Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Developmental Biology
 

Summary

Denne protokol beskriver måling af epitel barriere permeabilitet i real-time følgende farmakologiske behandling i menneskelige tarm organoids ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og live celle mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fremskridt i 3D kultur af tarmens væv fremstillet gennem biopsi eller genereret fra pluripotente stamceller via styret differentiering, har resulteret i sofistikerede in vitro- modeller af tarmslimhinden. Udnytte disse nye modelsystemer vil kræve tilpasning af værktøjer og teknikker udviklet for 2D kultur systemer og dyr. Her, beskriver vi en teknik til måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm organoids i realtid. Dette opnås ved mikroinjektion af fluorescently mærket dextran og imaging på en inverteret mikroskop udstyret med epifluorescerende filtre. Real-time måling af barriere permeabilitet i tarm organoids letter generation af høj opløsning temporale data i menneskelige intestinale epitel væv, selv om denne teknik kan også anvendes på fast tidspunkt imaging tilgange. Denne protokol kan let tilpasses til måling af epitel barriere permeabilitet efter udsættelse for farmakologiske stoffer, bakteriel produkter eller toksiner eller levende mikroorganismer. Med mindre ændringer, denne protokol kan også tjene som en generel primer på mikroinjektion af tarm organoids og brugere kan vælge at supplere denne protokol med supplerende eller alternative downstream programmer efter mikroinjektion.

Introduction

Den intestinale epitel udgør en selektiv barriere, der medierer retningsbestemt transport af næringsstoffer, H2O, ioner og affaldsprodukter samtidig minimere uspecifik diffusion-medieret udveksling af andre partikler mellem lumen og den mesenchymale væv eller blod levering1,2. Uspecifik permeabilitet af den intestinale epitel barriere har længe været betragtet som en nøgle funktionelle parameter i både sundhed og sygdom3,4,5,6, der afspejler satsen af Diffusion af små molekyler på tværs af epitel via paracellular plads. Måling af epitel barriere permeabilitet kan gennemføres i dyre modeller7 og i menneskelige patienter8 gennem indtagelse af Lose, som har ingen særlige transporter i mave-tarmkanalen, og den efterfølgende indsamling og måling af Lose koncentrationer i perifert blod. Alternative indtaget markører af barriere funktion som fluorescently mærket kulhydrater er også tilgængelige9,10. Denne tilgang er blevet tilpasset for intestinale epitel cellekulturer dyrkes på Transwell understøtter11, en forenklet fremgangsmåde, der giver mulighed for større eksperimentelle kontrol, men er også blevet kritiseret som en dårlig indikator for in vivo permeabilitet på grund af manglen på differentierede epitelial undertyper og væv struktur12. Brug kamre udgør endnu en anden tilgang og mulighed for måling af epitel barriere funktion i hele tarmslimhinden ex vivo13. Anvendelse af denne teknik er ofte begrænset af væv tilgængelighed og betingelse13,14. Dermed er nye metoder, som afbalancere reproducerbarhed og overførselshastighed med fysiologisk relevans nødvendige.

Den seneste udvikling i in vitro- organogenesis har ført til vedtagelsen af 3D vævskultur modelsystemer som en avanceret platform for recapitulating dynamikken i komplekse væv15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Især humane pluripotente stamceller (hPSC) afledt menneskelige tarm organoids (HIOs)19,24 er dukket op som en reproducerbar og eksperimentelt tractable modelsystem til undersøgelse af vært-mikrobielle interaktioner og epitel barriere dynamics25,26,27,28. Tilsvarende menneskelige væv-afledte organoids (også kendt som enteroids) kan være afledt af en simpel biopsi procedure og kan bruges som en tractable system til at studere menneskets fysiologi og sygdomme15,29,30. Mikroinjektion af menneskelige tarm organoids giver mulighed for levering af eksperimentelle forbindelser25 eller live mikrober25,31,32,33 til den apikale epitelial overfladen af organoid lumen. Leslie og Huang et al. 25 tilpasset for nylig denne teknik til at måle barriere permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran efter udsættelse for bakterielle toksiner.

Denne protokol er tænkt som en vejledning til måling af epitel barriere permeabilitet i hPSC-afledte HIOs og væv-afledte HIOs ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Med mindre ændringer, kan det også tjene som en generel primer på mikroinjektion af HIOs med eksperimentelle forbindelser. Brugere kan supplere denne protokol med supplerende eller alternative downstream programmer efter mikroinjektion.

Protocol

Normal, de identificerede menneskelige voksen tarm væv blev indhentet fra afdøde organdonorer gennem livets gave, Michigan. Menneskelige ES celle linje H9 (NIH registreringsdatabasen #0062) blev fremstillet af WiCell Research Institute. Alle menneskelige væv bruges i dette arbejde blev indhentet fra ikke-levende donorer, blev de identificerede og blev gennemført med godkendelse fra University of Michigan IRB (protokol # HUM00093465 og HUM00105750).

1. microinjector Setup

  1. Få de materialer, der er opført i Materialer tabel.
  2. Placere micromanipulator, dissekere anvendelsesområde og lyskilde i biosikkerhed kabinet. Ren opsætningen mikroinjektion med 70% ethanol eller andre desinfektionsmiddel før eksperimenterende brug. Undgå langvarig udsættelse for desinfektionsmidler indeholder blegemiddel, som kan ætses mikroinjektion udstyr.
    Bemærk: Et eksempel på en komplet microinjector forsamling er vist i figur 1.
  3. Placer dissekere anvendelsesområdet, så øjet brik kan bruges gennem adgangsport i skjoldet for Biosikkerhed kabinet.
    1. Skiftevis, bruge en ren bænk med positive air flow system i stedet for et skab med mikroskop adgangspunkter biosikkerhed.
  4. Samle micromanipulator på højre side af mikroskop ifølge producentens anvisninger og justere, så kontrolelementerne kan være let nået og justeret. Micromanipulator skal monteres på en jernplade eller ellers stabiliseret.
    Bemærk: Venstrehåndet brugernes må ville gerne placere micromanipulator til venstre for dissekere anvendelsesområdet.
  5. Montere mikropipette indehaveren på micromanipulator arm og Tilslut analoge slangen ved at indsætte det i mikropipette indehaveren.
  6. Fylde 10 mL glas sprøjte med ca. 5-7 mL sterilt mineralsk olie.
  7. Tilslut 10 mL glas sprøjte fyldt med mineralsk olie til den åbne ende af analoge slangen ved hjælp af Luer lock mekanisme. Placer glas sprøjte til venstre for dissekere anvendelsesområdet, overfor fra micromanipulator.
  8. Forsigtigt trykkes på sprøjten, skubbe mineralsk olie gennem slangen. Skylle ca 10 dråber af mineralsk olie fra spidsen af mikropipette indehaveren og indsamle i en petriskål eller et lignende fartøj og kassér.
    Bemærk: Dette trin fjerner alle luft fra slangen og bør udføres før hver mikroinjektion session.

2. forberedelse til mikroinjektion

  1. 24 timer før mikroinjektion:
    1. Forbered FITC dextran løsning ved at suspendere FITC dextran ved en koncentration på 2 mg/mL i sterilt PBS eller saltvand. Udarbejde en samlet maengde paa > 250 µL.
      Bemærk: Anvendes højere eller lavere koncentrationer af FITC-dextran spænder fra ca 0,1 - 10 mg/mL. Justere koncentrationen af FITC-dextran passer til nedstrøms billedbehandling ansøgning.
    2. Opsætning organoid kulturer på 4 - eller 8-godt glas kammer dias eller andre kultur fartøj egnet til live mikroskopi, med op til 4-6 HIOs pr. brønd, indlejret i 50 µL celle matrix løsning og kulturperler i EGF, Noggin og R-Spondin (ENR) vækstfaktor media 19 ,24. Passe på plads organoids jævnt (ca 5 mm fra hinanden) for at undgå at fange flere HIOs i en enkelt mikroskopisk felt under real-time imaging analyse. Se McCraken et al. for en komplet guide til HIO kultur og vedligeholdelse 24.
      Bemærk: Denne protokol blev udviklet ved hjælp af stamceller-afledt HIOs og de repræsentative resultater (se nedenfor) demonstrere brugen af denne vævskultur model. Samme protokol tilpasset nemt væv-afledte intestinale epitel organoids15,29. Væv-afledte HIOs er typisk mindre end PSC-afledte HIOs og mangler den understøttende mesenchymale basolateral celle struktur15,29,30. Mikroinjektion af væv-afledte HIOs kan kræve en større grad af teknisk kunnen og erfaring. Grad som epitel barriere permeabilitet data opnået ved hjælp af væv-afledte HIOs kan korrelere med hPSC-afledte HIOs er ukendt.
    3. Inkubér HIOs i en standard celle kultur inkubator på 42 ° C og 5% CO2 før mikroinjektion.
  2. 30 minutter før mikroinjektion, tænde biosikkerhed kabinet og øge skjoldet glas til den optimale arbejdshøjde.
  3. Fjerne alle unødvendige elementer fra biosikkerhed kabinet. Rod øger risikoen for udslip eller andre ulykker, når arbejder lukkede rum.
  4. Spray og grundigt rene bordpladen med 70% ethanol eller andre desinfektionsmiddel. Aftørre ren ved hjælp af en køkkenrulle.
  5. Kontrollere niveauet af mineralsk olie i glas sprøjte knyttet til microinjector. Hvis der er mindre end 3 mL af mineralsk olie tilbage, skru sprøjten og genopfylde inde i kabinettet, være omhyggelig med at undgå at indføre boblerne biosikkerhed. Fyld ikke mere end 7 mL.
  6. Tænd lampen til at belyse den dissekere anvendelsesområde. Justere okular til personlig komfort.
  7. Stilling micromanipulator til højre for dissekere anvendelsesområdet. Fastgør micromanipulator til en jernplade, ved hjælp af en magnetisk stand. Skifte den magnetiske stå til positionen OFF at justere placeringen af micromanipulator og sikker stand til jernplade ved at sætte den magnetiske stå til ON-position.
  8. Microcapillary installation
    1. Hente en enkelt 1 mm glas glødetråd fra opbevaringsbeholder fra producenten.
    2. Indsæt glas glødetråden gennem midten af kobber varmespiral af mikropipette puller.
      Bemærk: Se figur 2 for en guide til at forberede mikropipette puller.
    3. Placer glødetråden, så kobber varmespiral er ca midt i glas glødetråden. Dette vil sikre, at puller genererer to brugbare mikroinjektion nåle fra hvert glas glødetråd.
    4. Sikre den glas glødetrådens ved hjælp af skruetvinger ved at stramme toppen klemme først, og sørg for, at glas glødetråden er sikret inden for den indskåret grove at forhindre brud.
    5. Udvide aftrækker-armen til sin maksimale lodrette position før stramning bunden klemme.
      Bemærk: Dette trin er vigtigt. Manglende fuldt udvide aftrækker-armen bliver medfører uregelmæssige adskillelse af de to dele af glas glødetråden.
    6. Tjekke indstillingerne på varmen og trække mekanisme.
Vælg varme #1 med toggle (990) og indstille PULL på 059 (figur 2).
  • Tænd apparatet ved hjælp af toggle On/Off.
  • Luk den beskyttende plexiglas skærme og tryk på knappen træk på den nederste højre ansigt puller. Den kobber coil vil begynde at varme og vil glød lyse orange. Som temperaturen stiger, vil glas glødetråden begynde at strække og i sidste ende adskilt. Efter adskillelse af de to ender af glas glødetråd, vil apparatet magt ned.
    Bemærk: Den kobber coil vil forblive ekstremt varme i flere minutter. Trak glas glødetråden vil betegnes som en 'microcapillary' fra dette punkt fremad i protokollen.
  • Være omhyggelig med at undgå at berøre den kobber coil, fjerne en af glas microcapillaries. Microcapillary skal have en meget fin spids. Håndtere microcapillary omhyggeligt med latex eller nitril handsker og straks gå til biosikkerhed kabinet indeholder opsætningen af microinjector.
    Bemærk: Glas microcapillary er ekstremt skarpe og meget skrøbelig. Håndterer med omhu.
  • Løsne endedæksel micromanipulator arm. Indsæt den stumpe ende af den trak microcapillary i den åbne ende af mikropipette indehaveren og tryk det indad indtil det stopper.
  • Sikre den stump ende af microcapillary til micromanipulator arm af ny stramning endedæksel.
    Bemærk: Når du installerer microcapillary på mikroinjektion system sørge for at undgå at berøre skærpet slutningen. Dette vil reducere risikoen for forurening og bevare den fine point for mikroinjektion. Manglende korrekt sikre microcapillary kan resultere i ustabilitet eller brud på glas glødetråd under mikroinjektion.
  • Åbn spidsen af glas microcapillary. Under forberedelsen af trak glas microcapillary, vil spidsen af punktet sandsynlig smelte i således at forsegle den spidse ende af microcapillary. At fjerne denne blokering:
    1. Placer micromanipulator, sådan at microcapillary er pegede ned på stadiet glas dissekere anvendelsesområde uden at røre denne overflade.
    2. Find et sterilt plastik overflade (undersiden af kultur plade låg virker perfekt) og placere den på stadiet mikroskop direkte nedenunder microcapillary nål på scenen af dissekere anvendelsesområde.
    3. Centrere spidsen af microcapillary under gennemsyn område og sikre, at det er synligt, når man ser gennem okularet af mikroskopet under 1,5 X forstørrelse.
    4. Ved hjælp af micromanipulator Kontroller, langsomt forhånd micromanipulator arm og microcapillary mod sterile plastik kultur låg indtil spidsen næppe kontakter plast overfladen og spidsen af microcapillary bryder fri.
      Bemærk: Målet for den mindste mulige pause, der giver mulighed for væske flow fra glas glødetråd for at minimere skaderne på HIO under mikroinjektion.
    5. Tilbage microcapillary fra sterile overfladen for at minimere risikoen for utilsigtet brud, før du fortsætter.
    6. Check microcapillary for strømmen af deprimerende glas sprøjte, skubbe mineralsk olie gennem slangen. Hvis udgangen af microcapillary er blevet åbnet vil du se en lille dråbe af mineralsk olie emerge fra spidsen af microcapillary efter et par sekunder. Hvis dette ikke sker, Gentag de forrige trin og teste igen.
  • 3. sterile mikroinjektion

    Bemærk: Når microcapillary er blevet forberedt, installeret og testet, begynde microinjecting HIOs. Figur 3 illustrerer et væv-afledte HIO, har været succesfuldt sprøjtes med FITC-dextran.

    1. Fyld microcapillary med indsprøjtning materiale. Dykke spidsen af glas microcapillary i FITC dextran injektion suspension, være omhyggelig med at undgå at bryde spidsen af microcapillary mod sider eller bunden af røret. Når spidsen af microcapillary er neddykket i opløsningen, trække sig tilbage på mineralsk olie sprøjten trække ca 10 µL af FITC dextran suspension i microcapillary.
      Bemærk: Det anbefales at bruge 1,5 mL eller 0,5 mL rør til injektion løsninger/kulturer, da disse vil være de mest let tilgængelig for de installerede microcapillary. Alternativt, injektion løsninger kan trækkes fra en steril petriskål eller sterile parafilm, hvilket kan reducere risikoen for sharps skade ved at begrænse behovet for at holde en tube i umiddelbar nærhed af microcapillary. Hvis suspensionen er meget tyktflydende eller hvis åbningen af microcapillary er usædvanligt lille, kan det tage flere sekunder at udfylde microcapillary. Drage ikke mikroinjektion suspensioner i plast mikroinjektion slangen, da dette kan forurene hele mikroinjektion system.
    2. Stoppe fylde microcapillary når mikroinjektion suspension fylder 90% af længden af glas microcapillary. Trykkes sprøjten lidt før tilbagetrækning af microcapillary fra mikroinjektion løsning til at sikre, at spidsen af microcapillary ikke indeholder lommer af luft.
      Bemærk: Hvis undersøgelsen af microcapillary afslører lommer af luft, tømme og re fylde.
    3. Fjerne HIO kultur skilte fra celle kultur inkubator og overførsel til biosikkerhed kabinet med microinjector.
    4. Fjern låget fra HIO kultur plade inden for Biosikkerhed kabinet og center den første godt på stadiet mikroskop, således at det tydeligt kan ses gennem okularet anvendelsesområde ved den laveste forstørrelse indstilling.
    5. Drej micromanipulator arm, sådan at microcapillary er pegede ned i HIO kultur godt i en vinkel > 45° i forhold til stadiet mikroskop. Dette opnås lettest ved manuelt at dreje micromanipulator arm forsamling på sin vandrette akse på det punkt, hvor den vandrette micromanipulator arm støtte opfylder den lodret stander, da den fine kontrol (sort ringer) har et begrænset udvalg af motion. Placer spidsen af microcapillary over den første kultur vel på ca 1 cm over overfladen af medierne (figur 3A). Et repræsentativt billede viser mikroinjektion af væv-afledte intestinale epitel organoids er vist i figur 3B.
    6. Check at begge spidsen af glas glødetråden og HIO(s) er synlige gennem okularet. Re-holdning om nødvendigt.
    7. Forhånd microcapillary langsomt ved at dreje kontrolknappen z-aksen med uret.
      Bemærk: At bedømme placeringen af microcapillary spidsen, kræver særlig dybde, praksis. Som spidsen overtræder overfladen af medierne, mærke en lille visuel forvrængning af microcapillary spidsen.
    Fortsætte med omhu fra dette punkt til at undgå at bryde microcapillary mod bunden af kultur plade eller beskadige HIOs.
  • Gennembore HIO med microcapillary spids. Den ydre overflade af HIO vil presse lidt som microcapillary begynder at anvende pres og vil pop tilbage i form som spidsen trænger lumen. Det kan være vanskeligt at identificere spidsen af microcapillary inden for HIO lumen. Justere indstillingerne belysning eller forstørrelse af dissekere anvendelsesområde, hvis det er vanskeligt at se microcapillary.
  • Fjerne hænderne fra micromanipulator kontrollen, når microcapillary er korrekt anbragt med spidsen af microcapillary nær centrum af HIO.
  • Trykkes mineralsk olie sprøjten lidt for at skubbe mikroinjektion løsning ud af microcapillary og i HIO lumen. HIO kan udvide lidt for at imødekomme volumen af injektion.
    Bemærk: sørge for at undgå over påfyldning af HIO, da dette vil medføre organoid at briste. Som en tommelfingerregel betyder nogen synlige udvidelse af HIO volumen, at det er tid til at stoppe. Den gennemsnitlige volumen af modne HIO lumen er ca 1 µL, men kan variere betydeligt. Automatiseret sprøjte pumper kan bruges i stedet for en manuel sprøjte så fin kontrol af den injicerede volumen.
  • Trække microcapillary fra HIO ved hjælp af z-akse kontrol og position over overfladen af medierne.
  • Flytte til det næste HIO mål med microcapillary placeret over medierne til at undgå utilsigtet skade på HIOs under manøvrering og indsprøjtes i en lignende måde (Se trin 3.6-3.11).
    1. Refill microcapillary benytter metoden beskrevet ovenfor.
      Bemærk: Hvis spidsen pauser på noget tidspunkt under mikroinjektion, forsøg ikke at fortsætte injektioner. Ændre spidsen ifølge instruktionerne nedenfor.
  • Ændre microcapillary mellem behandlinger eller i tilfælde af brud. Løsn klemmen på enden af micromanipulator arm og fjerne microcapillary fra mikropipette indehaveren.
    Advarsel: Kan ikke håndtere microcapillary nær den skarpe ende. Den fine punkt af microcapillary er ekstremt skarpe og vil nemt punktere handsker og hud. Udvis forsigtighed og være opmærksomme på alle bevægelser, håndtering af microcapillary ved hjælp af manipulator kun og aldrig placere hænder mellem punktet af microcapillary og HIO kulturer. Søge lægehjælp øjeblikkeligt i tilfælde af en nålestiks fra en microcapillary, der indeholder smittefarlige stoffer eller toksiner.
    Bemærk: I nogle tilfælde kan det være vanskeligt at visuelt Bekræft vellykket HIO mikroinjektion. Synligheden af klare mikroinjektion suspensioner kan forbedres ved brug af tilsætning af højere koncentrationer af FITC-dextran.
  • 4. farmakologiske behandling af HIOs

    1. For at teste forbindelser leveres til den apikale epitel, resuspend i steril PBS, som indeholder 2 mg/mL FITC-dextran og microinject til HIO lumen som anført ovenfor (afsnit 3). For den repræsentative eksperiment, resuspend Clostridium difficile toksin kanaltilbehøret på 12,8 ng/µL i PBS, som indeholder FITC-dextran.
    2. For at teste forbindelser leveres til basolateral rum, erstatte den eksterne medier med nye medier indeholdende 2 mM ethylenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA)(positive control), PBS køretøj alene (negativ kontrol ), eller andre eksperimentelle sammensatte efter mikroinjektion af FITC-dextran.
      Bemærk: Dosering og timing af anvendelsen af farmakologiske forbindelser, toksiner eller andre agenter kan variere alt efter de eksperimentelle spørgsmål.

    5. live Imaging af Microinjected Organoids

    1. Begynde live imaging umiddelbart følgende mikroinjektion. Overføre kultur plader til en fluorescerende mikroskop udstyret med en fugtig kammer vedligeholdes ved 37 ° C og 21% O2 og 5% CO2 med en automatiseret levende celle imaging system. Luk den miljømæssige kammer og start billedprocessen.
    2. Lancere billede analyse software (f.eks softWoRx) fra skrivebordet. Klik på "File" og vælg "Erhverve (løse 3D)" at initialisere imaging og mikroskop control software.
    3. Indstil excitation/emission til FITC (475 nm excitation/523 nm emission), indstille transmission magt til 5%, og linsen til 4 X. Indstille eksponering til 0,025 ms (figur 4A).
      Bemærk: Eksponeringstid bør varieres passer til fluorescerende radiosignalets styrke. Generelt vil FITC fluorescens signal kun falde. Derfor for at sikre maksimal følsomhed, bør initial eksponering gange justeres, således at den optagede fluorescerende signal er lige under mætningspunktet kamera og billedbehandlingsprogrammer.
    4. Find HIOs på 4 X forstørrelse ved hjælp af den digitale controller tilsluttet mikroskop. Centrere HIO inden for gennemsyn område (figur 4A).
    5. Klik på "Vis" på værktøjslinjen og vælge "Punkt liste" til at afsløre et nyt vindue. Klik på "Marker punkt" til at gemme den aktuelle placering af scenen på listen punkt (figur 4A).
    6. Gentag trin 5.4 og 5.5, indtil holdninger af alle HIOs er blevet registreret. Brug en notesblok eller digital post, gøre opmærksom på den entydige id-nummer tildeles hver programmeret mikroskopi position og billeder fanget på denne holdning. Billedfiler vil være markeret med dette id-nummer og det vil være vigtigt at knytte billede id-numre til specifikke HIOs og behandlinger, når dataindsamlingen er afsluttet.
    7. For at setup automatiseret billede samlingen, skal du klikke på "File" og derefter "Eksperiment" i værktøjslinjen. Navnet eksperiment med datoen eller et andet entydigt navn.
    8. Angiv parametrene for billede samlingen ved at gå gennem hver af fanerne indstilling som vist i figur 4B.
      1. Un-kontrollere "Z skæring" under fanen "Skæring".
      2. Under fanen "Kanaler", skal du indtaste parametre fra vinduet øverste venstre "løse 3D". For at spare tid, udfylde den første række automatisk når boksen til venstre i kontrolleret.
      3. Under fanen ' Time-lapse ", markere afkrydsningsfeltet"Time lapse"og angive tidsintervallet mellem billeder i rækken mærket"Time-lapse"og den samlede varighed af forsøg i rækken mærket"totaltid". Softwaren vil automatisk beregne antallet af tiden point.
      4. Under fanen "Punkter", skal du markere afkrydsningsfeltet "Besøg punkt liste".
    Du kan også manuelt angive specifikke punkt numrene skal inkluderes i eksperimentet ved at skrive i tekstboksen.
  • Ændre ikke standardindstillingerne under fanerne "Paneler" eller "Handlinger".
  • Klik på "Kør" tab. postere datoen for eksperimentet i boksen mærket "image file name" og angive den opspare placering under "Indstillinger".
  • Klik på den grønne pil til at køre makroen eksperiment. En tid bortfalder tæller op på den eksperimentelle fremdriften.
  • I slutningen af den planlagte tidsforløb, eksportere og gemme alle billedfiler som 24-bit RGB TIFF-billeder (fig. 4 c).
    1. På værktøjslinjen, skal du vælge proces efterfulgt af opgave builder.
    2. Tilføj filer ved at navigere til mappen data angivet i 5.9 i menuen opgave builder. Fremhæv alle filerne ender på ".dv" ved at skrive "*.dv" i prompten. Vælg alle (Ctl + A) og klik på "Tilføj".
    3. Klik på + under afsnittet "Opgave." Vælg "Eksporter som..." og klik på fanen "Indstillinger".
    4. Sæt "Eksporter Format" til "TIFF billeder" og Marker afkrydsningsfeltet nedenfor til at tilføje en "Custom outputmappe". Dette er den placering, hvor TIFF-billeder vil blive eksporteret. Vælg 24-bit RGB under "TIFF outputtypen" og klik "Færdig".
    5. Klik på "Indsend til kø" for at køre makroen eksport.
  • Kopiere TIFF billeder eksporteret i 5.11 til en ekstern chauffør eller server, hvis du vil udføre efter imaging analyse (afsnit 6) på en anden computer.
    Bemærk: HIO væv og medier kan opbevares i histologi34, PCR35), vestlige duppes36eller andre downstream analyse.
  • 6. efter imaging analyse

    1. Kontroller, at ImageJ37 er installeret og fungerer korrekt på computeren for at kan bruges til analyseformål.
      Bemærk: Fiji37 er en alternativ fordeling af programmet ImageJ kerne, der vil arbejde lige så godt for denne analyse.
    2. Start batchanalyse ved at vælge "Processen" og derefter "Batch" og endelig "Makro" fra menuen ImageJ.
    3. Sæt Input til den mappe, der indeholder TIFF billeder indsamlet under den eksperimenterende tidsforløb. Åbn filen "thesholdmeasure.ijm" ImageJ makro eller direkte copy/paste makrokoden i vinduet. Klik på "Processen" for at begynde at behandle filerne.
      Bemærk: Minimumstærskel værdien x (setThreshold(x,255);) kan indstilles til et vilkårligt antal 0 - 255 og bør tilpasses for at fjerne baggrunden fluorescens. Værdier < 100 er anbefalet. Bestem empirisk den relevante tærskelværdi, skal du køre makroen imaging på et enkelt billede, der repræsenterer en organoid med ingen fluorescerende signal. Den gennemsnitlige intensitet af dette billede kan tjene som vejledning for fastsættelse af tærsklen korrekt. For den repræsentative analyse, der præsenteres nedenfor, blev grænsen sat til "42".
    4. ImageJ vil producere en stor tabel, der indeholder området af alle pixel inden for tærskel intensitet interval, og gennemsnit, median, minimum og maksimum (grænse) intensitet værdi for området inden for tærskelværdierne for intensitet. Gemme det som en CSV- eller XLS.
    5. Ændringer i intensitet over tid kan beregnes i et regneark39 ved at manipulere datatabel for at udføre beregningen nedenfor eller kan være automatiseret hjælp af en egnet programmering sprog. Et eksempel analyse script skrevet i R 40 er forsynet med dette håndskrift.
      Bemærk: For hver HIO relative fluorescens intensitet kan kvantificeres som Equation 1 . Eliminering tid 41 (t1/2) af FITC-dextran i HIO lumen blev beregnet som følger:
      1. Først beregne "arealet under kurven" (AUC) fra kurven beskriver relative fluorescens intensitet over tid (t) som:
        Equation 2
      2. Derefter beregne "clearance" (Equation 3) sats med mængden af distribution (Vd) defineret som 1 for den normaliserede fluorescens på t = 0:
        Equation 4
      3. Næste, angive "eliminering konstanten" (Equation 5) som:
        Equation 6
      4. Og endelig, beregne "eliminering tid" (t1/2) som:
        Equation 7
        Den reducerede ligning er således:
        Equation 8

    Representative Results

    HIOs blev differentieret fra humane pluripotente stamceller og kulturperler i celle matrix løsning som tidligere beskrevet19,24. Efter 4 uger i kultur, havde HIOs udvidet tilstrækkeligt til at tillade mikroinjektion. HIOs blev microinjected med 4 kDa FITC-konjugeret dextran suspenderet i PBS eller PBS, som indeholder Clostridium difficile toksin kanaltilbehøret. C. difficile er en opportunistisk gastrointestinale patogen, der udstiller toksin-medieret epitelial toksicitet i HIOs25. Som positiv kontrol, blev EGTA tilføjet til HIO kultur medier i et undersæt af HIOs injiceret med PBS og FITC-dextran. EGTA er et calcium-chelator, der forårsager hurtig nedtrapning polymerisering af actin cytoskeleton42. FITC fluorescens blev overvåget i realtid på live imaging mikroskop i et kontrolleret miljø kammer og billeder blev taget til fange i 10-minutters intervaller.

    Post-hoc analyse af billeddiagnostiske data afslørede betydelige forskelle i opbevaring af FITC fluorescens (figur 5). HIOs indsprøjtet med PBS beholdt næsten alle de fluorescerende signal stede ved t = 0, men HIOs, der var også injiceres med kanaltilbehøret af behandlet med EGTA udstillet et betydeligt fald i fluorescerende intensitet af 8 timer efter mikroinjektion (figur 5a). Imaging data blev kvantificeres for alle HIOs på alle tidspunkter til at generere en høj opløsning datasæt, der repræsenterer den relative ændring i fluorescerende intensitet over tid i hver eksperimentelle betingelse (figur 5B). Forskelle i epitelial permeabilitet blev evalueret ved beregningen af den gennemsnitlige afskaffelse (t1/2 ) FITC for hver behandling gruppe (tabel 1) og sammenligne forskelle i t t1/2 mellem grupper ved hjælp af Student's t-test. Kontrol-behandlede HIOs bevaret størstedelen af FITC fluorescerende signal for mere end 16 timer (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandling med EGTA reduceret betydeligt FITC-dextran eliminering tid i forhold til kontrol HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater25, mikroinjektion af kanaltilbehøret markant øget epitel barriere permeabilitet i forhold til kontrol behandling (t1/2 = 7.6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Således er både eksterne (EGTA) og microinjected (kanaltilbehøret) forbindelser i stand til at inducere betydelige ændringer i epitel barriere permeabilitet i HIOs. Disse resultater tyder på, at virkningerne af en bred vifte af farmakologiske stoffer, metabolitter, bakteriel produkter, cytokiner, vækstfaktorer og andre forbindelser på epitel barriere funktion kan evalueres ved hjælp af denne fremgangsmåde.

    Behandling Half-Life (h) SEM (h) Nedre 95% CI (h) Øvre 95% CI (h) n
    Kontrol 17,11 0,3 16.45 17.78 11
    EGTA 2,58 0,19 1,78 3.38 3
    Kanaltilbehøret 7.56 0,63 5,93 9.18 6

    Tabel 1: betyde afskaffelse tid (t1/2) til FITC-dextran i HIOs behandles med EGTA eller kanaltilbehøret. Enheder er timer efter mikroinjektion.

    Figure 1
    Figur 1: grundlæggende layout af en microinjector og micromanipulator for HIO mikroinjektion. Dette billede viser et komplet supplement af udstyr, der anvendes til at udføre mikroinjektion af HIOs. Nøglekomponenter er mærket og oplysninger om bestilling kan findes i tabellen materialer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2: mikropipette puller. Kobber opvarmning spole hc, top klemme c1, bunden klemme (c2), puller arm (pa), varme udvalg toggle (ht) identificeres ved hjælp af pilene. Korrekt indstilling af varme 1 og PULL er angivet med rød tekst. Indsatsen viser en korrekt monteret glas glødetråd klar til opvarmning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: repræsentant billeder af et væv-afledte HIO injiceres med FITC-dextran. (A) billede viser placeringen af glas microcapillary lige før indsættelse i HIO og mikroinjektion. (B) Brightfield billede af et væv-afledte menneskelige tarm organoids efter mikroinjektion af FITC-dextran. Bemærk at fluorescens signal er tilsyneladende selv uden brug af et bestemt filtersæt. Denne farvning aids mikroinjektion præcision. 3 X forstørrelse venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 4
    Figur 4: Live billeddannelse workflow. (A) Screenshot illustrerer de nødvendige skridt til at indstille parametrene mikroskop, finde HIOs på diaset, og Gem position af scenen for hver HIO til afbildning. (B) Pre-tænkelig indstillinger til at indfange FITC kanalen med jævne mellemrum på hver af positionerne angivet i A. (C) efter imaging eksport af DV-format data filer som TIFF-billeder med et TIFF-billede pr. HIO pr. tidspunkt.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 5
    Figur 5: repræsentative resultater. (A) stamcelle-afledt menneskelige tarm organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) afbildet i 20 timer. HIOs var også microinjected med PBS (kontrol) eller Clostridium difficile toksin kanaltilbehøret (12,8 ng/µL) eller behandlet med 2 mM EGTA tilføjet til den eksterne medier. 4 X forstørrelse. (B) Plot af gennemsnitlig normaliseret FITC intensitet over tid i HIOs behandlet med PBS (kontrol), kanaltilbehøret eller EGTA. Fejllinjer udgør S.E.M. og n = 11 HIOs (kontrol), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (kanaltilbehøret). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Denne protokol fastsætter en all-round metode for mikroinjektion af hPSC-afledte HIOs og væv-afledte tarm organoids og måling af epitel barriere permeabilitet i realtid. Vi har også demonstreret vores tilgang til analyse og fortolkning af data genereret ved hjælp af disse metoder. Givet den voksende vedtagelsen af tarm organoids modelsystemer16,20,21,28 og den mangeårige interesse i tarm barriere permeabilitet som en fysiologisk relevante funktionelle resultatet3,4,5,6, vi forventer, at andre, der arbejder på dette område vil være i stand til at anvende og bygge videre på disse metoder.

    Der er flere trin, som er afgørende for anvendelsen af denne teknik. Adgang til høj kvalitet hPSC- eller væv afledte HIO væv bør være etableret inden omfattende eksperimenter med mikroinjektion. HIO macrostructure kan være heterogene, med variation i både størrelse og form, selv om væv identitet og cellulære morfologi er yderst reproducerbare når udnytte etableret metode til at generere HIOs24. Kugleformet HIOs bestående af en enkelt semi-transparent lumen og måler ca 1 mm i diameter er ideelle til mikroinjektion og måling af luminale fluorescens i realtid. I nogle tilfælde mislykkes mikroinjektion, resulterer i kollaps af HIO eller indlysende lækage af injicerede materiale. Mislykket HIOs kan fjernes fra kultur godt på brugerens skøn ved hjælp af en standard mikropipette. Overveje mål linser til rådighed på en billeddannelse platform, når du vælger HIOs for mikroinjektion og billedbehandling. Generelt 2-4 X mål linser er ideelle til at indfange et komplet HIO fluorescerende signal, selv om en 10 X mål kan anvendes, hvis lavt strømforbrug objektiver ikke er tilgængelig, eller hvis de tilgængelige HIOs er < 1 mm i diameter. Imaging software skal give mulighed for automatiseret erobringen af fluorescerende billeder på definerede punkter over tid.

    Flere ændringer i denne protokol er muligt for at passer til de eksperimentelle krav. For eksempel, barriere funktion testresultater kan være afhængige af den molekylære størrelse af forbindelser i brug43 og det kan være hensigtsmæssigt at teste dextran præparater af varierende molekylvægt. Derudover kan brightfield imaging udføres ud over fluorescens imaging som en indikator for den overordnede strukturelle integritet af væv25. Når du udfører mikroinjektion af levende bakterier25,28,31,32,33,44, kan det være nødvendigt at tilføje penicillin og streptomycin eller gentamicin HIO kultur medierne forud for eller efter mikroinjektion. Ydersiden af microcapillary vil blive forurenet under påfyldning med bakteriekulturen suspension og dette kan overføres til HIO medier. Skiftevis, mikroinjektion kan udføres på HIOs suspenderet i ekstracellulær matrix (fx Matrigel) uden medier, tilføjer mediet efter mikroinjektion er afsluttet. Dette kan begrænse forurening til ekstracellulære matrix og eksterne ansigt af HIO. Når du planlægger mikrobiel vækst assays, kan det være nødvendigt at fjerne antibiotika i medierne efter 1-2 h til at undgå at bremse eller forhindre vækst af microinjected organismer.

    Endelig er erkender, at ikke alle forskere vil have adgang til mikroskopi udstyr egnet til in vitro- imaging, det vigtigt at påpege, at de procedurer, der er skitseret i denne protokol for indsamling af fluorescens data kan anvendes på billeder taget på faste timepoints ved hjælp af standard epifluorescerende mikroskopi uden automatiseret billedcapture eller miljøkontrol. Eksempler på denne fremgangsmåde findes i betænkningerne af Leslie og Huang et al. 25, der undersøgte C. difficile toksin aktivitet i hPSC-afledte tarm organoids og Karve og Pradan et al. 44, der undersøgte epitel barriere permeabilitet i lignende hPSC-afledte tarm organoids microinjected med live E. coli. Manuel betjening af imaging udstyr kan resultere i større variation og vanskeligheder med at normalisere den fluorescerende signal. Når udfører manuel billeddannelse af FITC-dextran injiceres HIOs er det afgørende at fastholde fast forstørrelse, fluorescerende excitation intensitet og eksponering gange hele eksperiment at undgå konkurrenceforvridende fluorescerende intensitet målinger.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter at videregive.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne takke Drs. Stephanie Spohn og Basel Abuaita for mange nyttige diskussioner på organoid mikroinjektion. JRS understøttes af Intestinal stamcelle Consortium (U01DK103141), et forskningssamarbejde projekt finansieret af det nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme (NIDDK) og National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID). JRS og VBY understøttes af NIAID roman, alternativ modelsystemer til enteriske sygdomme (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH understøttes mekanismer af mikrobielle patogenese uddannelse tilskud fra det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID, T32AI007528) og klinisk og translationel Science award til Michigan Institut for klinisk og sundhed Forskning (UL1TR000433).

    Den fuldstændige datafiler og data analyse kode bruges i dette håndskrift er tilgængelige på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
    Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
    Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBS Life Technologies 10010-023
    Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Manipulator Narshge UM-3C
    Micromanipulator Narshge UM-1PF
    Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
    Magnetic stand Narshge GJ-1
    Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
    Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
    CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
    EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
    FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
    Micropipette puller Sutter Instruments P-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
    Glass filaments WPI TW100F-4
    Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
    Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
    1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
    1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics