
  9. Når du har fuldført trinnet initialisering:
    1. Tryk [Kør] på skærmen og vælg det relevante bibliotek forberedelse instrument.
    2. Scanne den to-dimensionel stregkode af chippen.
    3. Indsæt sekventering chip på den relevante position.
    4. Luk chip klemme og instrument.
    5. Tryk [Chip check], [næste], og [OK] på skærmen for at starte sekventering run.
  10. Efter sekvensering reaktion, overføre data og udføre analyse af data rørledning på sekventering server13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser hele processen fra udarbejdelse TIC prøver til DNA-ekstraktion. Navnlig tager proceduren kun to dage at få genomisk DNA fra TIC prøver. Vi evalueret eventuelle virkninger af tumor opbevaring før slide behandling. Vi fandt, at tumorceller var fastgjort i glas diaset væv prøver blev straks rørt i diaset, og når væv blev holdt i saltvand fugtede steril-gaze for 1 h (figur 2). Men når væv blev holdt ved stuetemperatur, tumorcellerne var ikke godt fastgjort til diaset. Rede dias kunne opbevares ved 4 ° C for tre måneder. Derfor er det vigtigt ikke at lade prøverne at tørre.

Vi undersøgte nytte af vores metode og sammenligne det med prøver anskaffes ved hjælp af FFPE. TIC og FFPE prøver blev udarbejdet fra 14 tumor prøver, og vi bekræftede, at tumor indhold og renhed kunne vurderes ud fra TIC prøver. Efter vi udført Giemsa farvning, kunne antallet af tumorceller og tumor morfologi vurderes ved mikroskopi. Vi har således kunnet rutinemæssigt evaluere tumorcellerne og efterfølgende udføre en DNA kvalitet check.

DNA kvantitet og kvalitet blev anslået af kvantitative realtid PCR13,14,15. Vi fast besluttet på de absolutte mængder, DNA og RQ-værdi, som er en indikator for den nedbrydning af genomisk DNA. Resultaterne viste, at en højere DNA udbytte blev opnået ved hjælp af TIC enheder sammenlignet med FFPE prøver (tabel 1). Derudover RQ-værdier af TIC DNA var betydeligt højere sammenlignet med FFPE DNA (figur 3, p = 2,3 x 10-8, tosidede Student's t tests). Vi vurderede også RQ-værdier af TIC og FFPE DNA ekstraheret fra forskellige tumortyper og fandt, at TIC DNA var højere i kvalitet i forhold til FFPE DNA (figur 3). Disse resultater viste, at TIC DNA var mindre fragmenteret end FFPE DNA.

Vi vurderede næste om TIC DNA kunne anvendes til næste generation sequencing analyse. FFPE og TIC DNA blev udarbejdet fra primære kolorektal cancer og metastatisk leverkræft fremstillet af en patient (figur 4A). PCR-amplifikation og bibliotek forberedelse blev gennemført ved hjælp af panelet kræft Hotspot og efterfølgende målrettet sekventering blev udført. Som et resultat, blev APC Q1367 * identificeret i både FFPE og TIC DNA ekstraheret fra webstedet 1 (tabel 2). Derudover APC S1356 *, KRAS G12D og TP53 M237I blev opdaget i begge FFPE og TIC DNA ekstraheret fra webstedet, 2, 3 og 4 (tabel 2). Disse resultater antydet, at de identiske somatiske mutationer var identificeret i parrede FFPE og TIC DNA prøver fremstillet af den samme tumor site (figur 4B og tabel 2). Især, blev de samme somatiske mutationer fundet mellem primære kolorektal cancer (Site 2, ikke websted 1) og to metastatisk leverkræft prøver, tyder på, at tumor kloner fra webstedet 2 metastaserer til leveren (figur 4B og tabel 2). Sammen tyder disse resultater på, at TIC DNA er høj kvalitet og er velegnet til en lang række genetiske test herunder næste generation sequencing.

Figure 1
Figur 1. skematisk for at få DNA fra en TIC prøveforberedelse. Tumor væv er rørt på dias glasset til at forberede TIC prøven. Efter vurdering af tumor morfologi og indholdet under et mikroskop, kan tumor DNA udvindes og anvendes til gentest. Ved hjælp af TIC, tumor DNA kan fås fra klinisk patologisk prøvemateriale inden to dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Forberedelse af TIC prøver. Resected tumor prøver blev straks rørt på en normal glas dias (venstre panel), holdt i saltvand fugtede steril-gaze for 1 h (midten), og opbevares ved stuetemperatur i 1 time (til højre). Eksempel #1 hepatocellulært carcinom og prøve #2 var brystkræft. Mikroskopiske billeder blev fanget ved hjælp af et digitalt kamera monteret på et mikroskop. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. DNA kvalitet check anslået af kvantitative real-time PCR analyse. TIC og FFPE DNA blev udvundet fra 14 tumor væv fra kolorektal (n = 8), mave (n = 4), og metastatisk leverkræft (n = 2). Sammenligning af relative kvantificering score mellem TIC-Giemsa og FFPE-han prøver. RQ værdier af TIC DNA var betydeligt højere end i FFPE DNA. Statistisk analyse mellem de to grupper var udført og p-værdier blev beregnet ved uparret tosidede Student's t -test ved hjælp af Excel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Næste generation sequencing analyse data ved hjælp af TIC og FFPE DNA. (A) Macroscopic og mikroskopiske billeder. Repræsentative billeder af TIC-Giemsa og FFPE-han farvning fra kolorektal cancer (websted 1 og 2) og metastatisk lever karcinom prøver (side 3 og 4). Skalalinjen i makroskopiske billeder: 1 cm, skalalinjen i mikroskopiske billeder: 100 µm. (B) varmekort viser fordelingen af somatiske mutationer for hver tumor site (n = 8). Identiske mutationer blev fundet blandt parrede TIC og FFPE DNA prøver. Værdier af allel fraktioner angives i graduering farveskala fra 1% (lyserød) til 100% (lyserød). Grå kolonner viste ingen påvist mutation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

TIC-Giemsa (n = 14) FFPE-han (n = 14)
Samlede DNA (ng) Samlede DNA (ng)
Stikprøve Tumor site Kort Lang RQ Kort Lang RQ
Site1 Tyktarmen 1495 1247 0,83 939 349 0,37
Site2 Tyktarmen 991 1057 1.07 556 204 0,37
Site3 Leveren 467 511 1.09 130 39 0,3
Site4 Leveren 2172 2115 0,97 488 127 0,26
Site5 Tyktarmen 749 598 0,8 529 205 0,39
Site6 Mave 330 286 0,86 211 98 0,46
Site7 Mave 636 499 0,78 154 84 0,55
Site8 Mave 27 27 1,01 135 81 0,6
Site9 Tyktarmen 1986 1611 0,81 476 163 0,34
Site10 Tyktarmen 280 218 0,78 209 83 0,39
Site11 Tyktarmen 1546 575 0,37 366 159 0,43
Site12 Mave 1501 1200 0,8 274 132 0,48
Site13 Tyktarmen 1556 1404 0,9 326 179 0,55
Nærskibsfart14 Tyktarmen 1565 1210 0,77 680 295 0,43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

Tabel 1. DNA kvalitetsdata. Parret TIC (n = 14) og FFPE prøver (n = 14) blev udarbejdet fra tyktarmen, leveren og mave kræftformer. TIC prøver var plettet med Giemsa, og FFPE prøver var plettet med hæmatoxylin og eosin (han). DNA-prøver blev udvundet og kvantificeres ved kvantitative real-time PCR med to primer par forstærke RNaseP locus (lang amplikon (268 bp) og korte amplikon (87 bp)). RQ værdier blev beregnet som følger: den gennemsnitlige værdi af lang amplikon opdelt som middelværdien af korte amplikon. SD, standard afvigelse; RQ, relative kvantitering

Eksempel navnet Beliggenhed Forberedelse Gen symbol Mutation Position Reference Variant Kodning Dækning Allel brøkdel
Primære kolorektal cancer Webstedet 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
Primære kolorektal cancer Webstedet 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
Primære kolorektal cancer Site 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
Primære kolorektal cancer Site 2 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
Primære kolorektal cancer Site 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
Primære kolorektal cancer Site 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
Primære kolorektal cancer Site 2 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
Primære kolorektal cancer Site 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
Metastatisk leverkræft Side 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
Metastatisk leverkræft Side 3 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
Metastatisk leverkræft Side 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
Metastatisk leverkræft Side 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
Metastatisk leverkræft Side 3 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
Metastatisk leverkræft Side 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
Metastatisk leverkræft Side 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
Metastatisk leverkræft Side 4 FFPE KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
Metastatisk leverkræft Side 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
Metastatisk leverkræft Side 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
Metastatisk leverkræft Side 4 TIC KRAS G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
Metastatisk leverkræft Side 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

Tabel 2. Sammenligning af mutationer i parrede FFPE og TIC DNA fundet af målrettede sekventering analyse. Parret TIC og FFPE prøver blev udarbejdet fra 2 primære kolorektal kræft (websted 1 og 2) og 2 metastatisk leverkræft (side 3 og 4). Målrettet sekventering blev udført med disse DNA-prøver og somatiske mutationer blev identificeret. Mutation profiler var identiske mellem parrede TIC og FFPE DNA prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterede vi en alternativ metode til at opnå tumor DNA fra klinisk patologisk prøvemateriale ved hjælp af TIC. TIC forberedelse er meget enkel og kræver mindre tid sammenlignet med FFPE metoder, uden krav om særlige instrumenter10. Alle procedurer fra TIC forberedelse til DNA-ekstraktion kan afsluttes inden for to dage (figur 1). Denne metode forkorter dermed ekspeditionstid for udførelse af gentest. Navnlig, giver dette en betydelig fordel i afkortning antallet dage, der kræves for Molekylær analyse. Denne korte ekspeditionstid tillader os at straks tilbyde en passende behandling for progressive kræftpatienter, der kræver molekylært målrettet narkotika. Denne metode giver således fordele for analyser af genetiske ændringer på tumorer og administration af molekylært målrettet narkotika for kræftbehandling.

Der er nogle centrale punkter for succes ved hjælp af TIC DNA for genetisk analyse. Tumor væv kan være nekrotiske behandling såsom kemoterapi eller andre behandlinger. Således er forsigtighed nødvendig ved udarbejdelsen af TIC prøver at undgå prøveudtagning fra nekrotisk sektioner i tumor som muligt. Yderligere, indledende mikroskopisk bedømmelse er meget vigtig for efterfølgende procedurer. Derudover er forhindrer udtørring af tumor væv nødvendige for vellykket TIC prøveforberedelse. Hvis tumor væv er tørret, resulterer dette i færre tilknyttede celler på glas dias. Det vil også være vanskeligt at observere tumor celleforandringer og morfologi fordi tørring fører til degeneration af tumor væv.

Der er nogle potentielle fordele ved at bruge TIC DNA. Først, kan vi kontrollere tumor celleforandringer under den første vurdering med mikroskopi. Hvis normale celler, lymfocytter og stromale celler, rigeligt i vævsprøver, ville forurening af disse normale celler forhindre evne til at detektere somatiske mutationer i tumorceller. Hurtig mikroskopiske vurdering af prøverne kan bidrage til evalueringen af tumor celleforandringer og vurdering af hvorvidt passende tumor DNA-prøver blev indhentet fra TIC prøver før DNA-ekstraktion. For det andet viste vores resultater, at TIC DNA er både høj kvalitet og mængde. FFPE DNA er blevet brugt til næste generation sequencing analyse herunder målrettet sekventering, exome sekvensering og hele genome sequencing16,17,18,19,20. Archival FFPE DNA er også rutinemæssigt anvendes til genetisk analyse21,22, men FFPE DNA kan være fragmenteret under formalin fiksering. Dette kan resultere i problemer med PCR-amplifikation eller DNA-ekstraktion, forårsager manglende sekvens dækning, Ensartethed på målområder, og øge risikoen for sekvens fejl23,24. Derimod er TIC DNA ikke fragmenteret, hvilket kan skyldes alkohol fiksering, der har mindre indflydelse på den indsatte nukleinsyre. Som TIC DNA ikke er fragmenteret som FFPE DNA, vil prøverne være mere velegnet til næste generation sequencing analyse, real-time PCR og digital PCR. Ja, vi tidligere viste at TIC DNA fra tumor prøvemateriale kan bruges i næste generation sequencing analyse, en metode kaldet "TIC-seq", og resultaterne kunne netop fange tumor somatiske mutationer13. For det tredje, denne teknik er gældende for en lang række materialer. I den foreliggende betænkning brugte vi kirurgiske enheder. Ud over kirurgisk væv, metastatisk lymfeknude, kan bronkial eller endoskopisk biopsi bruges til at forberede TIC DNA.

Afslutningsvis, præsenterer vi en enkel og hurtig metode til forberedelse af høj kvalitet tumor DNA ved hjælp af TIC prøver. Denne metode vil udvide nye muligheder inden for genetisk analyse og bidrage til at fremme præcision medicin i de kliniske omgivelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Vi takker alle de medicinske og accessoriske ansatte i hospitalet og patienterne for samtykke til at deltage. Vi takker Gabrielle White Wolf, ph.d., fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) til at redigere et udkast af denne betænkning. Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for genom forskningsprojekt fra Yamanashi præfektur (YH og M.O.) og et tilskud fra The YASUDA medicinsk Foundation (YH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373, (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45, (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6, (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339, (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23, (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53, (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39, (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45, (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32, (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1, (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5, (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8, (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8, (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46, (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17, (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34, (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3, (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3, (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376, (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13, (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13, (7), 23 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics